LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) xác định trình tự gen e6 và l1 của HPV và gen EBNA 1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ala Alanine bp Base pair BL Burkitt’s Lymphoma CTC Cổ tử cung E Early region EBV Epstein-Barr Virus Gly Glycine gs-PCR Group-specific PCR HPV Human papilloma virus HP6 Hải Phòng (ký hiệu mẫu) L Late region LCL Lymphoblastoid LCR Long control region LMP Latent membrane protein MHC Major Histocompatibility Complex MT7 Miền trung (ký hiệu mẫu) NPC Nasopharyngeal carcinoma p53 Protein 53 PV Papilloma virus RB Retinoblast TR Terminal repeat ts-PCR Type- specific PCR UICC Universal Integrated Circuit Card UTBM Carcinoma VCA Viral capsid antigen VMH Vòm mũi họng WHO World Health Organization DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng luận văn Trang Bảng 1.1 Tình hình ung thư CTC giới (khơng tính Châu Phi) Bảng 2.1 Thành phần số lượng thành phần tham gia phản ứng multiplex-PCR HPV-16/HPV-18 38 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt độ phản ứng multiplex-PCR HPV16/HPV18 39 Bảng 2.3 Thành phần số lượng thành phần tham gia phản ứng PCR gen E6 cua HPV-16 39 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR gen EBNA-1 40 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng (pCR2.1TOPO) 43 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằ ng enzym EcoRI 47 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng tạo DNA sợi đơn 49 Bảng 2.8 Chu trì nh nhiệ t củ a phả n ứ ng giả i trì nh tự 49 Bảng 3.1 Kết truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen E6 mẫu PK12 56 Bảng 3.2 Kết truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen L1 mẫu PS16 57 Bảng 3.3 Kết truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi nucleotide gen EBNA-1 EB17, EB18, EB19 EB20 64 Bảng 3.4 Kết xác định phân týp chủng EBV qua phân tích acid amin tại vị trí 487 EBNA-1 66 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình luận văn Trang Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi người có khả nhiễm ung thư cổ tử cung châu lục Hình 1.2 Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) ung thư cổ tử cung Hình 1.3 Mối quan hệ phả hệ nguồn gốc 101 Papillomavirus dựa so sánh chuỗi nucleotid gene capsid L1 11 Hình 1.4 Human Papillomavirus chụp kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử hệ gene HPV -16 13 Hình 1.6 Quá trình nhân lên HPV 15 Hình 1.7 Sơ đồ minh họa trình tiến triển EBV thể bị nhiễm 27 Hình 1.8 Cấu trúc hệ gene EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a) dạng mạch thẳng (b) 29 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu phân tích gene EBNA-1 virus EBV E6 virus HPV16 L1 HPV18 34 Hình 2.2 Cấ u trú c vector pCR2.1-TOPO® (Invitrogen) 43 Hình 3.1 Kết kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51 Hình 3.2 Kiểm tra sản phẩm multiplex-PCR sử dụng lúc cặp mồi (E6F-E6R HP18F-HP18R) với khuôn DNA tổng số mẫu PS16, PK12, PK11, PK10 52 Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm tách dòng đoạn gen E6 mẫu PK12 (bản A) đoạn gen L1 mẫu PS16 (bản B) 53 Hình 3.4 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) phần trình tự gen E6 mẫu PK12 (HPV-16) 54 Hình 3.5 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) phần trình tự gen L1 mẫu PS16 (HPV18) 54 Hình 3.6 Trình bày chuỗi gen E6 typ HPV-16 55 Hình 3.7 Trình bày chuỗi gen L1 typ HPV-18 55 Hình 3.8 Kết bước đầu phát HPV16/HPV18 phương pháp đa mồi multiplex-PCR 59 Hình 3.9 Kết kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm EBV 61 Hình 3.10 Kết kiểm tra sản phẩm PCR điện di gen EBNA-1 61 Hình 3.11 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) phần trình tự gen EBNA-1 63 Hình 3.12 Kết chuỗi gen EBNA-1 EB17 thu nhận sau giải trình tự 63 Hình 3.13 So sánh phần trình tự acid amin EBNA-1 13 chủng nghiên cứu 65 MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung 1.1.1.1 Trên giới .4 1.1.1.2 Tình hình ung thư cổ tử cung Việt Nam 1.1.1.3 .3 Các yếu tố có nguy ung thư CTC 1.1.1.4 Human papilloma virus bệnh ung thư cổ tử cung 1.1.2 Phân loại đặc tính sinh học Papilloma virus 1.1.2.1 Phân loại Papilloma virus9 1.1.2.2 Đặc tính sinh học Human Papillomavirus 12 1.1.2.3 Quá trình nhân lên HPV .14 1.1.2.4 Cơ chế gây ung thư cổ tử cung HPV 16 1.1.3 Chẩn đoán ung thư CTC 17 1.1.3.1 Chẩn