tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng pcr đa mồi đặc hiệu methyl hóa cho các promoter wp cp và qp của ebv sử dụng các nguyên liệu là các tế bào dòng

ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi khác quần thể dân cư vùng địa lý khác giới Nơi có tỷ lệ ung thư vịm cao miền Nam Trung Quốc Grơnlen, châu Âu lại có tỷ lệ thấp Các nướcđơng nam Á, có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình.Virut Epstein - Barr (EBV), yếu tố môi trường khác nhạy cảm di truyền cho liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng EBV yếu tố nghiên cứu nhiều EBV có mặt 100% khối u vịm mũi họng thể ung thư biểu mơ khơng biệt húa tồn thể nhiễm tiềm ẩn I II, EBV biểu lộ gen quan trọng EBNA1, LMP1 EBNA1 giúp trì gen EBV tế bào chủ, LMP1 lại gen có chức quan trọng liên quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại chết theo chương trình tế bào có khả sinh ung thư tế bào bị nhiễm Các gen nằm xa gen biểu lộ nhờ promoter khác EBNA1 biểu lộ thể nhiễm tiềm ẩn nhờ hoạt húa promoter, bao gồm Cp, Wp Qp Tuy nhiên ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp Wp khơng hoạt động mà có Qp điều hũa biểu lộ gen EBNA1 Ngoại di truyền cho có vai trị quan trọng điều hũa biểu lộ gen, chúng bao gồm methyl húa ADN vùng promoter, sửa chữa histon nucleosom Mức độ methyl húa xảy vị trí CpG ADN vùng promoter exon1 có vai trị điều hũa biểu lộ gen, làm giảm biểu lộ khơng biểu lộ hồn tồn gen mà bình thường biểu lộ Việc xác định mức độ methyl húa vùng khởi động gen có ý nghĩa quan trọng tìm hiểu chế bệnh sinh bệnh liên quan đến chức gen nhiều trình bệnh lý ung thư, đồng thời dấu ấn 22 góp phần chẩn đốn sớm ung thư Ngoài ra, việc làm methyl húa có tác dụng làm gen hoạt động trở lại thực chức chúng, giúp cho việc điều trị rối loạn hay bệnh lý khác Hiện nay, nhờ tiến sinh học phân tử người ta xác định mức độ methyl húa gen đặc hiệu hay toàn bộ gen Các kỹ thuật dựa vào nguyên lý khác nhau, có kỹ thuật phức tạp, có ký thuật đơn giản thơng dụng Chúng sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl húa theo nguyên lý xử lý ADN phương pháp bisulfite để xác định mức độ methyl húa promoter Wp, Cp Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi promoter Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl húa giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền mức độ ADN nhiều gen, đặc biệt gen ức chế ung thư Đề tài nhằm mục đích sau: Tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl húa cho promoter Wp, Cp Qp EBV, sử dụng nguyên liệu tế bào dòng Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl húa promoter điều hũa biểu lộ gen EBNA1 mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vịm mũi họng CHƯƠNG TỔNG QUAN 22 1.1.Tình hình ung thư vịm mũi họng giới Việt Nam Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), khối u phát triển từ tế bào biểu mô nằm vị trí cửa mũi sauvà vịm họng, loại đứng hàng đầu số ung thư vùng đầu mặt cổ, với tính chất dịch tễ học đặc biệtlà liên quan tới địa lý.Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi giới xếp thành vùng khác nhau:Khu vực có tỷ lệ mắc cao miền Nam Trung Quốc Grơnlen với tỷ lệ mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm Còn lại vùng có tỷ lệ mắc trung bình ngày có xu hướng tăng lên, vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee đông nam Á với tỷ lệ từ - 12/100.000 dân (23,39)Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ ung thư nói chung đứng hàng đầu ung thư vùng đầu mặt cổ [4] 1.2 Những yếu tố nguy liên quan đến UTVMH 1.2.1 Vai trò virut Epstein - Barr VirutEpstein - Barr (EBV), yếu tố môi trường nghiên cứu nhiều cho thấy có liên quanchặt chẽ nú với UTVMH Người ta phát thấy EBV có mặt 100% khối u vịm mũi họng thể ung thư biểu mơ không biệt húa (UCNT) EBV phát từ tế bào UTVMH từ lympho thâm nhiễm