LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) đặc điểm của gen dreb5 ở hai giống đậu tương cúc lông phú bình và vàng ngân sơn

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill ) lương thực có vị trí quan trọng cấu trồng nơng nghiệp giới nói chung Việt Nam nói riêng Trong họ đậu, đậu tương coi loại trồng chiến lược nhiều quốc gia giới, có tác dụng nhiều mặt, có hiệu kinh tế cao, có thời gian sinh trưởng ngắn lại dễ trồng Sản phẩm từ đậu tương sử dụng cho người gia súc dùng trực tiếp hạt thô chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành đáp ứng nhu cầu đạm phần ăn hàng ngày người gia súc [2] Hạt đậu tương có từ 32% đến 56% protein từ 12% đến 25% lipit, từ 10-15% gluxit chứa nhiều loại vitamin [2] Gần nhà khoa học nghiên cứu phát đậu tương có vai trị chữa điều trị bệnh nan y ung thư, tim mạch Đậu tương cịn giải phần vấn đề nóng bỏng giới lượng từ sản phẩm Ngồi ra, đậu tương cịn có tác dụng cải tạo đất nhờ vi khuẩn cố định đạm chứa nốt sần rễ Với giá trị to lớn đó, đậu tương trồng phổ o o biến nhiều nơi từ 55 vĩ Bắc đến 55 vĩ Nam, từ vùng thấp mực nước biển đến vùng cao 2000m so với mực nước biển với diện tích đạt khoảng 74,7 triệu Hiện nay, Việt Nam, đậu tương chiếm vị trí quan trọng nông nghiệp nên gieo trồng vùng nơng nghiệp nước với mục đích giải vấn đề thiếu protein cho người gia súc, xuất cải tạo đất Trên giới, đậu tương sản xuất quy mô lớn phát triển mạnh mẽ nước Nam Mỹ Brazil, Argentina, Canada lớn phải kể đến Mỹ gần Trung Quốc Hàng năm họ sản xuất đưa thị trường giới hàng triệu tấn/năm, điều góp phần giải vấn đề nóng giới lượng, nhiễm Nước ta có hệ sinh thái đa dạng, khí hậu vùng miền lại khơng giống Địa hình có đến 3/4 đồi núi thường có mùa khơ hanh miền bắc, mùa khơ nóng Tây Ngun… Những năm gần diễn biến khí hậu ngày phức tạp, lượng mưa phân bố không vùng thời kỳ năm nên hạn hán nắng nóng kéo dài Tình trạng hạn hán ảnh hưởng đến sản xuất đậu tương không Việt Nam mà nước sản xuất đậu tương hàng đầu giới Argentina Thống kê cho thấy, sản lượng đậu tương Argentina vào vụ mùa năm 2009 giảm từ 34,5 triệu so với thời điểm năm 2008 46,2 triệu Ở Việt Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng địa phương làm cho sản lượng đậu tương năm 2009 giảm xuống 213,6 nghìn so với năm 2007 275,2 nghìn năm 2008 267,6 nghìn [33] Đậu tương tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc vào nhóm chịu hạn Chính nghiên cứu tạo giống đậu tương có kiểu gen chống chịu hạn có khả sống điều kiện bất lợi nước hướng nghiên cứu quan tâm nhà chọn giống [6], [7] Cho đến Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu tìm hiểu sở phân tử đặc tính chịu hạn đậu tương (Trần Thị Phương Liên, 1999 [5]; Chu Hoàng Mậu, 2001 [7]; Hoàng Thị Thu Yến đtg 2003 [10]), kết nghiên cứu cơng trình rằng, thông tin gen protein liên quan đến tính chịu hạn đậu tương sở cho việc tìm kiếm ứng dụng nhằm nâng cao khả chịu hạn đậu tương Q trình phiên mã nhóm gen chịu hạn chịu tác động yếu tố điều khiển trình phiên mã, có nhân tố DREB Nghiên cứu ứng dụng protein DREB thành công đối tượng khoai tây, cà chua, hoa cúc, lúa mì , đậu tương cơng trình nghiên cứu gen DREB cịn cơng bố Vì vậy, nghiên cứu nhân tố phiên mã theo hướng tăng cường khả biểu