đoán tế bào học 17 1.1.3.2 Chẩn đốn dựa phân tích mRNA 19 1.1.3.3 Định týp HPV sinh học phân tử 19 1.1.4 Tầm quan trọng việc nghiên cứu sinh học phân tử xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung Việt Nam 21 1.2 UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) .22 1.2.1 tễ học ung thư vòm mũi họng 22 1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 22 1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 23 1.2.2 Đặc tính sinh học Epstein-Bar virus (EBV) .24 1.2.2.1 Phát virus Epstein - Barr ung thư VMH 24 1.2.2.2 ểm phân loại cấu trúc EBV 25 1.2.2.3 nhân lên, tàng nhiễm khả gây ung thư EBV… 26 1.2.2.4 học phân tử xếp hệ gene EBV 28 1.2.2.5 ản phẩm gene EBNA-1 29 1.2.3 Tầm quan trọng việc nghiên cứu sinh học phân tử xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng Việt Nam 30 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tượng nghiên cứu 33 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu hoá chất nghiên cứu 33 2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị 33 2.2.2 Hoá chất 33 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.4 Quy trình nghiên cứu 35 2.4.1 mẫu bảo quản 35 2.4.2 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số 35 2.4.3 Quy trình phản ứng PCR kiểm tra sản phẩm PCR .37 2.4.3.1 Thiết kế mồi……………………………………………… 37 2.4.3.2 Quy trình phản ứng PCR 38 2.4.3.3 Kỹ thuật phát sản phẩm PCR 40 2.4.3.4 Tinh sản phẩm PCR 41 2.4.4 Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR .42 2.4.4.1 Tạo vectơ tái tổ hợp 42 2.4.4.2 Chuyển nạp…………………………………… ………… 43 2.4.4.3 Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp 44 2.4.4.4 Tách DNA plasmid tái tổ hợp 45 2.4.4.5 Kiểm tra DNA tái tổ hợp 47 2.4.5 Giải trình trình tự xử lý số liệu 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Kết thu nhận, giải trình trình tự xác định gen E6 HPV-16 L1 HPV-18 51 3.1.1 Kế t kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51 3.1.2 Kết thực phản ứng Multiplex-PCR phát HPV-16 HPV18 .52 3.1.3 Kết tách dịng giải trình tự sản phẩm HPV-16 HPV-18 từ mẫu kiểm tra .53 3.1.4 Kết giải trình tự thu nhận chuỗi gen E6 HPV-16 chuỗi gen L1 HPV-18 54 3.1.5 Kết truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 HPV16 L1 HPV18 56 3.1.6 Kết bước đầu phát HPV-16 HPV-18 phương pháp đa mồi multiplex-PCR .59 3.2 Kết thu nhận, giải trình trình tự xác định gen EBNA – EBV 60 3.2.1 Kết kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 60 3.2.2 Kết thực phản ứng PCR .61 3.2.3 Kết giải trình tự thu nhận chuỗi gen EBNA-1 EBV .62 3.2.4 Kết truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1 EBV 63 3.2.5 Kết xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin số 487 EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng chủng Việt Nam giới 64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 4.1 KẾT LUẬN 69 4.2 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, giới Việt Nam, ung thư (cancer) nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao người, chiếm khoảng 12% tổng số trường hợp tử vong hàng năm giới, đứng thứ sau tỷ lệ tử vong bệnh lí tim - mạch ngày có xu hướng gia tăng Bệnh ung thư khơng phát sớm điều trị kịp thời dẫn đến nguyên nhân gây tử vong, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Bệnh xảy lứa tuổi, hai giới (nam nữ) tất mô, quan thể Đặc biệt, ung thư cổ tử cung (CTC) ung thư vòm mũi họng (VMH) hai số loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao Việt Nam quốc gia phát triển khu vực Trong đó, ung thư CTC đứng thứ số ung thư nguyên nhân gây tử vong cao cho phụ nữ Việt Nam [1], [9] Bên cạnh đó, ung thư VMH loại ung thư phổ biến người loại hay gặp ung thư vùng tai mũi họng nước vùng Đơng nam Á phía nam Trung Quốc [23], [56] Nguyên nhân gây ung thư phức tạp, liên quan đến thể địa, tập quán, thói quen mơi trường sống Trong đó, số yếu tố coi liên quan chặt chẽ với việc gây ung thư như: yếu tố vật lí (phóng xạ), hóa chất độc, gốc tự đặc biệt ngày phát vai trò virus tiến triển ung thư Các công trình nghiên cứu gần chứng minh virus nguyên nhân gây hai loại ung thư người Nhiều nghiên cứu phát diện HPV (Human papilloma virus) 95% trường hợp ung thư cổ tử cung [62], HPV coi nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9] Các nghiên cứu mối liên quan Epstein-Barr Virus (EBV) ung thư VMH cho thấy