Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm Nucleic Acid để phát hiện sớm sự hiện diện virus HBV ở người hiến máu tình nguyện

Xác định tỷ lệ HBV dương tính bằng phương pháp sinh học phân tử kỹ thuật xétnghiệm NAT ở người hiến máu có kết quả xét nghiệm HBV âm tính với phươngpháp huyết thanh học.. Xét nghiệm NAT

ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

NGUYEN VAN THANH

Chuyén nganh: CONG NGHE SINH HOC

Mã ngành: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHO HO CHÍ MINH — 07/2018

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa —- DHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa hỌc : - ¿<2 5813 1S 1 23 vs kiCán bộ chấm nhận Xét Ï : + k + SE E#ESESEEEEeESEsEeEekrereeseesCán bộ chấm nhận Xét 2 : - E112 E9ESESE2E 2E SESEEEEEseserkes

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, DHQG Tp HCM

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngànhsau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỚNG KHOA

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập-Tự do-Hanh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VAN THẠC SĨHọ tên học viên: Nguyễn Văn Thành MSHV: 7140867

Ngày, thang, năm sinh: 15/08/1981 Nơi sinh: Long An

Chuyên ngành: Cong nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01I Tên đề tài

“Ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm nucleic acid (NAT) để phát hiện sớm sự hiện diệnvirus HBV ở người hiến máu tình nguyện”

II Nhiệm vụ và nội dung

1 Xác định tý lệ HBV dương tính băng phương pháp xét nghiệm huyết thanh học ởngười hién máu tình nguyện tại Trung tâm truyền máu Cho Ray

2 Xác định tỷ lệ HBV dương tính bằng phương pháp sinh học phân tử (kỹ thuật xétnghiệm NAT) ở người hiến máu có kết quả xét nghiệm HBV âm tính với phươngpháp huyết thanh học

3 Đánh giá hiệu quả sự kết hợp song song: 2 phương pháp huyết thanh học vàphương pháp sinh học tử (xét nghiệm NAT) trong sàng lọc vi rút HBV lây nhiễmqua đường truyền máu

III Ngày giao nhiệm vụ: 07/2017

IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 07/2018V Cán bộ hướng dẫn: 1.PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

2 TS.Lê Hoàng Oanh

TP HCM, ngày tháng nămCÁN BỘ HƯỚNG DAN1 CÁN BỘ HƯỚNG DAN2 CHU NHIỆM BỘ MÔN

TRƯỞNG KHOA

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Bách Khoa TP.HCM; Khoa Kỹ thuật Hóa

học; Bộ môn Công nghệ sinh học và Phòng đào tạo sau đại học đã tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi được học tập tại trường và hoàn thành luận văn.

Cô PGS.TS Nguyễn Thúy Hương đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trongsuốt quá trình học tập tại trường và hoàn thành luận văn này Xin chân thành cảmơn một người thay rất giỏi về chuyên môn và giàu lòng nhân ái, một người thaykhông những cho tôi học tập những kiến thức về chuyên môn mà còn cho tôi học ởCô nhiều đức tính tốt đẹp về đạo đức nghề nghiệp đạo đức sống và làm việc chuẩnmực của một nhà giáo Một lần nữa xin cảm ơn Cô vì tất cả, vì tương lai của thế hệmai sau, xin rất cảm ơn một người thay rất tâm huyết và yêu nghề đã hướng dẫn vàdiu dat tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành nhiệm vụ

TS.Lê Hoàng Oanh, một người lãnh đạo, cũng là một người thầy đã dạy dỗvà đìu dắt tôi trong suốt những năm tháng làm việc tại bệnh viện Chợ Ray và luôntận tâm hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn

Ban giám đốc Bệnh viện Chợ Ray, Ban giám đốc Trung tâm truyền máu ChợRay, đơn vị xét nghiệm và sàng lọc máu, bộ phận tiếp nhận máu cùng tat cả các anhchị đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện luận văn

Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến ba mẹ, anh, chị, em và những ngườithân trong gia đình luôn ở bên cạnh tôi, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và

thực hiện luận văn này.

Xin trân trọng và biệt ơn tat cả.

NGUYEN VĂN THÀNH

TÓM TAT LUẬN VAN

Đề tài luận văn:

“Ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm nucleic acid (NAT) để phát hiện sớm sựhiện diện virus HBVở người hiến máu tình nguyện tại Trung tâm Truyền máuCho Ray”

Học viên thực hiện: Nguyễn Van ThanhCán bộ hướng dẫn: 1 PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

2 TS Lê Hoàng Oanh

Thời gian thực hiện: 15/07/2017 đến 15/07/2018Nội dung đề tài

1 Xác định tỷ lệ HBV dương tính bằng phương pháp xét nghiệm huyết thanhhọc ở người hiến máu tình nguyện tại Trung tâm truyền máu Chợ Ray

2 Xác định tý lệ HBV dương tính bằng phương pháp sinh học phân tử (kỹthuật xét nghiệm NAT) ở người hiến máu có kết quả xét nghiệm HBV âm tính vớiphương pháp huyết thanh học

3 Đánh giá hiệu quả sự kết hợp song song: 2 phương pháp huyết thanh họcvà phương pháp sinh học tử (xét nghiệm NAT) trong sàng lọc vi rút HBV lây nhiễmqua đường truyền máu

truyền máu cho bệnh nhân.

lil

3 Comparison and evaluation the results between serology and nucleic acidtesting

II RESULTS

1 The positive rate of HBV tested by serology testingThere are 130 postive samples detected with HBV2 Positive rate of HBV tested by nucleic acid testing with negative samplesby serology testing

There are 17 postive samples detected with HBV-DNA,3 Combination screening Serology and NAT testing techniques aresignificant in shortening the window period, helping to detect the presence of HBVin the blood at very high rates Low serology methods that do not detect Theimplementation of HBV serologic tests in voluntary blood donors has contributed toimproving the quality of blood units and confirming the validity of this test inensuring the safety of blood transfusions for patients.

LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan đây là dé tài nghiên cứu của riêng tôi Các tài liệu tríchdân, các sô liệu trong đê tài là hoàn toàn trung thực và tuân theo đúng yêu câu củamột đề tài nghiên cứu Đê tài này là duy nhât và chưa từng được ai công bô trong

bat kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

NGUYÊN VĂN THÀNH

DANH MỤC CHU VIET TAT

TU VIET TAT TIENG ANH TIENG VIET

ALT Alanin amino TranferaseCMIA Chemiluminescent Miễn dịch vi hat hóa phát

microparticle immunoassay quangDNA Deoxyribonucleic acid EDTA

Etylen Diamin Tetra Acetate

ELISA Enzyme Linked Immuno Mién dich gan men

Sorbent AssayECLIA Electrochemiluminescence

Anti HBc Anti Hepatitis B core Kháng thé kháng kháng

nguyên lõi vi rút gây viêm

gan BHCV Hepatitis C virus Vi rut gay viém gan siéu vi CHIV Human Immunodeficiency Vi rút gây suy giảm miễn dich

Virus mắc phải ở người

NAT Nucleic Acid TestingRNA Ribonucleic acidRPHA Reversed Passive

Hemagglutination Assay

RIA Radio Immuno AssayMEIA Microparticles Enzyme

Immuno Assay

US FDA United State of Food and Drug Cơ quan quan lý thực phẩm va

Administration dược phẩm Hoa KỳWHO World Health Organization Tổ chức y tế thé giới

Vil

Hình 2.1.Hình 2.2.Hình 2.3.Hình 2.4.Hình 2.5.Hình 3.1.Hình 3.2.Hình 3.3.Hình 3.4.Hình 3.5.Hình 4.1.Hình 4.2.

