LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) nghiên cứu môi trường tái sinh của một số giống ngô (zea mays l ) phục vụ chuyển gen

i LỜI CAM ĐOAN học sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu luận văn Thái Nguyên, ngày 13 tháng 09 năm Tác giả luận văn ii LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, khoa Khoa học sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên người tận tình hướng dẫn, bảo, dìu dắt giúp đỡ tơi suốt thời gian thực hoàn thành luận văn Tôi xi - - thu , nghiên cứu , ngày 13 tháng 09 năm Tác giả luận văn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU Ý nghĩa khoa học Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược ngô 1.1.2 Giá trị kinh tế ngô 1.1.3 Tình hình sản xuất ngơ giới Việt Nam 10 1.2.1 Nghiên cứu tái sinh ngô giới .10 1.2.2 Nghiên cứu tái sinh ngô Việt Nam 14 1.3.Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thành phần môi trường đến khả tạo mô sẹo tái sinh ngô 14 1.3.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng 14 thành phần môi trường 17 1.3.3 in vitro 19 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 21 2.2 Hóa chất thiết bị 21 2.3 Phạm vi nghiên cứu 22 2.4 Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu 22 2.5 Phương pháp nghiên cứu 22 2.5.1 Tái sinh trực tiếp từ phôi non 23 2.5.2 Tạo mô sẹo từ phôi thân non 24 2.5.3 Nghiên cứu khả tái sinh từ mô sẹo 26 2.5.4 Nghiên cứu điều kiện đưa in vitro ngồi mơi trường 26 2.6 Xử lý số liệu 27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Tái sinh trực tiếp từ phôi non 28 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng tuổi phôi đến khả tái sinh trực tiếp từ phôi non 28 30 non 35 non 36 2,4-D đến khả tạo mô sẹo từ phôi non 38 -proline đến khả tạo mô sẹo từ phôi non 41 đến khả tạo mô sẹo từ phôi non 44 2,4-D .48 3.4 Nghiên cứu phôi non 51 kiện đưa in vitro ngồi mơi trường 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 I Kết luận 55 II Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC .63 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ BAP – benzylaminopurine đtg IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid MS Murashige & Skoog, 1962 NAA - naphthaleneacetic acid Nxb N6 Chu et al., 1975 2,4-D 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình sản xuất ngơ số khu vực giới giai đoạn 2009 - 2011 .7 Bảng 1.2 Tình hình sản xuất ngơ Việt Nam từ 1975 - 2012 21 28 Bảng 3.2 từ phôi 32 34 LVN 25, LVL 61, LVN 66, LVN 99, 36 hưởng 2,4-D 39 Bảng 3.6 - 43 Bảng 3.7 Ảnh hưởng AgNO3 45 vii 48 51 in vitro sau .54 10 DANH MỤC CÁC HÌNH 3.1 ổi phôi đế từ phôi non 885 29 3.2 đế từ phôi non LVN 885 32 35 3.4 885 37 2,4-D 40 3.6 Mô 885 - 41 - 44 (+++) (++) triển (+) , rễ khỏe , rễ phát , rễ phát triển i si n h 60 55.56 50 40 LVN 25 LVN 61 LVN 66 LVN 99 LVN 885 30 20 10 0,5 Mô sẹo 1,5 2,5 ngBAP (mg/l) môi trường tái sinh , hình thành rễ , sau biệt hóa tạo chồi Trên (11,11 môi trường BAP LVN 99 hành dịng ngơ CML-161; CML-323; CML-327 tỷ 35,66% - 42,49% [42] sucrose 60 g/l, NAA mg/l, agra 7,5 g/l, hydrolyzed casein 100 mg/l, BAP 885 y b) c) 885 Hình kiện đưa in vitro ngồi mơi trường 3.10 Bảng 3.10 in vitro Tỷ Chiều cao (%) (1:1) (cm) 75,56 6,48 11,74 1,06 1,73 0,23 +++ 55,56 7,86 8,74 0,86 1,39 0,11 ++ 31,11 9,56 6,67 0,42 1,17 0,12 ++ (Ghi chú: Cây tốt: +++, Cây trung bình: ++, Cây kém: +) 75,56% Giá thể cát cát + trấu hun (1:1) sống cao, đồng thời xanh tốt Giá thể cát nguồn bệnh lại k , ngô in vitro giá thể đất mùn phù hợp để KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I Kết luận : hôi non 7,5 g/l, hydrolyzed casein 100 mg/l, 40 g/l bổ sung agar 7,5 g/l, hydrolyzed casein 100 mg/l, sucrose 30 g/l , 2,4-D 1,0 mg/l, L-prolin 2,5 g/l, AgNO3 mg/l non