Luận văn sư phạm Tuyển chọn chủng nấm men, tìm điều kiện tối ưu cho quá trình lên men vang táo mèo

1 LờI CảM ƠN Trc trỡnh by ti nghiên cứu mình, em xin gửi đến giáo TS Đinh Thị Kim Nhung lời cảm ơn chân thành sâu sắc Cơ tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện tốt để em hồn thành đề tài Bằng lòng thành kính, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo, cô giáo khoa Sinh KTNN tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khoá luận Một lần em xin cảm ơn giúp đỡ thầy tồn thể bạn Em mong nhận ý kiến đóng góp q thầy để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! ĐHSPHN2, ngày 14 tháng năm 2007 Sinh viên NguyÔn Thị Hồng K29A SINH Mở Đầu A Lý chọn đề tài Rượu sản phẩm lên men nhân loại, ban đầu người ta đến vi sinh vật thực q trình chuyển hố đường thành rượu Trên di vật lưu chữ tìm thấy có hình vẽ từ thời cổ Hy Lạp minh hoạ trình nấu rượu Các hình vẽ Kim Tự Tháp cho thấy nghề nấu rượu phát triển vùng Riêng nghề làm rượu vang có trước người phát nấm men (thế kỉ XVII) trước Louis Pasteur khám phá chất trình lên men (1854 - 1864 ) Rượu vang trở thành loại đồ uống ưa thích hầu giới Người ta biết đến rượu vang sản phẩm lên men tự nhiên từ nước ép trái nho Mỗi nước có sản phẩm vang tiếng trở thành thương hiệu giới biết đến loại vang Pháp, Italia, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Mỹ, Hà Lan với loại rượu tiếng Brandy, Champagne, Sherry (Fino, Oloroso, Amontillado), Port, Medeira, Venmouth [15] Ngày nay, với hiểu biết chất trình lên men rượu hiểu biết nấm men rượu vang lên men từ nguồn hoa khác Việt nam số nước giới sản xuất số loại rượu vang từ nguồn nguyên liệu như: Anh Đào, Mơ, Dâu, Vải Thiều Thị trường vang nước giới phong phú Tuy vậy, rượu vang Việt Nam biết đến chưa nhiều chưa có sản phẩm đặc sắc tiếng Với tâm nguyện tạo cho Việt Nam sản phẩm vang đặc trưng tiếng nước giới, chúng tơi tiến hành tìm kiếm nguồn ngun liệu để lên men vang Thông qua việc quan sát phân tích sơ số tiêu, chúng tơi nhận thấy: Quả táo mèo có triển vọng việc sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất vang Cũng có số cơng trình nghiên cứu vang Táo Mèo, chúng tơi nhận thấy nhiều yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến trình lên men chưa khám phá kỹ Đối tượng nấm men phân lập từ Táo Mèo chưa nghiên cứu sâu Do vậy, định tiến hành đề tài nghiên cứu: “Tuyển chọn chủng nấm men, tìm điều kiện tối ưu cho trình lên men vang Táo Mèo” Với mong muốn tiêu kết phân tích hỗ trợ cho nghiên cứu nấm men Và quy trình lên men mở rộng quy mô sản xuất Rượu vang Táo Mèo sản phẩm đặc trưng bổ sung vào phong phú cho thị trường vang Việt Nam B Mục tiêu nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng nấm men lên men vang từ dịch Táo Mèo Định loại chủng nấm men Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng tuyển chọn Tách chiết DNA tổng