Máy phối trộn mẫu Hamilton STALR .- ¿5-52 52 5s+s+Ss£s+xezzsesee 37Máy tách chiết và tinh sạch nucleic acid - 25 +52 + s+s+sszszsee: 37Quy trình tách chiết nucleic acid bằng hạt từ .- 25-5255 5sc5se: 38Máy khuếch dai và phát hiện nucleic acid - + 2 25+ 5s+s+sze: 39Kết quả đo HBV bang phương pháp huyết thanh học -. - 50Kết quả đo của kỹ thuật HBV-DNA ¿2-5 522cc cecectsrerrered 54

DANH MỤC SƠ ĐỎ - BIEU DO

Sơ đồ 2.1 Truyền máu Ottenberg - ¿5+ 5% +s+E+EE£E£E£EEEEEEEEErkeEerkrkerrrrrerered 4Sơ đồ 2.2 Chuyển đổi huyết thanh HBSV ¿525222252 2 2EEEcEeEererrrrrrerree 14Sơ đồ 2.3 Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiẾp - 2555: 17Sơ đồ 2.4 Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp -. - 18Sơ đồ 3.1 So đỗ nghiên cứu tổng quát Lo ecccccccesessesssessescsesessesescsesessseseesssseeeeees 30Sơ đồ 4.1 Thay đổi về dau ấn huyết thanh của HBV trong giai đoạn

nhiễm HBV cấp ¿2-5522 32123219 1212111211111 2121111111111 tre 57Sơ đồ 4.2 Giai đoạn cửa số trong nhiễm cấp HBV -.- 5-2555 55 2c+ccscce2 58Biểu đồ 4.1 Phân loại người hiến máu theo giới tính . - 2 s55: 45Biéu đồ 4.2 Phân loại người hiến máu theo nhóm tuổi - ¿2-5 2 2 25555: 46Biéu đồ 4.3 Phân loại người hiến máu theo nhóm - ¿225 + + 2£s+s+S+2 47Biểu đồ 4.4 Phân loại người hiến máu theo địa phương . - + 2552: 48Biéu đồ 4.5 Phân loại người hiến máu theo hệ nhóm máu ABO -. 49

IX

Bang 3.1.

Bang 4.1.Bang 4.2.

Bang 4.3.

Bang 4.4.Bang 4.5.

Bang 4.6.Bang 4.7.

DANH MUC BANG

Giới han phát hiện các vi rút của hệ thống xét nghiệm Cobas® TaqScreen

MPX, phiên ban 2.0 của ROCHE - «cv re 42

Một số đặc điểm của đối tượng hiến máu ¿6xx csxsxsksesrsesed 43Kết quả xét nghiệm sàng lọc HBV dương tính bằng phương pháp huyết

10:11 = 49

Một số đặc điểm kết quả HBV dương tính bằng phương pháphuyết thanh hỌC - - ¿6 522123921 321221 1212112111111 1121111111111 re 51Kết qua xét nghiệm HBV-DNA eeescsesescseseesesesesescsessesesessesesesseseseesesen 53Đánh giá tình trang nhiễm HBV dựa trên tổ hop 3 xét nghiệm: HBsAg,

Anti HBs, Anti HBC - - c5 E212 11301 1111111 1v cv ra 55

Kết quả xét nghiệm các dau ấn chuẩn đoán nhiễm HBV 56Kết quả xét nghiệm của hai phương pháp - 2 25s s+s+s+e: 59

MỤC LỤC09009000) iiTOM TAT LUẬN VĂTN << << < << 9S Hư ưng x80 540 iii

SUMMARY 0 Ô iv

0900906297977 VDANH MỤC CHỮ VIET TAT 2 << << se s9 sesesesesese viDANEH MUC HINH cccccscscscssssssssssssssscssssssssssssssssessssssssssssscssssssssesssssesesesssssssenes viiiDANH MỤC SƠ BO - BIEU DO cccscssssscscssscssssssssscsssscsssssssssesssesssssssssessssssseees ixDANH MUC BÁNNG 5 << o0 0909090900 4 se X

1090000155 Ô xi

Chương 1 MO DAU 5-5 5 5% << << 99895 9 998.29 29 1 1 3 x9 sesese 1L.1 Dat VAI GE 11.2 Muc tidu ctia dé tai c.ccccscscscscscsssssessssscssscssssssscssssessssssssssssscssssssesesesesecs 2

1.3 NOL CUIG 5 G6 6 000000000 0006 660008900000904966606060666668 2

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU 5-5-5 5-5-5 sese s2 S2 s << ssesesesesese 32.1 Giới thiệu khái quát về máu và truyền máu s-s-ss<s<«- 32.1.1 Khái quát vỀ MAU - + ¿+ + SE +E+EEE+E#EEEE£ESEEEEEEEEEEErErrrrkrerreee 32.1.2 Lich sử truyỀn MAU - ¿+ + SE +E+ESE+E+EEEE£ESEEEEEEEEEerkrrrrererreee 32.1.3 Tác dụng của truyền máu và các hình thức của truyền máu 42.1.4 Vai trò người hién máu trong dịch vụ truyền máu - 52.2 Đặc điểm sinh học của HBV 2< << << ssseseseEeSeEeseeesesesee 6

2.2.1 Bệnh viêm gan cọ 62.2.2 Tình hình nhiễm HBV - ¿©2252 22222222 £EEEEEeErErvrerrrerrred 82.2.3 Cau trúc và đặc điểm nhân lên của HBV - 2s s+s+sze 8

2.3 Các kỹ thuật xét nghiệm được áp dụng trong sàng lọc máu 14

2.3.1 Phương pháp huyết thanh học + ¿2252 +2 £££+E£Ez£z£rsrereee 14

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tỬ - c9 he y 22

2.4 Tình hình xét nghiệm NAT trên thé giới và Việt Nam 25

XI

Chương 3 DOL TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU 293.1 Đối tượng và thời gian nghiên €Ứu - << scssesesesesesesesesese 293.2 Mẫu thử, hóa chất và các thiẾt ị << << =ssseseseseseseseseseseee 29

3.3 Nội dung nghiÊn CỨU c << << 6 S6 S S6 6 5559 9999.9.99999996606656.065959596688666666 30

3.3.1 Sơ đồ nghiên COU - ¿5561 E2 E21 15151111 2111111 1111111111 re 303.3.2 Thuyết minh sơ đồ ¿+ - 6 52262339 5EEEEEEEEEEE E111 rkred 313.4 Các phương pháp nghiÊn CỨU o 6555555596 69999966955696 313.4.1 Phương pháp lẫy mẫu va lưu mẫu - +5 2 2 2+s+s+£s£zcscs¿ 313.4.2 Phương pháp huyết thanh học - - + + 2 2+£+£+E+£££££Ezxzeerersred 3l

3.4.3 Phương pháp sinh học phân †Ử <9 he y 32

3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu ¿-¿- +6 S22 +E£E+ESEEErErEerererered 42Chương 4 KET QUÁ VÀ BAN LUẬN 5-e< 55c sc se se se se se csesesesesesesese 434.1 Một số đặc điểm của đối tượng hiến máu - << << <cs 434.2 Kết qua sàng loc HBV bằng phương pháp huyết thanh học 494.3 Kết quả xét nghiệm HBV-DNA băng kỹ thuật xét nghiệm

Chương 1MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vẫn đề

Máu là một dược phẩm quý giá mà tạo hóa đã ban tặng cho con người chúngta và nguồn máu có được chỉ từ người cho người, cho đến nay chưa có dược phẩmnào thay thế máu để điều trị hiệu quả cho bệnh nhân Tuy nhiên truyền máu là mộtphương thức trị liệu hiệu qua, nhưng truyền máu có thé gây ra cho người nhận nhiềutai biến khác nhau, trong đó có việc lây nhiễm các bệnh qua đường truyền máu Vìvậy chúng ta muốn có được nguồn máu an toàn dé điều trị cho bệnh nhân thì việcsàng lọc các tác nhân lây nhiễm qua đường truyền máu là hết sức quan trong và canthiết, trong các tác nhân đó có vi rút HBV chiếm tỷ lệ rất cao [4] Da phan tat cả cácphòng xét nghiệm của các cơ sở y tế ở nước ta phan lớn chỉ sàng lọc máu băngphương pháp huyết thanh học thường quy: Phương pháp ELISA, hóa phát quang,điện hóa phát quang Các phương pháp này còn nhiều hạn chế trong việc phát hiệnsớm vi rút lây nhiễm qua đường truyền máu đặc biệt là vi rút trong giai đoạn cửa sốnên chưa đảm bảo được an toàn cho bệnh nhân được truyền mau [9, LO]

Từ năm 1999 kỹ thuật xét nghiệm Nucleic acid (NAT) đã được triển khai tainhiều nước phát triển mạnh (Nhật, Mỹ, Đức ) để hạn chế tối đa việc lây nhiễm các

loại vi rút cho người nhận máu Xét nghiệm NAT là kỹ thuật sinh học phân tử dựa

trên nguyên lý phản ứng khuyếch đại nhân lên gấp bội các vật liệu di truyền cónguồn gốc từ các vi rút gây bệnh và tăng khả năng phát hiện sớm khi vi rút có quá ít

trong máu Việc ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm NAT giúp ngăn ngừa hữu hiệu nguy

cơ lây nhiễm vi rút cho bệnh nhân trong giai đoạn cửa số Kỹ thuật này cho phép rútngăn thời gian cửa số từ 90 ngày xuống còn 30 ngày đối với HCV từ 60 ngày xuống

còn 20 ngày với HBV, đặc biệt xét nghiệm NAT phát hiện vi rút HIV chi 11 ngày

sau thời gian người cho máu nhiễm bệnh Bên cạnh đó xét nghiệm NAT còn có théphát hiện nhiễm virus thé ấn, tức là những người nhiễm bệnh một thời gian đài,nhưng vi rút chỉ tiềm tàng trong tế bào mà cơ thể người bệnh không sản sinh rakháng thé nên các phương pháp huyết thanh học không thé phát hiện được [40]

