Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Ứng dụng kỹ thuật Lamp (Loop-mediated isothermal amplification) trong phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM THỊ HUYỀN TRANG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAMP LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION TRONG PHÁT HIỆN NHANH VIRUS WSSV VÀ IHHNV GÂY

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHẠM THỊ HUYỀN TRANG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) TRONG PHÁT HIỆN NHANH VIRUS WSSV VÀ IHHNV GÂY BỆNH TRÊN TÔM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2019

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tấn Trung

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Phạm Thị Huyền Trang MSHV: 7140871 Ngày, tháng, năm sinh: 04/07/1988 Nơi sinh: Nghệ An

I TÊN ĐỀ TÀI: Ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal

amplification) trong phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xây dựng được phương pháp phát hiện nhanh

virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)

- Thiết kế primer và tối ưu hóa phương pháp LAMP- Khảo sát độ nhạy của phương pháp

- Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp và so sánh với phương pháp PCR

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/01/2018

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/12/2018

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Tấn Trung

Tp HCM, ngày tháng năm 2018

TS Nguyễn Tấn Trung PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng được một phương pháp phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm bằng kỹ thuật LAMP, giúp cho các phòng thí nghiệm với trang thiết bị đơn giản có thể thực hiện được các xét nghiệm bệnh trên tôm Trong nghiêm cứu này chúng tôi đã tiến hành thiết kế 4 cặp mồi cho mỗi phản ứng LAMP phát hiện các tác nhân WSSV và IHHNV Tối ưu hóa nồng độ betaine cho vào phản ứng đối với LAMP-WSSV là 1M và đối với LAMP-IHHNV là 0.8M xác định độ nhạy của phản ứng LAMP là 25 copy DNA của virus Đồng thời với bộ mồi thiết kế cho phản ứng LAMP WSSV và IHHNV theo khảo sát của chúng tôi trên một số mẫu thực nghiệm có độ đặc hiệu là 100%, tương đồng với kết quả PCR

We conducted this study in order to develop a rapid detection method for WSSV and IHHNV by LAMP technique, enabling simple laboratory equipment to perform Disease testing on shrimp In this study we have designed 4 pairs of primers for each LAMP reaction to detect WSSV and IHHNV Optimization of betaine concentration in LAMP-WSSV reaction was 1M and for LAMP-IHHNV was 0.8M The sensitivity of the LAMP reaction is 25 copies of the DNA virus Simultaneously with the primer design for LAMP WSSV and IHHNV reactions according to our survey in some specimens has a specificity of 100%, similar to the PCR results

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi Các số liệu sử dụng phân tích trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong luận văn do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác

Học viên

Phạm Thị Huyền Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát về thực trạng nghề nuôi tôm ở Việt Nam 3

1.1.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 3

1.1.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm 5

1.2 Virus gây bệnh đốm trắng trên tôm (WSSV) 6

1.2.1 Phân loại và cấu tạo Virus 7

1.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 11

1.2.3 Cơ chế gây nhiễm và Kiểu lan truyền 12

1.3 Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô 14

1.3.1 Phân loại và cấu trúc virus 15

1.3.2 Dấu hiện bệnh lý 16

1.3.3 Phân bố và lan truyền 17

1.4 Các phương pháp phát hiện 18

1.4.1 Phương pháp mô học: 18

1.4.2 Phương pháp lai phân tử 19

1.4.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 20

1.4.4 Phương pháp DNA Real time PCR 21

1.4.5 Phương pháp LAMP 22

1.4.5.1 Nguyên tắc của phương pháp 22

1.4.5.2 Cơ chế phản ứng LAMP 23

1.4.5.3 Hiển thị kết quả LAMP 28

1.4.5.4 Ưu điểm của phương pháp LAMP 30

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGIÊN CỨU 33

2.1 Vật liệu nghiên cứu 33

2.1.1 Mẫu thí nghiệm 33

2.1.2 Máy móc, trang thiết bị 33

2.1.3 Hóa chất, vật tư dùng cho thí nghiệm: 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Thiết kế primer (thiết kế mồi) 36

2.2.2 Tối ưu hóa phản ứng LAMP 36

2.2.3 Tiến hành kiểm tra độ nhạy của phản ứng LAMP PCR 38

2.2.4 Tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của phương pháp LAMP 39

2.2.4.1 Thu nhận và xử lý mẫu 39

2.2.4.2 Tách chiết DNA tổng số 40

2.2.4.3 Thực hiện phản ứng LAMP trên tất cả các mẫu thực nghiệm 41

2.2.4.4 Thực hiện phản ứng PCR kiểm chứng kết quả của phản ứng LAMP41 2.2.4.5 Đối chiếu kết quả LAMP và kết quả PCR 43

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 44

3.1 Thiết kế primer 44

3.2 Kết quả tối ưu hóa phản ứng LAMP 48

3.2.1 Kết quả tối ưu hóa nồng độ betaine 48

3.2.2 Xác định thời gian phản ứng LAMP 52

3.2 Khảo sát độ nhạy phản ứng LAMP 56

3.3 Khảo sát độ đặc hiệu và độ chọn lọc của phương pháp LAMP 59

3.3.1 Thực hiện phản ứng LAMP trên các mẫu thực nghiệm 59

3.3.2 Kết quả chạy các mẫu thực nghiệm bằng phương pháp PCR 65

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70

4.1 Kết luận 71

4.2 Kiến nghị 72

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus

VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng thông kê dịch bênh tôm từ năm 2014-2016 5

Bảng 1.2 Thống kê dịch bệnh WSSV từ năm 2014-2016……… 6

Bảng 1.3 Những ưu nhược điểm của các phương pháp phát hiện……… 31

Bảng 2.1 Kích thước mẫu thí nghiệm 33

Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng LAMP WSSV và IHHNV……… 37

Bảng 2.3 công thức pha mix PCR phát hiện WSSV……… 42

Bảng 2.4 công thức pha mix PCR phát hiện IHHNV 42

Bảng 3.1 Thông tin bộ gene các chủng virus WSSV và virus IHHNV 45

Bảng 3.2 Trình tự primer cho phản ứng LAMP phát hiện WSSV 48

Bảng 3.3 Trình tự primer cho phản ứng LAMP phát hiện IHHNV 48

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng LAMP-WSSV 53

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng LAMP-IHNV 54

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất phản ứng LAMP cho chứng nội tại DECA 59

Bảng 3.7 Phân tích kết quả LAMP 60

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Biểu đồ thống kê diện tích nuôi trồng tôm nước lợ từ năm 2013-2016.4

Hình 1.2 Biểu đồ thống kê tổng sản lượng tôm nước lợ từ năm 2013-2016 4

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc virion của WSSV 8

Hình 1.4 Cấu trúc bộ gen WSSV 11

Hình 1.5 Tôm sú bị bệnh đốm trắng 12

Hình 1.6 Cơ chế gây nhiễm của WSSV 13

Hình 1.7 Cấu trúc di truyền bộ gen của IHHNV chủng Ấn Độ 16

Hình 1.8 A,B - tôm chân trắng bị bệnh IHHNV 17

Hình 1.9 Một lát cắt mô học trên tôm sú nhiễm IHHNV 19

Hình 1.10 Sơ đồ các bước phản ứng chuỗi polymerase 20

Hình 1.11 Bộ mồi phản ứng LAMP 23

Hình 1.12 Primer FIP bắt cặp với sợi DNA đơn và tổng hợp mạch bổ sung 25

Hình 1.13 Mồi F3 bám vào vị trí bắt cặp tổng hợp mạch DNA mới giải phóng mạch DNA chứa mồi FIP 25