chứng minh từ chuột trụi lông truyền khối u lấy từ bệnh nhân UTVMH, khối u không chứa lympho thâm nhiễm (Klein cs 1974) [trích từ 89] Ngồi ra, sản phẩm gen EBV EBER, EBNA1 LMP-1,-2 xác định hầu hết mẫu sinh thiết UTVMH tổn thương q sản biểu mơ vịm họng gồm dịng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV Điều phù hợp với giả thuyết cho EBV làmột yếu tố khởi phát trình nhiều bước dẫn đến phát triển UTVMH [124] 22 Ngoài việc phát EBV sản phẩm nú khối u vòm họng, người ta xác định kháng thể chống EBV huyết bệnh nhân Lượng kháng thể IgG IgA huyết bệnh nhân UTVMH cao - 10 lần so với bệnh nhân ung thư đầu mặt cổkhác người khỏe lâm sàng (Henle cs 1970, 1973; Klein cs 1970) [trích từ 89 c.binh] Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ EBV), xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường qui nhiều nước giới, có Việt Nam [6],[8],[7],[13],[18],[25], [156] , có giá trị để theo dõi phát nguy mắc UTVMH, đồng thời có giá trị dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh tăng cao( ref) Người ta cho tái hoạt hóa, chép nhân lên EBV tượng xảy suốt q trình phát triển UTVMH tương quan với nồng độ IgA/VCA[89] 1.2.2 Mơi trường sống thói quen sinh hoạt Nhiều tác giả đề cập đến mơi trường sống khí hậu, bụi, khói nhiễm liên quan đến UTVMH, nói đến nhiều tập quán ăn uống Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng tiến hành thu kết phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan lớn ăn cá muối từ nhỏ Dùng cá muối hàng ngày làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần Sử dụng thuốc cỏ liên quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa EBV trực tiếp thơng qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến tế bào chuyển dạng EBV Các chứng khác hút thuốc dùng formadehyde có giá trị thấp bệnh sinh ung thư vòm họng 1.2.3 Yếu tố di truyền Người ta thấy người Trung Quốc sinh Bắc Mỹ có tỷ lệ mắcthấp so với người sinh đất nước Trung Quốc, tỷ lệ 22 mắc chuẩn cao dân số nói chung [2] Điều cho thấy yếu tố di truyền có vai trò bệnh sinh UTVMH.Ở Việt Nam, việc nghiên cứu mối liên quan HLA UTVMH cho thấy có tăng nguy mắc UTVMH với tăng tần suất kháng nguyên A11, A2, B17 liên kết cân A2-B17, A11- B17 [13],[20] Việc xác định gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh lý nghiên cứu : CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M1 [111],[153] Cơ chế tác động chúng chưa rõ ràng, song điều khẳng định phát triển UTVMH phối hợp tác động yếu tố môi trường sống, EBV HLA 1.3 Virut Epstein - Barr 1.3.1 Sinh học EBV Trên thực tế, 90 % người trưởng thành giới nhiễm EBV nú tồn lâu dài thể nhiễm Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt lứa tuổi sớm đời sống người mà thường triệu chứng Ngồi ra, EBV lây nhiễm qua máu, tổ chức qua sữa mẹ truyền sang con, chí thơng qua quan hệ tình dục EBV nhân lên tuyến nước bọt, sau qua biểu mơ vịm họng xõp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 bề mặt tế bào Sau vào nhân tế bào, EBV tồn dạng vòng chủ yếu tự nhân lên nhờ nguyên liệu tế bào Tuy nhiên, EBV tích hợp vào DNA nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ tế bào dịng Namalwa, nú tích hợp vào nhiẽm sắc thể vị trí 1p35 Ở thể nhiễm tiềm ẩn lympho B, EBV biểu lộ kháng nguyên, với số lượng tế bào nhiễm thấp (1 tế bào lympho B/ 1ml máu) EBV khó bị tiêu diệt hệ miễn dịch Khi thể dung giải, EBV nhân lên nhiều giải phóng lại nhiễm vào tế bào 22 lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt hình thành chu kỳ nhân lên thể Với tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho virut vào cách sau:Khả thứ nhất: xảy tiếp cận tế bào biểu mơ vịm họng tế bào nhiễm EBV Tế bào B vào chu trình dung giải, bung virus, cung cấp số lượng lớn hạt virus cho tế bào khác diện rộng (Bayliss Wolf 1980,1981) [trích từ 89] Và khả thứ hai: virus vào tế bào