Đề cương luận văn (y học) xác định đk tối ưu phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa để PHMĐ methyl hóa ở các promoter wp, cp và qp của EBV ở các tế bào dòng b95 8, namalwa và raji

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi khác quần thể dân cư vùng địa lý khác giới Nơi có tỷ lệ ung thư vịm cao miền Nam Trung Quốc Grơnlen, châu Âu lại có tỷ lệ thấp Các nước Đơng Nam Á, Việt Nam có tỷ lệ UTVMH trung bình Virut Epstein-Barr (EBV), yếu tố môi trường khác nhạy cảm di truyền cho liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng EBV yếu tố nghiên cứu nhiều EBV có mặt 100% khối u vịm mũi họng thể ung thư biểu mơ khơng biệt hóa trì thể nhiễm tiềm ẩn I II, EBV biểu lộ gen quan trọng EBNA1, LMP1 LMP2 EBNA1 giúp trì gen EBV tế bào chủ, LMP1 lại gen có chức quan trọng liên quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại chết theo chương trình tế bào có khả sinh ung thư cho tế bào bị nhiễm Các gen nằm cách xa gen EBV biểu lộ hoạt hóa promoter khác EBNA1 biểu lộ thể nhiễm tiềm ẩn nhờ hoạt hóa promoter: Cp,Wp Qp Tuy nhiên, ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp Wp không hoạt động mà có Qp điều hịa biểu lộ gen EBNA1 Methyl hóa ADN vùng promoter yếu tố ngoại di truyền có vai trị quan trọng điều hịa biểu lộ gen Mức độ methyl hóa diễn vị trí đảo CpG vùng promoter exon1 có vai trị điều hịa biểu lộ gen, làm giảm biểu lộ khơng biểu lộ hồn tồn gen mà bình thường biểu lộ Việc xác định mức độ methyl hóa vùng promoter gen có ý nghĩa quan trọng tìm hiểu chế bệnh sinh bệnh liên quan đến chức gen nhiều q trình bệnh lý ác tính, đồng thời dấu ấn góp phần chẩn đốn sớm bệnh ung thư Ngồi ra, dùng chất hóa học để làm methyl hóa có tác dụng làm gen hoạt động trở lại thực chức chúng, giúp cho việc điều trị rối loạn hay bệnh lý khác [27] Hiện nay, nhờ tiến sinh học phân tử người ta xác định mức độ methyl hóa gen đặc hiệu hay toàn bộ gen Các kỹ thuật dựa vào nguyên lý khác nhau, có kỹ thuật phức tạp, có kỹ thuật đơn giản thông dụng Chúng sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa sau xử lýADN phương pháp bisulfite để xác định mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi promoter Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa khơng giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền mức độ ADN EBV mà nhiều gen khác liên quan đến ung thư, đặc biệt gen ức chế ung thư Đề tài nhằm mục đích sau: Xác định điều kiên tối ưu phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa để phát mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp Qp EBV tế bào dòng B95-8, Namalwa Raji Ứng dụng phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl hóa promoter điều hịa biểu lộ gen EBNA1 EBV mơ sinh thiết ung thư vòm mũi họng 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.Tình hình ung thư vịm mũi họng giới Việt Nam Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), khối u phát triển từ tế bào biểu mơ nằm vị trí cửa mũi sau vòm họng, loại bệnh đứng hàng đầu số ung thư vùng đầu mặt cổ với tính chất dịch tễ học đặc biệt liên quan tới địa lý[29] Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi giới xếp thành vùng khác nhau: Khu vực có tỷ lệ mắc cao miền Nam Trung Quốc Grơnlen với tỷ lệ mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp gồm: châu