nhóm gen liên quan đến đặc tính chịu hạn đậu tương quan tâm nghiên cứu Từ lí chúng tơi tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là: “Đặc điểm gen DREB5 hai giống đậu tương Cúc lơng Phú Bình Vàng Ngân Sơn” Mục tiêu đề tài Xác định sai khác trình tự gen DREB5 hai giống đậu tương nghiên cứu Nội dung nghiên cứu 3.1 Thu thập thông tin gen DREB5 thành phần phản ứng để nhân gen DREB5; 3.2 Nhân gen DREB5 từ DNA hệ gen đậu tương kỹ thuật PCR; 3.3 Tách dòng đọc trình tự gen DREB5 hai giống đậu tương Cúc lơng Phú Bình (CPB) Vàng Ngân Sơn (VNS); 3.4 So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid hai giống đậu tương CPB, VNS so sánh với trình tự DREB5 cơng bố Ngân hàng gen quốc tế Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Đặc điểm nông sinh học thành phần hoá sinh hạt đậu tương Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill), có nhiễm sắc thể 2n = 40, loại trồng thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidea) có nguồn gốc từ tỉnh phía Bắc Đơng Bắc Trung Q́ c , vùng kế cận Cộng hòa Liên bang Nga, Triều Tiên Nhật Bản Các giống đậu địa phương củ a nướ c ta hiệ n đượ c du nhậ p tƣ̀ Trung Quố c đã tƣ̀ lâu đờ i [2] Cây đậ u tương là thân thả o , phân cành dạ ng bụ i đậu tương có phận rễ, thân, lá, hoa Trong đậu tương kép vớ i chét, cũ ng có – chét Hoa mà u trắ ng hay tí m, thẳ ng hay quả cong đề u có nhiề u lông Vỏ hạ t đậ u tương có mà u nâu hoặ c đen, vàng, xanh Khố i lượ ng hạ t rấ t đa dạ ng tƣ̀ 200 – 400mg/hạt Cây đậ u tương có đặ c tí nh sinh trưở ng : sinh trưở ng hƣ̃ u hạ n và sinh trưở ng vô hạ n ; thờ i gian sinh trưở ng có loại: chín sớm (75 – 85 ngày), trung bì nh (80 – 100 ngày), muộ n (110 – 120 ngày) Thờ i gian sinh trưở ng là mộ t yế u tố rấ t quan trọng để lựa chọn trồng luân canh xen vụ Mộ t đặ c điể m nổ i bậ t là ở rễ đậ u tương thườ ng có nố t sầ n chứa vi khuẩ n có khả cố đị nh nitơ tư do, trồ ng đậ u tương cò n có tá c dụ ng cả i tạ o đấ t Các cơng trình nghiên cƣ́ u cho thấ y nhƣ̃ ng giố ng có khả cộ ng sinh và có đủ nố t sầ n thườ ng là m cho lượ ng protein cao Đậu tương tương đối mẫn cảm với điề u kiệ n ngoạ i cả nh Trong tậ p đoà n giố ng đậ u tương có nhƣ̃ ng giố ng chỉ trồ ng và o vụ hè , có giống trồng vào vụ đơng [2] Cây đậu tương với trồng khác bông, lạc, hướ ng dương, cải dầu , dƣ̀ a và cọ loại lấ y dầ u quan trọ ng quan tâm, đó , đậ u tương là trồ ng lấ y hạ t , cung cấ p dầ u quan trọ ng bậ c nhấ t cá c lấ y dầ u Hiệ n nay, thố ng kê củ a FAO cho thấ y tƣ̀ năm 1980 trở lại sản lượng đậu tương giới tăng lên lầ n chủ yế u nhờ và o tăng diệ n tí ch và suấ t Trong vò ng 20 năm qua diệ n tí ch gieo trồ ng tăng nhanh, suấ t bì nh quân khá cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu tương đứng đầu giới : Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quố c chiế m khoả ng 90 – 95% tổ ng sả n lượ ng đậ u tương thế giớ i [33] Hiệ n , Việt Nam đậu tương chiếm vị trí quan trọng nề n sản xuất nông nghiệ p, đặ c biệ t ở nhƣ̃ ng vù ng nông thôn nghè o , kinh tế chưa phá t triể n Nhưng ngành sản xuất đậu tương nước ta chưa đầu tư, suấ t cò n thấ p, vậ y nghiên cƣ́ u cả i tiế n cá c đặ c điể m nông sinh học giống địa phương tạo giố ng mớ i có suấ t cao , thích nghi với