Cho đến nay, các virus lây nhiễm qua đường truyền máu được phát hiệnbăng việc thực hiện băng phương pháp huyết thanh học gián tiếp thông qua sự cómặt của virus hay kháng thé của cơ thé người nhiễm phản ứng với virus trong đó cóvi rút HBV chiếm tỷ lệ rất cao từ 10-15% trên tổng số lượng mẫu xét nghiệm Tuyvậy, ở những người mới nhiễm lượng vi rút HBV còn quá ít và cơ thể chưa tạo rakháng thể thì các kỹ thuật huyết thanh học không thể phát hiện ra được bệnh.Khoảng thời gian này được gọi là giai đoạn cửa số Chính giai đoạn cửa số này làmột nỗi ám ảnh và là một thách thức lớn của các nhà nghiên cứu khoa học tronglĩnh vực an toàn truyền mau [13].

Từ tháng 6 năm 2015 Trung tâm Truyền máu Cho Ray đã bat dau triển khaikỹ thuật xét nghiệm NAT để sàng lọc tất cả các mẫu máu có kết quả âm tínhphương pháp huyết thanh học.Vì vậy, để đánh giá hiệu quả của kỹ thuật này chúngtôi tiễn hành nghiên cứu: “Ứng dung kỹ thuật xét nghiệm Nucleic acid (NAT) déphát hiện sớm sự hiện diện virus HBV ở người hiển máu tình nguyện tại Trung tâm

Truyén máu Chợ Rây ”.1.2 Mục tiêu của đề tài

Ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm Nucleic acid (NAT) trong việc phát hiện sớmsự hiện diện của vi rút HBV ở ngưởi hiến máu tình nguyện góp phan đem lại antoàn cho bệnh nhân khi truyền máu

- Đánh giá hiệu quả sự kết hợp song song: 2 phương pháp huyết thanh học vàphương pháp sinh học tử (xét nghiệm NAT) trong sàng lọc vi rút HBV lây nhiễm

qua đường truyền máu.

Chương 2

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu khái quát về máu và truyền máu2.1.1 Khái quát về máu

Máu gồm 2 phan là phần các tế bào (phần hữu hình) va phan huyết tương(phan vô hình) Lượng máu trong cơ thé phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi, giới,trọng lượng cơ thé Binh thường tổng lượng máu trong cơ thé người trưởng thànhbang khoảng 1/13 trọng lượng cơ thé Trung bình tong thé tích máu của cơ thé là77ml/kg cân nặng đối với nam và 6óml/kg cân nặng đối với nữ Lượng máu trongcơ thé tương đối ồn định nhờ cơ chế điều hòa giữa lượng máu sinh ra ở tủy xươngvới lượng máu bị mat đi Ước tính mỗi ngày sẽ có một lượng máu tương đương vớikhoảng 40 ml đến 80 ml được thay thé và tủy xương có khả năng sinh máu gấp 10lần (khoảng 400 ml đến 800ml) [1 4]

2.1.2 Lịch sử truyền máu

Loài người từ xa xưa đã biết đến vai trò của máu như là “chất kỳ diệu” củacuộc sống Thời cổ đại, người ta cho răng máu không chỉ là nhựa sống nuôi dưỡngcơ thé ma còn chứa đựng linh hồn của con người Chính vì vậy, con người luôn trântrọng, giữ gìn và bảo vệ dòng máu trong cơ thể của mình Không những thế, ngườixưa còn tim cách đưa máu vao trong co thé bang cách pha vào rượu để uống, chovào thức ăn dé ăn và tiêm máu vào cơ thể.Năm 1900, nha bác học người Mỹ gốc Áo

la Karl Landsteiner phát hiện ra nhóm máu hệ ABO mở ra ky nguyên mới cho

ngành truyền máu Truyền máu phát triển mạnh hơn sau khi Reuben Ottenberg nêura sơ dé truyền máu vào năm 1913 dựa vào sự hòa hợp nhóm máu giữa người cho -

người nhận và sơ đô truyện máu được mang tên tác giả.

Sơ đồ 2.1 Truyền máu Ottenberg [41]Ở Việt Nam, trước năm 1954 truyền máu do quân đội Pháp tô chức tại bệnhviện Đồn Thủy (nay là bệnh viện Trung ương Quân đội 108) và một số bệnh việntại Sài Gòn Từ năm 1954 đến năm 1975, truyền máu ở nước ta chủ yếu phục vụchiến tranh Từ năm 1975 đến năm 1992, truyền máu được triển khai trên toànquốc Cả nước có hang trăm cơ sở truyền máu Máu được lay chủ yếu từ người hiếnmáu chuyên nghiệp (trên 90%), số còn lại là người nhà cho máu, chưa có ngườihién máu tình nguyện Truyền máu toàn phan là chủ yếu Máu được lay vào chai,tiễn hành một số xét nghiệm sàng lọc như giang mai, sốt rét, xét nghiệm nhóm máuhệ ABO và làm phản ứng chéo rồi truyền cho người bệnh Năm 1993, cả nước tiếnhành sàng lọc HIV, sốt rét và giang mai trong truyền máu Năm 1994, tiếp tục triểnkhai sàng lọc virus viêm gan B (HBsAg) trong truyền máu Hiện nay, Bộ Y tế quiđịnh bắt buộc xét nghiệm sàng lọc 5 tác nhân lây nhiễm qua đường truyền máu làHIV/AIDS, virus viêm gan B (HBV), virus viêm gan C (HCV), giang mai và sốt rétcho tất cả các đơn vị máu tiếp nhận [10,11,13].

2.1.3 Tác dụng của truyền máu và các hình thức của truyền máu

Truyền máu là đưa các thành phan của máu vào một cá thé cần thiết tới máu,là hoạt động không thé thiếu trong cấp cứu và điều trị người bệnh khi bị mất máu

nhiều (do tai nạn, do chiến tranh, do các tai bién sản khoa, do xuất huyết tiêu hoa )

hoặc do thiếu hụt các thành phần máu (xuất huyết giảm tiểu cầu, bệnh Hemophilia,rồi loạn đông máu do nhiễm độc, mat huyết tương do bong, người bệnh đa chan

thương ) Nhờ có truyền máu ma các phương pháp điều trị hiện đại như ghép tạng,điều trị ung thư, phẫu thuật tim mạch, điều trị các bệnh về máu được mở rộng vàđiều trị đạt hiệu quả cao Tuy nhiên, truyền máu là đưa vào cơ thể người bệnh cácyếu tố lạ (các tế bào máu và huyết tương) nên có thể xem như một loại ghép cơquan cho nên truyền máu có thể gây nguy hiểm đến tính mạng người bệnh khi cósai sót về mặt kỹ thuật (như định nhằm nhóm máu), có thể nhiễm các tác nhân lâynhiễm qua đường truyền máu (như HIV/AIDS, HBV, HCV, Giang mai, Sốt rét )và có thé gây các phản ứng miễn dịch sau truyền máu|4,13].

Truyền máu có nhiều hình thức: dựa vào thành phần máu đưa vào cơ théchúng ta có truyền máu toàn phan và truyền máu từng phân (như khối hồng cau,khối tiểu cầu, khối bạch cau, huyết tương ) Ngày nay, nhờ sự tiễn bộ của truyềnmáu hiện đại nên chủ yếu truyền máu từng phân theo tiêu chí “Người bệnh thiếu gìtruyền nay” Còn dựa vào sự tương đồng giữa người cho - người nhận chúng ta cótruyền máu tự thân và truyền máu khác cá thé (người cho máu và người nhận máu

khác nhau) [11].

