Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Ứng dụng Enzyme Viscozyme L trích ly hợp chất Polyphenol trà oolong sản xuất từ trà xén cành Kim Tuyên

Nội dung nghiên cứuDé dat được 2 mục tiêu này, nội dung nghiên cứu của dé tài bao gồm:- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly: tỷ lệ nguyênliệu/nước, hàm lượng Viscozy

KHOA KY THUAT HOA HOCBO MON CONG NGHE SINH HOC

4c3HUỲNH THỊ PHƯƠNG

UNG DỤNG ENZYME VISCOZYME L TRÍCH LYHOP CHAT POLYPHENOL TRA OOLONGSAN XUAT TU TRA XEN CANH KIM TUYEN

Chuyén nganh: Cong nghé sinh hoc

Ma nganh: 60.42.80GVHD: TS Huynh Ngoc Oanh

LUAN VAN THAC SI

TP HO CHI MINH, thang 07 nam 2015

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HO CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Huynh Ngọc Oanh

Cán bộ cham nhận xét 1: PGS.TS Lê Phi Nga

Cán bộ cham nhận xét 2: PGS.TS Phan Phước Hién

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, DHQG Tp HCMngày 08 tháng 08 năm 2015.

Thành phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gôm:1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

2 Thư ký: 1S Hoàng Anh Hoàng.

3 Ủy viên — Phản biện 1: PGS TS Lê Phi Nga.4 Phản biện 2: PGS.TS Phan Phước Hiên.5 Ủy viên: TS Nguyễn Tan Trung

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Huỳnh Thị Phương MSHV: 11316012Ngày, tháng, năm sinh: 16/01/1988 Nơi sinh: Phú Yên

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60.42.80

I TÊN DE TÀIỨng dụng enzyme Viscozyme L trích ly hợp chat polyphenol trà Oolong sảnxuất từ trà xén cành Kim Tuyên

Il NHIỆM VU VÀ NOI DUNGe Khảo sát mức độ ảnh hưởng va tương tác của các yếu tố đến quá trình trích

ly tra Oolong có bồ sung Viscozyme L dé thu được dịch chiết có hàm lượng

polyphenol cao.

e Tối ưu hóa quá trình ứng dụng Viscoazyme L trích ly polyphenol trà Oolongsản xuất từ trà xén cành Kim Tuyên

e anh giá hoạt tính sinh học cao tra Oolong.

Il NGAY GIAO NHIỆM VU: 01/2015IV NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 06/2015V CAN BO HUONG DAN: TS Huynh Ngọc Oanh

Tp HCM, ngày thang năm 2015

CÁN BO HƯỚNG DAN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Ngọc Oanh, người hướng dẫn khoahọc trực tiếp cho tôi trong toàn bộ quá trình thực hiện luận văn này Cô đã hết lònghướng dan, động viên va tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện tốt côngviệc nghiên cứu khoa học của mình Đồng thời, tôi cũng cảm ơn đến các anh chị quản

lý phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học — Trường ĐH Bách Khoa

TP.HCM đã tận tình hướng dẫn, trao đổi và tạo điều kiện về thời gian cũng như hóachất, thiết bị trong suốt quá trình làm thí nghiệm

Cùng đồng hành với tôi trong quá trình này có bạn Nguyễn Ngọc Trâm, PhạmNgọc Xuân và hai em Tôn Nguyễn Thục Quyên, Lý Thanh Đăng Cảm ơn tất cả cácbạn đã hỗ trợ tôi rất nhiều

Bên cạnh đó không thé thiếu một lời cảm ơn chân thành gửi đến PGS.TS.Phan Phước Hiền — Trường DH Nông Lâm Tp.HCM Cùng tập thé cán bộ, nhân viênnhà máy sản xuất trà Công Ty Cầu Tre đã tạo điều kiện nghiên cứu và ứng dụng kếtquả nghiên cứu vào quy trình sản xuất thực tế

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình Gia đình luôn luôn là điểm tựa vững chắccho tôi trong bat cứ hoàn cảnh nào

Xin cảm ơn tât cả mọi người!