biểu kháng nguyên virus giai đoạn bệnh, vai trò quan trọng EBV bệnh học trình sàng lọc chẩn đoán điều trị, theo dõi tiên lượng bệnh [24] Papilloma virus (PV) thuộc họ Papillomaviridae, lưu hành phổ biến tự nhiên, gây bệnh chủ yếu cho lồi động vật có xương sống bậc cao như: người, ngựa, bị, chó, thỏ số lồi chim Đặc biệt, PV có đặc tính gây bệnh đặc hiệu lồi, HPV gây bệnh người mà không gây bệnh lồi khác [36] Đối với người, HPV thích ứng gây khối u da, miệng, thực quản, hầu, họng đường hậu môn - sinh dục Cấu trúc hệ gen HPV phân tử DNA sợi đôi (double strand DNA - dsDNA) hình vịng trịn khép kín, có độ dài khoảng 7900 cặp nucleotid, bao bọc phân tử protein histon, vùng gen HPV định vị sợi DNA Trong đó, L1 gen mã hố cho protein vỏ ngồi thành phần kháng nguyên bề mặt virus Gen E6 thuộc phân vùng gen thứ (vùng chép sớm) hệ gen HPV, tổng hợp protein E6 protein tương ứng, có vai trị quan trọng giúp cho nhân lên DNA virus, tham gia chế hình thành ung thư CTC Protein E6 HPV xâm nhập hệ gen tế bào, phong toả kìm hãm p53 cách bám vào p53, kích thích phân giải p53 nhờ enzym ubiquitin ligase [57] Hậu quả, tế bào tiếp tục phân chia, khơng có kiểm sốt phát triển thành khối u EBV loại virus nhiễm phổ biến cộng đồng gọi Herpes virus type 4, thuộc họ Herpesviridae [26] EBV gây bệnh người lây truyền qua đường tiêu hố, có đặc tính thích ứng tế bào Lympho B nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (IM), liên quan đến chế tiến triển số loại ung thư như: tăng sinh lympho B, ung thư biểu mô ung thư VMH ung thư dày Tuy nhiên, EBV có khả gây sơ nhiễm tồn lâu dài thể mà không gây bệnh Cấu trúc hệ gen EBV DNA sợi đơi xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172 kb, tính phần cấu trúc lặp hai đầu 184 kb, mã hoá cho protein virus Trong đó, gen EBNA-1 đoạn DNA nằm tổ hợp gen EBNA protein kháng nguyên, có vai trị thiết yếu q trình xâm nhập nhân lên trì tái tạo hệ gen virus, bên cạnh protein EBNA-1 cịn ngăn cản 3.2.3 giải trình tự thu nhận chuỗi gen EBNA-1 EBV Kết giải trình trình tự chuỗi gen EBNA-1 EBV thực máy ABI-3100 Avant Genetic Analyzer, biểu thị chương trình chuyên biệt, thể hình 3.11 A A BB CC D D Hình 3.11 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) phần trình tự gen EBNA-1 (Ghi chú: (A): EB17, (B): EB18, (C): EB19, (D): EB20) Hình 3.11 cho thấy, màu xác nhận loại nucleotide tương ứng, chứng tỏ chuỗi gen EBNA-1 EBV thu nhận có chất lượng tốt, giải trình trình tự hồn chỉnh khơng bị nhiễu q trình giải trình trình tự Bằng chương trình xử lí chuỗi trình tự nucleotide, chúng tơi thu chuỗi nucleotide gen EBNA-1, sử dụng làm chuỗi gen đích để truy cập Ngân hàng gen * 20 * 40 * 60 * GGGGCATTCAGATAGGAAGCCATTTTTCCACCCTGTAGGGGATGCCGATTATTTTGAATACCTCCAAGAAG SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > 80 * 100 * 120 * 140 GTGGCCCAGATGGTGAGCCTGACGTGCCCCCGGGAGCGATAGAGCAGGGCCCCACAGATGACCCAGGAGA SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > * 160 * 180 * 200 * GGCCCAAGCACTGGACCCCGGGGTCAGGGTGATGGAGGCAGGCGCAAAAAAGGAGGGTGGTTTGGAAAGC SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > 220 * 240 * 260 * 280 ATCGTGGTCAAGGAGGTTCCAACCCGAAATTTGAGAACATTGCAGAAGGTTTAAGAGTTCTCCTGGCTAG SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > * 300 * 320 * 340 * GAGTCACGTAGAAAGGACTACCGAGGAAGGAAATTGGGTCGCCGGTGTGTTCGTATATGGAGGTAGTAAG SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > 360 * 380 * 400 * 420 ACCTCCCTTTACAACCTCAGGCGAGGAATTGCCCTTGCTGTTCCACAATGTCGTATTACACCATTGAGTC SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > * 440 * 460 * 480 * GTCTCCCCTTTGGAATGGCCCCTGGACCCGGCCCACAACCTGGCCCACTAAGGGAGTCCATTGTCTGTTA SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > 500 * 520 * 540 * 560 TTTCATGGTCTTTTTACAAACTCATATATTTGCTGAGGTTTTGAAGGATGCGATTAAGGACCTTGTTAT SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > * 580 * 600 * 620 * GACAAAGCCCGCTCCTACCTGCAATATCAAGGTGACTGTGTGCAGCTTTGACGATGGAGTAGATTTGCCT SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > 640 * 660 * 680 * 700 CCCTGGTTTCCACCTATGGTGGAAGGGGCTGCCGCGGAGGGTGATGACGGAGATGACGGAGATGAAGGAG SEQUENCE OF EB17 EBNA1 > * 720 GTGATGGAGATGAAGGGTTGAGGAA //-SEQUENCE OF EB17 EBNA1 Hình 3.12 Kết chuỗi gen EBNA-1 EB17 thu nhận sau giải trình tự 3.2.4 Kết truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1 EBV Kết xác nhận trình tự