số Lên men rượu vang Táo Mèo quy mơ phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình lên men C Đối tượng nghiên cứu - Quả Táo Mèo (Docynia indica) - Chủng nấm men có khả lên men vang Táo Mèo D Ý nghĩa lí luận thực tiễn cơng trình - Nghiên cứu đặc tính sinh lí, sinh hố chủng nấm men có khả lên men vang Táo Mèo Tách chiết DNA tổng số Kết nghiên cứu dẫn liệu góp phần bổ sung cho nghiên cứu nấm men ứng dụng nấm men đời sống - Tạo sản phẩm vang làm phong phú thị trường vang nước giới E Cấu trúc luận văn Ngoài phần mở đầu, mục lục, phụ lục, danh mục, tài liệu tham khảo, đề tài gồm chương: Chương Tổng quan tài liệu Chương Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Chương Kết nghiên cứu thảo luận Chương Kết luận đề nghị CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu chung rượu vang 1.1.1 Khái niệm rượu vang Rượu vang sản phẩm lên men không qua chưng cất từ nước ép loại hoa như: Nho, Dâu, Mơ, Vải Thiều, Táo Theo từ điển viện hàn lâm ẩm thực Pháp, rượu vang định nghĩa sau: “Là chất lỏng sinh động, rượu vang mang bệnh, già chết” Thành phần chủ yếu rượu vang gồm có: - Rượu Etylic: Đây sản phẩm q trình lên men, q trình chuyển hố đường thành rượu điều kiện kỵ khí Hàm lượng Etanol rượu vang thường mức 10 – 14 độ rượu Đây sản phẩm giai đoạn lên men Phương trình hố học biểu diễn chuyển hố đường thành rượu: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 33KCal - Các chất bổ dưỡng có vang: Đường vang từ 62-132g/l Chủ yếu glucoza, fructoza .và galactoza - Các axit vô hữu cơ: axit malic, axit tartaric, axit citric, axit axalic hàm lượng axit tổng số từ 4-7 g/l(quy axit tartaric) 1.1.2 Phân loại rượu vang Có nhiều cách để phân loại rượu vang Hiện chia rượu vang thành loại sau: - Vang không gaz (still wines) Nổi tiếng vang không bọt Pháp, kể đến Ý, Đức, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Nga, Mỹ - Vang có gaz (Spanking wine) tiêu biểu Champagne Champagne tiếng Pháp, người ta phân biệt loại Champagne: + Loại khơng (brut) + Loại đường (extra dry, extra see) + Loại (sec;dry) Ngồi có loại rượu pha trộn từ nhiều loại vang khác tạo thành như: Brandy, sherry, rượu thơm (chủ yếu vermouth) [15] - Căn vào màu sắc chia rượu vang (chủ yếu vang nho) thành loại: + Vang đỏ: lên men từ nho đỏ có xác + Vang trắng: lên men từ nước ép nho trắng nước ép nho đỏ + Vang hồng: lên từ nho đỏ xác thời gian tiếp xúc xác dịch ép ngắn [14] 1.1.3 Nguồn nguyên liệu sản xuất vang Nguyên liệu sản xuất vang dịch ép loại trái tươi dịch chiết siro loại trái như: Nho, Mơ, Dâu, Táo, Vải, Anh đào Thành phần hoá học số loại trái dùng để lên men vang bảng 1.1 bảng 1.2 Bảng 1.1 Thành phần hoá học số loại Thành phần hoá học (%) Tên Nước Đườn axit Pectin Tanin g Nho 73,1 9,88 0,56 0,092 0,07 Vải 84,28 16,1 5,16 0,249 0,83 Dứa 54,3 3,9 0,6 0,249 0,83 Mơ 73,8 9,0 1,1 0,249 0,83 Dâu 84,74 9,19 0,49 