điề u kiệ n sinh thá i ở nhƣ̃ ng vù ng khá c bằ ng phương phá p truyề n thố ng kế t hợ p vớ i kỹ thuật hiệ n đạ i sẽ đá p ƣ́ ng đượ c yêu cầ u củ a thư c tiễ n đặ t và đó là chiế n lượ c quan trọ ng về sư phá t triể n đậ u đỗ củ a nướ c ta Trong hạt đậu tương, protein chiếm từ 30 – 56%, lipit 12- 25%, gluxit 20%; có muối khống Ca, Mg, K, P, Na, S, Fe, vitamin A, B1, B2, D, E, F, men, sáp, nhựa, cellulose Ngoài ra, đậu tương cịn có đầy đủ amino acid bản, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylanalin, tryptophan, valin [2] Protein thành phần chủ yếu hạt chiếm từ 30 - 56%, thực tế cho thấy kiểu gen điều kiện canh tác làm ảnh hưởng tới hàm lượng protein chúng chứa hàm lượng protein lớn loài thực vật khác [2] Protein dự trữ bào quan, có chức cung cấp nguồn amino acid nitơ cho trình nẩy mầm hạt, protein dự trữ chủ yếu hạt đậu tương albumin globulin Dựa vào hệ số lắng người ta chia protein hạt đậu tương thành loại: legumin, vixilin, enzim chất ức chế enzim có chất protein Trong hạt đậu tương protein dự trữ chiếm tới 70%, enzim, chất ức chế proteaza lectin Thành phần protein gồm có albumin (9,5%), globulin tan nước (75,8%), globulin tan NaCl chiếm 3%, glutelin tan NaOH 0,2M chiếm 11,7% [5] Protein họ đậu nói chung, đậu tương nói riêng coi chất lượng tốt loại protein thực vật, chúng chứa tất amino acid không thay cần thiết cho thể người động vật, tỷ lệ lyzin cao, hàm lượng amino acid chứa gốc SH methyonin, systein thấp [5], [7], [29] Hàm lượng lipid hạt đậu tương cao chiếm từ 12 – 25% khối lượng khơ, hàm lượng axit béo no thấp, khoảng 13% khơng có cholestrol, 30% axit béo không no nối đôi Lượng axit không no cần thiết: axit linoleic 50%, đặc biệt có 7% axit α- linoleic nguồn cung cấp chuỗi mạch dài omega quan trọng cho thể DHA (Docosa Hexaenoic Acid) EPA (Eicosa Pentaenoic Acid) Chất lượng lipit hạt đậu tương tốt, sử dụng rộng rãi công nghiệp chế biến thực phẩm Hạt đậu tương cịn có vitamin tan lipit, đặc biệt vitamin E=200mg/100glipit [2], hạt đậu tương chứa số chất khác cacbon hydrat, muối khống, axit nucleic, kích thích sinh trưởng 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam Trên giới: Với giá trị kinh tế sử dụng đậu tương nên xem loại trồng chiến lược nhiều quốc gia với vị trị đứng sau lúa, ngơ lúa mì Do có khả thích nghi rộng với điều kiện khí hậu sinh thái khác nên đậu tương trồng rộng rãi năm châu lục, tập trung nhiều Châu Mỹ, tiếp đến Châu Á Theo thống kê Tổ chức Nông nghiệp Lương thực Liên hiệp quốc, diện tích gieo trồng đậu tương giới tăng khoảng 3,6 triệu vòng năm trở lại (năm 2006 95,2 triệu năm 2009 98,8 triệu ha) [33] Trong đó, Hoa Kỳ quốc gia có diện tích gieo trồng đậu tương lớn 30,91 triệu tiếp đến quốc gia Brazil (21,76 triệu ha) Argentina (16,77 triệu ha) vào năm 2009 (Bảng 1.1) so với Việt Nam 0,15 triệu Bảng 1.1 Diện tích sản xuất đậu tương số quốc gia giới Quốc gia Diện tích thu hoạch (triệu ha)* Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009 Argentina 15,13 15,98 16,39 16,77 Brazil 22,05 20,57 21,06 21,76 Trung Quốc 9,30 8,75 9,13 8,80 Ấn Độ 8,33 8,88 9,52 9,60 Indonesia 0,58 0,46 0,59 0,72 Thailan 0,14 0,13 0,12 0,11 Hoa Kỳ 30,19 25,96 30,22 30,91 Việt Nam 0,19 0,19 0,19 0,15 * Theo số liệu