biểu mô tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA (Sixbey Yao, 1992) [trích từ 89].Ngồi ra, phân tử MHC lớp II đường virus xâm nhập vào tế bào biểu mơ [10] Ngồi tế bào lympho B tế bào biểu mô, EBV cịn bị cơng tế bào máu khác đai thực bào, lympho T tế bào diệt tự nhiên (Nature Killercell) 1.3.2 Cấu trúc EBV EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài gen nú khoảng 172 - kb ADN chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid.Suốt chiều dài gen chia làm vùng chính: chuỗi ngắn (US- short unique ), chuỗi lặp ( IR- internal repeat), chuỗi dài (UL - long unique ) chuỗi lặp cuối ( TR - terminal repeat ) EBV hình thành phân tử DNA dạng vòng tế bào bị nhiễm đầu TRcủa nú (hình 1A) Khi xử lý EBV dịng tế bào B95 - emzym cắt giới hạn BamHI, đoạn gen tạo ký hiệu theo bảng chữ theo thứ tự kích thước giảm dần (hình 1B) Thuật ngữ sử dụng cho đoạn sau: Theo chữ ký hiệu cho đoạn ( A, B …), đọc trực tiếp ( trái phải) số bắt đầu theo thứ tự (1,2,3…) ví dụ BARF0, BARF1 EBV dịng tế bào B95 - giải trình tự gen đầu tiên, có mã số ngân hàng gen V01555 [1] 22 nhân tế bào chủ, chức phiên mã virut [65, 66] Vùng gắn ADN protein EBNA1 tương tác với hai vùng nằm vùng oriP prụmụtơ Cp, bao gồm gia đình lặp lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nucleitid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyat Symetry) có vị trí gắn, vùng có hai vị trí gắn xi chiều Qp Hình Cấu trúc EBNA1 Liên kết EBNA1 với vùng FR có tính cao so với DS Qp gắn với FR điều hịa phiên mã gen EBNA Các gen biểu lộ kiểm sốt prơmơtơ Cp hay prơmơtơ Wp EBNA1 liên kết với intron xi chiều prơmơtơ Qp làm tự điều hịa biểu lộ protein EBNA1 [72] Ở thể nhiễm tiềm ẩn I II, prômôtơ Cp không hoạt động biểu lộ EBNA1 thực Qp Cp không hoạt động yếu tố phiên mã methyl hóa ADN [73, 74] 1.3.4.2 EBNA2 Protein EBNA2, có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa Do có trình tự gen khác chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A EBNA2B, dấu ấn quan trọngđể xếp loại EBV typ I typ II [78] Các protein EBNA2A EBNA2B chứa 484 443 axit amin cách tương ứngvà giống trình tự khoảng 57% [79, 80] EBNA2 protein virut biểu lộ tế bào lympho B bị nhiễm, xuất 24-48 sau nhiễm EBV nuôi cấy tế bào in vitro[81] Protein mộtchất kích hoạt phiên mã gen đặc hiệu virut tế bào bao gồm gen CD21, CD23, Bcl-2 c-myc [82, 83], cần thiết cho tế bào B in vitro [84, 85] EBNA2 không gắn trự tiếp với ADN, tác động thông qua protein in khác nhưRBP-JK), PU1 protein tế bào khác 22 B: Phiên mã bị chặn tăng methyla húa vùng prụmụtơ Do methyl húa ADN gen tế bào ung thư mục tiêu hấp dẫn điều trị kiến thức lĩnh vực chẩn đoán phân tử, tức là, phát sớm bệnh sử dụng PCR để xác định methyl húa ADN [ luận án] 1.4.2 Methyl húa ADN promotor EBNA1 EBNA1 biểu lộ tế bào nhiễm nhờ hoạt húa promoter khác thể tiềm ẩn khác (Wp, Cp Qp) chu kỳ dung giải (Fp) Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ promoter Fp hoạt húa, promoter khác không hoạt động Ngược lại, thể nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp Qp hoạt húa, nhiên phụ thuộc vào thể nhiễm tiềm ẩn I, II hay III Ở thể nhiễm tiềm ẩn I II có Qp hoạt động, cịn thể nhiễm tiềm ẩn III, hai promoter Wp Cp hoạt động Hai promoter hoạt động luân phiên Wp hoạt động trước thời gian ngắn, sau chuyển sang Cp hoạt động lâu dài Hình Các vùng promotor EBV điểu khiển phiên mã 22 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/ 2011 đến tháng 10/2011 - Mẫu thu thập Khoa xạ trị tổng hợp, Bệnh viện K Hà Nội - Các kỹ thuật tiến hành Phịng thí nghiệm môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh; Labo Trung tâm Y - Sinh học, Trường Đại học Y Hà Nội; Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện K Hà Nội 2.2 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Nhóm bệnh nhân 