Hình 1.14 Các bước tạo thành mạch DNA đơn có cấu trúc vòng 25

Hình 1.15 Tái bản và kéo dài chuỗi DNA……….27

Hình 1.16 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng điện di gel……… 28

Hình 1.17 Các phương pháp hiển thị hoá phản ứng LAMP đã xảy ra ……… 30

Hình 2.1 Màu sắc của ống phản ứng ban đầu và khi xẩy ra phản ứng LAMP dương tính 38

Hình 2.2 Mẫu tôm nhiễm bệnh thực nghiệm thu nhận……….40

Hình 3.1 Trình tự sắp gióng cột chọn vùng gen tương đồng để thiết kế primer giữa các chủng WSSV 46

Hình 3.2 Trình tự sắp gióng cột chọn vùng gen tương đồng để thiết kế primer giữa các chủng IHHNV 47

Hình 3.3 Kết quả LAMP-WSSV ở các nồng độ betaine khác nhau 49

Hình 3.4 Kết quả LAMP-IHHNV ở các nồng độ betaine khác nhau 50

Hình 3.5 Kết quả điện di trên các ống phản ứng tối ưu hóa betaine 51

Hình 3.6 Các ống phản ứng LAMP với các nồng độ DNA khác nhau chạy trong

Hình 3.10 Khảo sát độ nhạy phản ứng LAMP – WSSV 57

Hình 3.11 Khảo sát độ nhạy phản ứng LAMP – IHHNV 58

Hình 3.12 Kết quả LAMP chạy chứng nội tại DECA mẫu tôm nhiễm WSSV 61

Hình 3.13 Kết quả LAMP 10 mẫu tôm dương tính WSSV 61

Hình 3.14 Kết quả điện di kết quả LAMP mẫu dương tính WSSV 62

Hình 3.15 Kết quả điện di LAMP chứng nội tại của 10 mẫu tôm nhiễm WSSV.62 Hình 3.16 Kết quả khảo sát phản ứng LAMP-WSSV trên các mẫu tôm nhiễm bệnh khác 63

Hình 3.17 Kết quả LAMP 10 mẫu tôm dương tính IHHNV 64

Hình 3.18 Kết quả khảo sát phản ứng LAMP-IHHNV trên các mẫu tôm nhiễm bệnh khác 65

Hình 3.19 Kết quả PCR 10 mẫu WSSV dương tính 66

Hình 3.20 Kết quả PCR-WSSV trên các mẫu tôm nhiễm tác nhân khác 67

Hình 3.21 Kết quả chạy PCR 10 mẫu IHHNV dương tính 68

Hình 3.22 Kết quả PCR –IHHNV trên các mẫu tôm dương tính với tác nhân Khác 68

MỞ ĐẦU

Ngành nuôi trồng thuỷ sản ở nước ta đang phát triển mạnh theo hướng công nghiệp hoá Nghề nuôi tôm không chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản mà còn có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho người nuôi thủy sản Hiện nay để tăng sản lượng nuôi tôm, việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến như nuôi thâm canh năng suất cao và tăng diện tích nuôi đã có nhiều tác động đến môi trường sinh thái gây ô nhiễm môi trường và sự bùng phát dịch bệnh

Virus gây bệnh trên tôm là đối tượng gây thiệt hại đáng kể nhất cho người nuôi tôm, trong đó virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) và virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) là hai bệnh phổ biến trên tôm tại Việt Nam Do đó, việc phát hiện sớm các virus gây bệnh này, cũng như phân biệt các triệu chứng mắc bệnh trên tôm do virus gây ra hay do tác động từ yếu tố môi trường, hay vi khuẩn gây bệnh, có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong phòng chống kịp thời giảm thiểu sự lây lan của dịch bệnh Hiện nay chỉ có phương pháp PCR, realtime PCR và phương pháp LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) có thể giúp chẩn đoán nhanh, phát hiện sớm virus gây bệnh trên tôm trong thời kỳ ủ bệnh Tuy nhiên phương pháp PCR, realtime PCR đòi hỏi phải trang bị hệ thống thiết bị hiện đại và đắt tiền, nên phương pháp này chủ yếu sử dụng tại những phòng thí nghiệm đã được trang bị đầy đủ các máy móc thiết bị cần thiết cũng như được đào tạo về nguồn nhân lực Trên thực tế tất cả các phòng thí nghiệm đều nằm ở thành phố, trong khi các vùng nuôi tôm chủ yếu ở các vùng nông thôn hay ngoại ô, việc vận chuyển mẫu xét nghiệm và chờ đợi kết quả tốn nhiều thời gian, dịch bệnh do virus lại bùng phát rất nhanh Phương pháp LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) là một phương pháp đơn giản, có độ nhạy cao, dễ dàng thực hiện và chi phí thấp đã được nghiên cứu và áp dụng thực tiễn tại nhiều phòng thí nghiệm trong việc phát hiện các bệnh gây ra bởi vi khuẩn hay virus

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) trong phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm” giúp chẩn đoán nhanh

virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) và virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), đồng thời có thể áp dụng rộng rãi tại tất cả các phòng thí nghiệm cơ bản, cũng như người nuôi tôm có thể thực hiện được tại các trại tôm giống tại địa phương

Mục tiêu đề tài

 Thực hiện thành công phương pháp LAMP nhằm phát hiện WSSV và IHHNV

 Tôi ưu hóa phương pháp LAMP để đạt độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương vớiphương pháp PCR

 Phát hiện được WSSV và IHHNV có trong mẫu bệnh phẩm

 Xây dựng được quy trình chẩn đoán dựa trên những thiết bị đơn giản nhất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về thực trạng nghề nuôi tôm ở Việt Nam 1.1.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam

Nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài rất thuận lợi phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản Ngành nuôi tôm nước lợ chiếm vị trí đặc biệt quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế ngành thủy sản Việt Nam hơn 10 năm qua Cùng với quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng vật nuôi và chuyển đổi đất nông nghiệp, đất làm muối năng suất thấp chuyển sang nuôi tôm ở các tỉnh ven biển, nhờ vậy mà ngành tôm có sự tăng trưởng vượt bậc cả về diện tích, sản lượng và giá trị xuất khẩu

Năm 2017, diện tích nuôi tôm nước lợ cả nước đạt 721,1 nghìn ha; tăng 3,8% so với năm 2016 trong đó diện tích tôm sú là 622,4 nghìn ha; tăng 3,7% và diện tích tôm chân trắng là 98,7 nghìn ha; tăng 4,7% so với năm 2016 (hình 1.1) Sản lượng tôm nước lợ năm 2017 đạt 683,4 nghìn tấn, tăng 4% so với năm 2016 trong đó sản lượng tôm sú 256,4 nghìn tấn; giảm 2,8% nhưng sản lượng tôm chân trắng đạt 427 nghìn tấn, tăng 8,5% so với năm 2016 (Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2017) Tình hình xuất khẩu tôm 5 tháng đầu năm 2017 của nước ta đạt kim ngạch 3,86 tỷ USD, tăng 22% so với năm 2016 (Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản 2017) Có thể thấy, tôm nước lợ là mặt hàng xuất khẩu chủ lực hàng đầu của ngành thủy sản Việt Nam với hai sản phẩm chính là tôm Sú và tôm Thẻ chân trắng [44]

