Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Ứng dụng DNA Strip trong định danh và tính kháng thuốc của Mycobacterium

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Thực hiện xác định vi khuẩn lao và tính kháng thuốc theo phương pháp thông thường - Thực hiện Genotype MTBDRplus assay để xác định vi khuẩn và tính kháng thuốc v

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU

Nguyên liệu

Các loại hoá chất, thuốc thử, môi trường, thuốc kháng sinh và mẫu thử

- Các hoá chất: NALC-NaOH 4-6% (N-Acetyl-L-Cysteine & Sodium Hydroxide), Phenol, Alcohol, HCL, Tween 80, Fuchsin, Auramine O, KMnO 4,

- Pha thuốc nhuộm Ziehl Neelsen:

(a) Fuchsin: hòa 0.3 g basic fuchsin với 10 ml ethnol 95%

(b) Phenol: hòa 5.0 g phenol crytals với 100 ml nước cất ấm (c) Carbol fuchsin: trộn (a) với 90 ml (b)

(d) Acid Alcohol: hòa 3ml HCL đậm đặc với 97ml ethnol 95%

(e) Methylen blue: hòa 0.3g methylen blue chloride với 100ml nước

(a) Auramine O: 0.1 g auramine O hòa tan với 10 ml ethamol 95%

(b) Phenol: 3.0 g phenol crystals hòa tan với 87 ml nước cất (c) Trộn (a) với (b)

(d) Acid Alcohol: hòa 0.5 ml HCl đậm đặc với 100 ml ethanol 70%

(e) Potassium Permanganate (KMnO 4 ): hòa 0.5 g KMnO 4 với 100 ml nước cất

- Mycobacteria Grown Indicator Tube (7ml) - Bactec MGIT growth supplement:

10 % CO 2 và polypropylene 2.1.1.3 Kháng sinh, Kit:

- Isoniazid: Lot 2250351, - Rifampin: Lot 2250352 - Genotype MTBDRplus assay: Lot OV00050

Sử dụng chủng để kiểm chứng: chứng âm Mycobacterium avium

(ATCC # 25291), chứng dương M tuberculosis (ATCC # 25177), H37Rv,…

Các máy móc thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp II - Máy ly tâm lạnh (tube 50ml): 4 o C, 3000 vòng/phút, 15 phút - MicroCentrifuge :

Sức chứa 24 tube/1lần Tốc độ: 3.500 – 15000 v/phút Thang nhiệt độ : 4 – 40 o C - Máy lắc 150 lần/phút

- Kính hiển vi (quang học và huỳnh quang) - Tủ lạnh (2-8 o C)

- Tủ âm -20 o C - Tủ ấm 37 o C - Bactec MGIT 960 - Máy Vortex - Máy độ đục chuẩn - GenProbe 450i Luminometer

- Nồi hấp thanh trùng 140 lít

Dụng cụ

- Pipette Pasteur vô khuẩn - Pipette tự động: 5 -50μl, 50 - 200μl, 200 - 1000μl - Tube 50 ml có phân vạch chia thể tích trên thành tube và 1.5 ml…

- Lọ đựng mẫu thử 50 ml - Khuyên nuôi cấy

- Lọ thủy tinh: 20ml, 200ml, 500ml, 1000ml…

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Thu thập mẫu thử (đàm) Mẫu đàm đươc xử l theo phương pháp NALC NaOH

Mỗi mẫu đàm thực hiện phát hiện vi khuẩn và tính kháng thuốc của vi khuẩn lao theo phương pháp thông thường và Genotype MTBDRplus assay

+ Với phương pháp thông thường:

- Thực hiện soi KHV phát hiện vi khuẩn lao: sử dụng hai phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen và phương pháp nhuộm huỳnh quang

- Thực hiện nuôi cấy định danh vi khuẩn lao theo phương pháp thông thường bằng phương pháp môi trường Lowenstein-Jensen và phương pháp Mycobacterium Growth Indicator Tube

- Thực hiện xác định tính kháng thuốc của vi khuẩn lao theo phương pháp kháng sinh đồ thông thường trên môi trường MGIT phát hiện tính kháng thuốc Rifampin và Isoniazid

+ Với DNA Strip thực hiện trên thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay để xác định vi khuẩn và tính kháng thuốc của vi khuẩn lao với Rifampin và Isoniazid

Dựa trên các tiêu chí độ nhạy, độ đặc hiệu, thời gian trung bình thực hiện và an toàn sinh học, việc phân tích và so sánh phương pháp Genotype với phương pháp thông thường cho phép đánh giá hiệu quả và tính phù hợp của từng phương pháp trong chẩn đoán và giám sát bệnh truyền nhiễm.