TP.HCM, ngày 25 tháng 7 năm 2015

Học viênHuỳnh Thị Phương

Xác định điều kiện hoạt động tối ưu của Viscozyme L nhằm tăng hàm lượngpolyphenol thu được trong dịch chiết trà Oolong từ trà xén cành Kim Tuyên là mục

tiêu quan tâm trong nghiên cứu này Với lượng dung môi nước thích hợp (tỷ lệ

nguyên liệu/nước là 1/26), hàm lượng enzyme Viscozyme L 0.06ml/g thé hiện hoạttính tối ưu ở 48°C, trong thời gian 135 phút thì lượng polyphenol tổng thu được trongdịch chiết đạt hơn 23% (w/w)

Phương trình hồi quy từ phan mềm Minitab như sau:Y = 22.24 + 2.12X; + 1.17X;— 1.60X3 + 1.52X¿ — 1.80X,° — 2.59X¿ —

3.32X3° — 1.21XzZ— 0.53X¡X¿ + 0.42XzXa + 0.31XzX¿ + 0.60X3X4q

Với Y là hàm lượng polyphenol tổng (%)X,, Xo, X:, Xa lần luot la 4 yếu tổ tỷ lệ chiết, hàm lượng Viscozyme L,

nhiệt độ và thời gian trích ly với enzyme.

Ở điều kiện trích ly tôi ưu, polyphenol tổng và hoạt tính kháng oxy hóa quétgốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) cao trà Oolong của dịch chiết đượcbố sung Viscozyme L (52.68 % chất khô hòa tan và ICsp 215.62 zg/ml) đều cao hondịch chiết không có enzyme (40.57% chất khô hòa tan với ICs 301.44 g/ml) Đôngthời, mẫu cao trà Oolong có hàm lượng EGCG đạt 36.62% chất khô hòa tan và cókhả năng ức chế hai chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus,Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) khi nồng độ cao trà sử dụng là

50mg/ml (5¢/I).

This study takes interest in surveying the Viscozyme L operating conditionswhich help to increase the polyphenol content in the extract from Kim TuyenOolong tea With the appropriate water solvent (the ratio of materials/water is 1/26),

the content of Viscozyme L 0.06ml/g has the optimal activity at 48°C within 135

minutes, the total polyphenol collected in the extract is more than 23% (w/w).

The regression equation from Minitab software as follows:Y = 22.24 + 2.12X1 + 1.17X2 - 1.60X3 + 1.52X4 - 1.80X12 - 2.59X22 -

3.32X32 — 1.21X42 - 0.53X1X2 + 0.42X2X3 + 0.31X2X4 + 0.60X3X4.

With Y is the total polyphenol content (%).X 1, Xa, X3, Xa: ratio of materials/water, Viscozyme L concentration,temperature and enzyme extraction time.

In the optimal extraction conditions, total polyphenols and antioxidant activityscan |,1-diphenyl radical-2-picrylhydrazyl (DPPH) high of Oolong tea extract wasadded Viscozyme L (52.68% soluble dry matter and IC50 215.62 g/ml) were higherthan without the enzyme extract (40.57% soluble dry matter with IC50 301.44 g/ml).Beside Oolong tea samples whose the EGCG content reaches 36.62% are able toinhibit both Gram (+) bacteria Staphylococcus aureus, and Methicillin-resistantStaphylococcus aureus (MRSA) in concentrations of 50mg/ml (5g/I).

Tôi tên Huỷnh Thị Phương, học viên cao học chuyên ngành Công Nghệ Sinh

Học, khóa 2011, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Dai học Bách Khoa Tp Hồ Chí

Minh Tôi xin cam đoan:

Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, số liệu là kết quả nghiên cứuthực sự của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Huỳnh Ngọc Oanh

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt

nghiệp của mình.