thống kê Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO) [33] Mặc dù diện tích gieo trồng đậu tương tăng lên đáng kể năm trở lại sản lượng đậu tương giới lại có biến động khác năm Năm 2006 sản xuất đậu tương giới đạt 221,9 triệu tấn, năm 2007 giảm xuống 219,5 triệu tấn, tăng lên vào năm 2008 230,5 triệu năm 2009 222,2 triệu Năm 2009, Hoa Kỳ quốc gia sản xuất đậu tương nhiều giới với 91,42 triệu tấn, Brazil với 56,96 triệu Argentina 30,99 triệu [33] (Bảng 1.2) Bảng 1.2 Sản lượng sản xuất đậu tương số quốc gia giới Quốc gia Sản lượng (triệu tấn)* Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009 Argentina 40,54 47,48 46,24 30,99 Brazil 52,46 57,86 59,24 56,96 Trung Quốc 15,50 12,73 15.55 14,50 Ấn Độ 8,86 10,97 9,91 10,22 Indonesia 0,75 0,59 0,78 0,97 Thailan 0,21 0,20 0,19 0,19 Hoa Kỳ 87,00 72,86 80,75 91,42 Việt Nam 0,26 0,28 0,27 0,21 * Theo số liệu thống kê Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO) [33] Trong bốn năm trở lại suất cao đạt vào năm 2007 24,3 tạ/ha thấp năm 2009 22,4 tạ/ha Trong số quốc gia trồng đậu tương hàng đầu giới Hoa Kỳ trì suất đậu tương chí có phần tăng vào năm 2009 so với năm 2006, 2007 2008 (Bảng 1.3) Argentina nước có suất đậu tương giảm mạnh vào năm 2009 18,48 tạ/ha so với năm trước trung bình đạt khoảng 27 tạ/ha (Bảng 1.3) KẾ T LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đã nhân bả n, tách dịng thành cơng giải trình tự nucleotide gen mã hố nhân tố phiên mã DREB5 từ DNA hệ gen hai giống đậu tương CPB VNS Trình tự nucleotide gen DREB giống CPB giống VNS dài 924bp Trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tương CPB giống đậu tương VNS có độ tương đồng cao (99,2%) Trình tự nucleotide gen DREB5 giống CPB so với ba giống EF583447, giống Bản Giốc giống Xanh Tiên Đài có độ tương đồng từ 92,4% đến 99,1% Trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tương VNS so với ba giống EF583447, giống Bản Giốc giống Xanh Tiên Đài có độ tương đồng từ 92,4% đến 98,5% Trình tự amino acid protein DREB5 giống đậu tương CPB giống đậu tương VNS có độ tương đồng cao (98,7%) Trình tự amino acid protein DREB5 giống CPB so với ba giống EF 583447, giống Bản Giốc giống Xanh Tiên Đài có độ tương đồng từ 88,7% đến 98,4% Trình tự amino acid protein DREB5 giống VNS so với ba giống EF 583447, giống Bản Giốc giống Xanh Tiên Đài có độ tương đồng từ 88,4% đến 97,4% Đề nghị Cầ n tiế p tụ c nghiên c ứu gen DREB làm sở thiết kế vector mang cấu trúc gen DREB5 phục vụ chuyể n gentạo đậu tương biến đổi gen chịu hạn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trầ n Bì nh, Lê Thị Muộ i (1998), Phân lậ p gen và chọ n dò ng chố ng chị u ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đạ i Họ c Quố c gia, Hà Nội: 92 - 98 Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp Nguyễ n Thị Thú y Hườ ng , Chu Hoà ng Mậ u , Lê Văn Sơn , Nguyễ n Hƣ̃ u Cườ ng, Lê Trầ n Bì nh , Chu Hoà ng Hà (2008), “Đá nh giá khả chị u hạn phân lập gen P 5CS một số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”, Tạp chí cơng nghệ sinh họ c 6(4): 459 – 466 Trầ n Thị Phương Liên , Nguyễ n Huy Hoà ng , Đinh Duy Khá ng , Nông Văn Hải, Lê Thị Muộ i (1998), “Phân lậ p gen chaperomin ở giớ ng đậ u tương chịu nóng M103”, Tạp