nucleotide chuỗi gen EBNA-1 EBV thu nhận sử dụng chương trình Blast thơng qua truy cập Ngân hàng gen thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi nucleotide gen EBNA-1 EB17 Số đăng kí Chuỗi gen đích truy cập Tỉ lệ tương đồng AY961628.3 Human herpesvirus strain GD1, complete genome 99% V01555.2 Epstein-Barr virus (EBV) genome, strain B95-8 97% AJ507799.2 Human herpesvirus complete wild type genome 97% Chuỗi gen đích truy cập Tỉ lệ tương đồng M80517.1 Epstein-Barr virus, artifactual joining of B95-8 complete genome and the sequences from Raji of the large deletion found in B95-8 97% AY825078.1 Human herpesvirus EBNA-1 mRNA, partial cds 96% AJ507799.2 Human herpesvirus complete wild type genome 97% Số đăng kí Bảng 3.3 cho thấy trình tự chuỗi gen EBNA-1 EB17 thu nhận có tỉ lệ tương đồng cao (từ 97% đến 99%) so với gen EBNA-1 đăng kí Ngân hàng gen chủng EBV chủng EBV khác giới Các trình tự gen thu nhận gen EBNA-1 chủng EBV nghiên cứu Điều khẳng định toàn trình kĩ thuật, nhằm thu nhận gen EBNA-1 EBV, chúng tơi thực hồn toàn tin cậy sở cho việc xây dựng phương pháp chuẩn đoán nhanh kỹ thuật PCR 3.2.5 Kết xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin số 487 EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng chủng Việt Nam Thế giới Vị trí acid amin số 487 sử dụng để so sánh đối chiếu EBNA-1 mẫu EBV thu nhận từ bệnh nhân NPC nhập viện Hà Nội (EB17, EB18, EB19, EB20) số chủng Việt Nam thu nhận gần chủng HP6 (Hải Phòng); chủng EB9 (Hà Nội) đại diện bệnh nhân nhập viện miền Bắc chủng MT7 (Miền Trung) đại diện miền Trung Một số chủng quốc tế so sánh, đặc biệt chủng cổ điển B95-8 (1) B95-8 (2) sử dụng để phân biệt prototype; chủng C18, GD1 HHV (Trung Quốc) đại diện Nam Trung Quốc châu Á chủng AG876 (Ghana) đại diện EBV týp châu Phi (Hình 3.13) Kết so sánh trình bày Hình 3.13 cho thấy, vị trí số 487, chủng EBV Hà Nội chứa loại acid amin, V (valine), từ xác định thuộc phân týp: V-val (Variant valine) Kết xác định phân týp 13 chủng, bao gồm chủng nghiên cứu chủng tham chiếu Việt Nam giới liệt kê Bảng 3.4 Bảng 3.4 cho thấy chi tiết, mẫu nghiên cứu thuộc V-val (EB17, EB18, EB19, EB20); mẫu EB9 (Hà Nội) thuộc V-val; mẫu Miền trung thuộc P-thr (MT7); mẫu Hải Phòng thuộc mẫu P-ala (HP6); mẫu đại diện Nam Trung Quốc: mẫu C18 thuộc P-thr, GD1 thuộc V-val mẫu HHV thuộc P-ala; chủng cổ điển B95-8 (1) B95-8 (2) thuộc P-ala; chủng AG876 (Ghana) đại diện EBV týp thuộc V-leu aa 487 * 20 * 40 * 60 * 80 * 100 EB17-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 EB18-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 EB19-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 EB20-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 EB9EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 MT7-EBNA1 : PFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDMPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNQKFENIAEGLRTLLARCHVERTTDEGTWVAGVF : 105 HP6-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGHGGSNQKFENIAEGIKALLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 AG 876-EBN : PFFHPVAEADYFEYHQEGGPDGEPDMPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWYGKHRGEGGSSQKFENIAEGLRLLLARCHVERTTEDGNWVAGVF : 105 B95-8(1)-E : PFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF : 105 B958(2)-E : PFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF : 105 HHV-EBNA1 : PFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF : 105 GD1-EBNA1 : PFFHPVGDADYFEYLQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPTDDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRVLLARSHVERTTEEGNWVAGVF : 105 C18-EBNA1 : PVGQADYFEYHQEGGPDGEPDMPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNQKFENIADGLRTLLARCHVERTTDEGTWVAGVF : 101 Hình 3.13 So sánh phần trình tự acid amin EBNA-1 13 chủng nghiên cứu, gồm chủng nghiên cứu EB17; EB18; EB 19; EB20; chủng EB9 Hà Nội, chủng MT7 miền trung chủng HP6 Hải Phòng biến thể chủng cổ điển B95-8; chủng AG876 chủng Trung Quốc (HHV, GD1 C18) Vị trí aa 487 dẫn mũi tên; aa vị trí số 487 chủng EBV so sánh đóng khung dọc.