hydrolyzed casein 100 mg/l, 2,4-D mg/l môi trường MS bổ sung sucrose 60 g/l , agar 7,5 g/l, hydrolyzed casein 100 mg/l, BAP mg/l, NAA mg/l ngô in vitro II Đề nghị Nghiên cứu chi tiết hệ thống tái sinh cây, đặc biệt việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng số chất phụ gia vào môi trường nuôi cấy phục vụ chuyển gen TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1998), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tr 5-65 Đường Hồng Dật (2004), Cây ngô: kỹ thuật thâm canh tăng suất, Nxb Lao động - Xã hội Trần Đình Đạt (2006), Cơng Nghệ sinh học, Công nghệ di truyền, tập 4, Nxb Giáo dục Nguyễn Văn Đồng, Đinh Văn Trình, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Thu Về, Nguyễn Văn Toàn (2009), “Nghiên cứu chuyển gen nguyên ngô”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 7(2), tr 221-227 Lê Huy Hàm (2003), “Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất dịng ngơ kỹ thuật ni cấy bao phấn”, Báo cáo khoa học toàn quốc, tr 754-760 (2000), (1995), , Nxb , Nxb N Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình chất điều hịa sinh trưởng thực vật, Nxb Giáo dục Dương Công Kiên (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nxb 10 , Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2002), Giáo trình lương thực (dành cho cao học), Nxb Nông nghiệp 11 Chu Hoàng Mậu, Phạm Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2007), “Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro phục vụ chọn dòng chịu hạn chuyển gen ngô (Zea mays L.) địa phương miền núi”, - Ngun, 43(3), tr 110- 115 12 Ngơ Hữu Tình (2003), Cây ngơ, Nxb Nghệ An 13 Ngơ Hữu Tình (2003), “Chọn tạo dịng ngơ kỹ thuật ni cấy bao phấn”, Báo cáo khoa học toàn quốc, tr 862-865 14 Phạm Thị Lý Thu, Phạm Văn Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2005), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen ngô”, Thông tin công nghệ sinh học, 3, tr 27-35 15 Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội 16 Đỗ Năng Vịnh, Ngơ Xn Bình (2008), Giáo trình công nghệ sinh học đại cương, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 17 Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Giáo dục Hà Nội 18 Vũ Văn Vụ (1997), Sinh lí thực vật, Nxb Giáo dục Hà Nội, tr 134-148 II Tài liệu tiếng Anh 19 Alabed, Madasamy, Talla, Goldman, Rudrabhatla (2007), “Genetic engineering of maize with the Arabidopsis DREB1A/CBF gene using split - seed explants”, Crop Science Society, 47(6), pp 2390-2402 20 Armstrong C.L., Green C.E., (1985), “Establishment and maintenance of friable embryogenic maize callus and the involvement of L-proline”, Planta, 164(2), pp 207-214 21 Armstrong C.L., Green C.E., Phillips R.L (1991), “Development and availability of germplasm with high Type II culture formation response”, Maize Genet Coop Newsl, 65, pp 92-93 22 Bar , Obert B., Kovacs G (1999), “Colchicine, an efficient genome - douling agent for maize (Zea mays L.) microspore cultured in vitro”, Plant Cell Reprod, 18, pp 858-962 23 Binott J.J., Songa J., Ininda J., Njagi E.N., Machuka J (2005), “Plant regeneration from immature embryos of Kenyan maize inbred lines and their respective single cross hybrids though somatic embryogenesis”, Afri Crop Sci Conf Prod, 7, pp.1305-1310 24 Cheng M., Lowe B.A., Spencer T.M., Armstrong C.L (2004), “Factors influencing Agrobacterium - mediated transformation of monocotyledonous species in vitro”, Cell and Developmental Biology Plant, 40(1), pp 31-45 25 Cho M.J., Jiang W., Lemaux P.G (1998), “Transformation of recalcitrant barley cultivars through improvement of regenerability and decreased albinism”, Plant Sc 138, pp 229-244 26 Das U.S., Hadiuzzaman S and Sarker R.H (2001), “Somatic embryogenesis and regeneration of plantlet from immature embryos of maize (Zea mays L.)”, Plant Tissue Culture 11, pp 65-75 27 Frame B.R., Mcmurray J.M., Fonger T.M., Main M.L., Taylor K.