0,31 0,035 Bảng 1.2 Thành phần hoá học dịch táo mèo STT Thành phần hóa học Đơn vị Đường tổng số Nơi thu mẫu Trung bình Yên Bái Sơn La % 4,8 4,82 4,81 Axit tổng số % 1,45 1,48 1,47 Vitamin C mg/l 11,0 11,4 11,22 Nước % 84,0 85,1 84,6 Protein toàn phần % 0,92 0,92 0,92 Ph 2,8 3,0 2,9 Các tiêu hàm lượng đường, pH, axit tổng số cho thấy dùng táo mèo làm nguyên liệu cho lên men rượu vang 1.2 Hệ vi sinh vật tham gia vào trình lên men vang bệnh vang 1.2.1 Nấm men 1.2.1.1 Cấu tạo hình thái tế bào nấm men - Cấu tạo tế bào: Nấm men thuộc lồi Saccharomyces đối tượng tham gia vào q trình chuyển hố đường thành rượu Nấm men vi sinh vật nhận thực, có cấu tạo đơn bào cấu tạo phức tạp vi khuẩn Thành tế bào quan bảo vệ trì hình dạng tế bào Thành chứa chất có khả kết dính Điều có ý nghĩa lớn cơng nghệ sản xuất bia, rượu Thành có thành phần hố học chủ yếu hemixenluloza(70% trọng lượng khơ) Ngồi có kitin 1- 3%, protein 6- 10%, lipit 8- 8,5%, khoáng7% Thành phần nội bào quan trọng nấm men ty thể, khơng bào nhân Số lượng ty thể khoảng 10- 20/ tế bào Chúng có vai trò quan trọng q trình sinh trưởng sinh sản nấm men Không bào hình thành từ thể golgi hay mạng lưới nội chất Không bào chứa hệ thống keo bao gồm: enzym, protein, hydrocacbon, muối canxi, kali, phenolflavin, ribo flavin, axit nucleic chất dự trữ khác Nhân có hình ovan, hình tròn nằm gần khơng bào trung tâm với kích thước khoảng 2,4µm Nhân chứa tồn hệ gen tham gia điều khiển trình sinh tổng hợp tế bào nấm men - Hình thái tế bào: đa số có hình trứng, cầu hay hình Ovan Kích thước tế bào từ 3-10µm, 5-12µm Hình thái kích thước tế bào thay đổi theo điều kiện môi trường nuôi cấy Khi mơi trường nghèo dinh dưỡng nấm men thường có dạng hình giày 1.2.1.2 Sinh sản tế bào nấm men Nấm men sinh sản vơ tính hình thức đâm chồi q trình có xen lẫn hình thức sinh sản hữu tính Nảy chồi hình thức sinh sản phổ biến Khi tế bào phát triển đến mức độ định thể nảy chồi nhỏ mầm Mầm (tế bào con), phát triển thể mẹ, tách khỏi thể mẹ để phát triển độc lập Trong điều kiện thuận lợi 20 đến 30 phút có hệ tế bào hồn chỉnh Nấm men Saccharomyces có khả hình thành bào tử Bào tử túi sinh túi nhỏ gọi túi nang Mỗi túi nang chứa 1-8 bào tử Nấm men Saccharomyces hình thành theo lối sinh sản vơ tính Đó q trình tạo bào tử trực tiếp từ tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp Bào tử túi sau khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi phát triển thành tế bào nấm men Tiếp theo tế bào lại sinh sản theo lối nảy chồi * Nấm men dùng lên men rượu vang Saccharomyces cerevisiae Theo quan điểm kinh tế người ta chia thành chủng: - Chủng lên men với hiệu suất cao thời gian tối ưu sản sinh tới 20%V cồn - Chủng lên men thời gian ngắn, lên men tạo 8-12%V cồn - Chủng chịu nồng độ cồn cao, lên men rượu vang 30% đường tạo 10-13%V cồn 1.2.2 Vi khuẩn Trong nước rượu vang phát triển