Âu, Mỹ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm [15] Cịn lại vùng có tỷ lệ mắc trung bình ngày có xu hướng tăng lên, vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee Đông Nam Á với tỷ lệ từ - 12/100.000 dân [7] Ở Việt Nam UTVMH đứng hàng thứ ung thư nói chung đứng hàng đầu ung thư vùng đầu mặt cổ [1, 5] 1.2 Những yếu tố nguy liên quan đến UTVMH 1.2.1 Vai trò virut Epstein-Barr Virut Epstein-Barr (EBV), yếu tố môi trường nghiên cứu nhiều cho thấy có liên quan chặt chẽ với UTVMH Người ta phát thấy EBV có mặt 100% khối ung thư biểu mơ vịm mũi họng thể khơng biệt hóa (UCNT)[6] Ngoài ra, sản phẩm gen EBV EBER, EBNA1 LMP-1,-2 xác định hầu hết mẫu sinh thiết UTVMH tổn thương q sản biểu mơ vịm họng gồm dịng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV Điều phù hợp với giả thuyết cho EBV yếu tố khởi phát trình nhiều bước dẫn đến phát triển UTVMH [30] Ngồi việc phát EBV sản phẩm khối u vòm họng, người ta xác định kháng thể chống EBV huyết bệnh nhân Lượng kháng thể IgG IgA huyết bệnh nhân UTVMH cho thấy tỷ lệ UTVMH cá thể có IgA/VCA dương tính cao hàng trăm lần cá thể âm tính với IgA/VCA [3] Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ EBV), xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường qui nhiều nước giới, có Việt Nam có giá trị để theo dõi phát nguy mắc UTVMH, đồng thời có giá trị dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh [18, 40] Người ta cho tái hoạt hóa, chép nhân lên EBV tượng xảy suốt trình phát triển UTVMH tương quan với nồng độ IgA/VCA[4] 1.2.2 Mơi trường sống thói quen sinh hoạt Nhiều tác giả đề cập đến mơi trường sống như: khí hậu, bụi, khói nhiễm liên quan đến UTVMH, nói đến nhiều tập quán ăn uống Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng tiến hành thu kết phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan lớn ăn cá muối từ nhỏ [41] Dùng cá muối hàng ngày làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần [16] Sử dụng thuốc cỏ liên quan đến UTVMH thơng qua hoạt hóa EBV trực tiếp thông qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến tế bào chuyển dạng EBV [19] Các chứng khác hút thuốc dùng formadehyde có giá trị thấp bệnh sinh ung thư vòm họng 5 1.2.3 Yếu tố di truyền Người ta thấy người Trung Quốc sinh Bắc Mỹ có tỷ lệ mắc thấp so với người sinh đất nước Trung Quốc, tỷ lệ mắc chuẩn cao dân số nói chung Điều cho thấy yếu tố di truyền có vai trị bệnh sinh UTVMH Nghiên cứu Trung quốc UTVMH có mối liên quan đến HLA-A2, B14 B46 [20] Ở Việt Nam, kháng nguyên A11, A2, B17 liên kết cân A2-B17, A11B17 có liên quan đến UTVMH [3] Việc xác định gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh lý nghiên cứu: CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M1 Cơ chế tác động chúng chưa rõ ràng, song điều khẳng định phát triển UTVMH phối hợp tác động yếu tố môi trường sống, EBV HLA [7] 1.3 Virut Epstein-Barr 1.3.1 Sinh học EBV Trên thực tế, 90 % người trưởng thành giới nhiễm EBV tồn lâu dài thể nhiễm Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt lứa tuổi sớm đời sống người mà thường khơng có triệu chứng Ngồi ra, EBV lây nhiễm qua máu, tổ chức qua sữa mẹ truyền sang con, chí thơng qua quan hệ tình dục [23] EBV nhân lên tế bào biểu mơ tuyến nước bọt, sau qua biểu mơ vịm họng xâp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 