SƠ ĐỒ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Genotype MTBDRplus assay - DNA Strip

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trong nghiên cứu này tổng số mẫu thử 326, thời gian thực hiện từ 08/2013 đến 06/2014

- Mẫu đàm đươc xử l theo phương pháp NALC NaOH

- Mỗi mẫu thực hiện soi phát hiện vi khuẩn kháng acide alcohol sử dụng hai phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen và huỳnh quang

- Thực hiện nuôi cấy theo phương pháp môi trường Lowenstein-Jensen và phương pháp môi trường MGIT

- Thực hiện kháng sinh đồ (KSĐ) theo phương pháp môi trường MGIT phát hiện tính kháng thuốc Rifampin và Isoniazid

- Thực hiện thử nghiệm Genotype MTBDRplus asssay để định danh và xác định tính kháng thuốc với Rifampin và Isoniazid của MTBC

- Phân tích, so sánh kết quả dựa vào độ nhạy, độ đặc hiệu, thời gian thực hiện và an toàn sinh học

2.3.1 Thu thập mẫu đàm - Mẫu thử chủ yếu là đàm, đƣợc thu nhận từ những bệnh nhân đƣợc chẩn đoán X-quang phổi nghi lao

- Mẫu đàm đƣợc lấy trực tiếp từ bệnh nhân vào mỗi buổi sáng, sau khi bệnh nhân súc miệng bằng nước lọc, hít thở sâu ba lần, sau đó nín thở ho thật mạnh và cho vào tube 50ml

- Mẫu đàm nhận phải đạt chất lƣợng và số lƣợng

- Số mẫu thử nghiên cứu là 326 mẫu, đƣợc đánh số NC 001, NC 002,

- Mẫu thử sau thu nhận có thể xử lý ngay hoặc lưu giữ ở -20 o C [32,38]

Mẫu đàm đươc xử l theo phương pháp NALC-NaOH 4% Mẫu đàm dưới tác dụng NALC-NaOH 4% kết làm tan những hạt đàm tách AFB, đồng thời khử những tạp khuẩn trong mẫu đàm, li tâm AFB sẽ lắng xuống đáy tube

- Chuẩn bị mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương

- Nước cất vô trùng - Pha 4% NALC-NaOH

Bảng 2.1: Bảng tỉ lệ pha dung dịch NALC-NaOH %

Thể tích (ml) 4% NALC-NaOH

Mix (ml) 4% NaOH 2.9% Na Citrate 2H 2 O

0.25 0.50 1.00 2.50 500 4% NaOH: 4g NaOH hòa tan với 100 ml nước cất

2.9% Na Citrate 2H 2 O: 2.9g Sodium citrate dihydrate hòa với 100 ml nước cất

(a) 9.47g Na 2 HPO4 hòa với 100 ml nước cất (b) 9.07g KH 2 PO 4 hòa với 100 ml nước cất Hòa 50 ml (a) với 50 ml (b), chỉnh pH đúng 6.8

Dung dịch NALC-NaOH pha chỉ sử dụng trong ngày [32]

Xử lý mẫu thử đƣợc thực hiện tủ an toàn sinh học cấp II trong phòng vô khuẩn cách biệt

Mỗi đợt xử lý mẫu thử luôn phải có mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm chứng

Quy trình xử lý mẫu thử được thực hiện như sau:

- Cho NALC-NaOH 4% vào tube mẫu thử V đàm = VNALC-NaOH

- Vortex 20 - 30 giây - Lắc ngang ở nhiệt độ phòng 10 phút

- Thêm buffer pH 6.8 vào mỗi tube đúng vạch 50 ml - Ly tâm: ở 4 o C, 3000vòng/phút, 15 phút

- Gạn bỏ phần nước thu cặn lắng Mẫu đàm sau khi thuần nhất thực hiện nuôi cấy, phiến phết hay ly trích ngay hoặc có thể bảo quản ở -20 o C [32]

2.3.3 Phương pháp nhuộm soi kính hiển vi 2.3.3.1 Thực hiện phiến phết

- Chuẩn bị mẫu đã xử lý gồm mẫu thử và mẫu chứng - Chuẩn bị lame đánh số theo mã số mẫu thử và ghi vào phiếu tiến trình thực hiện