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân - Bệnh nhân nhập viện, chẩn đoán xác định UTVMH dựa vàotriệu chứng lâm sàng kết giải phẫu bệnh mơ sinh thiết lấy từ khối u vịm họng Các bệnh nhân chọn vào nghiên cứu xếp loại giai đoạn từ II đến IVB với T N M theo cách phân loại T N M giai đoạn lâm sàng Hiệp hội quốc tế chống ung thư năm 1997 -Tiêu mô sinh thiết Những tiêu mô sinh thiết tươi tiêu mô sinh thiết đúc farafin bệnh nhân chẩn đoán UTVMH thể không biệt húa 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ - Các thể mơ bệnh học khác ngồi UCNT - Các bệnh nhân giai đoạn có di - Bệnh nhân đến khám định kỳ -4 – 22 Phương pháp tiêu nghiên cứu: 2.3.1 Phương pháp nghiờn cứu: - Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang - Trình tự kỹ thuật cần thực hiện: + Thiết kế mồi + Chiết tách AND, ARN, Protein + Xử lý AND Bisulfite + Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi + Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu 2.3.2 Biến số số nghiên cứu: 2.3.3 Phương pháp thu thập thông tin - Quan sát ghi kết xét nghiệm - Hồi cứu thông tin từ hồ sơ bệnh án điền phiếu theo mẫu (phụ lục kèm theo) 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu làm trước nhập vào máy tính Xử lý số liệu phần mềm chương trình SPSS 15 với test thống kê thích hợp y học 2.5 Sơ đồ nghiên cứu 22 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 22 KHUYẾN NGHỊ 22 KẾ HOẠCH NGHIấN CỨU Tiến độ thời gian Các hoạt động triển khai 1, 2, 4, 5, 6, Nghiên cứu tài liệu viết, bảo vệđề cươn g Thu thập số liệu Nhập số liệu Xử lý số liệu Viết báo cáo v bảovệ 2.Dự trù kinh phí Cơng việc 1.Chuẩn bị đề cương - Cơng thu thập tài liệu tham khảo - Photo tài liệu tham khảo - Hoàn thiện đề cương Thu thập số liệu - Triết tách mẫu - Hóa chất sinh phẩm: Thành tiền 500.000đ 200.000đ 100.000đ 200.000đ 28.000.000 4000.0000 22 11, 12 + Bisufite + DNTPs + Enzym (Buffer) + Mồi In ấn tài liệu Chi phí phát sinh Tổng số tiền 8000.000/1kit 7.500.000 5000.000/250 mẫu 3.500.000/40 Nucleotid 1.000.000đ 500.000đ 30.000.000đ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN 1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng giới Việt Nam 1.2 Những yếu tố nguy liên quan đến UTVMH 1.2.1 Vai trò virut Epstein - Barr 1.2.2 Mơi trường sống thói quen sinh hoạt 1.2.3 Yếu tố di truyền 1.3 Virut Epstein - Barr 1.3.1 Sinh học EBV 1.3.2 Cấu trúc EBV 1.3.3 Thể tiềm ẩn EBV 1.3.4 Các gen EBVcủa thể nhiễm tiềm ẩn 1.4 Yếu tố ngoại di truyền UTVMH 11 Methyl húa ADN điều hũa biểu lộ gen 11 1.4.2 Methyl húa ADN promotor EBNA1 13 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 15 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 2.2 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2.1 Nhóm bệnh nhân 15 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 15 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ 15 Phương pháp tiêu nghiên cứu: 16 2.3.1 Phương pháp nghiờn cứu: 16 2.3.2 Biến số số nghiên cứu: 16 2.3.3 Phương pháp thu thập thông tin 16 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 16 2.5 Sơ đồ nghiên cứu 16 DỰ KIẾN KẾT QUẢ 17 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 18 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 19 KHUYẾN NGHỊ 20 ... gen, đặc biệt gen ức chế ung thư Đề tài nhằm mục đích sau: Tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl húa cho promoter Wp, Cp Qp EBV, sử dụng nguyên liệu tế bào dòng Ứng dụng PCR. .. mặt tế bào Sau vào nhân tế bào, EBV tồn dạng vòng chủ yếu tự nhân lên nhờ nguyên liệu tế bào Tuy nhiên, EBV tích hợp vào DNA nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ tế bào dịng Namalwa, nú tích hợp vào... xác định mức độ methyl húa promoter Wp, Cp Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi promoter Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl húa giúp ích cho nghiên cứu ngoại