2.1.4 Vai trò người hiến máu trong dịch vụ truyền máu

Dịch vụ truyền máu là đem lại cho người bệnh nhận máu người hiến máu vàcác đối tượng cong chúng liên quan sự phục vụ tốt nhất, đảm bảo an toàn truyềnmáu (với những đơn vị máu, chế phẩm máu đảm bảo chất lượng và chi phí hợp lý.Các cơ sở truyền máu không sản xuất được máu nhân tạo mà chỉ là cầu nối để đưanhững dòng máu nhân ái từ người hiến máu đến với người bệnh cần truyền máu Dovay, người hién máu là một phan quan trong nhat dé tao nén dich vu truyén máu,nếu không có người hiến máu thì không có dịch vụ truyền máu

Người hiến máu quyết định đến số lượng máu của các trung tâm truyền máu.Thực tế trên thế giới và ở Việt Nam, một trong các chỉ SỐ quan trọng để đánh giánăng lực hoạt động của hệ thống truyền máu là số đơn vị máu tiếp nhận được và tỷlệ máu đáp ứng với nhu cầu máu điều trị

Người hién máu quyết định đến chất lượng máu Nếu lẫy máu ở người bị

thiêu mau thì các trung tâm truyên mau không thé “cô đặc” đê nâng cao chat lượng

máu lên được vì các tế bào máu đòi hỏi phải là tế bào sống nên nếu “cô đặc” thì cáctế bào này sẽ chết.

Người hiến máu quyết định đến an toàn truyền máu Người hiến máu cónhận thức day du dé “tu sàng lọc” một cách nghiêm túc va hiệu quả, được tuyếnchọn và chăm sóc tốt sẽ là một biện pháp cơ bản nhất để đảm bảo an toàn truyềnmáu Ngược lại, nếu người hién máu bị nhiễm bệnh nhất là trong “giai đoạn cửa số”thì nguy cơ lây nhiễm cho người bệnh nhận máu, nhân viên làm công tác truyềnmáu là rất lớn mặc dù các trung tâm truyền máu đã có những nỗ lực áp dụng nhiềubiện pháp để đảm bảo an toàn truyền máu [9,11,13,19]

2.2 Đặc điểm sinh học của HBV

2.2.1 Bệnh viêm gan B

Vi rút viêm gan B (HBV) được phát hiện đầu tiên bởi Blumberg vào năm1976 Cho đến nay khoa học đã có được những hiểu biết sâu sắc về dịch té hoc,cách thức truyền nhiễm, cơ chế sao chép phân tử, miễn dịch, các phương thức ngănchặn hữu hiệu va các phương pháp điều trị đối với HBV Cho đến nay đã phát hiện

được 5 loại virus chính gây nên bệnh viêm gan đó là vi rút viêm gan A, B, C, D, E.

Trong đó vi rút viêm gan B là nguy hiểm nhất với tỷ lệ tử vong cao nhất, trung bìnhhàng năm trên thế giới có 1-2 triệu người tử vong do vi rút này gây ra

Viêm gan do vi rút hiện nay vẫn là một bệnh rat phố biến trên toàn thế giớivà luôn là mỗi quan tâm lớn đối với công tác y tế của toàn cau Bệnh có tỉ lệ ngườimac cao và thường gây nên những hậu quả nặng nề như viêm gan man, xơ gan vàung thư gan nguyên phát Viêm gan là tốn thương tại gan với sự có mặt của các tếbào bị viêm trong mô gan Tình trạng bệnh có thể là tự khỏi hoặc có thể phát triểntới việc gây sẹo tại gan Viêm gan cấp tính là khi bệnh chỉ kéo dài dưới 6 tháng, còn

viêm gan mãn tính là khi bệnh kéo dài hơn.

Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu thì không có sự giống nhau về triệuchứng và sự đáp ứng lại liệu pháp kháng vi rút của bệnh nhân mắc bệnh viêm ganmạn tính ở các vùng khác nhau trên thế giới do có sự khác nhau giữa các kiểu gen

của HBV [22, 38].

2.2.2 Tình hình nhiễm HBV

Theo tổ chức Y tế thé giới thi gần 30% dân số thế giới, tương đương khoảng2 ty người có bang chứng huyết thanh nhiễm HBV Ước tính khoảng 350-400 triệungười trong tong số những người này mac viêm gan B mạn tính, và mỗi năm cókhoảng 1-2 triệu trường hợp tử vong vì bệnh gan man tính, gồm bệnh xơ gan và ungthư gan Châu Á và Tây Thái Bình Dương là vùng lưu hành cao của HBV, chiếmkhoảng 3/4 số nhiễm HBV mạn tính trên thế giới [38]

Việt Nam là nước có tỷ lệ hiện mac viêm gan B cao; ước tính có khoảng 8,6triệu người nhiễm vi rút viêm gan B Tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính đượcước tính khoảng 8,8% ở phụ nữ và 12,3% ở nam giới Nhiễm vi rút viêm gan B mạntính là nguyên nhân chính gây bệnh gan ở Việt Nam như xơ gan và ung thư

gan.Tiêm chủng vac xin viêm gan B cho tat cả trẻ sơ sinh đã được triển khai từ năm2003 Tỷ lệ bao phủ của vac xin viêm gan B năm 2012 là 97% và tỷ lệ bao phủ liều

sau sinh tăng lên 75% trong năm 2012 so với 65% của năm 2006 Theo một cuộc

khảo sát năm 2011, chỉ còn 2% trẻ dưới 5 tuổi bị nhiễm vi rút viêm gan B ViệtNam đang hướng tới mục tiêu giảm ty lệ hiện mắc viêm gan B xuống dưới 1% ở trẻ

dưới 5 tuôi vào năm 2017 [39].2.2.3 Cau trúc và đặc điểm nhân lên của HBV2.2.3.1 Cau trúc hình thể HBV

HBV thuộc họ Hepadnaviridae, vi rút mang vật chất di truyền là ADN, gâyviêm gan HBV có bộ gen là phân tử ADN chuỗi kép, chiều dài khoảng 3,2 kp.HBV có dạng hình cau, hình sợi, đường kính trung bình từ 42-45 nm Vi rút ton taidưới 3 kích thước 20-22 nm, 42-45 nm va 20-200 nm Vi rút có sức dé kháng tốtvới nhiệt do, ở 100°C trong 30 phút vi rút mới bị chết, ở nhiệt độ thường chúng cóthé sống trong thời gian dài từ 5-6 tháng, ở nhiệt độ lạnh thì rất bền vững, chúng cóthé sống tới 20 năm ở -20°C [15]

Trước đây, HBV được phân ra làm 4 kiểu huyết thanh: adr, adw, ayr và aywdựa trên việc xác định các kiểu kháng nguyên bề mặt vi rút B, tuy nhiên cho đếnnay có rất ít dữ liệu về vai trò của các kiểu huyết thanh này Ngày nay, những tiến

bộ của kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự

chuỗi ADN của HBV, từ đó đã phân loại HBV thành 8 kiểu gen khác nhau (A-H)dựa vào sự khác nhau trên 8% toàn bộ trình tự chuỗi của hệ gen Sự phân bố cáckiểu gen là khác nhau ở các châu luc và các nước khác nhau Kiểu A thấy nhiềunhất ở châu Au, Bac Mỹ và châu phi trong khi đó kiểu B và C phố biến ở ĐôngNam Á, kiểu D là dạng chiếm ưu thế nhất ở Nam Âu cũng như ở vùng Trung Đông,kiểu E phân bố khắp châu Phi trong khi kiểu F được tìm thấy ở người An Độ gốcNam Mỹ Kiểu G mới được tim thay gan đây và thay ở châu Âu và Bac Mỹ [39].

HBV có 3 loại kháng nguyên là HBsAg, HBcAg va HBeAg HBsAg là

kháng nguyên bề mặt của lớp vỏ ngoài lipoprotein của vi rút với các polypeptide cókhối lượng phân tử khác nhau Kháng nguyên này thường thấy xuất hiện trong tếbào chat của các tế bào gan của bệnh nhân viêm gan B Kháng nguyên bề mặt có ở

3 loại vi rút HBV và có sự khác nhau giữa chúng Có loại HBV mang cả 3 loạikháng nguyên HBsAg đó là HBsAg kích thước lớn, vừa và nhỏ Có loại HBV chỉ có

HBsAg kích thước lớn và vừa, loại HBV hình cầu nhỏ kích thước 20-200 nm chỉ có

HBsAg loại nhỏ Lối bên trong của vi rút có protein HBcAg, HBeAg, một sợi ADN

đơn (-) và enzyme ADN polymerase Trong tất cả các vi rút đã biết thì HBV là nhỏnhất HBcAg là kháng nguyên của capsid, thường thay trong nhân tế bào gan củabệnh nhân mắc bệnh và chỉ có ở HBV kích thước 42-45nm HBeAg là protein chưabiết rõ nguôn gốc nhưng người ta cho rằng nó có thé là một phan của HBcAg đã bịbiến đối Nếu có mặt HBeAg thì chứng tỏ vi rút viêm gan B đang nhân lên mạnh mẽvà bệnh nhân đang ở trạng thái viêm gan nặng rất dễ dẫn đến viêm gan mạn tính và

ung thư gan [39].