Hình 1.1 Biểu đồ thống kê diện tích nuôi tôm nước lợ từ năm 2013-2017

(Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2017)

Hình 1.2 Biểu đồ thống kê tổng sản lượng tôm nước lợ từ năm 2013-2017

(Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2017)

Tổng sản lượng tôm hàng năm từ

2013-2017

Tổng sản lượng tôm (Tấn)655255

Tổng diện tích nuôi tôm nước lợ hàng năm

Diện tích nuôi tôm nước lợ (ha)

1.1.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm

Theo thống kê từ cục thủy sản, trong năm 2016 tổng diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại là 66.140,79 ha (tăng 16,99% so với cùng kỳ năm 2015 với tổng diện tích bị thiệt hại là 56.534,91 ha) chiếm 9,66% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước (bảng 1.1) Trong đó, diện tích nuôi thâm canh, bán thâm canh bị thiệt hại là 18.012,3 ha; diện tích nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến là 35.921,06 ha; còn lại các hình thức nuôi khác là 12.207,43 ha Nếu thống kê dựa vào các tác nhân gây bệnh, tổng diện tích nuôi tôm bị thiệt hại do các bệnh là 10.662,26 ha (giảm 40,54% so với cùng kỳ năm 2015 có tổng diện tích bị bệnh là 17.930,44 ha) chiếm 1,56% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước; không xác định nguyên nhân 13.116,54 ha, còn lại là do biến đổi môi trường, thời tiết là 42.361,99 ha (Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2017)

Trong 6 tháng đầu năm 2017 tổng diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại là

11.430 ha, chiếm 1,89% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước Trong đó, tổng diện tích tôm nuôi do các tác nhân sinh học gây bệnh là 4.165,78 ha, chiếm 36.4% Trong đó, các bệnh trên tôm nuôi bao gồm bệnh đốm trắng chiếm 14%, bệnh hoại tử gan tụy cấp chiếm 14%, bệnh hoại tử cơ quan tạo máu, còi, phân trắng chiếm 8% trên tổng diện tích bị thiệt hại Diện tích tôm nuôi bị bệnh không xác định nguyên nhân là 4.745 ha, chiếm 41,5,8%, và do biến đổi môi trường, thời tiết là 2.519 ha, chiếm 22,0

% (Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2017)

Bảng 1.1 Bảng thông kê dịch bệnh trên tôm từ năm 2014-2016 (Theo báo cáo của Tổng cục thủy sản năm 2016)

Diện tích tôm bị thiệt hại 59.579 ha 56.534 ha 66.140 ha Diện tích tôm bị thiệt hại do bệnh 31.514 ha 16.278 ha 10.662 ha

Ghi nhận báo cáo dịch bệnh đốm trắng do virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV) trong nững năm gần đây, nhờ công tác phòng chống dịch bệnh được đẩy mạnh, nên tổng diện tích tôm bị nhiễm bệnh có dấu hiệu giảm, tuy nhiên diện tích nuôi trồng tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng vẫn còn rất lớn (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Thống kê dịch bệnh đốm trắng từ năm 2014-2016 (Theo báo cáo

của Tổng cục thủy sản năm 2016)

Mặc dù công tác phòng chống dịch bệnh được tăng cường nên qua những năm gần đây diện tích tôm bị thiệt hại do dịch bệnh có dấu hiệu giảm, tuy nhiên với tình hình nuôi tôm theo hướng công nghiệp hóa và các vấn đề ô nhiễm môi trường ngày càng tăng thì những thiệt hại do bệnh trên tôm nuôi do virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) còn lớn, đặt ra cho các nhà khoa học, nhà quản lý, các doanh nghiệp và nông dân cần phải có những giải pháp cụ thể khác nhau để phòng, trị và giảm dần thiệt hại bệnh do virus gây ra trên tôm

1.2 Virus gây bệnh đốm trắng trên tôm (White spot syndrome virus - WSSV)

Năm 1993, virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV) lần đầu tiên được phân lập và xác định là tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm ở Đài Loan Từ đó, virus này đã được phát hiện phân bố rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới, bệnh đốm trắng vẫn là một trong các bệnh thường gặp do virus gây ra và nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay [4]

Tổng diện tích bị bệnh (ha) 23.872,78 5.337,64 3.643,91

1.2.1 Phân loại và cấu tạo virus

Virus gây bệnh đốm trắng trên tôm

(White spot syndrome virus - WSSV) có dạng

hình trứng, hình elipse, hay hình dạng như vi khuẩn bacillus Hình dạng virus thường đối xứng, đường kính 60 x 167 nm, có một đuôi phụ ở một đầu, và tổng chiều dài là 210 x 420 nm

Cấu trúc của virus WSSV bao gồm: màng bao (envelope) và nucleocapsid chứa vật chất di truyền

 Màng bao: Màng bao của virus WSSV bao gồm ít nhất 35 protein khác nhau, trong đó VP28 và VP26 là hai protein phổ biến nhất, chiếm khoảng 60% màng bao VP28, được mã hóa bằng khung đọc mở ORF 421 (wsv421), là protein màng bao chính Một số nghiên cứu cho rằng VP28 có vai trò quan trọng trong các bước xâm nhiễm ban đầu của WSSV vào tế bào VP28 có vai trò như một protein tạo vị trí bám cho virus vào các tế bào tôm, và giúp virus thâm nhập vào tế bào chất [39] VP26 là một sản phẩm protein được mã hóa bởi gen wsv311, lần đầu tiên được xác định là có liên quan đến nucleocapsid Sau đó,

VP26 được phát hiện có thể được mã hoá bởi một ORF khác là gene p22 do một phân tích so sánh trình tự bộ gene cho thấy gene p22 mã hoá protein có

trình tự tương đồng với protein VP26 Protein VP26 nằm trong khoảng trống giữa màng bao và nucleocapsid, hoạt động như một protein liên kết VP26 có thể giúp WSSV di chuyển về phía nhân tế bào, nơi có nhiều hoạt đông phiên mã và sao chép diễn ra, bằng cách tương tác với actin hoặc protein liên kết với actin của tế bào [39] Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra rằng cả VP28 và VP26 tự nhiên có thể hình thành dạng trimer trong vỏ virus và có vai trò quan trọng đối với sự tương tác giữa màng virus và các thụ thể tế bào chủ [39]

White spot syndrome virus [45]

Phân loại virus

Nhóm: I (DNA bộ gene mạch đôi)

Họ: Nimaviridae Giống: Whispovirus Loài : White spot syndrome virus

 Nucleocapsid: nằm bên trong màng bao, có cấu trúc bao gồm các protein tiểu đơn vị hình cầu VP15 xếp chồng lên nhau thành 14, 15 vòng dọc theo hai trục Kích thước của nucleocapsid có chiều dài từ 180-420 nm và đường kính 54-85 nm, khoảng cách giữa màng bao và nucleocapsid thay đổi từ 2 – 7.5 nm chứng tỏ bộ gene của virus được nén rất chặt trong nucleocapsid Bên trong màng bao mặc dù nucleocapsid được nén chặt nhưng khi được giải phóng khỏi màng bao kích thước của nucleocapsid sẽ tăng lên [39]