Cặn lắng QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU THỬ

Lắc ngang 150 lần/phút, 10 phút Buffer pH 6.8 đến vạch 50 ml

- Thực hiện thao tác trong tủ an toàn sinh học, dùng que vô khuẩn lấy cặn lắng trong tube xử lý, phết lên lame

- Tiêu chuẩn phiến phết: ngang 1cm, dài 2cm - Để phiến phết khô tự nhiên trong tủ an toàn sinh học

- Qui trình nhuộm Ziehl Neelsen

+ Phủ carbon fuchsin lên lame và hơ nóng 3 lần trong 5 phút + Rửa nước và làm khô lame

+ Phủ acide alcohol 3% trong 2 phút + Rửa nước và làm khô lame

+ Phủ methylen blue 1-2 phút + Rửa nước và để khô

- Qui trình nhuộm Fluorescence + Phủ thuốc nhuộm auramine O lên phiến phết 15 phút + Rửa với nước cất và làm khô nước

+ Phủ phiến phết acide alcohol 0.5%, 2 phút + Rửa với nước cất và làm khô nước

+ Phủ phiến phết với potassium permanganate 2 phút + Rửa với nước cất để khô [32]

Trước khi tiến hành đọc mẫu thử, cần sử dụng lame chuẩn để kiểm tra độ sáng, độ nét và màu sắc của kính hiển vi Bên cạnh đó, sử dụng lame chứng để kiểm tra màu sắc và hình dạng nhuộm vi khuẩn nhằm đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong quá trình quan sát.

Phiến phết đƣợc soi với kính hiển vi theo hình chừ Z từ 60 - 100 quang trường (QT)

Hình 2.2: Sơ đồ soi lame kính hiển vi [32]

- Quy trình soi kính hiển vi huỳnh quang:

+ Bật kính hiển vi chờ 10 - 15 phút

+ Dùng lame chuẩn điều chỉnh kính đúng độ sáng, đọc lame chứng dương kiểm tra sự phát quang của vi khuẩn

+ Soi với vật kính 20x, 40x và chuyển 60x để xác định, soi khoảng 60 quang trường

Hình 2.3: AFB dương tính nhuộm huỳnh quang - Quy trình soi kính hiển vi quang học:

+ Bật kính hiển vi quang học + Nhỏ giọt dầu soi kính lên phiến phết + Soi với vật kính 100x khoảng 100 quang trường + Ƣớc lƣợng mật độ AFB theo bảng chuẩn

Vi khuẩn lao nhìn thấy trên vi trường bắt mầu đỏ trên nền hơi xanh của lame, hình que cong, thân có hạt, đứng thành từng đám, hay từng đôi song song hay hình chữ v hay riêng rẽ [1,5]

Hình 2.4: AFB dương tính Ziehl Neelsen 2.3.4 Phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy là phương pháp chẩn đoán chính xác vi khuẩn lao, có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, tuy nhiên vi khuẩn lao có thời gian sản sinh rất chậm và chỉ tăng sinh được ở trong môi trường nuôi cấy chuyên biệt Mẫu thử trước khi nuôi cấy phải đƣợc xử lý, nhằm tách vi khuẩn lao từ các hạt đàm và khử các tạp khuẩn

- Môi trường LJ: kiểm tra không bị nhiễm - MGIT: kiểm tra độ nhiễm bằng đèn UV

- Dán mã số tương ứng với mã của mẫu vào mỗi tube môi trương - Lọ Bactec MGIT growth supplement (15ml) + lọ BBL MGIT PANTA (đông khô), làm tan đều và giữ ờ 2 - 8 o C (pha trước khi nuôi cấy tùy theo số lương mẫu thử, mỗi mẫu 0.8 ml)

Chuẩn bị mẫu cặn lắng mẫu thử và mẫu chứng cho vào 1-2 ml nước cất vortex nhẹ, mỗi mẫu nuôi cấy vào 01 tube môi trường MGIT và 02 tube môi trường LJ như sau [32.38] a Môi trường MGIT:

- Khi dùng hòa 15 ml Bactec MGIT growth supplement vào lọ BBL MGIT PANTA Sau đó cho 0.8 ml vào mỗi tube môi trường MGIT

- Vortex nhẹ tube cặn lắng - Dùng pipette cho 0.5 ml cặn lắng vào tube môi trường MGIT - Trộn đều cho vào máy Bactec MGIT 960 nhiệt độ 37 o C b Môi trường LJ:

- Dùng pipette Pasteur cho 4 giọt vào mỗi tube LJ - Nghiêng tube cho mẫu thử thấm đều trên mặt thạch - Để nấp không chặt và đặt nằm trên giá nghiêng, cho vào tủ ấm 37 o C - Sau ba ngày cho hơi nước thoát ra hết, vặn nấp lại cho vào giá đứng mỗi tuần đọc kết quả một lần

0.5 ml 4 giọt mọc mọc không mọc mọc không mọc

Nhiễm, Xử lý, Cấy lại

2.3.4.3 Định danh Khi máy Bactect báo có vi khuẩn mọc trong môi trường MGIT hoặc quan sát thấy khóm khuẩn hình bông cải trên môi trường LJ Thực hiện phiến phết từ canh cấy môi trường MGIT hoặc từ khóm khuẩn trên môi trường LJ, nhuộm ZN và soi KHV Khi kết quả nhuộm ZN là AFB dạng thừng thì thực hiện định danh bằng Genprobe Nếu tạp khuẩn thì phải xử lý lại và cấy lại từ đầu

Hình 2.7: Mycobaeterium tuberculosis mọc trên môi trường LJ và MGIT

Hình 2.8: Non-tuberculous mycobateria mọc trên môi trường LJ

Kết quả soi kính hiển vi nhuộm ZN từ canh cấy nhƣ sau:

Kết quả nhuộm bệnh phẩm không phát hiện vi khuẩn, nấm không thấy AFB thì mẫu xét nghiệm bị nhiễm Phải chờ các ống môi trường nuôi cấy khác xem có bị nhiễm không Nếu tất cả đều bị nhiễm thì cần xử lý lại mẫu và nuôi cấy lại.

- Kết quả nhuộm: AFB âm tính (-), yếu tố thừng (-) là NTM chờ thêm các tube môi trường khác mới kết luận kết quả chung cho mẫu thử

- Kết quả nhuộm: AFB (+), dạng thừng (+) thì thực hiện genprobe đề định danh [32]

Hình 2.9: Nhuộm ZN AFB (+), dạng thừng (+) [48]

Hình 2.10: Nhuộm ZN AFB (+), dạng thừng (-) [48]

Hình 2.11: Nhuộm ZN AFB (-), nhiễm tạp khuẩn [48]

Khi kết quả ZN canh cấy là AFB và dạng thừng (+) thì thực hiện Genprobe để định danh MTBC hay NTM

+ Máy Sinocator + Máy đo GEN-PROBE 450i Luminometer + Chuẩn bị mẫu chứng và mẫu thử: Chứng âm Mycobacterium avium

( ATCC # 25291), chứng dương M tuberculosis (ATCC # 25177) Mẫu thử là canh cấy lỏng MGIT hoặc khóm khuẩn trên LJ

- Qui trình thực hiện Genprobe gồm Các giai đoạn thực hiện: ly trích, lai và phát hiện a Ly trích (extraction) :

+ Đánh mã số mẫu lên tube ly trích

+ Dùng Pipette 100 l R1(Lysis Reagent) và 100 L R2 (Hybridization Buffer) cho vào những tube ly trích Nếu mẫu thử là môi trường lỏng thì không thêm R1

+ Cho 100 l môi trường lỏng hoặc dùng que cấy lấy vi khuẩn trên môi trường đặc vào mỗi tube ly trích

+ Vortex tube trộn đều + Đặt những tube ly trích vào water bath 15phút 95C  5 C + Cho vào máy Sonicate 15 phút

+ Lấy những tube ly trích khỏi Sinocate b Lai (Hybridization):

+ Dùng Pipette 100 L từ tube ly trích vào tube lai tương ứng

+ Đặt những tube lai vào water bath 15 phút 59.5 - 61C

+ Lấy những tube lai ra khỏi water bath

+ Dùng Pipette cho 300 L R3 (Selection Reagent) vào mỗi tube

+ Đặt Probe Reagent Tubes vào water bath 10 phút 59.5 - 61C

+ Lấy tube để nhiệt độ phòng đo kết quả trong 60 phút c Phát hiện (Detection)

+ Bật máy GEN-PROBE 450i Luminometer trước 15 phút

+ Đặt các tube vào máy theo trình tự: tube chứng âm, tube chứng dương sau là những tube mẫu

+ Chọn chương trình đo là MTBC Kết quả genprobe MTBC (+): kết quả mẫu thử MTBC dương tính

Kết quả genprobe MTBC (-): là NTM [30,32]