Hepatitn B « antigen

Hopatiti HH core `

aritigeny [HIk Ag) Hepatfitis 8

suttace antigen[itn Ag]

Purtially double aranted DNA

Hinh 2.1 Cau tao cia HBV [39]

2.2.3.2 Hệ gen HBV, chu trình nhân lên của HBV

Hệ gen ADN của HBV chỉ được thấy ở dạng vòng kép Chuỗi dài hay chuỗi(-) phần lớn là dạng vòng phức và liên kết cộng hóa trị với enzyme reversetranscriptase ở đầu 5° Chuỗi ngăn hay chuỗi (+) có chiêu dài chiếm khoảng 50-80%so với chuỗi (-) với đầu 5' cố định và đầu 3' tự do Gắn với đầu 5' của chuỗi (+) làoligoribonucleotide được chụp mũ Hệ gen của vi rút có 4 hệ thống đọc mở đượcdịch bộ mã hóa cho 4 bản sao mARN Bản sao đài nhất (3,5 kb) làm khuôn cho quátrình sao chép hệ gen và sự biểu hiện của phan tiền lõi hay lối và polymerase (polproteins) Pol có 3 vùng chính là vùng amin đầu cùng, reverse transcriptase vàRNase, vùng tận cùng của protein cũng đóng vai trò then chốt trong việc đóng gói

ARN Bản sao mã kích thước 2,4 kb mã hóa cho các protein pre S1, pre $2 và

10

HBsAg, trong khi bản sao kích thước 2,1 kb chỉ mã hóa cho các protein pre $2 và

HBsAg Bản sao nhỏ nhất mã hóa cho protein X Protein X là protein không cautrúc, nó đóng vai trò như các protein điều hòa của vi rút và ảnh hưởng tới số lượngprotein của nhân trong sự điều khiến chu trình tế bào, sao chép và sửa chữa ADN

[23].

Chu trình sống của HBV bat đầu khi vi rút gan vào tế bao vật chủ (tế baogan) Sự tan công vào tế bào có sự tham gia trung gian của vùng pre-Slctia HBsAglớn Sau khi liên kết với thụ thể và virion cởi bỏ lớp vỏ, các nhân của vi rút trong tếbào chất được vận chuyền tới nhân bên trong - nơi hệ gen vòng lỏng lẻo và képđược chuyển thành ADN vòng đóng (ceeADN) và ton tại như vi thé nhiễm sắc củavi rút Sự chuyển đối được thực hiện bởi các enzyme của tế bào vật chủ Các vi thểnhiễm sắc của vi rút làm khuôn cho quá trình sao mã 4 loại mARN của vi rút bởiARN polymerase II của tế bào vật chủ Các ARN này được đóng gói và sau đó diễnra quá trình tong hợp chuỗi âm và chuỗi dương Trong các mảnh nhân của tế bàochất, sự sao chép của hệ gen HBV diễn ra nhờ cơ chế tổng hợp không liên tục củachuỗi (-) Cuối cùng, sự hình thành virion theo phương thức nảy chéi trong manglưới nội chất là nơi tất cả các protein bề mặt vi rút viêm gan được tong hop Sau khinảy chổi, các virion được đưa ra ngoài chủ yếu theo cách vận chuyén của bong vatiếp tục lây nhiễm sang các tế bào khác Trong khi tấn công các tế bào gan, HBVkhông trực tiếp giết các tế bào vật chủ do nó được giải phóng khỏi tế bào mà khôngcần dung giải chúng Vì thế, sự tốn thương của gan là do sự ảnh hưởng lẫn nhaumột cách trực tiếp giữa hệ thống miễn dịch của vật chủ với các tế bào gan bị nhiễm

HBV [23].

Hình 2.2 Chu trình sống của HBV [23]

2.2.3.3 Giai doan gây bệnh

a) Viêm gan cấp tínhThời gian ủ bệnh từ 1 - 6 thang Một số bệnh nhân có cảm giác như bị cảmnhẹ, đôi khi không biết mình bị HBV Một số khác bị vàng da, mệt mỏi, đau nhức,buôn ói, chán ăn, sốt nhẹ, biến đối cảm giác (hiện tượng đặc biệt là người nghiềnthuốc lá tự nhiên không thích mùi thuốc lá), đau bụng (dưới sườn bên phải) Nhữngtrường hợp bị viêm nặng sẽ đưa đến gan to, khó ngủ, mê muội, lãng trí hoặc bất

Phần lớn khi bị viêm mạn tính cảm thay bệnh nhân hoàn toàn bình thường.Một số bị viêm mạn tính nặng thì tiếp tục bị các triệu chứng viêm cấp như mệt mỏi,

chán ăn, đau bụng, và suy gan.

Biểu hiện lâm sàng: Gan to, bàn tay tng đỏ Khi bị biến chứng xơ gan có thé

bi ứ nước trong bụng, vàng da, loãng mau, chảy mau trong dạ dày, tinh mach toa

lớn từ rồn (do tăng áp làm giãn tĩnh mạch cửa gan), nam vú lớn như vú nữ, tinhhoàn teo nhỏ (vì gan yếu làm thay đối cân băng của các hormone giới tính)

2.2.3.4 Đáp ứng miễn dịch

Khi các vi rút đi vào cơ thé, nó gây ra sự đáp ứng của các hệ thông miễn dichbao gdm cơ chế phòng thủ bam sinh và sự đáp ứng miễn dịch thích ứng với tế bàovà các sự đáp ứng miễn dịch của người đối với các vi rút Phụ thuộc vào khả năngcủa các hệ miễn dịch chồng lại các vi rút mà bệnh sẽ diễn tiễn khác nhau; hoặc khỏibệnh hoặc bị ung thư mạn tính và dẫn đến tử vong [23]

Sơ đồ 2.2 Chuyén đối huyết thanh HBV [39]

2.3 Cac kỹ thuật xét nghiệm được áp dụng trong sàng loc mau2.3.1 Phương pháp huyết thanh học

2.3.1.1 Một số kỹ thuật xét nghiệm xác định các dau ấn huyết thanh học nhiễm

virus viêm gan B

Các xét nghiệm HBsAg dau tiên được thực hiện băng kỹ thuật khuếch tánmiễn dich hai chiều Ouchterlony, nhưng sau đó các kỹ thuật với độ nhạy cao hơn (

như RIA và ELISA) đã được áp dụng Ngày nay, mặc dù việc thực hiện các xét

nghiệm HBsAg đang có đã thay đôi đáng kế và sàng loc máu hiện nay ở Liên minhchâu Âu (EU) cần độ nhạy là 0,13 IU / mL, nhưng một SỐ kỹ thuật với độ nhạy caohơn (<0,013 IU / ml) đã có sẵn Dé phát hiện hiệu qua các đột biến HBsAg, các kỹthuật trong đó có bao gồm nhiều kháng thể đơn dòng trong giai đoạn bắt giữ cùngvới một cộng hợp kháng thé đa dòng thường được ưa chuộng [21]

Dưới đây trình bày một số kỹ thuật sử dung phố biến tại các bệnh viện hiện

nay.

a) Kỹ thuật ngưng kết hông cầu thụ động ngược (RPHA)

Nguyên lý: xét nghiệm HBsAg RPHA

Gan AntiHBs trên bề mặt hồng cau cừu Tiến hành phan ứng trực tiếp bangcách nhỏ huyết thanh thử vào vào huyền dịch AntiHBs trong một giếng nhựa Đểyên 60 phút Nếu trong huyết thanh thử có HBsAg thì hiện tượng ngưng kết sẽ xảy

ra do hong cầu cừu sẽ tu tập lại một cách thụ động Đọc kết quả bang mat thuong

Phan ứng âm tính khi không có hiện tượng ngưng kết xảy ra: xuất hiện hìnhnút hoặc hình vòng nhẫn của các hồng cau không ngưng kết lang xuống đáy giếng