` Bảng 3.4 Kết xác định phân týp chủng EBV qua phân tích acid amin vị trí số 487 EBNA-1 TT Chủng EB17- EBNA-1 Năm phân lập aa 487 Kết xác định phân týp 2000 V V-val EB18- EBNA-1 2000 V V-val EB19- EBNA-1 2000 V V-val EB20- EBNA-1 2000 V V-val EB9- EBNA-1 2000 V V-val MT7- EBNA-1 2009 T P-thr HP6- EBNA-1 2009 A P-ala AG876- EBNA-1 2007 L V-leu B95-8 (1)-EBNA-1 2006 A P-ala 10 B95-8 (2)-EBNA-1 1996 A P-ala 11 HHV- EBNA-1 2006 A P-ala 12 GD1- EBNA-1 2005 V V-val 13 C18 – EBNA-1 2004 T P-thr Kết xác định acid amin vị trí aa số 487 chủng EBV Hà Nội cho thấy thuộc phân týp V-val; mẫu phân lập năm 2000 Theo nghiên cứu tác giả Lê Thanh Hòa cs (2010), có phân tích 22 mẫu nghiên cứu thu thập năm 2000 gần (2008-2009), 14 mẫu có phân týp V-val; tất mẫu năm 2000 thuộc phân týp V-val [10] Như nay, chưa phát phân týp khác V-val mẫu NPC thu nhận trước năm 2000 Một điều lưu ý EBV có đặc tính đa hình biến đổi chủng phân lập vùng địa lý thuộc Nam Đông Nam châu Á [68] nghiên cứu Mai et al [43], [44] chứng minh chủng EBV thuộc V-val vùng Nam Trung Quốc, có khả tăng cường chép có vai trị quan trọng tiến triển NPC Xác định phân týp (V-val) số mẫu EBV nghiên cứu (EB17, EB18, EB19, EB20) so sánh (EB9) Hà Nội, giúp khẳng định mẫu nghiên cứu năm 2000 thuộc V-val, mẫu MT7, HP6 năm 2009 xuất thuộc P-ala P-thr chủng so sánh khác giới thuộc V-leu, P-ala P-thr Tuy số mẫu chưa nhiều, nghiên cứu cho thấy EBV Việt Nam, mặt dịch tễ học, có bị ảnh hưởng vệt dịch tễ EBV từ Quảng Đông - Nam Trung Quốc tới Đông Nam châu Á Thảo luận chung - Với kết thu được, sở trình tự nucleotide acid amin HPV-16 HPV-18 nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC mẫu bệnh phẩm làm đối tượng nghiên cứu thu nhận tại Hà Nội Mối liên quan loại/týp HPV-16 HPV-18 xác định bệnh ung thư CTC số bệnh nhân Hà Nội, bước đầu tìm hiểu xác ngun nhân gây bệnh bệnh nhân phụ nữ Trên sở bước đầu phát HPV-16/HPV-18 phương pháp đa mồi multiplex-PCR xây dựng phương pháp chẩn đoán phân tử dựa phản ứng PCR nhằm hỗ trợ phương pháp chẩn đốn tế bào mơ bệnh học - Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử chủng EBV Việt Nam thu nhận liệu từ gen EBNA-1 (gen gây ung thư giai đoạn sớm) báo cáo phân tích sản phẩm có ý nghĩa quốc gia quốc tế, đặc biệt virus EBV vùng châu Á có xu hướng gây sơ nhiễm, nhiễm tiềm tàng, tái hoạt gây tiến triển NPC Các trình tự gen chúng tơi thu nhận gen EBNA-1 của chủng EBV nghiên cứu Điều khẳng định toàn trình kĩ thuật, nhằm thu nhận gen EBNA-1 EBV, thực hoàn toàn tin cậy Xác định phân týp (V-val) số mẫu EBV nghiên cứu (EB17, EB18, EB19, EB20) so sánh (EB9) Hà Nội, giúp khẳng định mẫu nghiên cứu năm 2000 thuộc V-val, mẫu MT7, HP6 năm 2009 xuất thuộc P-ala P-thr chủng so sánh khác giới thuộc V-leu, P-ala P-thr Tuy số mẫu chưa nhiều, nghiên cứu cho thấy EBV Việt Nam, mặt dịch tễ học, có bị ảnh hưởng vệt dịch tễ EBV từ Quảng Đông - Nam Trung Quốc tới Đông Nam châu Á sở cho việc xây dựng phương pháp chuẩn đoán nhanh kỹ thuật PCR KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết phân tích bàn luận trên, chúng tơi rút số kết luận sau: Trình tự gen E6 có kích thước 321 bp, gen L1 có kích thước 556 bp, số mẫu nghiên cứu PK10, PK11, PK12, PS16 thu nhận phân tích Kết thực phản ứng Multiplex-PCR mẫu HPV nghiên cứu mẫu song nhiễm hai týp HPV-16 HPV-18 Thực thành công phản ứng Multiplex-PCR phát HPV16/HPV18 11 mẫu nghiên cứu Trình tự gen EBNA-1 mẫu EB17, EB18, EB19, EB20 có kích thước khoảng 800 bp phân lập tại Hà Nội thu nhận phân tích Xác định phân týp (V-val) số mẫu EBV (EB17, EB18, EB19, EB20) so sánh (EB9) Hà Nội, giúp khẳng định mẫu nghiên cứu năm 2000 thuộc V-val, mẫu MT7, HP6 năm 2009 xuất thuộc P-ala P-thr chủng so sánh khác giới thuộc V-leu, P-ala P-thr KIẾN NGHỊ Tiếp tục thu nhận, giải trình tự mẫu bệnh phẩm bệnh nhân EBV HPV nhằm thu liệu sinh học phân tử gen EBNA-1 chủng EBV hai gen E6 chủng HPV-16 L1 chủng HPV-18, làm sở cho chẩn đoán, giám định phân loại xây dựng phương pháp chuẩn đoán nhanh mẫu bệnh phẩm chủng EBV HPV TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phạm Thị Hoàng Anh, Nguyễn Mạnh Quốc, Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Chấn Hùng (2001), “Tình hình bệnh ung thư Việt Nam năm 2000”, Tạp chí thơng tin Y dược 2/2001, Bộ Y tế - Viện thông tin Y học Trung ương, tr 3- 11 Bộ môn Vi Sinh (2001), Vi Sinh Y học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 386 Trịnh Quang Diện (1995), Phát dị sản, loạn sản ung thư cổ tử cung phương phát tế bào học, Luận án Tiến sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Trịnh Quang Diện (2002), Theo dõi tế bào học mô bệnh học tế bào bào vẩy không điển hình ý nghĩa chưa xác định (ASCUS) gặp phát tế học tổn thương nội biểu mô ung thư cổ tử cung, Chuyên đề ung thư học, Y học thực hành, Nhà xuất Y học, số 431, tr 266- 269 Đào Trung Dũng (2003), Chẩn đoán tế bào học ASCUS phát sớm ung thư cổ tử cung, Luận văn Bác sỹ Y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội Phan Trường Duyệt, Đinh Thế Mỹ (2003), Lâm sàng sản phụ khoa, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 444- 448 Nguyễn Văn Đô, Phan Thị Phi Phi (2003), Xác định đột biến đoạn 30bp đột biến điểm gen EBV-LMP bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Việt Nam, Hội nghị sinh học phân tử hoá sinh toàn quốc, tr 129-134 Phạm Thị Hồng Hà (2000), Giá trị phiến đồ âm đạo - cổ tử cung, soi cổ tử cung mô bệnh học việc phát sớm ung thư cổ tử cung, Luận văn Thạc sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Lê Thanh Hoà (2006), Y - Sinh học phân tử, Quyển I, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr 64- 85 10 Lê Thanh Hòa, Vũ Thị Tiến, Hoàng Thị Minh Châu, Lê Thanh Hà, Nguyễn Đình Phúc (2010), Xác định phân typP-ala, P-thr V-val EBNA-1 EBV phân lập Việt Nam, Tạp chí Nghiên cứu Y học 70(5), tr 8-12 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 Vương Tiến Hoà (2004), Một số vấn đề bệnh lý cổ tử cung, Nhà xuất Y học, Hà Nội 12 Trần Phương Mai (1999), Nhận xét 89 trường hợp ung thư cổ tử cung Viện BVBM TSS năm (1992- 1997), Tạp chí Y học thực hành số 1/1999, tr 37- 39 13 Phan Thị Phi Phi (2005), Báo cáo tổng quan đặc điểm sinh học chủ yếu gặp bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Việt Nam số ứng dụng lâm sàng Hội thảo chuyên đề ung thư vòm mũi họng, Hà Nội (07-09.11.2005) 14 Nguyễn Đình Phúc (2006), “Nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng gen virus Epstein – Barr ung thư vòm mũi họng’’, Luận án TS khoa học Y học – ĐHYHN 15 Nguyễn Quốc Trực, Lê Văn Xuân (2000), Chẩn đoán điều trị thương tổn tiền ung thư cổ tử cung, Tạp chí thơng tin Y - Dược 8/2000, Viện thơng tin Y học Trung ương, tr 220- 224 Tiếng Anh 16 Apt D, Watts RM, Suske G, U Bernard U (1996), “High Sp1/Sp3 ratios in epithelial cells during epithelial differentiation and cellular transcription correlate with the activation of the HPV-16 promoter”, Virology, 224, pp 281– 291 17 Bosch F, Manos MM, Munoz N, Sherman M, Jansen AM, Peto J, Schiffman M H, Moreno V, Kurman R, Shah KV, International Biological Study on Cervical Cancer (IBSCC) Study Group (1995), “Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective”,J Natl Cancer Inst, 87, pp 796–802 18 Bosch FX, Munoz N (2002), “The viral etiology of cervical cancer”, Virus Res 89, pp 183-190 19 Bosch FX, Lorincz A, Munoz N, Meijer CJ, Shah KV (2002), “The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer”, J Clin Pathol 55, pp 244-265 20 Chan AT, Teo PM, Huang DP (2004), Pathogenesis and treatment of nasopharyngeal carcinoma Semin Oncology, 31(6), pp 794-801 21 Chan SY, Bernard HU, Ratterree M, Birkebak TA, Faras AJ, Ostrow RS (1997), “Genomic diversity and evolution of papillomaviruses in rhesus monkeys”, J Virol 71, pp 4938- 4943 22 Chan SY, Delius H, Halpern AL, Bernard HU (1995), “Analysis of genomic sequences of 95 papillomavirus types: uniting typing, phylogeny, and taxonomy”, J Virol 69, pp 3074-3083 23 Chang ET, Adami HO, (2006), The enigmatic epidemiology of nasopharyngeal carcinoma Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 15(10), pp 176577, Review 24 Chou J, Lin YC, Kim J, You L, Xu Z, He B, Jablons DM (2008), Nasopharyngeal carcinoma-Review of the molecular mechanisms of tumorigenesis Head Neck 2008 Apr 29 25 Clifford GM, Smith JS, Plummer M, Munoz N, Franceschi S (2003), Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a metaanalysis, Br J Cancer 88, pp 63-73 26 Cohen JI (2006), Virology and molecular biology of Epstein-Barr virus In “Epstein-Barr Virus”, Edited by Tselis A and Jenson HB.Taylor and Francis Group LLC, New York NY, pp 21-37 27 Denny L, Ngan HYS (2006), Malignant manifes-tations of HPV infection: Carcinoma of the cervix, vulva, vagina, anus, and penis International Journal of Gynecology and Obstetrics 2006; 94(Suppl 1), pp S50–S55 28 Epstein MA, Barr YM, Achong BG (1964), Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt’s