Bảng 2.3 : Định danh Mycobacterium tuberculosis Complex

MGIT LJ ZN Cording Genprobe Kết quả

+ + AFB + MTBC (+) MTBC dương tính

+ - AFB + MTBC (+) MTBC dương tính

- + AFB + MTBC (+) MTBC dương tính

2.3.5 Thực hiện kháng sinh đồ

Khi kết quả nuôi cấy MTBC dương tính thì thực hiện kháng sinh đồ theo phương pháp MGIT trên máy Bactec MGIT 960, cho hai loại kháng sinh

Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ trên máy Bactec MGIT 960 được hiện trong môi trường lỏng MGIT sử dụng 02 loại kháng sinh là: Rifampin và Isoniazid [32,35]

2.3.5.1 Chuẩn bị dụng cụ, thuốc thử

- Các lọ thủy tinh 20 ml - Hạt bi thủy tinh

- Máy vortex, máy đo độ đục - Pipette 20 - 200 μl, 200 - 1000 μl - Tween 10%

- Bactec diluting fluid (BDF) - Môi trường MGIT, Supplement - Kháng sinh

Lọ kháng sinh trước khi sử dụng được kiểm tra, bằng cách thực hiện kháng sinh đồ với chủng vi khuẩn H37Rv

Mẫu thử đƣợc định danh MTBC thực hiện kháng sinh đồ có thể sử dụng vi khuẩn trên môi trường MGIT hoặc LJ

2.3.5.2 Thực hiện kháng sinh đồ

- Cho 4 ml BDF vào lọ kháng sinh, lắc nhẹ cho tan hết kháng sinh

- Mỗi kháng sinh đồ gồm 05 tube MGIT: 01 Growth Control (GC) và 02 cho 02 loại kháng sinh

- Chuẩn lọ pha huyền trọc: lọ chứa 5 ml và 10 ml BDF - Cho 800 ml supplement vào mỗi tube MGIT

- Cho 100 ml kháng sinh mỗi tube - Chuẩn bị huyền trọc vi khuẩn: có thể sử dụng từ tube MGIT hay LJ có vi khuẩn mọc, mỗi loại môi trường có cách pha huyền trọc như sau: a MGIT

- MGIT: 1- 2 ngày kề từ ngày máy báo dương tính

+ Dùng pipette lấy 100 μl canh cấy từ tube MGIT cho vào lọ 10 ml vortex nhẹ độ pha loãng (1:100)

+ Dùng pipette lấy 500 μl canh cấy từ tube MGIT cho vào từng tube MGIT chứa kháng sinh

+ Dùng pipette lấy 500 μl từ lọ 1:100 cho vào tube growth control

+ Trộn đều các tube, xếp vào giá kháng sinh đồ theo thứ tự GC, I, R và cho vào máy Bactec 960

- MGIT: 3- 5 ngày kề từ ngày máy báo dương tính + Dùng pipette lấy 1000 μl canh cấy từ tube MGIT cho vào lọ 0.5 ml vortex nhẹ độ pha loãng (1:5)

+ Lấy 100 μl từ lọ pha loãng 1:5 cho vào lọ 10 ml vortex nhẹ (1:100) + Lấy 500 μl từ lọ 1:5 cho vào từng tube MGIT chứa kháng sinh

+ Lấy 500 μl từ lọ 1:100 cho vào tube growth control + Trộn đều xếp vào giá kháng sinh đồ và cho vào máy bactec

- MGIT: > 5 ngày kề từ ngày máy báo dương tính, do vi khuẩn trong tube tăng sinh nhiều nên phải pha loãng 1:100 và lấy 500 μl cho vào tube MGIT có chứa 800 μl supplement cho vào máy Bactec nuôi cấy lại b Đối với môi trường LJ

- Pha huyền trọc của vi khuẩn từ môi trường LJ gồm các bước sau:

+ Cho 4-5 giọt Tween 10% vào lọ pha loãng có chứa 8-10 bi thủy tinh + Dùng khuyên cấy câu khóm vi khuẩn từ LJ cho vào lọ

+ Vortex 2-3 phút cho tan hết khóm vi khuẩn + Cho vào 4 ml BDF vortex, để yên 20 phút + Rút 2 ml phần trên chuyển sang lọ khác để yên 15 phút

+ Rút 1 ml phần trên chuyển sang tube khác và chỉnh độ đục 0.5 McF

+ Chuyển 1ml vào lọ 5 ml (1:5)

- Cho huyền trọc vào các tube nhƣ của MGIT + Lấy 100 μl từ lọ pha loãng 1:5 cho vào lọ 10 ml vortex nhẹ (1:100) + Lấy 500 μl từ lọ 1:5 cho vào từng tube MGIT chứa kháng sinh