chí Khoa họ c công nghệ , 36: - 14 Trầ n Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứ u đặ c tí nh hó a sinh và sinh họ c phân tử củ a mộ t số giố ng đậ u tương có khả chị u nó ng , chịu hạn Việ t Nam, Luậ n á n tiế n sĩ sinh họ c , Việ n Công nghệ sinh họ c , Hà Nội: 22- 34 Trầ n Đì nh Long (1991), Nhữ ng nghiên cứ u mớ i về chọ n tạ o giố ng đậ u đỗ , NXB Nông nghiệ p, Hà Nội: 1-10 Chu Hoàng Mậu (2001), Sư dụng phương pháp đột biến thực nghiệm đê tạo dịng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thu Hiền (2007), “Đánh giá khả chịu hạn tách dịng gen mã hóa protein dehydrin (LEA-D11) một số giống đậu tương (Glycine max L Merrill) địa phương miền núi”, Tạp chí Sinh học, 29(4): 31-41 Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Minh Hồng, Hoàng Văn Mạnh (2011), “Đặc điêm gen DREB1 phân lập từ giống đậu tương địa phương (Glycine max L Merrill) Xanh lơ Ba bê (Bắc Kạn)”, Tạp chí Sinh học, 33(1): 74 - 79 10.Hồng Thị Thu Yến , Chu Hoàng Mậu , Nghiêm Ngọ c Minh , Nơng Văn Hải, Trịnh Đình Đạt (2003), “Phân lậ p gen chaperonin ở cá c dò ng đậ u tương độ t biế n ML 10, ML48 ML 61”, Nhƣ̃ ng vấ n đề nghiên cƣ́ u bả n khoa họ c sư số ng, NXB Khoa họ c và Kỹ thuật: 1073 – 1076 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11.Cao Xin-You, and MA You-Zhi (2008), “Isolation and Identification of a GmGβ1 Interacting Protein with GmDREB5 Protein in Soybean (Glycine max)” Acta Agronomica Sinica, 34(10): 1688−1695 12.Chen M., Wang Q Y, Cheng X G, Xu Z S, Li L C, Ye X G, Xia L Q, Ma Y Z., (2007) “GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants” Biochem Biophys Res Commun 353(2): 299 - 305 13.Close T.J (1996), “Dehydrin: Emergence biochemical role family plant dehydrin proteins”, Physiol Plant 97: 795 – 803 14.Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2005), “AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis”, Plant Cell 17(12): 3470 - 88 15.Gaiyun Zhang, Ming Chen, Liancheng Li, Zhaoshi Xu, Xueping Chen, Jiaming Guo and Youzhi Ma (2009), “Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco” Journal of Experimental Botany, 60(13): 3781- 3796 16.Gawel N J., Jarret R L., (1991), Genomic DNA isolation http://www Weihenstephan.de/pbpz/bambra/html/dna.htmn 17.Hartl F.U (1996), “Molecular chaperones in cellular protein folding”, Nature, 381: 571 – 580 18.Keder J C.(1996), “Lipid – transfer proteins in plant”, Annual review of Plant Physiology and Plant moculelar Biology, 47: 627 – 654 19.Chu Hoang Lan, Nguyen Tuan Anh, Nguyen Vu Thanh Thanh, Nguyen Hiep Hoa, Chu Hoang Mau (2010), “Characterization of the GmDREB5 gene isolated from the soybean cultivar Xanh Tien Dai, Vietnam” Proceedings of 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010), 28-30, December 2010, Hong Kong, IEEE: 354-358 20 Liao Y., Zou H F., Wang H W., Zhang W K., Ma B., Zhang J S., Chen S Y., (2008), “Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants”, Cell Res, 18(10): 1047-1060 21.Lin R., Zhao W., Meng X., Wang M and Peng Y (2007), “Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea”, Plant Sci 172 (1): 120-130 22.Liu Q., Y Sakuma, H Abe, M Kasuga, S Miura, K YamaguchiShinozai, and K Shinozaki (1998), “Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low temperatureresponsive gene expression, respectively, in Arabidopsis” Plant Cell 10: 1391–1406 23.Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein II (LTP 2) mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AY300807 24.Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein I (LTP 1) mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AY300806 25.Maitra N, Cushman J C (1994), “Isolation and characterization adrought – induced soybean cDNA encoding aD95 family late – embryogenesis – abudant protein”, Plant Physiol, 106: 805 - 806 26.Chu Hoang Mau, Nguyen Tuan Anh, Pham Thi Thanh Nhan, Dinh Thi Ngoc, Bui Thi Tuyet (2010), “The characteristics of chaperonin gene isolated local soybean cultivars (Glycine max L Merrill) grown in Tay Nguyen region, Viet Nam” Proceedings of 2010 International Conference on Chemical Engineering and Applications (CCEA 2010), Singapore: 452 - 456 27.Chu Hoang Mau, Nguyen Thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le Van Son, Chu Hoang Ha (2010), “Characteristics of the gene encoding pyrroline-5-carboxylate synthase (P5CS) in Vietnam soybean cultivars (Glycine max L Merrill)”, Proceedings of 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010), 28-30, December 2010, Hong Kong, IEEE: 319-323 28.Porcel R., Azcon R., Ruiz-Lozano J.M (2005), “Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativa plants” J Exp Bot, 56(417): 1933 - 1942 29.Serrtti C., Schapagh W T ADN Leffel R.C (1994), “Amino acid profile of high seed protein soybean”, Crop Sci, 34: 207 – 209 30.Tran L S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simopson S D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi – Shinozaki K., (2007), “Co-expression of the stress-inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis”, Plant J, (1): 46 - 63 31.Wangxia W., Basia V., Oded S., Arie A (2004), “Role of plant heat shock proteins and mocular chaperones in the abiotic stress response”, Plant Science, 9(5): 244 – 252 32.Wang Y M and He C.F (2010), “A cold-induced DREB gene in Aloe vera L”, Plant Mol Biol Rep 25: 121-132 33 Http://faostat.fao.org 34 Http://www.gso.gov.vn 35.Zhaoshi Xu, Ming Chen, Lanqin Xia, Liancheng Li, Xianguo Cheng, Jianhui Dong, Qiaoyan Wang and Youzhi Ma, (2008), Cold-induced modulation and functional analyses of the DRE-binding transcription factor gene, GmDREB3, in soybean (Glycine max L.): 121 – 135 36.Dubouzet JG, Sakuma Y, Ito Y, Kasuga M, Dubouzet EG, Miura S, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, (2003) OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold-responsive gene expression: 63 – 751 37.Yanfang Yang, Jian Wu, Kai Zhu, Liqing Liu, Fadi Chen and Deyue Yu, (2007), Identification chrysanthemum and characterization of two (Dendronthema × moriforlium) DREB genes, belonging to the AP2/EREBP family 38.Xue-Ping Li, Ai-Guo Tian, Guang-Zuo Luo, Zhi-Zhong Gong, Jin-Song Zhang and Shou-Yi Chen, (2005), Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trì nh nghiên cƣ́ u củ a riêng Các số liệ u, kế t quả nêu luậ n v ăn là trung thư c và chưa tƣ̀ ng công bố bấ t kỳ công trì nh nà o khá c Thái Nguyên, ngày 19 tháng năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thùy Giang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 67 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bà y tỏ lò ng biế t ơn sâu sắ c tớ i PGS TS Chu Hoàng Mậu, Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn , tài trợ kinh phí và tạ o mọ i điề u kiệ n giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Ngun trực tiếp hướng dẫn tơi tiến hành thí nghiệm đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ cán thuộc Phịng thí nghiệm Sinh học, Khoa khoa học sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Bộ môn Sinh học phân tử - Công nghệ gen, Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên Tôi xin cảm ơn Bộ môn Hệ thống canh tác, Viện nghiên cứu Ngô cung cấp hạt số giống đậu tương làm vật liệu nghiên cứu cho đề tài luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè nhiệt tình ủng hộ động viên tơi suốt q trình thực luận văn Công trình được thực với tài trơ kinh phí dự án TRIG Tác giả luận văn Nguyễn Thùy Giang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ng uyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 BẢNG NHƢ̃ NG CHƢ̃ VIẾ T TẮ T ABA Abscisic acid (Axit abxisic) DNA Deoxyribonucleic amino ASTT Áp suất thẩm thấu bp Base pair (Cặ p base) CTAB Cetyltrimethyl – ammonium bromide đtg Đồng tác giả DREB Dehydration- Responsive Element Binding EDTA Ethylen Diamin Tetraaccetic Amino kb Kilo base HSP Heat shock protein (Protein số c nhiệ t) LEA Late Embryogenesis Abundant (Protein tí ch lũ y vớ i số lượ ng lớ n ở giai đoạ n cuố i củ a quá trì nh hì nh thà nh phôi) LTP Lipid transfer protein (Protein vận chuyển lipid) MGPT Môi giớ i phân tƣ̉ (Molecular chaperone) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) TAE Tris Acetate EDTA CPB Giống đậu tương địa phương Cúc lơng Phú Bình VNS Giống đậu tương địa phương Vàng Ngân Sơn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Th Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 69 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN BẢNG NHƢ̃ NG CHƢ̃ VIẾ T TẮ T MỤC LỤC DANH MỤ C CÁ C BẢ NG TRONG LUẬ N VĂN DANH MỤ C CÁ C HÌ NH TRONG LUẬ N VĂN MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài 3 Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬ U TƯƠNG 1.1.1 Đặc điểm nông sinh học thành phần hóa sinh hạt đậu tương 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam 1.2 GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 12 1.2.1 Hạn tác động hạn đến đậu tương12 1.2.2 Các gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tương 16 1.2.2.1 Các gen chức 17 1.2.2.2 Các gen điều khiển trình phiên mã 20 1.3 NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB 23 Chương 2: VẬ T LIỆ U VÀ PHƯƠNG PHÁ P 26 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyên 70 2.1 NGUYÊN LIỆ U THƯ C VẬ T 26 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 26 2.2.1 Các hóa chất chuyên dụng 26 2.2.2 Thiết bị 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 28 2.3.2 Định lượng kiểm tra độ tinh DNA tổng số 29 2.3.3 Kỹ thuật PCR 29 2.3.4 Tạo vector tái tổ hợp 31 2.3.5 Phương pháp xác định trình tự nucleotide xử lí số liệu 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35 3.1.Kết