Các protein cấu thành nucleocapsid của WSSV ít được hiểu rõ hơn so với những protein được tìm thấy trên màng bao virus VP15 là sản phẩm protein được mã hóa bởi wsv214, là một trong những protein cấu trúc chính nằm ở nucleocapsid Công trình nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng VP15 mã hóa một peptid 80 aa, bao gồm một lượng đáng kể các amino acid có tính base (44,2%) và serine (24,6%), một đặc tính quan trọng trong những protein có thể liên kết với DNA Bằng chứng thực nghiệm cho thấy VP15 có khả năng gắn kết chặt chẽ với DNA mạch đôi theo cách không đặc hiệu, cho thấy vai trò quan trọng của VP15 trong việc đóng gói bộ gene của WSSV trong nucleocapsid và protein VP15 có khả năng tương tác với chính nó để có thể tham gia vào quá trình lắp ráp nucleocapsid [40]

Một trong những tính năng đặc biệt nhất của bộ gene WSSV là sự xuất hiện của wsv360 Đó là một chuỗi trình tự DNA khổng lồ gồm 18234 nucleotide mã hóa cho một protein 6077 aa, được gọi là VP664, nằm trong nucleocapsid Protein này có vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp và tạo hình thái của virion Bên cạnh chức năng này, VP664 biểu hiện một tính năng đặc hiệu giữa các protein cấu trúc virus: nó là protein lớn nhất từng được tìm thấy trong virus [39]

Đã có báo cáo cho rằng VP51 và VP76 được mã hoá bởi wsv308 và wsv220 nằm ở phần màng bao của virus Tuy nhiên, gần đây VP51 và VP76 được báo cáo là những thành phần cấu trúc nhỏ liên kết với nucleocapsids của virus [41], và chức năng của những protein này vẫn chưa biết

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc virion của WSSV [39] Kích thước và

đường kính của WSSV được chú thích trên hình

 Vật chất di truyền: Bộ gene của virus đốm trắng là phân tử DNA mạch đôi, siêu xoắn, dạng vòng với hàm lượng A+T khoảng 59% phân bố đồng nhất Các khu vực phân lập WSSV khác nhau thì bộ gene sẽ có kích thước khác nhau Ba chủng virus đốm trắng có kích thước bộ gene khác nhau được phân lập ở ba vùng khác nhau là Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan: WSSV phân lập tại Trung Quốc (WSSV-Cn) có kích thước 305kb (Genbank Acceession No AF332093), WSSV phân lập tại Thái Lan (WSSV-Th) có kích thước 293kb (GenBank Accession No AF369029), WSSV phân lập tại Đài Loan (WSSV-Tw) có kích thước 307kb (GenBank Accession No AF440570) [3] [32]

Protein màng bao

NucleocapsidsMàng bao (envelope)

Các báo cáo ban đầu sử dụng phương pháp RFLP để kiểm tra các biến thể di truyền giữa ba chủng WSSV, cho thấy các chủng phân lập có liên quan chặt chẽ với nhau Tuy nhiên, việc công bố các trình tự bộ gen hoàn chỉnh của các chủng phân lập đã cho phép xác định các biến thể bằng phương pháp phân tích tin sinh học Sự khác biệt chính giữa các bộ gen WSSV được phân lập từ ba vùng như sau [39]:

- Một đoạn trình tự lớn 13.2 kb ở vùng liên gen (intergenic region) biến mất trong bộ gen WSSV-Th khi được so sánh với bộ gene WSSV-Cn và WSSV-Tw

- Một đoạn 1337 bp được chèn trong bộ gene WSSV-Tw có độ tương đồng 100% với các gene nhảy có nguồn gốc từ prokaryote và eukaryote

- Số lượng các trình tự lặp trong các vùng tương đồng và những vùng lặp giữa các bộ gene WSSV có sự khác nhau

- Các đột biến nucleotide đơn lẻ bao gồm SNP và mất/thêm nucleotide được phân bố ngẫu nhiên trên những bộ gen WSSV Ngoại trừ bộ gene WSSV-Tw, gần 25% các đột biến này xảy ra ở các vùng mã hóa của ORF24, ORF25, ORF30, ORF38 và ORF84

Do đó, các biến thể bộ gene của WSSV cho thấy sự lan truyền về mặt địa lý từ một tổ tiên chung WSSV ở eo biển Đài Loan đến Thái Lan từ năm 1992 và 1995, cũng tương tự như vậy cho giữa chủng WSSV-Tw và chủng WSSV-Cn được phân lập từ Trung Quốc Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng chủng phân lập từ Việt Nam (WSSV-Vn) [22] cũng có đoạn trình tự bị mất có chiều dài từ 11,5 - 12,2 kb và chủng phân lập từ Ấn Độ (WSSV-In) có đoạn trình tự bị mất có chiều dài từ 10,9 kb Đặc điểm của các chủng này hỗ trợ giả thuyết về nguồn gốc tổ tiên chung, sau đó được phân tán khắp thế giới Cuối cùng, các chuỗi trình tự hoàn chỉnh của ba chủng phân lập có độ tương đồng tới 99,32% khi bỏ qua những vùng mất đoạn lớn, các vùng trình tự biến đổi và trình tự gen nhảy [39]

Hình 1.4 Cấu trúc bộ gen WSSV phân lập tại Thái Lan [33] Chiều mũi tên

chỉ ra hướng phiên mã của các gene Các tên trên gene chỉ ra các sản phẩm protein được mã hoá bởi gene

1.2.2 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh đốm trắng bùng phát thường được đặc trưng bởi việc tôm bị bệnh chết nhiều và nhanh sau khi có biểu hiện lâm sàng Tôm nhiễm bệnh hoạt động yếu, bơi lờ đờ và dạt vào bờ, đang ăn nhiều đột ngột bỏ ăn Dấu hiệu đặc trưng là xuất hiện các đốm trắng tròn dưới lớp vỏ, nhất là vùng giáp đầu ngực, đốt bụng thứ 5 – thứ 6 và có thể lan toàn thân Những đốm này ở trong lớp vỏ và không thể loại bỏ bằng việc chà sát (hình 1.5) Tôm sắp chết cũng có thể biến màu từ hồng sang đỏ Khi các đốm trắng xuất hiện, sau 3-10 ngày tôm chết hàng loạt với tỉ lệ cao [1]

Hình 1.5 Tôm sú bị bệnh đốm trắng có dấu hiệu đỏ thân (mũi tên đỏ) có

các đốm trắng dưới vỏ (mũi tên trắng) [1]

1.2.3 Cơ chế gây nhiễm và kiểu lan truyền

Một virion WSSV lây nhiễm vào một tế bào qua trung gian thụ thể Đầu tiên, VP28 trên bề mặt của virus sẽ gắn trực tiếp lên các receptor chuyên biệt cho WSSV làm cầu nối cho hạt virion của WSSV đi vào trong tế bào (hình 1.6) Lớp màng bao của virus WSSV có thể dung hợp với màng của tế bào tôm bằng quá trình endosome, sau đó nucleocapsid được vận chuyển đến nhân tế bào vật chủ Nucleocapsid của WSSV không có màng gắn vào màng nhân tế bào vật chủ nên bộ gen của WSSV được giải phóng trực tiếp vào nhân Bộ gen của WSSV bắt đầu sao chép Trong tế bào chất của tế bào vật chủ, ty thể bắt đầu thoái hóa Trong nhân, nhiễm sắc thể của tế bào tích tụ gần màng nhân và lưới nội chất thô trở nên mở rộng và hoạt động mạnh Các protein của virus bắt đầu tạo thành các túi và sau đó hình thành các màng bao virus Cấu trúc nucleosome của virus được hình thành chứa các protein trong nucleocapsid và bộ gene của virus sau khi được sao chép Các màng bao trống được lắp ráp vào các nucleocapsid tạo thành các hạt virion WSSV mới trong nhân Trong tế bào chất, các bào quan bị phân rã, màng tế bào và màng nhân bị tiêu hủy Các virus