+ Lấy 500 μl từ lọ 1:100 cho vào tube growth control

+ Trộn đều xếp vào giá kháng sinh đồ và cho vào máy Bactec 960 Máy bactec MGIT 960 sẽ báo và in khi có kết quả kháng sinh đồ khoảng 4 - 14 ngày

Với kỹ thuật DNA strip: các đoạn dò đặc hiệu đƣợc gắn trên thanh giấy, khi lai với sợi DNA (ampicor) từ mẫu thử (đã xử lý, khuếch đại) cho phép xác định đƣợc những DNA bắt cặp với đoạn dò trên thanh giấy

Thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay dựa trên kỹ thuật DNA Strip,

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả phát hiện vi khuẩn lao

Phương pháp soi phát hiện AFB

Để phát hiện AFB, mẫu soi tươi được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở vật kính 20x với khoảng 60 quang trường Trong trường hợp không phát hiện AFB, kết quả được ghi nhận là không phát hiện AFB Nếu AFB được phát hiện, vật kính 40x, 60x sẽ được sử dụng để ước lượng số lượng AFB và xác định chúng.

- Kết quả nếu phát hiện AFB dương tính thì nhuộm lame đó lại với phương pháp ZN, đọc với kính hiển vi quang học với vật kính 100x xác định và ƣớc lƣợng mật độ AFB trên lame theo bảng ƣớc lƣợng chuẩn

Bảng 3.1: Ước lượng kết quả soi phát hiện AFB với phương pháp nhuộm huỳnh quang và phương pháp Niehl Neelsen [32]

0 AFB/100 QT Không phát hiện AFB

Số AFB một quang trường 400x KHV huỳnh quang tương đương 4 lần số AFB của một quang trường 1000x KHV quang học

Trong nghiên cứu thực hiện 326 mẫu đàm soi phát hiện AFB theo phương pháp tập trung có kết quả như sau: Phát hiện AFB dương tính là 220/326 (67.5%) và AFB âm tính là 106/326 (32.5%)

Bảng 3.2: Kết quả phương pháp soi phát hiện AFB của 326 mẫu đàm

Kết quả phát hiện AFB Trường hợp (n26)

- Tỉ lệ phát hiện AFB dương tính là 220/326 (67.5%) tương đối cao do trong nghiện cứu này thực hiện phiến phết theo phương pháp tập trung đàm Phương pháp trực tiếp là thực hiện phiến phết chỉ chọn một ít đàm từ mẫu thử, phương pháp tập trung dùng cả mẫu đàm cho chất xử lý thuần nhất đàm sau đó ly tâm vi khuẩn lắng xuống đáy tube, lấy cặn lắng thực hiện phiến phết Tuy nhiên phương pháp này chỉ phát hiện AFB, không phân biệt là MTBC hay NTM, vi khuẩn còn sống hay chết

- Không phát hiện AFB là 106/326(32.5%) Một số trường hợp mẩu đàm có ít AFB nên phương pháp soi KHV không phát hiện được, một số trường hợp lame nhuộm phương pháp huỳnh quang phát hiện AFB dương tính, nhưng khi nhuộm lại ZN thì không phát hiện AFB vẩn kết luận không phát hiện AFB

- Thời gian trung bình thực hiện là 2 giờ

Phương pháp soi kính hiển vi phát hiện AFB, kỹ thuật đơn giản, cho kết quả nhanh, phát hiện được nguồn lây lan Tuy nhiên phương pháp này chỉ phát hiện AFB, không phân biệt là MTBC hay NTM, vi khuẩn còn sống hay chết và có kháng thuốc hay không.

Phương pháp nuôi cấy

- Nghiên cứu thực hiện 326 mẫu đàm nuôi cấy định danh MTBC, Mẫu đàm, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương sau khi xử lý, thực hiện nuôi cấy 01 môi trường MGIT và 02 môi trường LJ Từ cặn lắng cho vào 1-2 ml nước cất, vortex nhẹ, cho 0.5 ml vào môi trường MGIT cho vào máy Bactec 960 và cho 3-5 giọt vào mỗi môi trường LJ ủ tủ ấm 37 o C

Khi máy Bactec 960 báo có vi khuẩn mọc hay quan sát môi trường LJ có vi khuẩn mọc thì thực hiện phiến phết nhuộm ZN nếu kết quả nhuộm ZN là AFB, dạng thừng thì định danh bằng thử nghiệm genprobe xác định MTBC

