tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng pcr đa mồi đặc hiệu methyl hóa cho các promoter wp, cp và qp c

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các quần thể dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Nơi có tỷ lệ ung thư vòm cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu lại có tỷ lệ rất thấp. Các nước đông nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình. Virut Epstein-Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác và sự nhạy cảm di truyền đều cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng và EBV là yếu tố được nghiên cứu nhiều nhất. EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không biệt hóa và tồn tại các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ các gen quan trọng là EBNA1, LMP1 và 2. EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV trong tế bào chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào và có khả năng sinh ung thư trong các tế bào bị nhiễm. Các gen này nằm xa nhau trong bộ gen và được biểu lộ nhờ những promoter khác nhau. EBNA1 được biểu lộ trong các thể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter, bao gồm Cp, Wp và Qp. Tuy nhiên trong ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều hòa biểu lộ gen EBNA1. Ngoại di truyền được cho là có vai trò rất quan trọng trong điều hòa biểu lộ gen, chúng bao gồm methyl hóa ADN vùng promoter, sửa chữa histon và nucleosom. Mức độ methyl hóa xảy ra ở các vị trí CpG của ADN tại vùng promoter và exon1 có vai trò trong điều hòa biểu lộ gen, có thể làm giảm biểu lộ hoặc không biểu lộ hoàn toàn một gen mà bình thường vẫn được biểu lộ. Việc xác định mức độ methyl hóa vùng khởi động của một gen có ý nghĩa quan trọng trong tìm hiểu cơ chế bệnh sinh của bệnh liên quan đến chức năng gen đó trong nhiều quá trình bệnh lý như ung thư, đồng thời dấu ấn này cũng 2 góp phần trong chẩn đoán sớm trong ung thư. Ngoài ra, việc làm mất methyl hóa có tác dụng làm gen hoạt động trở lại và thực hiện chức năng của chúng, giúp cho việc điều trị những rối loạn hay bệnh lý khác nhau. Hiện nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thể xác định được mức độ methyl hóa của một gen đặc hiệu hay toàn bộ bộ gen. Các kỹ thuật này dựa vào những nguyên lý khác nhau, có những kỹ thuật rất phức tạp, nhưng có những ký thuật đơn giản và thông dụng. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa theo nguyên lý xử lý ADN bằng phương pháp bisulfite để xác định mức độ methyl hóa các promoter Wp, Cp và Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi đối với các promoter đó. Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền ở mức độ ADN của nhiều gen, đặc biệt là các gen ức chế ung thư. Đề tài này nhằm mục đích sau: 1. Tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa cho các promoter Wp, Cp và Qp của EBV, sử dụng các nguyên liệu là các tế bào dòng. 2. Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu xác định mức độ methyl hóa các promoter điều hòa biểu lộ gen EBNA1 trong các mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam. Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), một khối u phát triển từ các tế bào biểu mô nằm ở vị trí cửa mũi sau và vòm họng, là loại đứng hàng đầu trong số các ung thư vùng đầu mặt cổ, với tính chất dịch tễ học khá đặc biệt là liên quan tới địa lý. Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp thành 3 vùng rất khác nhau: Khu vực có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen với tỷ lệ mới mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm. Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹ chỉ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm. Còn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình nhưng ngày càng có xu hướng tăng lên, đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee và đông nam Á với tỷ lệ từ 8 - 12/100.000 dân (23,39)Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ 5 trong các ung thư nói chung và đứng hàng đầu trong các ung thư ở vùng đầu mặt cổ [4] 1.2. Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH 1.2.1. Vai trò của virut Epstein-Barr . Virut Epstein-Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được nghiên cứu nhiều nhất cho thấy có liên quan chặt chẽ của nó với UTVMH. Người ta phát hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không biệt hóa (UCNT) và EBV được phát hiện là từ tế bào UTVMH chứ không phải từ lympho thâm nhiễm đã được chứng minh từ chuột trụi lông được truyền khối u lấy từ bệnh nhân UTVMH, khối u này không chứa lympho thâm nhiễm (Klein và cs 1974) [trích từ 89]. Ngoài ra, các sản phẩm gen của EBV là EBER, EBNA1 và LMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu sinh thiết UTVMH hoặc ở tổn thương quá sản tại biểu mô 4 vòm họng gồm những dòng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV. Điều này phù hợp với giả thuyết cho rằng EBV là một trong những yếu tố khởi phát trong cả quá trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển của UTVMH [124]. Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nó trong khối u vòm họng, người ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh nhân. Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân UTVMH cao hơn 8 - 10 lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác hoặc người khỏe về lâm sàng (Henle và cs 1970, 1973; Klein và cs 1970) [trích từ 89 c.binh]. Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường qui ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [6],[8],[7],[13],[18],[25],[156] , có giá trị để theo dõi và phát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có giá trị là một dấu ấn quan trọng theo dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng cao( ref). Người ta cho rằng sự tái hoạt hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triển của UTVMH và nó tương quan với nồng độ IgA/VCA [89]. 1.2.2. Môi trường sống và thói quen sinh hoạt Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô nhiễm liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn uống. Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết quả phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) là nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muối ngay từ nhỏ. Dùng cá muối hàng ngày có thể làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần. Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa EBV hoặc trực tiếp thông qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyển dạng do EBV. Các bằng chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde có giá trị thấp trong bệnh sinh ung thư vòm họng. 5 1.2.3. Yếu tố di truyền Người ta thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ lệ mắc thấp hơn so với những người sinh ra ở đất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lệ mắc chuẩn vẫn cao hơn dân số nói chung [2]. Điều đó cho thấy rằng yếu tố di truyền có vai trò trong bệnh sinh của UTVMH. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu mối liên quan giữa HLA và UTVMH cho thấy có tăng nguy cơ mắc UTVMH với tăng tần suất các kháng nguyên A11, A2, B17 và liên kết mất cân bằng A2-B17, A11- B17 [13],[20]. Việc xác định các gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh lý cũng đã được nghiên cứu : CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M1 [111],[153]. Cơ chế tác động của chúng cho đến nay vẫn chưa được rõ ràng, song điều hiện nay đã và đang được khẳng định là sự phát triển UTVMH là do sự phối hợp tác động của 3 yếu tố môi trường sống, EBV và HLA 1.3. Virut Epstein-Barr 1.3.1. Sinh học của EBV Trên thực tế, hơn 90 % người trưởng thành trên thế giới nhiễm EBV và nó tồn tại lâu dài trong cơ thể nhiễm. Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt và ở lứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường không có triệu chứng. Ngoài ra, EBV có thể được lây nhiễm qua máu, tổ chức và cũng có thể qua sữa của mẹ truyền sang con, thậm chí là thông qua quan hệ tình dục. EBV nhân lên trong tuyến nước bọt, sau đó qua biểu mô vòm họng rồi xâp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 trên bề mặt tế bào. Sau khi đi vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở dạng vòng là chủ yếu và tự nhân lên nhờ nguyên liệu của tế bào. Tuy nhiên, EBV cũng tích hợp vào DNA của nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ ở tế bào dòng Namalwa, nó tích hợp vào nhiẽm sắc thể ở vị trí 1p35. Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong lympho B, EBV biểu lộ rất ít kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm quá thấp (1 tế bào lympho 6 B/1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn dịch. Khi ở thể dung giải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngoài rồi lại nhiễm vào các tế bào lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân lên trong cơ thể. Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho rằng virut có thể vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra là sự tiếp cận giữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV. Tế bào B đi vào chu trình dung giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus mới cho các tế bào khác trên một diện rộng (Bayliss và Wolf 1980,1981) [trích từ 89]. Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu mô bởi hiện tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA (Sixbey và Yao, 1992) [trích từ 89]. Ngoài ra, phân tử MHC lớp II cũng có thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu mô [10]. Ngoài các tế bào lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởi các tế bào máu khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Nature Killer cell). 1.3.2. Cấu trúc của EBV EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nó khoảng 172-kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid. Suốt chiều dài của gen có thể chia làm 4 vùng chính: 1 chuỗi ngắn duy nhất (US- short unique ), 1 chuỗi lặp ( IR- internal repeat), 1 chuỗi dài duy nhất (UL - long unique ) và 1 chuỗi lặp cuối cùng ( TR - terminal repeat ). EBV hình thành phân tử DNA dạng vòng ở tế bào bị nhiễm bởi đầu TR của nó.(hình 1A). Khi xử lý EBV của dòng tế bào B95-8 bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn gen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ cái và theo thứ tự kích thước giảm dần. (hình 1B). Thuật ngữ sử dụng cho từng đoạn như sau: Theo mỗi chữ là ký hiệu cho từng đoạn ( A, B …), đọc trực tiếp ( trái hoặc phải) và số bắt đầu 7 theo thứ tự (1,2,3…) ví dụ như BARF0, BARF1. EBV của dòng tế bào B95-8 được giải trình tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân hàng gen là V01555 [1]. Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác nhau (các phân tử protein lớn) trong thể dung giải của nó, ngược lại, chỉ có khoảng 10 kháng nguyên được sản xuất trong các thể nhiễm tiềm ẩn [2] Hình 1. Sơ đồ cấu trúc của EBV 1.3.3. Thể tiềm ẩn của EBV Giống như tất cả các virut herpes, EBV có thể tồn tại dạng không hoạt động trong tế bào bị nhiễm. Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, nhưng chỉ có 10 gen trong số này được phiên mã để tổng hợp protein, bao gồm 6 loại protein là kháng nguyên nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,,3A,3B,3C, -LP; 3 loại protenin màng tiềm ẩn ( Latent Membrane Protein): LMP1, 2A, 2B; 2 loại RNA không mã hóa (EBV Early RNA) : EBER1&2. Có bốn thể tiềm ẩn được phân loại dựa trên sự biểu lộ gen của virut ( được liệt kê theo bảng dưới) [11]. BamHI IR UL TRUSTR C B A A EBER1&2: EBV Early RNA EBNA1-6: EBV Nuclear Antigen LMP1&2: Latent Membrane Protein 8 Bảng 1: Thể tiềm ẩn Biểu lộ gen EBV Người thường và các bệnh liên quan 0 EBER1 & 2 LMP2A +/- Người thường I EBER1 & 2 EBNA1 U lympho Burkitt, NPC II EBER1 & 2 EBNA1 LMP1 LMP2A&2B NPC, U lympho loại Hodgkin U lympho tế bào T, ung thư tuyến nước bọt… III EBER1&2 EBNA1- 6 LMP1 LMP2A & B U lympho sau ghép tạng. U lympho ở bệnh nhân AIDS, bạch cầu đơn nhân nhiễn khuẩn, DLBCL? 1.3.4. Các gen EBVcủa thể nhiễm tiềm ẩn 1.3.4.1. EBNA1 Protein EBNA1 của EBV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng khoảng 66-95 kDa và chiều dài là 641 axit amin. Kích thước này được thay đổi ở các chủng khác nhau do sự khác nhau ở đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly- Ala) [58]. Các cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia thành bốn vùng rõ ràng: một vùng cơ bản nằm ở đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm 239 acid amin, vùng cơ bản ngắn và một vùng gắn DNA ở đầu C có chiều dài từ 459-641 [59, 60] (Hình 3). EBNA1 là protein biểu lộ ở tất cả các tế bào nhiễm EBV [61-64] và nó đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì episom của EBV (dạng vòng) trong nhân tế bào chủ, cũng như chức năng phiên mã của virut [65, 66]. Vùng gắn ADN của protein EBNA1 tương tác với hai vùng nằm ở vùng oriP của 9 prômôtơ Cp, bao gồm gia đình lặp đi lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nucleitid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyat Symetry) có 4 vị trí gắn, và một vùng có hai vị trí gắn xuôi chiều của Qp. Hình 2. Cấu trúc của EBNA1 Liên kết EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so với DS và Qp và khi gắn với FR thì nó điều hòa phiên mã các gen EBNA. Các gen này được biểu lộ dưới sự kiểm soát của prômôtơ Cp hay các prômôtơ Wp. EBNA1 cũng có thể liên kết với các intron đầu tiên xuôi chiều của prômôtơ Qp làm tự điều hòa biểu lộ protein EBNA1 [72]. Ở các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các prômôtơ Cp không hoạt động và biểu lộ của EBNA1 được thực hiện bởi Qp. Cp không hoạt động do các yếu tố phiên mã và methyl hóa ADN [73, 74]. 1.3.4.2. EBNA2 Protein EBNA2, có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa. Do có trình tự gen khác nhau ở các chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A và EBNA2B, cũng là dấu ấn quan trọngđể xếp loại EBV typ I và typ II [78]. Các protein EBNA2A và EBNA2B chứa 484 và 443 axit amin một cách tương ứng và giống nhau về trình tự khoảng 57% [79, 80]. EBNA2 là một trong những protein virut đầu tiên được biểu lộ ở các tế bào lympho B bị nhiễm, xuất hiện 24-48 giờ sau khi nhiễm EBV ở nuôi cấy tế bào in vitro[81]. Protein này là mộtchất kích hoạt phiên mã gen đặc hiệu của virut và tế bào bao gồm cả những gen như CD21, CD23, Bcl-2 và c-myc [82, 83], và là cần thiết cho sự bất tử của tế bào B trong in vitro [84, 85] . EBNA2 không gắn trự tiếp với ADN, nhưng tác động thông qua các protein in khác như RBP-JK), PU1 các protein các tế bào khác. 1.3.4.3. Gia đình EBNA3 ( EBNA3A, 3B và 3C) 10 Các gen trong gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B và 3C nằm ở giữa bộ gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự và có trọng lượng phân tử từ 140-180 kDa. Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B và 3C giữa EBV typ 1 và II có giống nhau ở 84%, 80% và 72% một cách tương ứng [89]. Các protein này hoạt động có chức năng phiên mã và cũng có thể tương tác với các protein RBP-JK [90]. 1.3.4.4. EBNA-LP Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác nhau từ 20- 130 kDa, là kết quả của hoạt động prômôtơ Wp . Cùng với EBNA2, EBNA- LP là một trong những protein đầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào lympho B in vitro 1.3.4.5. LMP1 Protein LMP1 được phiên mã từ vùng BNLF1 nằm ở gần cuối đầu 3'của bộ gen EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng virus [104, 105]. Ở chủng EBV của tế bào dòng B95-8, protein này có ba vùng, (i) một vùng đầu N gồm 24 axit amin, (ii) sáu vùng xuyên màng kỵ nước được kết nối bởi ba vòng bên ngoài và hai vòng nội bào (iii) một vùng đầu C có 200 acid min bao gồm hai lĩnh vực chức năng quan trọng[104, 106] được gọi là vùng hoạt hóa CTAR1 (C-Trminal Activation Region1: aa194- 232) và CTAR2 ( aa 351-386). LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng , di căn và chống lại chết theo chương trình LMP1 được coi là sản phẩm của một gen sinh ung thư vì nó có thể làm chuyển dạng các nguyên bào sợi động vật gặm nhấm, biến đổi tế bào Rat-1 trong ống nghiệm để tăng trưởng độc lập, và là tumorigenic ở chuột nude [109]. Biểu hiện của LMP1 cũng tác động ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của tế bào biểu mô, ức chế sự biệt hóa của [...]