dạng vi khuẩn có tính ổn định lớn với rượu axit hữu Chúng nguyên nhân gây nên biến đổi sâu sắc rượu vang vị chua, mùi, có loại gây đục vang Đó thường loại vi khuẩn: Acetobacter xyllium, Acetobacter aceti Louis Pasteur tìm chế làm hỏng vang rượu vang tiếp xúc với khơng khí có vi khuẩn Bacillus Do vậy, để bảo quản rượu vang người ta trùng Pasteur Nhưng phương pháp làm giảm chất lượng vang Ngoài ra, người ta dùng phương pháp vi lọc dùng số chất bảo quản SO2 (75120mg/l) 1.2.3 Nấm mốc Nấm mốc phát triển chất bã sản xuất rượu vang, thùng thiết bị khơng khí Một số loại nấm mốc hay gặp thuộc chi: Rhizopus, Aspergillus 1.2.4 Vi sinh vật làm hỏng vang Có khơng vi sinh vật làm cho vang bị đục, bị chua gắt có mùi khó chịu, làm cho vang bị hỏng như: Acetobacter xylium, Acetobacter aceti [8] Các vi khuẩn kị khí: vi khuẩn lactic như: Lb.brevia, Lb.pastoerianus, Lb.plantarum làm cho vang bị vẩn đục, chúng tác động làm chuyển hoá axit citric, tạo lượng lớn axit lactic, axit axetic 2,3 butadiol Các vi khuẩn hiếu khí: số lồi nấm men tạo màng bề mặt vang như: Candida, Zygopichia, Pichia phân giải đường thành axit hữu cơ: xitric, axetic làm cho vang bị đục, độ chua tăng, vị không ngon [11] 10 1.3 Ảnh hưởng yếu tố tới trình sinh trưởng phát triển nấm men 1.3.1 Nguồn cacbon - Cacbon nguồn nguyên liệu kiến tạo nên khung tế bào nấm men Là thành phần quan trọng tất chất trao đổi Cacbon nguồn dinh dưỡng hàng đầu cho vi sinh vật - Nguồn cacbon cung cấp cho nấm men Saccharomyces cerevisiae lấy chủ yếu từ nguồn đường: Glucoza, saccaroza, fructoza - Nguồn cacbon đáp ứng nhu cầu nấm men + Sản sinh lượng thơng qua q trình oxi hố khử + Tạo thành tiền chất + Tham gia vào q trình oxi hố khử 1.3.2 Nguồn nitơ khoáng chất Nitơ thành phần quan trọng tế bào vi sinh vật, nguyên tố cấu thành lên axit nucleic Nitơ cung cấp cho vi sinh vật chủ yếu từ nguồn: nguồn vô nguồn hữu 1.3.3 Ảnh hưởng oxy Quá trình tăng sinh nấm men trình hiếu khí oxy nguồn quan trọng để nấm men tăng sinh khối giai đoạn nhân giống 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men 1.4.1 Hàm lượng cồn pH Nấm men lên men sản sinh lượng cồn Nồng độ cồn thích hợp cho nấm men phát triển tốt 9-14%V Khả chịu cồn lên men tốt mơi trường có nồng độ cồn thích hợp tiêu chí để tuyển chọn chủng nấm men cho trình sản xuất rượu 32 Dùng pipet 10µl hút 3µl dung dịch DNA trộn với 2µl dung dịch đệm 6x Sucarose , dùng pipet 10µl nạp mẫu vào giếng gel thao tác phải xác để tránh mẫu - Bước 3: Chạy điện di Sau nạp gel xong nối dòng điện dẫn vào bồn với nguồn, tiến hành chạy điện di 50V vòng 60 phút - Bước 4: Xử lý gel sau điện di Sau chạy điện di gel lấy soi tia uv, ánh sáng uv ta thấy giải băng sáng phát huỳnh quang có màu vàng cam Ta quan sát nhiều giải huỳnh quang có kích thước khác bao gồm: phân đoạn DNA genom có phân tử gam, phân tử RNA DNA bị đứt gãy Sau tiến hành