Phương pháp môi trường MGIT theo dõi 06 tuần máy Bactec 960 báo âm tính, còn phương pháp môi trường LJ theo dõi 08 tuần cho kết quả âm tính

Bảng 3.3: Biện luận kết quả nuôi cấy từ môi trường MGIT, LJ và Genprobe

MGIT Âm tính (6 tuần) Tạp nhiễm

MTBC Dương tính Tạp nhiễm

Nuôi cấy lại NTM MTBC

MTBC Âm tính NTM NTM MTBC

Kết quả nuôi cấy 326 mẫu đàm trên môi trường MGIT, LJ, kết hợp nhuộm ZN khảo sát AFB, yếu tố thừng và genprobe cho thấy:

226/325(69.3%) MTBC dương tính, 21/326(6.4%) NTM và 79/326(58.9%) MTBC âm tính

Bảng 3.4: Kết quả phương pháp nuôi cấy 326 mẫu đàm

MGIT LJ ZN Thừng Gen-probe Kết quả

+ + AFB + MTBC(+) MTBC dương tính 192 (58.9%)

+ - AFB + MTBC(+) MTBC dương tính 24 (7.4%)

- + AFB + MTBC(+) MTBC dương tính 10 (3.1%)

+ Xác định 226/326(69.3%) MTBC dương tính trong đó 192 (58.9%) có vi khuẩn lao tăng sinh trên cả hai môi trường MGIT và LJ, 24 (7.4%) vi khuẩn lao chỉ tăng sinh môi trường MGIT không tăng sinh trên LJ và 10 (3.1%) vi khuẩn lao không tăng sinh môi trường MGIT chỉ tăng sinh trên LJ

+ Xác định 21/326(6.4%) NTM, có vi khuẩn lao tăng sinh trên cả hai môi trường MGIT và LJ, 20 (6.1%) AFB(+) nhưng yếu tố thừng âm và 01 (0.3%) AFB(+) nhƣng yếu tố thừng (+) nhƣng Genprobe(-)

+ Xác định 79/326(58.9%) MTBC âm tính, không có vi khuẩn lao tăng sinh trên cả hai môi trường MGIT và LJ

Thời gian nuôi cấy là thời gian cần thiết để xử lý, nuôi cấy mẫu bệnh phẩm và xác định kết quả Thời gian này phụ thuộc vào sự có mặt hay không của vi khuẩn trong mẫu Đối với mẫu có vi khuẩn mọc dương tính với MTBC, thời gian nuôi cấy thường từ 1 đến 3 tuần Trong khi đó, đối với mẫu không có vi khuẩn mọc, phải chờ đến 8 tuần để có kết quả âm tính với MTBC Theo thống kê, thời gian nuôi cấy trung bình là 31 ngày.

- Phương pháp nuôi cấy phải thao tác với vi khuẩn sống trong suốt quá trình dài từ lúc nhận mẫu đàm, xử lý, theo dõi nuôi cấy và định danh đến lúc cho kết quả cuối cùng là thời gian dài (08 tuần), nên phương pháp nuôi cấy nguy cơ phơi nhiễm rất cao Do đó phương pháp nuôi cấy cần phải có điều kiện an toàn sinh học rất cao

Phương pháp nuôi cấy xác định MTBC, có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, có thể phát hiện MTBC ở giai đoạn sớm, Phương pháp nuôi cấy kỹ thuật phức tạp, thời gian cho kết quả dài và mức độ phơi nhiễm cao, do thao tác với vi khuẩn đang tăng sinh, đòi hỏi điều kiện an toàn sinh học cao

3.1.3 Thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay (DNA Strip) phát hiện MTBC

- Ứng dụng kỹ thuật DNA Strip trong xác định MTBC trên Genotype MTBDRplus assay từ 326 mẫu đàm qua các giai đoạn: xử lý mẫu đàm, ly trích DNA, khuếch đại, lai sợi DNA với đoạn dò thanh giấy, phát hiện và so với bảng chuẩn đọc kết quả

Chuẩn mực khi đánh giá kết quả cho thấy: sau khi phát hiện các vạch CC và AC trên thanh giấy chuẩn, nếu có thêm vạch TUB có màu xuất hiện thì kết luận là MTBC dương tính; ngược lại, nếu không có thêm vạch TUB có màu thì kết luận là MTBC âm tính.