... c chế c c yếu tố điều hòa biểu lộ gen gắn vào vùng khởi động do g c CH3 gắn vào Xytosin, c chế này đư c minh họa trong hình (?) Hai là, c c c protein gắn đ c hiệu với CpG methyl hóa làm mất axetyl c a histon và làm c u tr c sợi chromatin co lại , cuối c ng dẫn đến c c yếu tố phiên mã không gắn đư c vào vùng đó c a DNA (Hình ?) Hình 13 Chú thích (Hình ): Một c chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa. .. tiềm ẩn I và II chỉ c Qp hoạt động, c n thể nhiễm tiềm ẩn III, c hai promoter Wp và Cp hoạt động Hai promoter này hoạt động luân phiên và Wp đư c hoạt động trư c ở một thời gian ngắn, sau đó mới chuyển sang Cp hoạt động lâu dài hơn Hình 4 C c vùng promotor c a EBV điểu khiển phiên mã Vi c c c promoter đóng ho c mở đư c th c hiện bởi c c yếu tố kh c nhau, trong đó c methyl hóa c c CpG vùng promoter. .. luận án] 1.4.2 Methyl hóa ADN c c promotor c a EBNA1 14 EBNA1 đư c biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt hóa c a c c promoter kh c nhau ở những thể tiềm ẩn kh c nhau (Wp, Cp và Qp) và chu kỳ dung giải (Fp) Ở chu kỳ dung giải, EBNA1 biểu lộ do promoter Fp hoạt hóa, trong khi c c promoter kh c không hoạt động Ngư c lại, trong thể nhiễm tiềm ẩn Wp, Cp và Qp đư c hoạt hóa, tuy nhiên phụ thu c vào từng thể... exon 1c a khoảng 40% c c gen c a động vật c vú C chế gắn g c CH3 vào ADN 12 trong quá trình phân bào nhờ c c enzym methyltransferase (DNMT) C 4 loại DNMT đư c x c định ở động vật c vú và c 4 enzym đều chuyển nhóm CH3 từ S-adenosyl methionin sang ADN Trong c c mô bình thường c c đảo CpG thường không methyl hóa Khi chúng bị methyl hóa ở vùng khởi động dẫn đến hai c chế điều hòa biểu lộ gen: Một là,... A: Hai nucleotid CpG ở vùng prômôtơ không methyl hóa, cho phép phiên mã xảy ra trong c c tế bào bình thường B: Phiên mã bị chặn bởi tăng methyla hóa trong vùng prômôtơ Do đó sự methyl hóa ADN c a c c gen trong c c tế bào ung thư hiện nay là một m c tiêu hấp dẫn điều trị và là một kiến th c mới trong lĩnh v c chẩn đoán phân tử, t c là, phát hiện sớm bệnh bằng sử dụng PCR để x c định methyl hóa ADN [... không c M c dù chưa biết đư c ch c năng c thể c a LMP2B, nhưng vi c biểu hiện mạnh mẽ c a n cho thấy rằng nó đóng vai trò quan trọng trong sinh h c của EBV [120] Trong khi ch c năng c a LMP2A đã đư c kiểm tra trong c c tế bào B Tuy nhiên, protein này biểu lộ ở một tỷ lệ thấp trong c c khôi u vòm họng 1.4 Yếu tố ngoại di truyền trong UTVMH Ngoại di truyền là nghiên c u c c c chế làm không biểu lộ gen... ẩn I và II, c c promoter Wp và Cp bị đóng lại, do đó EBV chỉ biểu lộ EBNA1 do Qp như trong trường hợp UTVMH Tuy nhiên, người ta vẫn chưa biết tại sao trong ung thư vòm mũi họng EBV lại chỉ c biểu lộ một số gen như đã nêu, kh c với trong một số ung thư liên quan đến EBV Nghiên c u về methyl hóa giúp tìm hiều c chế biểu lộ gen, đồng thời nó c ng là những dấu ấn giúp cho 15 chẩn đoán c ng như điều trị... kiện diễn ra do một nhóm CH3 liên kết đồng hóa trị với vị trí cacbon số 5 c a Xytosin nằm ở vị trí hai nu cleotid XytosinGuanin viết tắt là CpG (p là liên kết phosphodiester) Khi CpG tập hợp nhiều trong khoảng 200bp tại một ví trí nào đó trong gen c GC chiếm hơn 50% thì người ta gọi là đảo CpG Khoảng 10-15% CpG ở động vật c vú nằm ở vùng đảo CpG và đảo CpG thường xuất hiện ở vị trí vùng prômôtơ và. .. nghiên c u: - Thiết kế nghiên c u mô tả c t ngang - Trình tự kỹ thuật c n th c hiện: + Thiết kế mồi 17 + Chiết tách AND, ARN, Protein + Xử lý AND bằng Bisulfite + Chạy kỹ thuật PCR đơn mồi + Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đ c hiệu 2.3.2 Biến số và chỉ số nghiên c u: 2.3.3 Phương pháp thu thập thông tin - Quan sát và ghi kết quả xét nghiệm - Hồi c u thông tin từ hồ sơ bệnh án và điền phiếu theo mẫu (phụ l c kèm... lý số liệu C c số liệu đư c làm sạch trư c khi nhập vào máy tính Xử lý số liệu bằng phần mềm chương trình SPSS 15.0 với c c test thống kê thích hợp trong y h c 18 2.5 Sơ đồ nghiên c u Mẫu ARN ADN Tách chiết mẫu Protein RT-PCA Bisulfite MSP CDNA MMSP PCR 19 CHƯƠNG 3 DỰ KIẾN KẾT QUẢ 20 CHƯƠNG 4 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 21 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 22 KHUYẾN NGHỊ 23 KẾ HOẠCH NGHIÊN C U 1 Tiến độ về thời gian C c hoạt động . m c độ ADN c a nhiều gen, đ c biệt là c c gen c chế ung thư. Đề tài này nhằm m c đích sau: 1. Tìm điều kiện tối ưu cho một phản ứng PCR đa mồi đ c hiệu methyl hóa cho c c promoter Wp, Cp và. promoter Wp, Cp và Qp c a EBV, sử dụng c c nguyên liệu là c c tế bào dòng. 2. Ứng dụng PCR đa mồi đ c hiệu x c định m c độ methyl hóa c c promoter điều hòa biểu lộ gen EBNA1 trong c c mẫu sinh thiết. promotor c a EBV điểu khiển phiên mã. Vi c c c promoter đóng ho c mở đư c th c hiện bởi c c yếu tố kh c nhau, trong đó c methyl hóa c c CpG vùng promoter. Ở thể nhiễm tiềm ẩn I và II, c c promoter