bề mặt tế bào Sau vào nhân tế bào, EBV tồn dạng vòng chủ yếu tự nhân lên nhờ nguyên liệu tế bào Tuy nhiên, EBV tích hợp vào ADN nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ tế bào dịng Namalwa, tích hợp vào nhiễm sắc thể vị trí 1p35 Ở thể nhiễm tiềm ẩn lympho B, EBV biểu lộ kháng nguyên, với số lượng tế bào nhiễm thấp (1 tế bào lympho B/1ml máu) EBV khó bị tiêu diệt hệ miễn dịch Khi thể dung giải, EBV nhân lên nhiều giải phóng ngồi lại nhiễm vào tế bào lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt hình thành chu kỳ nhân lên EBV thể [36] Với tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho virut vào cách sau: Khả thứ xảy tiếp cận tế bào biểu mô vòm họng tế bào nhiễm EBV Tế bào B vào chu trình dung giải, bung virus, cung cấp số lượng lớn hạt virus cho tế bào khác diện rộng [13] Và khả thứ hai virus vào tế bào biểu mô tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA Sixbey and Yao [37] Ngồi ra, phân tử MHC lớp II đường virus xâm nhập vào tế bào biểu mơ [25] Ngồi tế bào lympho B tế bào biểu mơ, đơi EBV cịn bị công tế bào máu khác đai thực bào, lympho T tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer cell) [2] 1.3.2 Cấu trúc EBV EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài gen khoảng 172-kb ADN chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid EBV hình thành phân tử ADN dạng vịng tế bào bị nhiễm (hình 1A) Khi xử lý EBV dòng tế bào B95-8 emzym cắt giới hạn BamHI, đoạn gen tạo ký hiệu theo bảng chữ theo thứ tự kích thước giảm dần (hình 1B) Thuật ngữ sử dụng cho đoạn sau: Mỗi chữ ký hiệu cho đoạn (A, B …), khung đọc mở trái phải thứ tự (0,1,2,3…) ví dụ BARF0 BARF1 Toàn bộ gen EBV dịng tế bào B95-8 giải trình tự gen đầu tiên, có mã số ngân hàng gen V01555 7 Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác (các phân tử protein lớn) thể dung giải nó, ngược lại, có khoảng 10 kháng nguyên sản xuất thể nhiễm tiềm ẩn [33] A A BamHI B Hình Sơ đồ cấu trúc EBV: A) Cấu trúc EBV dạng vòng biểu thị vùng promoter gen thể nhiễm tiềm ẩn: EBER1 2: EBV Early RNA, EBNA1-6: EBV Nuclear Antigen, LMP1 2: Latent Membrane Protein B) EBV dạng thẳng gồm đoạn gen tạo sau xử lý với enzym giới hạn BamH1 vị trí gen thể tiềm ẩn 1.3.3 Thể tiềm ẩn EBV Giống tất virut herpes, EBV tồn dạng khơng hoạt động tế bào bị nhiễm Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, có 10 gen số dịch mã để tổng hợp protein, bao gồm loại protein kháng nguyên nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,3A,3B,3C, -LP; loại protenin màng tiềm ẩn (Latent Membrane Protein): LMP1, LMP2A 2B; loại RNA khơng mã hóa protein (EBV Early RNA): EBER1và2 Có bốn thể tiềm ẩn phân loại dựa biểu lộ gen virut liệt kê bảng [24] Bảng 1: Các thể tiềm ẩn EBV Thể tiềm ẩn Biểu lộ gen EBV Người thường bệnh liên quan I II III EBER1 & LMP2A +/EBER1 & EBNA1 EBER1 & EBNA1 LMP1 LMP2A&2B EBER1&2 EBNA1- LMP1 LMP2A & B Người thường U lympho Burkitt, UTVMH UTVMH, U lympho Hodgkin, U lympho tế bào T, ung thư tuyến nước bọt U lympho sau ghép tạng U lympho bệnh nhân AIDS, bạch cầu đơn nhân nhiễn khuẩn, LCL 1.3.4 Các gen EBV thể tiềm ẩn 1.3.4.1 EBNA1 Protein EBNA1 EBV thuộc dịng tế bào B95-8 có trọng lượng khoảng 66-95 kDa chiều dài 641 axit amin Kích thước thay đổi chủng khác khác đoạn lặp lại glycin- alanin (GlyAla) [13] Các cấu trúc EBNA1 chia thành bốn vùng rõ ràng: Một vùng nằm đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm 239 acid amin, vùng ngắn vùng gắn ADN đầu C có chiều dài từ axit amin 459-641[11] (Hình 2) 9 Hình Cấu trúc EBNA1 EBNA1 protein biểu lộ tất tế bào nhiễm EBV [12] đóng vai trị quan trọng việc trì episom EBV (dạng vịng) nhân tế bào chủ, chức phiên mã virut[38] Vùng gắn ADN protein EBNA1 tương tác với hai khu vực nằm vùng oriP promoter Cp, bao gồm gia đình lặp lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nucleotid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyad Symmetry) có vị trí gắn, vùng có hai vị trí gắn sau promoter Qp Liên kết EBNA1 với vùng FR có tính cao so với DS Qp gắn với FR điều hịa phiên mã gen EBNA Các gen biểu lộ kiểm sốt promoter Cp hay Wp EBNA1 liên kết với intron xuôi chiều promoter Qp làm tự điều hòa biểu lộ protein EBNA1 Ở thể nhiễm tiềm ẩn I II, promoter Cp Wp không hoạt động biểu lộ EBNA1 thực Qp Cp Wp không hoạt động yếu tố phiên mã methyl hóa ADN [35] 1.3.4.2 EBNA2 Protein EBNA2 có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa Do có trình tự gen khác chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A EBNA2B, dấu ấn quan trọng để xếp loại EBV typ I typ II [8] Các protein EBNA2A EBNA2B chứa 484 443 axit amin cách tương ứng giống trình tự khoảng 57% EBNA2 10 protein virut biểu lộ tế bào lympho B bị nhiễm EBV, xuất khoảng 24-48 sau nhiễm EBV nuôi cấy tế bào in vitro[28] Protein chất kích hoạt phiên mã số gen virut tế bào bao gồm gen CD21, CD23, Bcl-2 c-myc, cần thiết cho tế bào B in vitro EBNA2 không gắn trực tiếp với ADN, tác động thông qua protein in khác RBP-JK), PU1 protein khác tế bào [21] 1.3.4.3 Gia đình EBNA3 ( EBNA3A,3B 3C) Các gen gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B 3C nằm gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự có trọng lượng phân tử từ 140-180 kDa Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B 3C EBV typ I II có giống 84%, 80% 72% cách tương ứng Các protein hoạt động có chức phiên mã tương tác với protein RBP-JK[34] 1.3.4.4 EBNA - LP Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác từ 20130 kDa, kết hoạt động promoter Wp Cùng với EBNA2, EBNALP protein biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào lympho B in vitro [9] 1.3.4.5 LMP1 Protein LMP1 phiên mã từ vùng BNLF1 nằm gần cuối đầu 3' gen EBV có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng virus Ở chủng EBV tế bào dòng B95-8, protein có 386 axit amin chia thành ba vùng,(i) vùng đầu N gồm 24 axit amin,(ii) sáu vùng xuyên màng kỵ nước kết nối ba vòng bên ngồi hai vịng nội bào, (iii) vùng đầu C có 200 axít amin bao gồm hai lĩnh vực chức quan trọng gọi vùng hoạt hóa CTAR1 (C-Terminal Activation Region 1: aa194232) CTAR2 ( aa 351-386) [22] 11 LMP1 tham gia ba chức chuyển dạng, di chống lại chết theo chương trình LMP1 coi sản phẩm gen sinh ung thư làm chuyển dạng nguyên bào sợi động vật gặm nhấm Biểu LMP1 tác động ảnh hưởng đáng kể đến tăng trưởng tế bào biểu mô, ức chế biệt hóa chúng, gây biến đổi hình thái số dịng tế bào biểu mơ, làm tăng biểu yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR[26] 1.3.4 LMP2A/2B LMP2 mã hóa chỗ ghép nối hình thành dạng vịng EBV LMP2 có hai loại LMP2A LMP2B, khác LMP2A có thêm