WSSV mới được hình thành hoàn toàn và sẵn sàng được giải phóng khỏi tế bào bị tiêu hủy để bắt đầu chu trình mới trong các tế bào khác [42]

Hình 1.6 Cơ chế gây nhiễm của WSSV [6] Bước 1 gồm các virion WSSV tự do,

bước 2 bám dính của WSSV vào màng tế bào, bước 3 xâm nhập vào tế bào bằng quá trình endosome, bước 4 WSSV di chuyển trong tế bào chất của tế bào đến nhân, bước 5 nucleocapsid của WSSV gắn lên màng nhân và bước 6 phóng thích trực tiếp bộ gene của WSSV vào nhân tế bào Bước 7 và 8, tổng hợp mới các protein cho WSSV và sao chép DNA bộ gene của WSSV Bước 9 lắp ráp hoàn chỉnh virion của WSSV, ly giải màng nhân Bước 10, ly giải tế bào chủ và phóng thích virion của WSSV cho quá trình xâm nhiễm mới

Bệnh đốm trắng lây truyền ngang là chính Virus lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) đã nhiễm virus gây bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm Khi các cá thể tôm bị bệnh đốm trắng trong ao bị yếu hoặc chết, các con tôm khoẻ sẽ ăn chúng dẫn đến bệnh lây lan càng nhanh hơn Trong

nguồn nước hay môi trường có các tác nhân mang mầm bệnh có thể làm lây lan dịch bệnh từ nơi này sang nơi khác Một số loài chim đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi mang theo nguồn bệnh qua thức ăn thừa Ngòai ra bệnh đốm trắng còn có khả năng lây truyền theo chiều dọc khi cảm nhiễm từ tôm bố mẹ mang mầm bệnh đốm trắng chuyển sang thế hệ con [19]

1.3 Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô

(Infectious Hypodemal and Haematopoietic Necrosis Virus – IHHNV)

Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (Infrectious Hypodemal and Haematopoietic Necrosis Virus - IHHNV) lần đầu dược phát hiện tại Hawai vào năm 1981 Virus này gây chết đối với tôm con cụ thể là tôm

Litopenaeus stylirostris với tỷ lệ tử vong lên tới 90% [17] Hiện nay IHHNV đã được

phát hiện ở nhiều quốc gia trên thế gới Kể từ khi phát hiện vào năm 1980 ước tính thiệt hại do IHHNV gây ra trên thế giới khoảng 0,5 - 1 triệu USD [18] Trước những thiệt hại to lớn do IHHNV gây ra, các nhà khoa học đã bắt tay vào nghiên cứu loại virus này Cho đến nay đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về IHHNV được công bố

1.3.1 Phân loại và cấu tạo virus

IHHNV là loại virus nhỏ nhất được biết đến trong các loài virus gây bệnh trên tôm Virus có đường kính 22 nm, hình khối 20 mặt đối xứng, không có màng bao mật độ trung bình là 1,4g/ml trong dung dịch CsCl [18]

IHHNV có bộ gen là DNA mạch đơn dài khoảng 4,1 kb Vỏ của IHHNV được tạo thành bởi 4 sợi polypeptide có trọng lượng phân tử lần lượt là 37.5, 39, 47 và 74 KDa

Bộ gene IHHNV gồm 3 khung đọc mở lớn gồm ORF1, ORF2 và ORF3) (hình 1.7) Khung đọc mở ORF1 chiếm khoảng 50% bộ gen mã hóa cho 1 protein không cấu trúc (NS1) bắt đầu ở vị trí nucleotide 648 và kết thúc với codon TAA ở vị trí nucleotide 2648 ORF này mã hóa một protein có 666 aa, với khối lượng phân tử là 75,8 KDa Trình tự protein được mã hoá bởi ORF1 chứa các motif bảo tồn cao cho quá trình sao chép Protein này còn chứa vùng NTP tương ứng từ vị trí 257 đến 315 aa và vùng helicase từ vị trí 480 và 579 aa tương ứng [2] [29]

Khung đọc mở ORF2 khởi đầu ở vị trí nucleotide 591, chồng lấp lên ORF1 Khung đọc mở ORF2 bao gồm 1092 bp và kết thúc ở codon TAG ở 1681 ORF này mã hóa một protein 363 aa với khối lượng phân tử 42,11 kDa được giả định là một protein không cấu trúc (NS2) Chức năng của protein này vẫn chưa được biết [2]

Khung đọc mở ORF3 có kích thước nhỏ nhất (990 bp) trong số ba ORFs trong bộ gene của IHHNV bắt đầu bằng codon ATG ở vị trí nucleotide 2590 và chấm dứt

Infectious hypodermal and hematopoietic

necrosis virus (IHHNV) [29]

Phân loại virus [18]

Nhóm: II (DNA bộ gene mạch đơn)

Họ: ParvoviridaeGiống: Brevidensovirus Loài: IHHNV

với codon TAA ở vị trí nucleotide 3577 ORF này mã hóa một protein 329 aa với khối lượng phân tử là 37,48 kDa [2]

Hình 1.7 Cấu trúc di truyền bộ gene của IHHNV chủng Ấn Độ [17] bao gồm các

ORF1, ORF2, và ORF3 Các số đánh dấu chỉ ra vị trí nucleotide trên bộ gene mạch đơn của IHHNV +1: khung đọc mở bắt đầu vị trí +1, +3: dịch khung đọc mở ORF đến vị trí + 3

1.3.2 Dấu hiệu bệnh lý

Virus IHHNV khi xâm nhiễm vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ Tôm nuôi ở giai đoạn tôm bột (postlarvae) và tôm giống (juvenile) với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này Tôm nhiễm virus IHHNV có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi nước, xoay tròn và chết từ từ trong 2 – 3 tuần Các loài tôm khác nhau khi nhiễm bệnh thì

có dấu hiệu khác nhau Biểu hiện chung của các loài tôm P stylirostris, tôm thẻ chân trắng (P vannamei), tôm sú (P monodon) nhiễm IHHNV là hội chứng dị hình, chủy

biến dạng, còi cọc, hoạt động yếu [1]

Khi tôm P stylirostris nhiễm IHHNV dạng cấp tính, tôm nổi lên mặt nước,

xoay tròn rồi chìm xuống đáy, bỏ ăn, xuất hiện chấm lốm đốm ở lớp vỏ ngoài, tỷ lệ chết cao Biểu hiện về mặt mô học là sự hoại tử, viêm sưng lớp biểu mô dạ dày, ruột, mang, cơ, hệ thần kinh, mô liên kết và mô tạo máu, đồng thời xuất hiện thể vùi Cowdry loại A trong nhân của những tế bào trên (hình 1.9) [1]

Đối với tôm thẻ chân trắng P vannamei thì IHHNV không gây tỷ lệ chết cao như P stylirostris nhưng cũng không kém phần nguy hiểm IHHNV làm tôm

chậm lớn, dị hình, còi cọc Tôm giống chậm phát triển, dị hình, râu quăn queo, vỏ

kitin xù xì hoặc biến dạng Tuy vậy, khi tôm mới nhiễm bệnh thường không có biểu hiện rõ rang (hình 1.8 – C) [1]