- Kết quả thực hiện 326 mẫu đàm trên Genotype MTBDRplus assay trong xác định MTBC là:

Bảng 3.5: Kết quả 326 mẫu thử thực hiện Genotype MTBDRplus assay xác định MTBC

Kết quả Genotype MTBDRplus assay (TUB) Số mẫu (n26)

Kết quả Genotype MTBDRplus assay xác định MTBC 226/326 (69.3%) MTBC dương tính, tương dương kết quả xác định MTBC của phương pháp nuôi cấy, phương pháp nuôi cấy hiện được xem là tiêu chuẩn vàng trong xác định vi khuẩn lao Genotype MTBDRplus assay không phát hiện đƣợc MTBC là 100/326 (30.7%)

- Thời gian thực hiện Genotype MTBDRplus assay xác định MTBC là từ lúc nhận mẫu đàm xử lý, ly trích, khuếch đại, lai và phát hiện đọc kết quả, trung bình khoảng 6 giờ

- Thời gian thực hiện ngắn, giai đoạn thao tácvới mẫu thử không nhiều, nguy cơ phơi nhiễm ít nên an toàn sinh học cao

Thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay xác định MTBC từ mẫu đàm chỉ trong vòng vài giờ, độ nhạy cao, kỹ thuật dễ thuật hiện, có thể tự động hóa, phơi nhiễm ít, an toàn sinh học cao

3.1.4 So sánh kết quả phương pháp soi phát hiện AFB, phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay

Kết quả phát hiện vi khuẩn của 326 mẫu thử của ba phương pháp soi phát hiện AFB, nuôi cấy và Genotype MTBDRplus assay đƣợc so sánh nhƣ sau:

- Tỉ lệ phát hiện AFB và MTBC của ba phương pháp soi phát hiện AFB, phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay

Bảng 3.6: Kết quả phát hiện vi khuẩn lao của ba phương pháp 326 mẫu

Phương pháp Kết quả (+) Kết quả (-)

Nhìn chung thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay cho kết quả phát hiện MTBC không khác với các phương pháp thông thường, điều đáng nói thử nghiệm

Genotype MTBDRplus assay cho kết quả phát hiện MTBC là (69.3%) tương đương với phương pháp nuôi cấy hiện được xem lả tiêu chuẩn vàng xác định MTBC

Tỉ lệ phát hiện AFB dương tính cuả phương pháp soi KHV khá cao là 67.5% vì sử dụng phương pháp tập trung nên tỉ lệ phát hiện AFB cao hơn phương pháp soi thực hiện phiến phết trực tiếp từ mẫu thử Phát hiện MTBC dương tính của phương pháp nuôi cấy vả thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay như nhau là 69.3% cho thấy nghiệm Genotype MTBDRplus assay phát hiện MTBC tương đương với phát hiện MTBC của phương pháp nuôi cấy (tiêu chuẩn vàng)

- Kết quả các trường hợp phát hiện AFB và MTBC của ba phương pháp soi phát hiện AFB, phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay

Bảng 3.8: So sánh kết quả soi phát hiện AFB, phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay

Trong kết quả 326 trường hợp Soi phát hiện AFB, phương pháp nuôi cấy và Genotype MTBDRplus có:

- 217 trương hợp cả ba phương pháp đều dương tính và 97 trường hợp cả ba phương pháp cùng âm tính

- 07 trường hợp nuôi cấy (+), Genotype MTBDRplus assay (+), Soi phát hiện AFB (-) và 01 trường hợp nuôi cấy (+), Genotype MTBDRplus assay (-), Soi phát hiện AFB (-) những trường hợp này do AFB trong mẫu thử quá ít [9,12,13]

- 01 trường hợp nuôi cấy (-), Genotype MTBDRplus assay (+), Soi phát hiện AFB (+) đây là trường hợp bệnh nhân đang điều trị nên vi khuẩn đã chết [12,14]

- 01 trường hợp nuôi cấy (-), Genotype MTBDRplus assay (-), Soi phát hiện AFB (+) đây là trường hợp AFB là NTM [,12,13,14 ]

Thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay phát hiện MTBC dựa kiểu gen nên trong những trường hợp bệnh đang diều trị AFB đã chết cũng phát hiện được

Vì vậy không sử dựng thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay phát hiện MTBC cho những bệnh đã diều trị 2 tuần

Bảng 3.7: Kết quả phát hiện vi khuẩn lao của ba phương pháp soi phát hiện

AFB, phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm Genotype MTBDRplus assay

Số mẫu (n26) Soi phát hiện

Kết quả phát hiện tính kháng thuốc cùa MTBC