khuếch đại tách dòng gen DREB5 từ hai giống đậu tương CPB VNS 35 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số giống đậu tương địa phương 35 3.1.2 Nhân gen DREB5 tƣ̀ giố ng đậ u tương Cúc lơng Phú Bình (CPB) Vàng Ngân Sơn (VNS) 36 3.1.3 Kế t quả tá ch dò ng gen DREB 37 3.2 Kết xác định trình tự gen DREB5 giống đậu tương CPB VNS40 3.3 So sánh trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tương Cúc lơng Phú Bình Vàng Ngân Sơn Việt Nam với gen DREB5 giống đậu tương khác .43 KẾ T LUẬ N VÀ ĐỀ NGHI ̣ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái N guyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 71 DANH MỤ C CÁ C BẢ NG Bảng Tên cá c bả ng luậ n văn Trang 1.1 Diện tích sản xuất đậu tương số quốc gia giới 1.2 Sản lượng sản xuất đậu tương số quốc gia giới 1.3 Năng suất đậu tương số quốc gia giới 1.4 Sản lượng sản xuất đậu tương tỉnh thành phố 11 2.1 26 2.2 Nguồ n gố c đặc điểm củ a cá c giố ng đậ u tương nghiên cƣ́ u Danh mụ c cá c thiế t bị sƣ̉ dụ ng 2.3 Mồ i nhân gen DREB5 29 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen DREB5 30 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 31 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp 32 3.1 Thống kê vị trí nucleotide thay đổi gen DREB5 27 45 CPB VNS với EF 583447, Xanh Tiên Đài Bản Giốc So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide gen 3.2 DREB5 giống đậu tương CPB, VNS với giống 52 đậu tương, Xanh Tiên Đài, Bản Giốc EF583447 3.3 3.4 Trình tự amino acid gen DREB5 thay đổi 56 giống đậu tương So sánh mức độ tương đồng trình tự amino acid c protein DREB5 giống đậu tương Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn 72 DANH MỤ C CÁ C HÌ NH Hình 1.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Tên cá c hì nh luậ n văn Trang Cơ chế phân tử q trình tăng cường tính chịu hạn thực vật Hình ảnh điện di DNA tổng số giống đậu tương nghiên cứu Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen DREB5 giống đậu tương Vector pTZ57R/T 21 35 36 37 Ảnh điện di sản phẩm tách plasmit enzym giới hạn BamHI So sánh trình tự nucleotide gen DREB5 giống đậu tương CPB VNS So sánh trình tự amino acid CPB VNS 38 41 42 So sánh trình tự nucleotide gen DREB5 CPB, VNS với Xanh Tiên Đài, Bản Giốc EF 583447 Sơ đồ hình biểu diễn quan hệ di truyền dựa trình tự gen DREB5 số giống đậu tương So sánh trình tự amino acid CPB, VNS với EF 583447, Xanh Tiên Đài Bản Giốc 45 53 55 Sơ đồ hình biểu diễn quan hệ di truyền dựa 3.10 trình tự amino acid protein DREB5 58 giống đậu tương Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 73 ... liên quan đến đặc tính chịu hạn đậu tương chúng tơi quan tâm nghiên cứu Từ lí tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là: ? ?Đặc điểm gen DREB5 hai giống đậu tương Cúc lơng Phú Bình Vàng Ngân Sơn? ?? Mục tiêu... trình tự gen DREB5 hai giống đậu tương Cúc lơng Phú Bình (CPB) Vàng Ngân Sơn (VNS); 3.4 So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid hai giống đậu tương CPB, VNS so sánh với trình tự DREB5 công. .. khác trình tự gen DREB5 hai giống đậu tương nghiên cứu Nội dung nghiên cứu 3.1 Thu thập thông tin gen DREB5 thành phần phản ứng để nhân gen DREB5; 3.2 Nhân gen DREB5 từ DNA hệ gen đậu tương kỹ thuật