thu DNA genom từ gel Để thu DNA genom ta tiến hành cắt đoạn gel chứa DNA genom ngâm vào dung dịch đệm thích hợp, DNA khuyếch tán từ gel dung dịch đệm Sau tiến hành tinh DNA dùng để chạy PCR 3.4.4 Nhân gen PCR đọc trình tự gen chờ kết * Kết kết luận Chúng tiến hành tách chiết thu DNA genom nấm men chủng TM4 phân lập từ dịch táo mèo (Hình 3.3) Trên nghiên cứu bước đầu để thu DNA tổng số sử dụng cho bước quy trình giải trình tự đoạn DNA quy định RNA-18S 33 Hình 3.3Ảnh chụp gel sau điện di soi tia uv 3.5 NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI LÊN MEN VANG TÁO MÈO Động thái lên men vang q trình chuyển hố đường hợp chất hữu có dịch thành rượu, axit hữu cơ, vitamin, chất thơm… làm cho vang có hương vị đặc trưng khác hẳn nhiều loại rượu khác Động thái lên men vang trình biến đổi phức tạp hợp chất, ảnh hưởng định đến chất lượng sản phẩm cuối Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tập chung nghiên cứu số biến đổi số chất hữu q trình lên men vang táo mèo biến đổi đường, axit tổng số, độ pH, hàm lượng rượu, số lượng tế bào nấm men…thông qua nghiên cứu động thái lên men vang 28 đầu ngày đầu trình lên men vang táo mèo 3.5.1 Động thái lên men vang trình nhân giống (24 giờ) Chúng tơi tiến hành lên men vang quy mơ thí nghiệm bình lên men có dung tích lít Mơi trường lên men dịch siro táo mèo pha loãng nước tới nồng độ đường tổng số 25% ( 250 g/l ) Tiến hành khử trùng môi trường K2S2O5 ( chứa 55% SO2 ) với hàm lượng 50 mg/l Sau tiếng bổ sung K2S2O5 vào môi trường tiến hành cấy giồng với tỉ lệ 34 5% v/v ( tương đương khoảng 12.106 tế bào/ml ) Các bình sau cấy giống chuyển vào tủ ấm 300C, giá trị pH khoảng từ 3,8-4,2 Tiến hành phân tích mẫu lần 24 liên tục, thu kết sau Bảng 3.5.1 Động thái lên men vang trình nhân giống(24 giờ) Chỉ tiêu Đơn Thời gian (giờ) vị 12 16 20 HLcồn %V 0.25±0.01 0.26±0.01 0.28±0.01 0.3±0.01 0.32±0.01 0.5±0.01 HLaxit tổng số g/l 4.6±0.01 4.65±0.01 4.7±0.01 4.76±0.01 4.82±0.01 4.9±0.01 HL đường tổng số g/l 25±0.1 25.5±0.1 24±0.1 23.5±0.1 23±0.1 22.5±0.1 HLđường khử g/l 62.6±0.02 61.5±0.02 60.0±0.02 59.8±0.02 58.2±0.02 57.8±0.02 3.8±0.1 4.0±0.1 4.01±0.1 3.95±0.1 4.0±0.1 3.84±0.1 12±1.1 16±1.1 38±1.1 48±1.1 82±1.1 160±1.1 pH SL tế bào x106/ ml Kết cho thấy : nửa ngày hàm lượng đường giảm chậm, số lượng tế bào nấm men tăng dần, hàm lượng etylic có tăng ít, thơng số khác có biến đổi không rõ rệt Theo nửa ngày thời gian nấm men làm quen với môi trường, số nấm men đề kháng yếu với SO2 bị tiêu diệt Những nấm men thích nghi tồn sinh sản nên điều dẫn đến tượng nửa ngày số lượng tế bào nấm men tăng lên chậm chạp, thông số khác biến đổi không nhiều lúc nấm men thực sinh sản chủ yếu Hàm lượng etylic tăng từ 0,25 ( nấm men dại hoạt động chậm chạp dịch siro tạo thành ) đến 0,54±0,01 Điều cho thấy ngày etylic sản xuất với hàm lượng Đó ngày nấm men thực trao đổi