đoạn 119 acid amin đầu N tận cịn LMP2 khơng có Mặc dù chưa biết chức cụ thể LMP2B, việc biểu lộ nhiều cho thấy đóng vai trị quan trọng sinh học EBV Trong chức LMP2A xác định tế bào B Tuy nhiên, protein biểu lộ tỷ lệ thấp khối u vòm họng [14] 1.4 Yếu tố ngoại di truyền Ngoại di truyền nghiên cứu chế làm không biểu lộ gen mà không liên quan đến thay đổi trình tự nucleotid gen Những biến đổi ngoại di truyền di truyền từ hệ tế bào sang tế bào khác Khi nói đến ngoại di truyền người ta thường nhấn mạnh yếu tố là: methyl hóa ADN, sửa chữa histon nucleosom Các thay đổi độc lập với methyl hóa xảy mức độ ADN yếu tố lại diễn mức độ protein [32] 1.4.1 Methyl hóa ADN điều hịa biểu lộ gen Methyl hóa ADN kiện diễn gốc CH3 liên kết đồng hóa trị với vị trí cacbon số Cytosin nằm vị trí hai nucleotid CytosinGuanin viết tắt CpG (p liên kết phosphodieste) Khi CpG tập hợp nhiều khoảng 200bp ví trí gen có GC chiếm 50% 12 người ta gọi đảo CpG Khoảng 10-15% CpG động vật có vú nằm vùng đảo CpG thường xuất vị trí vùng promoter exon1của khoảng 40% gen động vật có vú Cơ chế gắn gốc CH3 vào ADN trình phân bào nhờ enzym methyltransferase (DNMT) Có loại DNMT xác định động vật có vú enzym chuyển nhóm CH3 từ Sadenosyl methionin sang AND [10] Trong mơ bình thường đảo CpG thường khơng bị methyl hóa Khi chúng bị methyl hóa vùng promoter dẫn đến hai chế điều hòa biểu lộ gen: Một là, ức chế yếu tố điều hòa biểu lộ gen gắn vào vùng khởi động gốc CH3 gắn vào Cytosin, chế minh họa Hình Hai là, có protein gắn đặc hiệu với CpG methyl hóa dẫn đến chế làm acetyl histon làm cấu trúc sợi chromatin co lại, cuối dẫn đến yếu tố phiên mã khơng gắn vào vùng ADN Hình 3: Một chế không biểu lộ gen methyl hóa ADN A) Hai nucleotid CpG vùng promoter khơng methyl hóa, cho phép thực phiên mã tế bào bình thường B) Phiên mã bị chặn tăng methyl hóa vùng promoter 1.4.2 Methyl hóa ADN promotor EBNA1 13 EBNA1 biểu lộ tế bào nhiễm nhờ hoạt hóa promoter khác thể tiềm ẩn khác (Wp, Cp Qp) chu kỳ dung giải (Fp) Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ promoter Fp hoạt hóa, promoter khác khơng hoạt động Ngược lại, thể nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp Qp hoạt hóa, nhiên phụ thuộc vào thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III Ở thể nhiễm tiềm ẩn I II có Qp hoạt động, thể nhiễm tiềm ẩn III, hai promoter Wp Cp hoạt động Hai promoter hoạt động luân phiên Wp hoạt động trước thời gian ngắn, sau chuyển sang Cp hoạt động lâu dài [31] Hình Các promotor EBV điểu khiển phiên mã EBNA1 Việc promoter đóng mở thực yếu tố khác nhau, có methyl hóa CpG vùng promoter Ở thể nhiễm tiềm ẩn I II, promoter Wp Cp bị đóng lại, EBV biểu lộ EBNA1 Qp trường hợp UTVMH [39] Nghiên cứu methyl hóa giúp tìm hiều chế biểu lộ gen, đồng thời dấu ấn giúp cho chẩn đoán điều trị liên quan đến ngoại di truyền rối loạn 14 sửa chữa nhờ chất hóa học bổ sung vào tế bào [17] Chúng phát triển kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa mơ hình EBV ung thư vịm mũi họng, đồng thời ứng dụng cho nhiều gen khác bệnh lý khác 15 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu -Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/2011 đến tháng 10/2011 - Mẫu thu thập Bệnh viện K Hà Nội - Các kỹ thuật phân tử tiến hành Phòng thí nghiệm Bộ mơn Miễn dịch - Sinh lý bệnh