Với loài tôm sú P monodon, những con nhiễm IHHNV khi hấp hối có màu xanh lơ và hệ cơ vân ở phần bụng có thể bị mờ đục, chậm lớn P monodon ở

Philippine khi nhiễm bệnh chậm phát triển, còi cọc, riêng tôm đực thì chất lượng tinh dịch không tốt

Hình 1.8 A, B - tôm thẻ chân trắng bị bệnh IHHNV với chủy biến dạng (mũi tên), C- tôm chân trắng bị bệnh với râu bị quăn queo (mũi tên xanh) [1]

1.3.3 Phân bố và kiểu lan truyền

Có 4 chủng di truyền (genotypes) của IHHNV đã được nhận diện [17] Chủng type 1 từ Châu Mỹ và Đông Á (chủ yếu là Philippines), chủng type 2 từ Đông Nam Á, chủng type 3A từ Đông Phi, Ấn Độ và Úc, và chủng type 3B ở miền tây vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương

Virus có thể lây lan theo chiều dọc và chiều ngang Sự lây truyền ngang của IHHNV trong hệ thống nuôi cấy xảy ra chủ yếu qua việc ăn tôm chết và do tiếp xúc với nước có chứa virus Sự lây truyền theo chiều dọc xảy ra do sự lây truyền của virus

từ mẹ trứng tôm con Ấu trùng tôm P stylirostris thường lây nhiễm IHHNV từ nguồn

tôm bố mẹ, tuy nhiên virus không gây ảnh hưởng ngay trong vài tuần đầu, nó chỉ gây chết khi ấu trùng tôm đạt trọng lượng 0,05 – 0,1g Bệnh xuất hiện từ giai đoạn ấu

trùng đến tôm trưởng thành Tuỳ vào mức độ nhiễm mà có biểu hiện bệnh khác nhau Khi nuôi ấu trùng và tôm giống với mật độ cao rất dễ mắc bệnh [1]

1.4 Các phương pháp phát hiện virus gây bệnh

Trong thuỷ sản, khi một loài nuôi trồng bị nhiễm bệnh, cần thiết nhanh chóng xác định loại bệnh, các tác nhân gây bệnh, từ đó có thể đề ra các biện pháp phòng chống và chữa trị bệnh, cũng như các phương pháp chẩn đoán thích hợp Bên cạnh việc quan sát các dấu hiệu bệnh lý trên đối tượng nuôi trồng, các phương pháp như nuôi cấy – phân lập – xác định tác nhân gây bệnh, quan sát hình thái các tác nhân gây bệnh dưới kính hiển vi, phân tích mô bệnh học cũng như các phương pháp sinh học phân tử khác nhau đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tác nhân gây bệnh cũng như chẩn đoán Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh lý gây ra bởi các tác nhân sinh học như virus, vi khuân ở những đối tượng thuỷ sản được nuôi trồng, do tính đặc hiệu và độ nhạy cao, có thể phát hiện mầm bệnh trong giai đoạn sớm

1.4.1 Phương pháp mô bệnh học

Mô bệnh học giúp nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào Phương pháp này không những giúp mô tả tổn thương, còn giúp để so sánh, đối chiếu các tổn thương đó với những biểu hiện lâm sàng của cá, tôm, nhuyễn thể, chỉ ra mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các rối loạn chức năng Dựa trên cơ sở đó có thể giúp cho việc xác định, chẩn đoán các tác nhân gây bệnh [18]

Trong thuỷ sản, mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp chỉ có thể chẩn đoán được bệnh bằng phương pháp này Tuy nhiên cũng có những hạn chế là thao tác chậm, tốn nhiều thời gian và chỉ phát hiện rõ khi tôm đã bị nhiễm nặng, đồng thời các kỹ thuật viên phân tích phải có kinh nghiệm Phương thức này nên sử dụng như là một công cụ trong xác định nguyên nhân gây bệnh Phương thức này rất khó áp dụng cho những trại tôm đang nuôi quy mô lớn, cũng như chỉ dung phát hiện bệnh ở giai đoạn trễ, nên không được ưu tiên sử dụng trong chẩn đoán

Hình 1.9 Một lát cắt mô học trên tôm sú nhiễm IHHNV nhuộm với H

&E ở độ phóng đại 1000X lần cho thấy các thể vùi nội nhân bắt màu Eosin (thể vùi Crowdry type A) đặc trưng cho tế bào bị nhiễm virus IHHNV (IHHNV

infected cell) Normal cell: tế bào bình thường [28]

1.4.2 Phương pháp lai tại chỗ (In-situ hybdridization – ISH)

Lai phương pháp lai tại chỗ (In-situ hybdridization – ISH) là hiện tượng tái bắt

cặp trở lại của hai mạch đơn khi nhiệt độ xung quanh giảm dần trong điều kiện thí nghiệm thích hợp Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của nhiệt độ cao, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột, lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn với các cấu hình không gian không xác định Ngược lại, nếu sau khi hai mạch phân tử tách rời, nhiệt độ được giảm dần trong điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại tạo nên hiện tượng lai [7] Trong thủy sản, trong trường hợp đặc biệt cần chẩn đoán các mầm bệnh nguy hiểm trên tôm, ngoài các biện pháp truyền thống đã được áp dụng trước đây thì phương pháp lai phân tử có thể phát huy được thế mạnh của một phương pháp chẩn đoán mới, hiệu quả cao, có độ chuyên biệt cao Tuy nhiên phương pháp này khá tốn thời gian và phải trải qua rất nhiều công đoạn xử lý mẫu, rất khó áp dụng cho những trại tôm đang nuôi quy mô lớn, nên không được ưu tiên sử dụng trong chẩn đoán.

1.4.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại một hay nhiều đoạn trình tự DNA chuyên biệt với sự hiện diện của một hoặc nhiều cặp mồi (oligonucleotides), enzyme tổng hợp DNA (DNA polymerase), các nucleotide tự do (dNTPs), dung dịch đệm theo các chu kỳ luân nhiệt thích hợp Kỹ thuật này được phát minh và đặt tên bởi Mullis và các cộng sự (Mỹ) vào năm 1985 Đây là một kỹ thuật rất nhạy và đặc biệt cho phép phát hiện nhanh chóng tác nhân sinh học gây bệnh khi trong mẫu có một lượng rất thấp PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (hình 1.10): bước 1 (giai đoạn biến tính), bước 2 (giai đoạn gắn mồi), bước 3 (giai đoạn kéo dài)

Hình 1.10 Sơ đồ các bước phản ứng PCR bao gồm ba bước và số lượng phân

tử DNA được nhân lên theo cấp số mũ sau các chu kỳ luân nhiệt [26] Bước 1 biến tính giúp tách hai mạch DNA hoàn toàn, bước 2 giúp cho quá trình bắt cặp lai giữa các đoạn oligo ngắn (được gọi là mồi) vào mạch đơn khuôn DNA, và bước 3 là quá trình tổng hợp DNA kéo dài từ mồi theo chiều 5’ – 3’ bằng enzyme DNA polymerase sử dụng cơ chất là các dNTPs

Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, hiện nay một số mầm bệnh thủy sản quan trọng được chuẩn đoán bằng phương pháp PCR : virus đốm trắng (WSSV), virus gây bệnh đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan

primer

tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), virus gây hội chứng Taura (TSV), nội ký sinh trùng và vi khuẩn đặt biệt là nhóm Vibrio [7]