chất theo kiểu hiếu khí cách dùng oxy phần tử lưu lại bình lên men 35 Thời điểm từ 12h- 24h số lượng tế bào tăng lên nhanh, cách tiếng số lượng tế bào lại tăng gấp đôi, độ pH giảm hàm lượng axit tổng số có tăng không đáng kể Về mặt sinh trưởng, khẳng định : 24h kể từ cấy giống, giai đoạn từ - 8h ứng với pha tiềm phát, giai đoạn từ - 12h ứng với pha khởi phát pha cấp số mũ (logarit) Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả khác [6], [9] nghiên cứu đặc điểm sinh sản, phát triển Saccaromyces cerevisiae nghiên cứu lên men vang 3.5.2 Động thái trình lên men vang táo mèo Để xác định động thái trình lên men vang táo mèo, tiến hành lên men bình có dung tích lít Mơi trường lên men dịch siro táo mèo ( có hàm lượng đường tổng số khoảng 50% ) pha loãng nước tới nồng độ đường tổng số 25 % ( 250 g/l ) Tiến hành khử trùng môi trường K2S2O5 ( chứa 55 % SO2 ) với hàm lượng 50 mg/l Sau tiếng bổ sung K2S2O5 vào mơi trường tiến hành cấy giồng với tỉ lệ % v/v ( tương đương khoảng 12.106 tế bào/ml ) Các bình sau cấy giống chuyển vào tủ ấm 300C, giá trị pH khoảng từ 3,8-4,2 Tiến hành phân tích mẫu ngày lần 14 ngày liên tục, thu kết sau: 36 Biểu đồ 3.5.2 Động thái trình lên men vang táo mèo 30 25 20 15 10 SL tế bào 400 10 Thời gian (ngày) 15 HL cồn HL đường tổng số 300 200 100 11 13 Thời gian(ngày) SL tế bào Kết cho thấy : tế bào nấm men sinh sản nhanh vào ngày thứ đến ngày thứ tiếp tục trì ngày thứ 6, thứ 7, thứ 8, sau bắt đầu giảm dần giảm nhanh từ ngày thứ đến ngày thứ 12 trình lên men, đến ngày thứ 14 số lượng tế bào nấm men lại 47.106 tế bào/ml Số lượng tế bào đạt cực đại vào ngày thứ với số lượng tế bào là: 168.106 tế bào (đây thời gian pha log ) Theo ngày thứ ngày thứ nấm men sinh sản nhanh môi trường có nhiều dinh dưỡng, hàm lượng cồn thấp chưa có khả ức chế sinh trưởng phát triển nấm men Ngày thứ thứ ( thuộc pha cân động ) môi trường đủ dinh dưỡng để trì số lượng tế bào nấm men Nhưng từ ngày thứ trở hàm lượng cồn tăng nhanh, hàm lượng đường giảm mạnh, đặc biệt cạn kiệt nguồn đạm làm cho tế bào nấm men bị tự phân lắng xuống đáy bình Do số lượng tế bào vào ngày cuối giảm nhanh đến ngày thứ 14 47.106 tế bào/ml Về biến đổi hàm lượng cồn, nhận thấy độ cồn tăng nhanh 37 vào ngày thứ 3, đồng thời đường tổng số giảm mạnh vào thời điểm Từ ngày thứ trở độ cồn tăng chậm hàm lượng đường giảm chậm Quan sát mắt thường cho thấy từ ngày thứ đến ngày thứ số lượng bọt khí CO2 tạo nhiều, từ ngày thứ trở số lượng bọt khí bắt đầu giảm dần Như kết thí nghiệm cho thấy : biến đổi hàm lượng cồn hàm lượng đường có liên quan chặt chẽ với theo biến động số lượng tế bào nấm men Hàm lượng axit tổng số tăng dần, nhiên thay đổi hàm lượng axid tổng số không lớn Điều giải thích sau : q trình lên men rượu, ngồi việc tạo sản phẩm rượu tạo nên axit xucxinic, axetic, lactic Theo CH.Barthomenf (1986) từ 100 phần đường