lymphoma, Lancet 15, pp 702-703 29 Gulley ML (2001), Molecular Diagnosis of Epstein-Barr Virus-Related Diseases, J Mol Diag 3(1), pp 1-10 30 Guo XC, Scott K, Liu Y, Dean M, David V, Nelson GW, Johnson RC, Dilks HH, Lautenberger J, Kessing B, Martenson J, Guan L, Sun S, Deng H, Zheng Y, de The G, Liao J, Zeng Y, O'Brien SJ, Winkler CA (2006), Genetic factors leading to chronic Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma in South East China: study design, methods and feasibility, Hum Genomics, 2(6), pp 365-75 31 Hiraki A, Fujii N, Masuda K, Ikeda K, Tanimoto M, (2001), Genetics of Epstein-Barr virus infection, Biomed Pharmacother 55(7), pp 369-72, Review 32 Howley PM (1995), “Papillomavirinae: The Viruses and Their Replication”, In Fields Virology Lippincott-Raven, Philadelphia, pp 2045-2076 33 Ke X, Yang YC, Hong SL, (2010), EBV-LMP1-targeted DNAzyme restrains nasopharyngeal carcinoma growth in a mouse C666-1 xenograft model PMID: 20862567, Abstract 34 Klein U, Klein G, Ehlin-Henriksson B, Rajewsky K, Kuppers R (1995), Burkitt’s lymphoma is a malignancy of mature B cells expressing somatically multated V-region genes, Mol, Med, 1, pp 495-505 35 Kumar S, Tamura K, Jakobsen IB & Nei M (2001), “MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software”, Arizona State University, Tempe, Arizona, USA 36 Laderman EI, Whitworth E, Dumaual E, Jones M, Hudak A, Hogrefe W, Carney J, Groen J (2008), Rapid, sensitive, and specific lateral-flow immunochromatographic point-of-care device for detection of herpes simplex virus type 2-specific immunoglobulin G antibodies in serum and whole blood Clin Vaccine Immunol, 15(1), pp 159-63 37 Lee YC, Hwang YC, Chen KC, Lin YS, Huang DY, Huang TW, Kao CY, Wu HC, Lin CT, Huang CY, (2007), Effect of Epstein-Barr virus infection on global gene expression in nasopharyngeal carcinoma, Funct Integr Genomics, 7(1), pp 79-93 38 Lin JC, Cherng JM, Lin HJ, Tsang CW, Liu YX, Lee SP, (2004), Amino acid changes in functional domains of latent membrane protein of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma of southern China and Taiwan: prevalence of an HLA A2-restricted 'epitope-loss variant', J Gen Virol 85(7), pp 2023-34 39 Lin JC, Wang WY, Liang WM, Chou HY, Jan JS, Jiang RS, Wang JY, Twu CW, Liang KL, Chao J, Shen WC, (2007), Long-term prognostic effects of plasma epstein-barr virus DNA by minor groove binder-probe real-time quantitative PCR on nasopharyngeal carcinoma patients receiving concurrent chemoradiotherapy, Int J Radiat Oncol Biol Phys, 68(5), pp 1342-8 40 Liu JP, Cassar L, Pinto A, Li H, (2006), Mechanisms of cell immortalization mediated by EB viral activation of telomerase in nasopharyngeal carcinoma Cell Res, 16(10), pp 809-17, Review 41 Lo KW, Huang DP (2002), Genetic and epigenetic changes in nasopharyngeal carcinoma, Semin Cancer Biol, 12(6), pp 451-62, Review 42 Lowy DR, Kirnbauer R, Schiller JT (1994), Genital human papillomavirus infection, Proc Natl Acad Sci USA 91, pp 2436-2440 43 Mai SJ, Ooka T, Li DJ, Zeng MS, Jiang RC, Ju XJ, Zhang RH, Chen SP, Zeng YX (2007), Functional advantage of NPC-related V-val subtype of Epstein-Barr virus nuclear antigen compared with prototype in epithelial cell line, Oncology Reports, 17, pp 141-146 44 Mai SJ, Xie D, Huang YF, Wang FW, Liao YJ, Deng HX, Liu WJ, Hua WF, Zeng YX (2010), The enhanced transcriptional activity of the V-val subtype of Epstein-Barr virus nuclear antigen in epithelial cell lines, Oncol Rep 23(5), pp 1417-24 45 McDermott AL, Dutt SN, Watkinson JC, (2001), The aetiology of nasopharyngeal carcinoma, Clin Otolaryngol Allied Sci, 26(2), pp 82-92, Review 46 Middeldorp JM, Brink AA, van den Brule AJ, Meijer CJ (2003), Pathogenic roles for Epstein-Barr virus (EBV) gene products in EBV-associated proliferative disorders, Crit Rev Oncol Hematol 4(1), pp 1-36 47 Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV, nijders PJ, Meijer CJ (2003), Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer, N Engl J Med, 348 (6), pp 518-27 48 Murray PG, Young LS, (2001), Epstein-Barr virus infection: basis of malignancy and potential for therapy, Expert Rev Mol Med, 3(28), pp 1-20 49 Philip JD (1994), “Disorders of the Uterine Cervix”, Danforth’s Obst and Gyn, 7th