Phản ứng dương tính khi có hiện tượng ngưng kết xảy ra, không có hình núthoặc vòng nhẫn [24, 25]

e Ưu điểm: không cần dụng cụ đắt tiền, cách tiễn hành đơn giản, đọc kết quảbăng mắt thường nên còn được ứng dụng rộng rãi để chân đoán các bệnh khác

e Nhược điểm: ít nhạy so với kỹ thuật ELISA

14

b) Kỹ thuật miễn dịch sắc ký

Nguyên lý: test nhanh HBsAg

Dùng AntiHBs don dòng và AntiHBs đa dòng cố định trên que thử bang giấythâm dé phát hiện sự có mặt của HBsAg trong huyết thanh

Khi cho que thử tiếp xúc với huyết thanh thử theo qui định, huyết thanh thửsẽ thấm dan lên trên Nếu trong mẫu thử có HBsAg thì AntiHBs đơn dòng có ganhạt keo vàng sẽ kết hợp với kháng nguyên và hình thành phức hợp kháng nguyên-

kháng thể làm xuât hiện màu hồng ở vạch T (vạch thử) Huyết thanh tiếp tục mao

dẫn lên trên, kết hợp với kháng huyết thanh đa dòng AntilgG làm xuất hiện màuhồng ở vạch C (vạch chứng)

Nếu trong mẫu huyết thanh thử không có HBsAg thì sẽ không xuất hiện màuhong ở vạch T, nghĩa là không xảy ra phản ứng ngưng kết giữa HBsAg và AntiHBs,nhưng tại vạch C vẫn xuất hiện màu hồng VÌ CÓ su ngưng kết của nhiều loại IgGtrong mẫu huyết thanh với kháng huyết thanh đa dòng AntilgG

Kết quả dương tính khi xuất hiện 2 vạch rõ ràng và kết quả âm tính khi xuất

hiện một vạch C [37].

Ưu điểm của miễn dịch sắc kýQui trình đơn giản, nhanh: chỉ trong vài phút, đọc kết quả bằng mắt thường.Cùng với kỹ thuật ngưng kết, kỹ thuật test nhanh được WHO khuyến cáo là có thé

dùng sàng lọc máu ở những phòng xét nghiệm qui mô nhỏ, ở nơi xa xôi hẻo lánh

hoặc trong những tình huống cấp cứu Hiện nay, test nhanh HBsAg được áp dụngđể sàng lọc người hién máu tại địa điểm tổ chức hiến máu tình nguyện, sau đó tiếnhành sàng lọc đơn vị máu hiến một lần nữa bằng kỹ thuật ELISA hoặc hóa phát

quang tại phòng xét nghiệm

Nhược điểm của miễn dịch sắc ký: Phụ thuộc vào đánh giá chủ quan của

người đọc, có một tỉ lệ âm tính giả nhất định Nghiên cứu tại Viện Huyết

học-Truyền máu Trung ương năm 2011 cho thấy tỉ lệ dương tính HBsAg ELISA là1,07% trên những đơn vị máu đã được sàng lọc bang test nhanh HBsAg [37]

c) Kỹ thuật miễn dich gắn enzym (ELISA)

Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểmchung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trongđó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường lànitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chấtcó màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể vớikháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nông độ kháng nguyên haykháng thé can phát hiện.

Assay-Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất

như peptides, protein, antibodies, hormone, Đôi khi nó còn được gọi bởi một têngọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay)

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc

kháng thé ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịchphóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền va an toàn hơn mavẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhângây bệnh như virus, vi khuẩn, nắm, kí sinh

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên,kháng thể và chất tạo màu: thực hiện qua hai bước:

e Phan ứng miễn dịch hoc: La sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thé

e Phan ứng hóa hoc: Thông qua hoạt tính xúc tác cua enzyme làm giải phóng

oxy nguyên tử [O] từ nước dé oxy hóa cơ chất chỉ thị mau, do đó làm thay đổi màucủa hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm [24]

K hang the 2 a "Thêm dung dich tạo mau

Hình 2.3 Kỹ thuật ELISA [24]Phân loại ELISA

*Direct ELISA (ELISA trực tiếp)Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trongđó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được găn trực tiếp lên bề mặt giá thé và sẽ đượcphát hiện băng một kháng thé duy nhất (kháng thé nay đã được gan enzyme)

Cho kháng nguyên vào đĩa ELISA

Dem ú các đĩa chứa kháng nguyên

Rwa

U 6 37°

co chat

U 637°CDoc két quaSo đồ 2.3 Tiền trình thực hiện phan ứng ELISA trực tiếp- Ưu điểm: Đơn giản nhất

- Nhược điểm: Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có it nhất

là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dung | kháng

thể găn vào một epitope

Phải đánh dau cho từng kháng thé chuyên biệt với từng đối tượng [25].*ELISA gián tiếp

Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thé batkháng nguyên không được gan enzyme ma no la muc tiéu gan đặc hiệu cua motkháng thé khác (kháng thé này mới là kháng thé được gắn với enzyme).

Cho kháng nguyên vào đĩa

18

Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau Điều

này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệmvới nhiều kháng huyết thanh khác nhau dé kết quả có thé tin tưởng được [24]

2.3.1.2 Kỹ thuật miễn dịch enzym vi hạt (MEIA)

Phương pháp ELISA cải tiễn mới đây dùng các vi hat (microparticles) vaphương tiện vi tính cho ra các xét nghiệm miễn dịch enzym vi hạt (MEIA) khanhanh (45 phút) và hoàn toàn tự động.

Nguyên lý cơ bản của thử nghiệm vi hạt khác với thử nghiệm trên giếng làtoàn bộ bé mặt của hạt gelatin hoặc hoặc hat latex có kích thước khoảng Inm tronghuyền dịch với đệm thích hợp Mỗi thử nghiệm dùng một thể tích huyền dịch, trongđó bao gôm hàng triệu hạt nhỏ Các hạt này cung cấp diện tích bé mặt lớn cho phảnứng Phân lớn thử nghiệm vi hạt được thiết kế cho hệ thống chuyên dụng và chứatrong các giếng nhỏ, trong đó xảy ra phản ứng Nguyên lý kỹ thuật và phương phápgiống như kỹ thuật ELISA Hệ máy PRISM và AxSYM của hãng Abbott là các vídụ về thử nghiệm này [20]

2.3.1.3 Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA)

Kỹ thuật này được thực hiện trên máy tự động hoàn toàn.

Nguyên lý: Dùng kháng thể đã biết để phát hiện kháng nguyên chưa biết, vàngược lại Dùng hệ thống phát hiện là điện hoá phát quang để nhận biết được sựhiện diện của phức hợp kháng nguyên- kháng thé

Kỹ thuật bao gồm các phản ứng:Phản ứng miễn dịch: kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể đượcđánh dấu băng ruthenium Sử dụng sự tương tác của biotin và streptavidin cùng vớicác vi hạt có từ tính để gắn phức hợp kháng nguyên-kháng thé (đánh dấu bangruthenium) vào pha ran

Phản ứng điện hoá phát quang: để phát hiện sự hiện diện của phức hợp khángnguyên- kháng thể đánh dấu băng ruthenium Dưới tác dụng của điện, phức hợp

ruthenium phản ứng với tripropylamine (TPA) và phát quang.

20

Ru*** trang tháitrang hich thich

bi

fenHình 2.4 Phan ứng điện hóa phat quang tai bề mặt điện cực [35]Kết quả phản ứng điện hóa phát quang là tín hiệu ánh sáng được máy ghinhận và suy ra nồng độ ban đầu của kháng nguyên hoặc kháng thể có trong mẫuthử Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang sử dụng chất đánh dấu là ruthenium

khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vì vậy có khả năng phát hiện

chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh, trong khoảng 18 phút Các kháng thể(hoặc kháng nguyên) gan biotin và chất đánh dấu ruthenium cùng vi hạt phủstreptavidin được ủ trong hỗn hợp phản ứng Khi đặt một điện thế lên điện cựcbuông đo, phức hợp ruthenium tác dụng với prophylamine, chuyển sang trạng thái

kích thích, và tín hiệu phát quang được hình thành Tín hiệu ánh sáng được đo và

kết quả xét nghiệm được xác định qua đường chuẩn xét nghiệm đã được thiết lập.Một đường cong qui chiếu được ghi nhớ trong một thanh đã mã hóa các thuốc thửvà được xác định một lần nữa bởi máy phân tích tự động bởi một đường chuẩn ở haiđiểm [35]

+ >.