Ư., Torney F.J., Wang K (2006), “Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts”, Plant Cell Reports, Genetic Transformation and Hybridization, 25(4), pp 1024-1034 28 Frame B.R., Shou H., Chickwamba R.H., Zhang Z., Xiang C., Fonger T.M., Pegg S.E.K., Li B., Nettleton D.S., Pei D., Wang K (2002), “Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of maize embryos using a standard binary vector system breakthrough technologies”, Plant Physiology, 129(1), p 13-22 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 29 Frame B.R., Main M., Schick R., Wang K (2011), “Genetic transformation using maize immature zygotic embryos, Plant embryo culture: methods and protocols, methods in Molecular Biology” New York: Springer Science, 710, pp 327-341 30 Garcial M.D., Molina M.D.C (1988), “In vitro culture of immature embryos”, Maize Newsletter, 62, pp 75 - 76 31 Gorji A.H., Zolnoori M., Jamasbi A., Zolnoori Z (2011), “In vitro plant generation of tropical maize genotypes”, International Proceedings of Chemical, Biological and Environmental Engineering, 16, pp 52-59 32 Green C.E., Phillips R (1975), “Plant regeneration from tissue cultures of maize”, Crop Science, 15(3), pp 417-421 33 Hassan L., Ahmad S.D and Okumus A (2001), “The direct regeneration of maize haploids through anther culture”, On Line Journal of Biological Sciences, 1(10), pp 900-901 34 Huang X.Q., Wei Z.L (2004), “High - Frequency plant regeneration through callus initiation from mature embryos of maize (Zea Mays L.)”, Plant Cell Rep, 22(11), pp 793-800 35 Huang X.Q, Wei Z.M (2005), “Successful Agrobacterium - mediated genetic transformation of maize elite inbred lines”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 83(2), pp 187-200 36 Lee B.L., Kennon A.R., Chen X., Jung T.W., Ahn B.O., Lee J.Y., Zhang Z.J (2007), “Recovery of transgenic events from two highly recalcitrant maize (Zea mays L.) genotypes using Agrobacterium - mediated standart - binary - vector transformation”, Maydica, 52(4), pp 457-469 37 Lu C., Vasil V., Vasil I.K (1983), “Improved efficiency of somatic embryogenesis and plant regeneration in tissue cultures of maize (Zea mays L.)”, Theor Appl Genet, 66, pp 285-289 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 38 Naqvia S., Zhua C., Farrea G., Ramessara K., Basiea L., Breitenbachb J., Conesac D P., Rcsc G., Sandmannb G., Capella T., Christoua P (2009), “Transgenic multivitamin corn thorough biofortification of endosperm with three vitamins representing three distinct metabolic pathways”, Pnas, 106(19), pp 7762-776 39 Ombori O., Gitonga N.M., Machuka J (2008), “Somatic embryogenesis and plant regeneration immature embryos of tropical maize (Zea mays L.) Inbred Lines”, Biotechnol, 7(2), pp 224-232 40 Simth R.H (1992), Plant Tissue Culture, Department of soil and crop science 41 Sharma V K., Hasch R., Mendel R.R., Schulze J (2005), “Mature embryo axis-based high frequency somatic embryogenesis and plant regeneration from multiple cultivars of barley (Hordeum vulgare L.)”, Journal of Experimental Botany, 56(417), pp 1913-1922 42 Shohael A.M., Akanda M.A.L., Parves S., Mahfuja S., Alam M.F., Islam R., Joarder N (2003), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryo derived callus of inbred maize (Zea mays L.)”, Biotechnol, 2(2), pp 154-161 43 Shou H., Frame B.R., Whitham S.A., Wang K (2004), “Assessment of transgenic maize events produced by particle bombardment or Agrobacterium - mediated transformation”, Molecular Breeding, 13(2), pp 201-208 44 Sidorov