PCR dễ sử dụng và đưa ra kết quả có độ tin cậy cao, độ chuyên biệt và độ nhạy cao Kỹ thuật này chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ để xác định mầm bệnh, ngay cả có thể lấy mẫu từ cá thể tôm nhỏ để phân tích mà không cần làm chết tôm, hay có thể sử dụng trong chẩn đoán sớm giai đoạn đầu của bệnh khi hàm lượng DNA bản sao của tác nhân gây bệnh còn rất thấp Mặc dù kỹ thuật PCR phát hiện nhanh với độ nhạy cao nhưng vẫn cần 2,5 - 3 giờ cho một xét nghiệm, phải đầu tư hai hệ thống máy móc chính, chi phí khá cao là máy PCR và hệ thống điện di – chụp ảnh gel, đồng thời khó áp dụng tại nông trường nuôi tôm

1.4.4 Phương pháp real-time PCR

Real - time PCR là phương pháp biến thể của phương pháp PCR, tuy nhiên trong quá trình khuếch đại DNA cũng đồng thời phát hiện các đoạn DNA đã được khuyếch đại chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang Trong phản ứng real - time PCR, quá trình nhân bản DNA cũng diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt và được theo dõi trực tiếp từ máy luân nhiệt Nồng độ DNA (số lượng bản sao) trong các mẫu xét nghiệm sẽ được xác định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng (Ct) với log cơ số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn [27]

Ưu điểm của kỹ thuật này là khả năng định lượng chính xác số lượng bản sao DNA tham gia phản ứng, quan sát trực tiếp tiến trình khuếch đại đang diễn ra theo từng chu kỳ khi phản ứng real - time PCR xảy ra, không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng real - time PCR Quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời gian cho kết quả, độ nhạy cao cho các mẫu bệnh có hàm lượng bản sao DNA của tác nhân gây bệnh thấp, có thể sử dụng trong chẩn đoán sớm giai đoạn đầu của bệnh, độ đặc hiệu cao Tuy nhiên real - time PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao cho các thành phần hoá chất của phản ứng real-time PCR, đồng thời khó áp dụng tại nông trường nuôi tôm

1.4.5 Phương pháp LAMP (Loop-mediated isothermal amplifcation) 1.4.5.1 Nguyên tắc của phương pháp

Phương pháp LAMP (Loop-mediated isothermal amplifcation) là sự khuếch đại DNA ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua trung gian cấu trúc vòng (cấu trúc DNA dạng kẹp tóc) [23] Phương pháp LAMP được phát triển lần đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm tác giả người Nhật Tsugunori Notomi sau đó kỹ thuật này tiếp tục được nghiên cứu và phát triển bởi công ty Eiken Chemical Đây môt phương pháp khuyếch đại trình tự DNA mới, có thể tổng tổng hợp một đoạn DNA lớn mà không cần các chu trình biến nhiệt như PCR, do đó không cần thiết bị luân nhiệt mà có thể sử dụng một thiết bị ủ có nhiệt độ cố định cho phản ứng [13]

Phương pháp này dựa trên sự tổng hợp một chuỗi sản phẩm DNA mạch đôi có cấu trúc vòng nối tiếp phức tạp bằng enzyme DNA polymerase và hai cặp mồi trong và mồi ngoài được thiết kế đặc biệt sao cho phản ứng diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt Ở các bước đầu của phản ứng LAMP cả 4 mồi được sử dụng, nhưng sau đó trong suốt các phản ứng chu kỳ chỉ các mồi trong được sử dụng để tổng hợp chuỗi sản phẩm DNA có cấu trúc vòng [25] Chính các cấu trúc kẹp tóc trong chuỗi sản phẩm DNA được khuyếch đại giúp cho quá trình bắt cặp của cặp mồi được diễn ra dễ dàng mà không cần quá trình biến tính, tách mạch DNA như PCR Kỹ thuật LAMP khuyếch đại DNA có tính đặc hiệu cao, phản ứng chỉ xảy ra khi cả 4 chuỗi mồi, bao gồm cặp mồi đơn F3, B3, các cặp mồi kép FIP (F2+F1c), BIP (B2+B1c) bám được vào sáu vùng trình tự đích của khuôn thì sản phẩm DNA mạch đôi có cấu trúc vòng mới được tạo ra (hình 1.8) Chỉ một hay vài mồi không hoạt động, hoặc không bám đặc hiệu, sản phẩm DNA vòng sẽ không được tạo ra [13]

Trên trình tự gen, sáu vùng trình tự DNA được chọn cho quá trình thiết kế các cặp mồi, theo lý thuyết sẽ bao gồm các vùng F3/F3c, F2/F2c, F1/F1c ở đầu 3’ và vùng B1/B1c, B2/B2c, B3/B3c ở đầu 5’ (F3c, F2c, F1c, B1c, B2c, B3c là các trình tự DNA bắt cặp bổ sung với các trình tự F3, F2, F1, B1, B2, B3, một cách lần lượt) (hình 1.11) Những trình tự này là cơ sở cho việc thiết kế 4 cặp mồi đặc biệt: FIP,

BIP, F3, B3 Trong đó mồi FIP (Forward Inner Primer) là một trình tự mồi kép gồm hai phần: vùng F2 (ở đầu 3’) có trình tự bắt cặp bổ sung cho F2c, được nối với vùng trình tự F1c nằm ở phía trước trình tự F2c – tính theo chiều 5’-3’ của trình tự DNA Còn mồi BIP (Backward Outer Primer) cũng là một trình tự mồi kép gồm hai phần: vùng B2 (ở đầu 5’) có trình tự bắt cặp bổ sung cho B2c, được nối với vùng trình tự B1c (vùng trình tự này nằm ở phía sau trình tự B2 – tính theo chiều 5’-3’ của trình tự DNA Mồi F3 (Forward Outer Primer) là mồi đơn chứa vùng trình tự F3 có thể bắt cặp bổ sung cho vùng F3c Tương tự mồi B3 (Backward Outer Primer) cũng là mồi đơn chứa vùng trình tự B3 có thể bắt cặp bổ sung bổ sung cho vùng B3c [13]

Hình 1.11 Bộ mồi phản ứng LAMP bao gồm các cặp mồi F3 – B3 và FIP – BIP và

các vùng trình tự DNA có thể bắt cặp với các cặp mồi F3 – B3 và FIP - BIP [25]

1.4.5.2 Cơ chế phản ứng LAMP

Phản ứng LAMP bao gồm ba bước: (1) tạo vật liệu khởi đầu, (2) khuyếch đại và (3) kéo dài chuỗi và lặp lại chu kỳ [10] (hình 1.12)