Tp.HCM, ngày 25 tháng 7 năm 2015

Học viên

Huỳnh Thị Phương

LOI CẢM ƠN G1 12111 1 1112111111 1111 111111 01111111 110120110111 11 21111111111 re iTOM TAT LUẬN VAN Q.uececccccscssscscscscscecscecececececscsescvevavsvevevevsvasacecececessesavavavavavavavavaees iiLOI CAM DOAN oieeeccccccccccccscscsecscscscsesscscscscsesscsescscscssescscssscssssesesssssesscsessavssssesessseeteess iii

1090922 ivi

DANH MUC HINH cecccescecececsssscscecesessevscscecscsevscacececsesvacacevavacecesseavacacecesvavarsenceees viCAC CHU VIET TAT wiceccccccccccccccsesscscscscscssscscscsssscscscscsssscsescscsssssssseseessssssseseesssseeas viiCHƯƠNG 1: MO DAU wiecescccccccccccscscsscscscscsssscscscscsssscsescscssssescscscscessssscacscsvssecscssasseseees |1.1 Đặt vẫn đỀ cac 11111111 111011111 H11 TT TH ng ngu ri 2

1.2 Mục tiêu nghiÊn CỨU - - - - << + 1110001 nọ 31.3 Nội dung nghiÊn CỨU - - - - < << E100 0 0 nọ 3

CHƯƠNG 2: TONG QUAN TÀI LIỆU ¿2-5-5 52S2222S£‡E+E2EE£EEeEkrrrrrerrerered 42.1 Hợp chat polyphenol -. -¿-¿- - +6 5£ +E+E£SE£E£E£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrkrkrrrrkrrei 52.2 Giới thiệu chung VỀ trầ - - S621 1 2 1 1211151111 11111111151111 1101111111110 rk 82.2.1 Đặc điểm sinh thái của cây trà (Camellia sinensis) và giỗng trà Kim Tuyên 8

2.2.2 Thành phần hóa học chủ yếu trong trà -:::+-:+++++t + 10

2.2.3 Một số tính chất chung của hợp chat polyphenol trong trà: -:-++ + 132.3 Tác dung sinh học và tiềm năng ứng dung của hop chat polyphenol trà 132.4 Một số phương pháp trích ly polyphenol ccccccsessssessesesessescsesessesesessesesesseseseeees 17

2.4.1 Phương pháp trích bằng cdc dung MOI 5 17

2.4.2 Phương pháp trích bằng các chất lỏng siêu tới hanes rst 17

2.4.3 Các phương pháp trích ly khác: -: -: + +***hhnhhnhenhhhhhhhhhhhhhheenneeeeereeeee 18

2.4.4 Phương pháp sinh học: : -*+**** nh nen hhhhhhhhhhhhnhhhhhhhhhhheeheehkeneeneeeeee 19

CHƯƠNG 3: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5 55ccccccreerkeerrrerre 213.1 Nguyên vật liệu, hóa chat và thiết bị sử dung chủ yếu trong nghiên cứu 22

3.1.1 Nguyên liệu trà xén cành::: -:++++++ te stnehhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhdrreenrrrrnne 22

3.1.2 Enzyme thương mại " 24

3.1.5 Thiết bi VA dung CU mm —.Ớ.ớỬớẰ}ớ]p7ớ7ớ,77Ớớ,ớớ,,,pỚỚPẪỚỌỚỌỚỌẪỌPẪẶPẪẶPẶPẶpƑyƑỚPyPdớỚH 25

3.2 Nội dung và phương pháp nghiÊn CỨU - G G3901 11 1113 99 3111 kg 26

3.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của các đơn yếu t6 đến hoạt động của enzyme - 27

3.2.2.1 Tỷ lệ nguyên liệu Va THƯỚC - - - -G Ăn ngờ 283.2.2.2 Ảnh hưởng của ham lượng enzyme Viscozyme LL - + 55 s+sz s5: 283.2.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động của enzyme Viscozyme LL 28