V., Gilbertson L., Addae P., Duncan D (2006), “Agrobacterium - mediated transformation of seedling - derived maize callus”, Plant Cell Rep, 25, pp 320-328 45 Songstad D.D., Duncan D.R and Widholm (1988), “Effect of aminocycopropane - - carboxilic acid silver nitrate and norbornadiene on plant regeneration from maize callus cultures”, Plant Cell Rep, 7(4), pp 262-265 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 Songstad, D D., Petersen, W L., Armstrong, C L (1992), “Establishment of friable embryogenic (type II) callus from immature tassels of Zea mays.L (Poaceae)”, American Journal of Botany, 76(7), pp 761-764 47 Vain P., Yean H., Flament P (1989), “Enhancement of production and regeneration of embryogenic type II callus in Zea mays L by AgN03”, Plant Cell Tiss Org, 18, pp: 143-15 48 Vasil I.K (2005), “Tissue cultures of maize”, Maydica, 50, pp 361365 49 Vasil V., Vasil I.K (1986) “Plant regeneration from friable embryogenic callus and cell suspension cultures of Zea mays L.”, Plant Physiol, 124, pp 399-408 50 Vega J M., YU W., Kennon A., Chen X., Zhang Z J (2008), “Improvement of Agrobacterium-mediated transformation in Hi-II maize (Zea mays) using standard binary vectors”, Plant Cell Reports, 27(2), pp 297-305 51 Wang Y., Fu S., Wen Y., Zhang Z., Xia Y., Liu Y., Rong T., Pan G (2007), “Selection of maize inbred lines with high regeneration and susceptibility to Agrobacterium tumefaciens”, Journal of Genetics and Genomics, 34(8), pp 749-755 52 Zhang H.W., Tan Z.B., Chen G., Li J.S (2004), “Evaluation of elite inbred lines of Maize (Zea mays L.) group Tangsipingtou for in vitro culture and plant regeneration”, Maydica, 49, pp 273 - 278 53 Zhang Y., Yin X., Yang A., Li G., Zhang J (2005), “Stability of inheritance of transgenes in maize (Zea mays L.) lines produced using different transformation methods”, Euphytica, 144(1-2), pp 11-22 54 Zhu C., Naqvi S., Gomez - Galera S., Pelacho A.M., Capell T., Christouh P (2007), “Transgenic strategies for the nutritional enhancement of plants”, Trends in Plant Sciences, 12(12), pp 548-555 III Tài liệu internet 55 http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Maize&oldid=604761244/ 56 http://faostat.fao.org/ 57 http://vtv.vn/ PHỤ LỤC Phụ lục: Thành phần môi trường MS, N6 THÀNH PHẦN Murashige & Chu’s N6 Skoog (g/l) (g/l) Ammonium Nitrate 1,650000 Ammonium Sulfate 0,463000 Calcium Chloride Anhydrous 0,332020 0,125330 Magnesium sulfate Anhydrous 0,180700 0,090370 Potassium Nitrate 1,900000 2,830000 Boric Acid 0,006200 0,001600 Potassium Phosphate monobasic 0,170000 0,400000 Cobalt Chloride Anhydrous 0,000025 Cupric Sulfate Anhydrous 0,000025 Ferrous Sulftate - H2O 0,027800 0,027850 Manganese Sulfate - H2O 0,016900 0,003330 Molybdic Acid Sodium Salf - 2H2O 0,000250 Na2-EDTA-2H2O 0,037260 0,037250 Potassium Iodide 0,000830 0,000800 Zinc Sulfate-7H2O 0,008600 0,001500 4,331 g/l 3,981 g/l Glycerine 0,002000 0,002000 Myo-Inositol 0,100000 Nicotinic Acid 0,000500 0,000500 Pyridoxine-HCl 0,000500 0,000500 Thiamine-HCl 0,000100 0,001000 0,1031 g/l 0,004 g/l ... phát từ l? ? trên, l? ??a chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu môi trường tái sinh số giống ngô (Zea mays L. ) phục vụ chuyển gen? ?? Xác định điều kiện thích hợp để tái sinh từ phôi non từ mô sẹo giống ngô - Xác... ngô Việt Nam ngơ, l? ?: ? ?nghiên cứu mơi trường ni cấy in vitro phục vụ chọn dòng chịu hạn chuyển gen ngô (Zea mays [11] Kết nghiên cứu cho thấy môi trường N6 bổ sung 2,4-D mg /l; casein 100 mg /l; ... dòng lai tái sinh dòng dòng lai [34] Năm 2011, Gorji nghiên cứu sẹo tái sinh Kết dòng ngô khả tạo mô môi trường N6 tần số tạo cao bổ sung dicamba mg /l, mơi trường MS có bổ sung 2,4-D nồng độ mg/l