Quá trình 1: Tạo vật liệu khởi đầu

Với phương pháp LAMP, không giống như phương pháp PCR, không cần bước biến tính nhiệt nhằm tách DNA mạch đôi thành mạch đơn Một trong những mồi FIP sẽ bám vào trình tự DNA đích ở vị trí bắt cặp F2c (hình 1.12), sau đó dưới

tác dụng của enzyme Bst DNA polymerase kéo dài sợi mới theo chiều 5’ - 3’, đoạn

DNA bổ sung cho DNA mạch khuôn được tổng hợp, bắt đầu từ đầu 3’ của đoạn F2 của FIP Mồi F3 bám vào trình tự F3c, vùng trình tự nằm bên ngoài FIP trên DNA mạch khuôn và bắt đầu tổng hợp mạch DNA bổ sung mới, giải phóng mạch DNA bổ sung được tổng hợp từ mồi FIP (hình 1.13) Mạch đơn DNA này được giải phóng tạo thành cấu trúc kẹp tóc ở đầu 5’ do đoạn trình tự F1c bắt cặp bổ sung vào F1 Chính cấu trúc kẹp tóc này ngăn cản quá trình lai DNA của mạch đơn DNA mới hình thành với trình tự DNA khuôn ban đầu Do đó mạch đơn DNA mới này trở thành mạch khuôn DNA cho việc tổng hợp DNA mạch đơn mới do mồi BIP khởi đầu BIP bám vào vùng trình tự B2c trên DNA mạch đơn này (được tạo thành trong bước 5) và bắt đầu tổng hợp mạch DNA bổ sung từ đầu 3’ của BIP Mồi B3 bắt cặp bổ sung với vùng trình tự B3c nằm bên ngoài trình tự BIP và sau đó tổng hợp mạch DNA mới giải phóng mạch DNA được tổng hợp từ mồi BIP thành mạch đơn (hình 1.14) Mạch đơn DNA mới này tạo thành cấu trúc kẹp tóc ở mỗi đầu (cấu trúc DNA hình quả tạ) Chính cấu trúc DNA đặc biệt này là khuôn DNA khởi đầu cho quá trình khuếch đại

trong phương pháp LAMP (bước 8)

Hình 1.12 Mồi FIP bắt cặp

với sợi DNA đơn ngay vùng F2c và tổng hợp mạch bổ sung theo chiều 5’-3’ [10]

Hình 1.13 Mồi F3 bám vào vị trí vùng F3c bắt cặp tổng hợp mạch DNA mới (bước 3 – 4) giải phóng mạch DNA chứa mồi FIP (bước 5) [10]

Hình 1.14 Các bước tạo thành mạch DNA đơn có cấu trúc vòng (kẹp tóc ở mỗi đầu)

tổng hợp từ mồi BIP và mồi B3 bắt cặp vào vùng trình tự B2c và B3 một cách lần lượt [11]

 Quá trình 2: Các chu kỳ khuyếch đại

Với cấu trúc DNA hình quả tạ, ngay tại vùng đầu bắt cặp bổ sung F1/F1c chứa vòng trình tự F2 (hình 1.15), trình tự DNA mạch đơn mới sẽ được tổng hợp kéo dài từ đầu 3’ của trình tự F1 Sau khi tổng hợp, trong phản ứng sẽ có DNA mạch đôi với cấu trúc mạch vòng đơn nằm ở một đầu chứa trình tự F2 Mạch đôi DNA với cấu trúc vòng mạch đơn chứa trình tự F2 sẽ giúp mồi FIP bám vào đoạn mạch đơn ở ngay vị trí trình tự F2 để tổng hợp mạch đơn bổ sung mà không cần bước biến tính DNA để tách mạch như PCR, và giải phóng đoạn mạch đơn DNA đã được tổng hợp (khởi đầu từ vùng trình tự F1 trước đó) Vùng mạch đơn giải phóng chứa vùng trình B1/B1c và B2, ngay lập tức tạo cấu trúc mạch kẹp tóc ở đầu 3’ bởi đoạn B1c bổ sung với B1 chứa vòng mạch đơn là trình tự B2 Sau đó bắt đầu từ đầu 3’ của đoạn B1, sẽ tiếp tục sự tổng hợp DNA mạch đơn mới giải phóng mạch bổ sung gắn FIP (bước (9)) Mạch đơn mới được giải phóng tạo cấu trúc DNA hình quả tạ vì hai đầu có đoạn bổ sung F1 - F1c và B1c - B1 (bước (11)) Cấu trúc này đối xứng với cấu trúc DNA hình quả tạ được tạo thành trong bước 8 (do trình tự DNA mạch đơn được tổng hợp ở bước này có trình tự bổ sung với trình tự DNA mạch đơn ở bước 8) Tương tự như từ bước 8 đến bước 11, cấu trúc DNA hình quả tạ trong bước 11 dẫn đến quá trình tổng hợp DNA mạch đơn được bắt đầu từ đầu 3’ của đoạn trình tự B1, ngay tại vùng đầu bắt cặp bổ sung B1/B1c Sau đó mồi BIP bám vào đoạn B2c và bắt đầu sự tổng hợp DNA thay thế mạch, giải phóng đoạn DNA do tổng hợp tự mồi trước đó tạo thành cấu trúc giống như ở bước (8) Trong suốt quá trình tổng hợp này, trong phản ứng sẽ tồn tại một dạng DNA cấu trúc mạch đôi phức tạp chứa các mạch đơn vòng là các trình tự B2 hay F2 (bước 10) Chính các DNA cấu trúc mạch đôi phức tạp này là khuôn cho quá trình thứ 3

Hình 1.15 Tái bản và kéo dài chuỗi DNA trong phản ứng LAMP bao gồm các bước phức tạp từ 8 đến 11 bằng cặp mồi FIP – BIP [10]

 Quá trình 3: Kéo dài chuỗi và lặp lại chu kỳ

Các mồi FIP và BIP thay phiên nhau bắt cặp vào trình tự DNA cấu trúc mạch đôi chứa các mạch đơn vòng là trình tự F2 hay B2 đễ thực hiện tổng hợp DNA bổ sung, kéo dài hình thành nên các sản phẩm chuỗi cấu trúc mạch đôi được nối với nhau qua các vòng trình tự lặp F1-F2-F1c hay B1-B2-B1c Phản ứng cứ vậy tiếp tục, lặp lại chu kỳ và tạo nên 109 - 1010 bản sao DNA mạch đôi nối liên tục với nhau thành một chuỗi qua các vòng trình tự lặp F1-F2-F1c hay B1-B2-B1c trong suốt khoảng thời gian 15 phút đến 1 giờ phản ứng

Khi mẫu có bản chất là RNA, thì có hai cách thực hiện phản ứng LAMP: thứ nhất có thể tạo cDNA trước sau đó tiến hành phản ứng LAMP bình thường; hoặc có

thể thực hiện phản ứng RT-LAMP, phương pháp này cần bổ sung enzyme sao chép ngược là reverse transcriptase đồng thời trong phản ứng LAMP [25]

1.4.5.3 Hiện thị hoá kết quả LAMP

Đánh giá kết quả bằng điện di: LAMP có thể được đánh giá kết quả bằng điện di để xác định chắc chắn phản ứng LAMP có xảy ra hay không Kết quả dương tính sẽ cho một vạch smear dài, điều này là do sản phẩm có cấu trúc gốc vòng là các sản phẩm DNA mạch đôi nối liên tục với nhau thành một chuỗi qua các vòng trình tự lặp F1-F2-F1c hay B1-B2-B1c có độ dài khác nhau được hình thành trong phản ứng LAMP (hình 1.16) [24]

Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứng mà không cần điện di Khi sử dụng dẫn chất deoxynucleotide triphosphate (dNTPs), theo nguyên tắc tổng hợp DNA, các gốc phosphate được giải phóng sẽ kết hợp với ion Mg2+ hay Ca2+ bổ sung trong thành phần của phản ứng để tạo nên chất tủa vẩn đục Mg2P2O7/ Ca2P2O7 (magnesium pyrophosphate/calcium pyrophosphate) có màu trắng đục [25]

Hình 1.16 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng điện di gel [25] ở giếng 1 và 2,

giếng (-) phản ứng LAMP cho kết quả âm tính, và giếng M là thang DNA với chiều dài DNA được ghi bên cạnh