® xmocx

1 BIOTINYLATED

ANTIBODY

Hình 2.5 Nguyên ly sandwich của kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang [35]

2.3.2 Phương pháp sinh hoc phan tử (xét nghiệm NAT)

Phương pháp Nucleic acid testing (NAT) là phương pháp xét nghiệm phat

hiện lõi virus (là acid nucleic, có thé là ADN — acid deoxiribonucleic hoặc ARN acid ribonucleic) Các xét nghiệm đã được kết luận Non reaction (không phản ứng)băng phương pháp Huyết thanh học vì nhiêu lí do khác nhau, trong đó có nguyênnhân do nồng độ các kháng nguyên của virus hoặc các kháng thé của co thé chốnglại virus là rất thấp nhưng mam bệnh phẩm vẫn có thé có sự tổn tại của virus (AND-ARNI ở nông độ rất nhỏ Hiện tại phương pháp NAT đang được áp dụng công nghệReal time PCR (trên hệ thong S201) hoặc TMA trên hệ thống Panther được sử dụngđể xét nghiệm những mẫu đã được kết luận là Non rection với phương pháp Huyếtthanh học Nong độ acid Nucleic trong mau bénh pham được nhân lên nhiều lầnthông qua phản ứng PCR, qua đó việc phát hiện ra virus sẽ dễ dàng hơn Thực tếcũng đã có những trường hợp phát hiện ra sự ton tai của virus gây bệnh khi sử dụngphương pháp này, mặc dù qua phương pháp Huyết thanh học những mẫu bệnhphẩm nay được kết luận là không phản ứng

-22

Trong quá trình tiến triển bệnh truyền nhiễm (viêm gan B, viêm gan C, HIV),có những giai đoạn có hé phát hiện vỏ vitus mà không hé phát hiện được lõi củavirus, và ngược lại, có giai đoạn chỉ phát hiện được lõi mà không thể phát hiện vỏvirus Quá trình phát triển bệnh viêm gan B, HBsAg xuất hiện sớ trong huyết thanhtrước khi men gan tăng (GPT) đạt đỉnh cao nhất và trước khi vàng da từ một vàituần đến một vài tháng Cùng với sự xuất hiện của HBsAg, AND polymerase cũngbiéu thị HBV đang hoạt động và phát triển về số lượng HBsAg mất đi sau 2-3tháng nhưng cũng có thể tồn tại đến 6 tháng hay suốt đời [5] Với một số trườnghợp mac chứng viêm gan cấp, có người chi phát hiện được ADN bang PCR lông(nested PCR) (điều nav cho thấy lượng virus thấp) và không có các chỉ điểm HBVtrong huyết thanh [6] Với người nhiễm HIV ở giai đoạn thứ 2 (kéo dài từ 1-2 năm)được gọi pha không có triệu chứng xuất hiện, hay giai đoạn tiềm ảxL Số lượngkháng thé 6n định ở mức cao, kháng nguyên p24 thường khó phát hiện nhưng virusHIV có thé được phát hiện bang PCR Vì vậy, nhiều nước trên thé giới, trong đó cóViệt Nam và đi đầu là Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã kết họp sửdụng cả hai phương pháp Huyết thanh học và phương pháp NAT Băng kỹ thuậtsinh học phân tử sẽ giảm giai đoạn cửa số xuống 7 ngày cho HCV, 11 ngày HIV va20 đến 30 ngày cho HBV [12].

Việc triển khai song song cả hệ thông xét nghiệm băng phương pháp Huyết

thanh học và NAT cần có đầu tư lớn về cơ sở vật chất, kỹ thuật Chất lượng xét

nghiệm cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chất lượng kit sử dụng, tình trạng máymóc và việc tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình làm việc, các uy định về bảo hộ laođộng các virus gây bệnh cũng có thé có thay đối nào đó trong vật liệu di truyén (lõiAND/ARN) do tác động của thuốc kháng sinh hoặc các nguyên nhân khác Sự thayđổi trong vật liệu di truyền có thé dẫn đến những thay đổi trong các chuỗiplolypeptit được tổng hợp, là thay đối cau trúc vỏ của virus, các loại kit hiện tạiđược thiết kế để tạo phản ứng Kháng nguyên — Kháng thể đã biết trước, vì vậy sẽ vôtác dụng nếu kháng nguyên trên bề mặt virus đã thay đôi Điều tương tự cũng có thểxảy ra với các phản ứng PCR khi cấu trúc của AND, ARN thay đổi, các đoạn mỗi sẽvô tác dụng, phản ứng PCR sẽ kém hiệu quả Ví dụ với virus HBV, các thé đột biếntrong vùng S đã được biết đến từ nhiều năm nay, do khung đọc protein của § và các

enzym dich mạc nam gối lên nhau, những thé dot biến này có thé gây ra sự thay thếcác acid amin khác của protein S [6] Như vậy với những kit hiện tại được thiết kếđể xác định những protein có cau trúc hod học đã biết, liên quan đến sự t6n tai ciavirus gây bệnh (cau tao protein vỏ virus, AND/ARN virus ) sẽ không phát huy tác

dụng nếu virus đã bị thay đổi về vật liệu di truyền, mặc dù vậy virus không mat đi

khả năng biểu hiện sự sống vì vẫn tôn tại trong cơ thể người bị phơi nhiễm

Khai thác mặt mạnh của PCR, nhiều công ty đã nghiên cứu và phát triểnnhiều thế hệ sinh phẩm phát hiện HIV và HBV nhờ COBAS Ampliscreen HIV-1

Test,Roche Amplicor HIV-1 Monitor Test va COBAS Ampliscreen HBV Test v.v

Tuy nhiên, các sinh phẩm nay được nghiên cứu va sản xuất dé phù hop sử dungtrong sàng lọc máu của những người cho máu Không thể phủ nhận răng PCR cómặt hạn chế của nó đó là phương pháp có thể cho kết quả dương tính giả khi mộtlượng rất nhỏ chuỗi đích được khuếch đại bị nhiễm vào mẫu phân tích hay các hóachất dùng cho phân tích ADN bị nhiễm này có thể sau đó lại được dùng làm khuôncho phản ứng nhân bản tiếp theo và vì thế sẽ cho kết quả dương tính giả Một xuhướng mới đó là sử dụng các xét nghiệm đa thành phan (multiplex PCR) dé pháthiện đồng thời một số tác nhân gây bệnh bằng cách sử dụng đồng thời một số môi

đặc hiệu cho các gen đích khác nhau trong cùng một phản ứng PCR Dạng

multiplex PCR có một số ưu điểm nhờ giảm số lượng mẫu cần phải thao tác, cũngnhờ giảm được giá thành hóa chất và tiết kiệm được thời gian nhưng vẫn đảm bảođược mức độ an toàn gan giống với các phản ứng PCR riêng lẻ, đặc biệt là phù hợpcho xét nghiệm sàng lọc máu với số lượng lớn Đối với các tác nhân vi sinh vật gâyra những triệu chứng lâm sàng giống hoặc tương tự nhau hay có cách thức lâynhiễm giống nhau như HIV, HBV hoặc HCV thì NAT sẽ có những ưu thế.Kỹ thuậtxét nghiệm NAT được thực hiện trên hệ thống Cobas s 201 của Roche với phản ứngphiên mã ngược - khuyếch đại chuỗi (RT-Real time PCR) sẽ phát hiện đồng thời

RNA của HIV-I (nhóm M và O), HIV-2 RNA, HCV RNA, và HBV DNA Day là

một hệ thống gom các mồ-đun tự động được sử dung trong sang loc máu Đầu tiênlà pipettor Hamilton Microlab® STAR IVD, có vai trò hút mẫu và phối trộn mẫu tựđộng Tiếp theo mẫu sẽ được tách chiết acid nucleic trên Cobas Ampliprep (CAP).Sau cùng Cobas® TaqMan® (CTM) thực hiện khuếch đại và phát hiện DNA hoặcRNA của vi rút có trong mẫu Cả quá trình xét nghiệm được kiểm soát bởi hệ thống

24

quan lý mẫu thử và sử dụng phần mềm quản lý dữ liệu dé phân tích và biện luận kết

quả [26], [40].