Labo Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội 2.2 Đối tượng nghiên cứu phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tế bào dòng Các nguyên liệu tế bào dòng B95-8, Namalwa, Raji tài trợ Labo nghiên cứu ung thư vòm mũi họng, MTC, Viện Karolinska, Stockholm, Thụy điển 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân - Bệnh nhân chưa điều trị , chẩn đoán xác định từ mô sinh thiết lấy từ khối u UT biểu mơ vịm mũi họng thể khơng biệt hóa (UCNT) - Những mô sinh thiết tươi mô sinh thiết đúc farafin bệnh nhân chẩn đoán UTVMH thể khơng biệt hóa 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ - Các thể mơ bệnh học khác ngồi UCNT - Bệnh nhân tái phát đến khám định kỳ 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu: - Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang - Trình tự kỹ thuật cần thực hiện: 16 + Thiết kế mồi: Để xác định mức độ methy hóa, gen cần thiết kế cặp mồi Một cặp mồi dùng cho xác định methyl hóa (M) cặp mồi dùng để xác định không methyl hóa (K), sử dụng phần mềm chuyên dụng + Chiết tách kiểm tra chất lượng: ADN, ARN, Protein + Xử lý ADN Bisulfite + Sử dụng kỹ thuật PCR đơn mồi đặc hiệu methyl hóa + Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa + Điện di sản phẩm PCR, nhuộm chụp ảnh 2.5 Biến số số nghiên cứu: - Các số nghiên cứu PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa nghiên cứu bao gồm thơng số lượng ADN khuôn mẫu, nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg++, chu kỳ nhiệt hai loại mồi methyl hóa khơng methyl hóa - Các biến số nghiên cứu mẫu sinh thiết bệnh nhân mức độ methyl hóa hay khơng methyl hóa promoter EBNA1 2.2.6 Phương pháp thu thập thông tin - Quan sát ghi kết nghiên cứu thực nghiệm - Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án điền phiếu theo mẫu (phụ lục kèm theo) 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu phần mềm chương trình SPSS 15.0 với test thống kê thích hợp y học 17 2.3 Sơ đồ nghiên cứu Mẫu PCR đơn mồi ADN ARN Bisulfite cADN PCR đa mồi Protein WB RT-PCR Điện di, nhuộm sản phẩm PCR chụp ảnh Thu thập thông tin xử lý số liệu 18 CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ Các cặp mồi gen nội chuẩn sử dụng để xác định lượng ADN đưa vào để so sánh tỷ lệ khếch đại gen nghiên cứu Sản phẩm khuếch đại gen đánh giá định tính định lượng phần mềm chuyên dụng Trước thực kỹ thuật PCR đa mồi, cặp mồi đơn chạy xác định sản phẩm Các kết thay đổi thông số nồng độ mồi, ADN khuôn mẫu, nồng độ Mg++, nhiệt độ gắn mồi chu kỳ nhiệt cặp mồi methyl hóa khơng methyl hóa Kèm theo ảnh minh họa Bảng 3.1 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi sử dụng số lượng tế bào dòng Namalwa khác (mỗi tế bào dòng Namalwa có EBV) Số lượng tế bào Promoter Wp Cp Qp 10000 K M 1000 K M 100 K 10 M K M K M K: Khơng methyl hóa; M: Methyl hóa Nhận xét: Bảng 3.2 Nồng độ mồi cặp mồi khơng methyl hóa methyl hóa 19 Mồi Promoter Wp Cp Qp NĐ1 K NĐ2 M K M NĐ3 K M NĐ4 K M NĐ5 K M Nhận xét: Bảng 3.3 Nhiệt độ gắn mồi cặp mồi khơng methyl hóa methyl hóa Nhiệt độ Promoter Wp Cp Qp 560C K 580C M K M 600C K M 620C K M 640C K M Nhận xét: Bảng 3.4 Nồng độ Mg++ phản ứng PCR đa mồi với cặp mồi không methyl hóa methyl hóa Mg++ Promoter Wp Cp Qp Nhận xét: 2.0mM 2.5mM 3.0mM K K K M M M 3.5mM K 4.0mM M K M 20 Bảng 3.5 Số lượng chu kỳ nhiệt phản ứng PCR đa mồi khơng methyl hóa methyl hóa Chu kỳ nhiệt Promoter Wp Cp Qp 34 K 36 M K 38 M K 40 M K 42 M K M Bảng 3.6 Mức độ khơng methyl hóa methyl hóa promoter EBNA1 tế bào dòng khác Dòng tế bào Namalwa K Promoter Wp Cp Qp Raji M K B95-8 M K M Bảng 3.7 Mức độ không methyl hóa methyl hóa promoter EBNA1 20 mẫu sinh thiết ung thư vòm họng khác Mẫu sinh thiết Promoter Wp Cp Qp Nhận xét: 01 K 02 M K 03 M K 04 M K 05… M K M 21 CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN Bàn luận kết thay đổi thông số thành phần chủ yếu kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa tế bào dòng chuẩn Bàn luận mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp Qp EBV khối u vòm họng Bàn luận chế điều hòa biểu lộ gen EBNA1 ung thư vòm mũi họng 22 DỰ KIẾN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU Tiến độ thời gian Các hoạt động triển khai Nghiên cứu tài liệu viết, bảo vệ đề cương Thu thập số liệu Nhập số liệu Xử lý số liệu Viết báo cáo bảo vệ 2.Dự trù kinh phí 1,2,3 4,5,6,7 Công việc 1.Chuẩn bị đề cương - Công thu thập tài liệu tham khảo - Photo tài liệu tham khảo - Hoàn thiện đề cương Thu thập số liệu - Chiết tách mẫu - Hóa chất sinh phẩm: + Kit xử lý ADN (Bisufite) + Trizol + dNTPs + Enzym Taq ADN polymerase + Mồi +Và hóa chất khác: In ấn tài liệu Chi phí phát sinh Tổng số tiền 10 11,12 Thành tiền 500.000đ 200.000đ 100.000đ 200.000đ 31.500.000đ 8.000.000đ 4.000.000đ 2.500.000đ 8.000.000đ 5.000.000đ 4.000.000đ 1.000.000đ 500.000đ 33.500.000đ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng giới Việt Nam 1.2 Những yếu tố nguy liên quan đến UTVMH 1.2.1 Vai trò virut Epstein-Barr 1.2.2 Mơi trường sống thói quen sinh hoạt 1.2.3 Yếu tố di truyền .5 1.3 Virut Epstein-Barr 1.3.1 Sinh học EBV 1.3.2 Cấu trúc EBV 1.3.3 Thể tiềm ẩn EBV 1.3.4 Các gen EBV thể tiềm ẩn 1.4 Yếu tố ngoại di truyền 11 1.4.1 Methyl hóa ADN điều hòa biểu lộ gen 11 1.4.2 Methyl hóa ADN promotor EBNA1 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu .15 2.2 Đối tượng nghiên cứu phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Tế bào dòng 15 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 15 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ .15 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu: 15 2.5 Biến số số nghiên cứu: .16 2.2.6 Phương pháp thu thập thông tin 16 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 16 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 17 CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 18 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 21 DỰ KIẾN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt ... mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp Qp EBV tế bào dòng B95- 8, Namalwa Raji Ứng dụng phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl hóa promoter điều hịa biểu lộ gen EBNA1 EBV mô sinh thiết... thuật PCR đơn mồi đặc hiệu methyl hóa + Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa + Điện di sản phẩm PCR, nhuộm chụp ảnh 2.5 Biến số số nghiên cứu: - Các số nghiên cứu PCR đa mồi đặc hiệu methyl. .. độ đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi sử dụng số lượng tế bào dòng Namalwa khác (mỗi tế bào dịng Namalwa có EBV) Số lượng tế bào Promoter Wp Cp Qp 10000 K M 1000 K M 100 K 10 M K M K M K: Khơng methyl