saccaroza thu 105,4 phần đường tự sau thủy phân thu 0,7 phần axit xucxinic[8] Sự tạo thành acid trình lên men dẫn đến làm giảm độ pH dịch lên men Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả nghiên cứu nấm men nói chung [9], [12] 3.6 NGHIÊN CỨU TÌM ĐIỀU KIÊN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN VANG TÁO MÈO Quá trình lên men vang nói chung nhiều yếu tố có mơi trường dịch lên men như: nhiệt độ, hàm lượng đường, pH, tỉ lệ men giống… Trong phạm vi đề tài này, tiến hành nghiên cứu yếu tố hàm lượng đường nồng độ NH4(SO4)2 3.6.1 Hàm lượng đường Hàm lượng đường có dịch lên men không ảnh hưởng đến hoạt động sống nấm men mà ảnh hưởng đến giá trị cảm quang sản phẩm, đường tạo vị với vị chua axit tỉ lệ thích hợp làm tăng giá trị cảm quang hương vị đặc trưng vang 38 Dịch lên men dịch táo mèo bổ sung đường saccaroza để hàm lượng đường ban đầu đạt mức độ 190g/l, 210g/l, 230g/l, 250g/l, 280g/l, pH=4, tiến hành lên men nhiệt độ 28-30oC Kết thu dẫn bảng 3.6.1 Bảng 3.6.1 Hàm lượng đường q trình lên men Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Hàm lượng đường(g/l) 180 210 230 250 280 Thời gian lên men Ngày 10 10 10 10 10 HL đường sót g/l 6,1 5,3 5,3 6,2 7,3 HL cồn %V 8,8 9,8 10,85 12.1 11,9 4,0 3,85 3,75 3,8 3,7 pH Qua nghiên cứu thấy hàm lượng đường dịch lên men tăng 180-280g/l hàm lượng đường sót tăng dần độ pH giảm Theo chúng tôi: hàm lượng đường dịch lên men tăng làm cho áp suất thẩm thấu dịch lên men tăng lên Hơn hàm lượng cồn tạo trình lên men tăng dần ức chế trình trao đổi chất hoạt động sống nấm men ức chế hoạt động nhiều loại enzym làm hiệu suất lên men bị giảm Khi hàm lượng đường dịch lên men 180-230g/l hàm lượng cồn thấp khó bảo quản ổn định chất lượng chất lượng trình tàng trữ tiêu thụ Hàm lượng đường dịch lên men 280g/l cao nấm men tồn mơi trường có hàm lượng đường cao Song hiệu suất lên men khả tạo cồn lại có giới hạn Do hàm lượng đường dịch lên men tăng cao hàm lượng đường sót tăng 7,3g/l trình chuyển hố đường thành rượu bị giảm, mà nguyên nhân hoạt động sống nấm men bị ức chế Từ kết cho thấy hàm lượng đường 250g/l phù hợp cho trình lên men vang táo mèo 39 3.6.2 Nồng độ (NH4)2SO4 Để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 tới trình lên men phải bổ xung vào dịch lên men hàm lượng (NH4)2SO4 nồng độ: 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% Ở pH=4, hàm lượng đường 250g/l, hàm lượng men giống 10% Kết nghiên cứu bảng 3.6.2 Bảng 3.6.2 Nồng độ NH4(SO4)2 môi trường lên men (NH4)2SO4 Chỉ tiêu phân tích 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% 0,5% Ngày 9 9 Hàm lượng đường sót G/l 6,00,2 5,60,2 5,70,2 6,30,2 7,00,2 Hàm lượng cồn %V 10,20,2 110,2 11,20,2 100,2 9,50,2 3,80,2 3,80,2 3,70,2 3,50,2 3,20,2 Đơn vị Thời gian lên men PH Qua ta nhận thấy: (NH4)2SO4 khoảng 0,2-0,3% trình lên men cho kết hàm lượng đường sót thấp (5,6%), hàm lượng cồn cao (1111,2%V), pH cao 3,7- 3,8 Có với hàm lượng (NH4)2SO4: 0,2-0,3% hàm lượng thích hợp Nó cung cấp ngun liệu cho trình tổng hợp phần tế bào chứa Nitơ Đồng thời hàm lượng điều chỉnh hoạt tính Enzym đồng hố loại thức ăn chứa cacbon, thúc đẩy trình trao đổi chất tế bào nấm men Tuy nhiên, bổ xung nhiều làm giảm pH (ở mức 0,5%Ph thấp = 3,2) làm dối loạn trình trao đổi chất tế bào Nếu (0,1%) tốc độ lên men yếu, hàm lượng cồn thấp, hàm lượng đường sót cao Kết luận: Ở nồng độ 0,2-0,3% (NH4)2SO4 thích hợp cho trình lên men vang Táo Mèo 40 3.7 ỨNG DỤNG LÊN MEN VANG TÁO MÈO VỚI QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM Qua kết nghiên cứu tiến hành lên men vang táo mèo với môi trường lên men TM3 thực nghiệm trình lên men ở: nhiệt độ 28oC pH: 4,5, tỷ lệ men giống 10% với quy mơ phòng thí nghiệm bình lên men lit sau 17 ngày kết thúc giai đoạn lên men đánh giá rượu thành phẩm cảm quan sau chuyển tiếp lên men phụ Kết phân tích dẫn bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết phân tích rượu thành phẩm Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Mẫu Độ rượu %V 12,5 Đường sót % 5,0 Acid(%) % 0,48 Độ pH 4,2 Sản phẩm đánh giá cao Trên sở chúng tơi xây dựng quy trình cơng nghệ lên men vang táo mèo 41 3.8 QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ LÊN MEN VANG TÁO MÈO 3.8.1 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất vang táo mèo Môi trường nhân giống Giống Quả táo mèo chín Rửa bổ sung đường Giống cấp Dịch Giống cấp Giống cấp Mơi trường lên men Lên men (15 dến 17 ngày) Vang non Lên men phụ Lọc Tàng trữ Lọc Đóng chai 42 3.8.2 Thuyết minh cơng nghệ Quy trình sản xuất vang táo mèo bao gồm giai đoạn là: - Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men - Giai đoạn 1: Lên men - Giai đoạn 3: Lên men phụ (Ủ chín vang ) - Giai đoạn 4: Hoàn thiên chất lượng tiêu thụ sản phẩm 3.8.2.1 Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men Quả thu hoạch cần phải chọn lấy chín, loại bỏ non, dập nát thối Quả chọn đem rửa nước đạt tiêu chuẩn vệ sinh để nước Sau cho vào ang thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1 Quả táo mèo ta khía đường nhỏ quanh Khoảng hai ngày khuấy trộn lần Sau tháng ta thu thứ siro nước có nồng độ đường khoảng 60-80 % nhiều dưỡng chất khác chiết từ thịt 3.8.2.2 Giai đoạn 2: Lên men Bổ sung nấm men vào dịch lên men (thường tỉ lệ 5-7%V) Điều chỉnh nhiệt độ phù hợp cho trình lên men vang táo mèo 26-28oC, suốt trình lên men vang phải tiến hành phân tích mẫu kiểm tra nấm men thường xuyên để điều chỉnh trình lên men cho phù hợp để hạn chế thất cồn, hương thơm…trong q trình lên men chính, cần thiết phải lên men gần đầy bình, nên giữ áp lực mức thấp Quá trình lên men vang táo mèo thường kết thúc sau 15-17 ngày 3.8.2.3 Giai đoạn 3: Lên men phụ (Ủ chín vang) Quá trình lên men phụ (ủ vang) nên giữ nhiệt độ