2.4 Tình hình xét nghiệm NAT trên thé giới và Việt Nam

Trên thé giới: Thang 7 Nam 1999 Ủy ban châu Âu đọc quyên về dược đã yêucầu tat cả các sản phẩm có nguồn góc từ huyết tương phải được sàng lọc HBV bang

kỹ thuật NAT với độ nhạy phát hiện I00I1Ư/ml tương đương 230 bản sao/ml:Fừ

tháng 4/1999 các ngân hang máu tai đức khi triển khai NAT đả yêu cầu các chếphẩm máu phải được sàng lọc HBV bằng kỹ thuật NAT với độ nhạy phát hiện là

50001U/ml, năm 2002: FDA Hoa Ky công nhận kỹ thuật NAT xét nghiệm HBV,

HCV và HIV trong sàng lọc đơn vị máu.Theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giảtại Viện Quốc gia về tim mạch, phối và máu cùng nhóm nghiên cứu về NAT củaMỹ, từ giữa năm 1999 đến 2001 trên 37.164.054 đơn vị máu đã có kết quả âm tínhvới phương pháp huyết thanh học Người ta ghi nhận có 12 mẫu dương tính HIVvới kỹ thuật xét nghiệm NAT (chiếm ty lệ 1/3.000.000 đơn vi máu) Đối với HCV,

ty lệ dương tính với kỹ thuật xét nghiệm NAT là 1/230.000 đơn vi máu Bên cạnh

đó, người ta còn thống kê được tỷ lệ dương tính của người hiến máu lần đầu caohơn người hién máu nhắc lại từ 3,3 đến 4,1 lần [34]

Theo dữ liệu thống kê của Viện Robert Koch- Viện thông kê và phân tích cácdữ liệu dịch tế học của Đức, được đăng trên tạp chí vào ngày 01/02/2005 về nguycơ lây nhiễm các bệnh lây qua đường truyền máu là HIV, HBV và HCV trong sốnhững người hiến máu từ năm 2000 đến 2002, nếu như không thực hiện xét nghiệmNAT thì tỷ lệ nhiễm HIV là 1-2/770.000; HBV là 1/230.000 va HCV là 1/670.000đơn vị máu Ngược lại, néu được xét nghiệm NAT thì tỷ lệ nguy cơ nhiễm các vi rúttrên giảm xuống đáng kể, đối với HIV là 1/5.540.000; HBV là 1/620.000 va HCV là1/4.400.000 Điều này có thé thay rằng nếu áp dụng kỹ thuật xét nghiệm NAT vàotrong xét nghiệm sàng lọc máu sẽ làm giảm nguy cơ bị lây nhiễm các bệnh lây quađường truyền máu [30]

Theo một nghiên cứu được thực hiện tại bệnh viện đa khoa Almana ở Saudi

Arabia trên đối tượng là người hiễn máu từ năm 2008-2012 Qua đó, ghi nhận được

13435 mẫu thử âm tính với các xét nghiệm huyết thanh học Sau khi được thực hiện

băng kỹ thuật xét nghiệm NAT, phát hiện có 7 mẫu dương tính: 4 mẫu dương tính

với HBV, 2 mẫu dương tính với HCV va 01 mẫu dương tính với HIV Sau đókhoảng từ 3 đến 6 tháng, người ta kiểm lại bằng phương pháp huyết thanh học với 7người hiến máu đã cho kết quả dương tính với xét nghiệm NAT ở trên thì thấy rangcả 7 mẫu này đều dương tính với phương pháp huyết thanh học Như vậy, kỹ thuậtxét nghiệm NAT sẽ giúp phát hiện sớm các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máuở giai đoạn cửa số [28].

Tại các nước Châu Á như Nhật, Singapore, Malaysia, Dai Loan, Thái Lan cũng đã áp dụng kỹ thuật này vào trong sàng lọc máu Tuy nhiên, do ty lệ nhiễmviêm gan B ở khu vực Châu Á khá cao nên hầu hết các nước đều chọn hình thức làlàm riêng rẽ từng mẫu chứ không gộp mẫu như các nước Châu Âu [27, 31, 32]

Theo nghiên cứu của tác giả H Ohnuma và cộng sự được thực hiện tại hội

Chữ thập đỏ và dịch vụ truyền máu Nhật Bản từ tháng 02 năm 2001, với hơn6.000.000 đơn vị máu đã có kết quả âm tính với HIV, HBV và HCV băng phươngpháp huyết thanh học, sau khi kiểm tra băng kỹ thuật xét nghiệm NAT thì phát hiệnthêm 112 mẫu dương tính với HBV, 25 mẫu dương tính với HCV và 4 mẫu dươngtính với HIV [27].

Thái Lan bắt dau triển khai kỹ thuật xét nghiệm NAT trên 100% các đơn vi

máu từ năm 2006 Theo một nghiên cứu của Ngân hàng máu Thái Lan được thực

hiện vào năm 2007 với 242.363 mẫu thử đã có kết quả âm tính với phương pháp

huyết thanh học, sau khi xét nghiệm NAT thì phát hiện thêm 108 mẫu dương tính,

trong đó 03 mẫu dương tính với HIV, 01 mẫu dương tính với HCV và 104 mẫudương tính với HBV Như vậy qua nghiên cứu này có thể kết luận được kỹ thuật xétnghiệm NAT có thé rút ngăn giai đoạn cửa số nhiễm HIV, HBV, HCV [32]

Theo một nghiên cứu của Ngân hàng máu Malaysia được thực hiện từ năm

2008 - 2010 với tong số mẫu thử lay ngẫu nhiên từ người cho máu là 1.388 mẫu.Các mẫu này chưa thực hiện xét nghiệm sang lọc Sau khi được tiễn hành đồng thờibăng phương pháp huyết thanh học và kỹ thuật xét nghiệm NAT, người ta ghi nhậncó 360 mẫu cho kết quả âm tính và 4 mẫu cho kết quả dương tính với cả hai phươngpháp và kỹ thuật nêu trên Riêng 24 mẫu có sự khác biệt, trong đó 05 mẫu dươngtính với kỹ thuật xét nghiệm NAT và 19 mẫu dương tính với phương pháp huyếtthanh học Tuy nhiên khi tái kiếm tra khang định bằng phương pháp huyết thanh

26

học thì 19 mẫu này lại cho kết quả âm tính Như vậy, qua nghiên cứu này có thé kếtluận được kỹ thuật xét nghiệm NAT có thể hạn chế các trường hợp dương tính giả

[31].

Tại Việt Nam: Hiện nay, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương và các

trung tâm truyền máu lớn trên toàn quốc đã thực sự làm chủ được xét nghiệm NAT

(Nucleic Acid Test) - xét nghiệm hiện đại sàng lọc virus HIV, viêm gan B (HBV),

Viêm gan C (HCV) trong đơn vị máu nhằm bảo đảm an toàn truyền máu.Việc làmchủ được kỹ thuật hiện đại trên là cơ sở vững chắc để hoàn thành lộ trình triển khaixét nghiệm NAT trên toàn quốc.Thông tin trên được Giáo sư Nguyễn Anh Trí, Việntrưởng Viện Huyết hoc-Truyén máu Trung ương công bố tại buổi giới thiệu ứngdụng kỹ thuật xét nghiệm NAT - Kỷ nguyên mới bảo đảm an toàn truyền máu vớisự hỗ trợ của Công ty Roche Việt Nam, tổ chức sáng 26/4/2014, tại Hà Nội Kỹthuật NAT hiện là kỹ thuật xét nghiệm sàng lọc máu tiên tiễn nhất Bộ Y tế đã banhành Thông tư hướng dẫn, cho phép áp dụng kỹ thuật trên tại các trung tâm truyềnmau, cơ sở sàng lọc mau của các bệnh viện trên toàn quốc theo lộ trình cụ thể Theothông tin từ Bộ Y tẾ, kỹ thuật NAT được thực hiện trên máy xét nghiệm sinh học

phân tử hoàn toàn tự động sàng lọc virus HBV, HCV, HIV cho độ chính xác, độ

nhạy cao, đem hiệu quả rõ rệt trong việc rút ngăn thời gian cửa số phát hiện cácvirus Kỹ thuật này góp phan mở ra kỷ nguyên mới bảo đảm an toàn truyền mau,cung cấp nguồn máu an toàn, kịp thời Xét nghiệm NAT có thể phát hiện virus HIVsau 23 ngày trong khi phương pháp sang lọc huyết thanh thì phải chờ sau 85 ngày.Với bệnh viêm gan B, xét nghiệm NAT có thể phát hiện ra bệnh trên chỉ sau 34ngày, trong khi nếu dùng phương pháp sàng lọc huyết thanh thì mat tới 60 ngay[40]

Năm 2015, Viện Huyết học-Truyền máu trung ương là đơn vị đầu tiên trongcả nước chính thức cung cấp tất cả các đơn vị máu, chế phẩm máu đều được sànglọc bằng xét nghiệm NAT Sau đó, xét nghiệm trên đã được triển khai ở các trungtâm truyền máu của Bệnh viện Truyền máu-huyết học Thanh phố Hồ Chí Minh,

Bệnh viện Chợ Ray va Bénh vién huyết học-Truyền máu Cần Thơ