editions, JB lippincott company, Philadelphia, 48, pp 893- 926 50 Richartd RM (1997), “ Cervical cancer precursors and their management”, Te Linde's operative Gyn, 8th edition, Lippincotte- Raven, Philadelphia, New York, chapter 48, pp 1385-1409 51 Sapp M, Volpers C, Muller M, Streck RE (1995), “Organization of the major and minor capsid proteins in human papillomavirus type 33virus-like particles”, J Gen Virol 76, pp 2407–2412 52 Smith JS, Lindsay L, Hoots B, Keys J, Franceschi S, Winer R, Clifford GM, (2007), Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical lesions: a meta-analysis update, Department of Epidemiology, University of North Carolina-Chapel Hill, Chapel Hill, NC 27599-7435, USA 53 Spano JP, Busson P, Atlan D, Bourhis J, Pignon JP, Esteban C, Armand JP (2003), Nasopharyngeal carcinomas: an update, Eur J Cancer 39(15):212135 Review 54 Steller M (2002), “Cervical cancer vaccines: progress and prospects”, J Soc Gynecol Investig 9, pp 254 55 Syrjaanen SM, Syrjaaanen KJ (1999), “New concepts on the role of human papillomavirus in cell cycle regulation”, Ann, Med, 31, pp 175–187 56 Tao Q, Chan AT (2007), Nasopharyngeal carcinoma: molecular pathogenesis and therapeutic developments, Expert Rev Mol Med 9(12), pp 1-24 Review 57 Thomas M, Pim D, Banks L (1999), “The role of the E6-p53 interaction in the molecular pathogenesis of HPV”, Oncogene 18, pp 7690–7000 58 Thompson MP, Kurzrock R (2004), Epstein–Barr virus and cancer, Clin Cancer Res 10(3), pp 803–21 59 Torrisi A, Del Mistro A, Onnis GL, Merlin F, Bertorelle R, Minucci D (2000), “Colposcopy, cytology and HPV testing in HIV-positive and HIVnegative women”, Eur J Gynecol Oncol, 21, pp 168–172 60 Tselis A, Jenson HB (2006), Epstein-Barr Virus Taylor and Francis Group LLC, New York NY, pp 446 61 Volpers C, Streek RE (1991), “Genome organization and nucleotide sequence of human papillomavirus type 39”, Virology, 181, pp 419–423 62 Walboomers JMM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah K V, Snijders PJF, Peto J, Meijer CJLM, Munoz N (1999), “Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervicalcancer worldwide”, J Pathol, 189, pp 12–19 63 WHO/IVB/10.05, (2009), Report of the meeting on HPV Vaccine Coverage and Impact Monitoring, 16-17 November 2009, Geneva, Switzerland 64 WHO/RHR/08.14, (2007), Cervical cancer, human papillomavirus (HPV), and HPV vaccines 65 Wilkinson EJ (1990), “Pap Smear and screening for cervical neoplasia”, Clinical Obstrict and Gynecologie, 33(4), pp 817- 825 66 Young LS, Rickinson AB (2004), Epstein-Barr virus: 40 years on Nature Review 4, pp 757-768 67 Zeng MS, Li DJ, Liu QL, Song LB, Li MZ, Zhang RH, Yu XJ, Wang HM, Ernberg I, Zeng YX (2005), Genomic sequence analysis of Epstein-Barr virus strain GD1 from a nasopharyngeal carcinoma patient, J Virol, 79(24), pp 1532315330 68 Zhao C, Wang Y, Liu X, Xing X, Cui Y, Luo B (2010), Variations of Epstein-Barr virus nuclear antigen gene in gastric carcinomas and nasopharyngeal carcinomas from Northern China, Virus Res 147(2), pp 25864 69 Zhong BL, Zong YS, Lin SX, Zhang M, Liang YJ, (2006), Epstein-Barr virus infection in precursor lesions of nasopharyngeal carcinoma, Ai Zheng, 25(2),pp 136-142 70 Zhou X.B., Guo M., Quan L.P., Zhang W., Lu Z.M., Wang Q.H., Ke Y and Xu N.Z (2003), Detection of human papillomavirus in Chinese esophageal squamous cell carcinoma and its adjacent normal epithelium, World J Gastroenterol 9(6), pp 1170-1173 71 Zur Hausen H (1996), “Papillomavirus infections - a major cause of human cancers”, Biochim, Biophys, Acta, 1288, pp 55–78 72 Zur Hausen H (1999), “Papillomaviruses in human cancers”, Proc, Assoc, Am Physicians 111, pp 581–587 ... .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 1. 1 .1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung 1. 1 .1. 1 Trên giới .4 1. 1 .1. 2 Tình hình ung thư cổ. .. Virus (EBV) , tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xác định trình tự gen E6 L1 HPV gen EBNA- 1 EBV để ứng dụng chuẩn đoán ung thư cổ tử cung vòm mũi họng? ?? với mục tiêu nghiên cứu: Thu nhận chuỗi gen E6 HPV- 16 ... pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung Việt Nam 21 1.2 UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) .22 1. 2 .1 tễ học ung thư vòm mũi họng 22 1. 2 .1. 1 Tình hình