3.2.2.4 Anh hưởng thời gian đến hoạt động của enzyme Viscozyme LL 29

3.2.2.5 Anh hưởng chế độ lắc đến hoạt động của enzyme Viscozyme L 29

3.2.3 Quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly polyphenol trà Oolong -::: :: - 29

3.2.4 Trích ly thu nhận cao trà Oolong -:::::::: ++++++tttthnhheehthhhhhhhheehhnrrnseeo 313.3 Phương pháp phân tÍCh - - 6 E213 32203111111 1111111111111 1 1 111 0001111 1 khe 313 3 l Cac chi tiéu co ban " — 3]

3.3.2 Định lượng polyphenol tổng dựa vào phan ứng mau với muối tartrate - 32

3.3.3 Xác định hàm lượng TF và TR : -: -++-*rtenhhhhhhhhhhhenhhhhnrennreenneennrenne 323.3.4 Xác định khả năng chống OXY hÓa ++ th nh nhhhhhhhhhe nhe nhe hhehhheeeee 333.3.5 Xác định khả năng kháng khuẩn: -**** nh nh nh nh nh nh kh kh kh heo 343.3.6 Xác định hàm lượng EGCG -: -: -++ nh nnnhnhhhhhhhhhhhhrehneeneeeneeenreeee 353.3.7 Dinh lượng tannin-:-:-: -+:-++ + nh nhe ee ee ne ree 363.3.8 Xác định màu tong (TLC — total liquor color) : -+*++****e*hehhhhhhhhthhhhhehheee 373.3.9 Phương pháp xử lý số TC eS 37CHƯƠNG 4: KET QUA VA BAN LUẬN 5c 384.1 Khao sát sơ bộ nguyên liệu nghiÊn CỨU <5 +5 E351 13955111 11k crs 394.1.1 Thành phần các chất trong nguyên liệu: : :- +: ++t+tthstnhhhhhhhhhheehee 394.1.2 Mối quan hệ giữa tỷ lệ theaflavin/thearubigin (TF/TR) với mau sac dịch trà - - 39

4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt động của enzyme Viscozyme L 42

4211 Tỷ lệ nguyên liệu/nước " Ẳ eeeeeeees 42422 Ham luong Viscozyme II 43

4.2.5 Ảnh hưởng của chế độ lắc đến hoạt động cua enzyme Viscozyme L -: - 46

4.3 Quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly polyphenol tra Oolong 47

4.3.1 Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh "U53 47

4.3.2 Thí nghiệm trung tâm và tối ưu Aba rr + nh tt tt kh kh khe, 50

4.4 Trích ly thu nhận cao tra Oolong - G0 HH rre 56

4.4.1 Hiệu quả trích ly trà Oolong:::::::++ -++++** nhe thhhhhhhhhhhhhhhhhrrrnnrreeeend 56

4.4.2 Hoạt tính sinh học của sản phẩm cao trà Oolong: -++-*++* the he 584.4.2.1 Khả năng chong oxy hóÓa ¿6-5532 391212151121 2111 21111111111 584.4.2.2 Khả năng kháng khuẩn + - S522 2E 1 E5 E1 211111511 1511111111111 xe 61CHUONG 5: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 65x EeEsEEESESEEeEseserees 635.1 KẾ luận -.- - tt 919191 1E 9111919111 11111011110 111g HH1 gi 64

TÀI LIEU THAM KHẢO 6 G61 3E 19191 1E 51119191 11811 81 111gr rrreở 66

PHU LUC 2 3 74

Bang 2.1: Ký hiệu các catechin trong tra - - - << ss s0 0n ng 12

Bảng 3.1: Các bước tiến hành thí nghiệm - + 255252 +E+E£££E+Ee£ezxvxerscxee 26Bang 3.2: Mức khảo sát các yếu tỐ 5+ 6 c+S2 2E E2 3211211112111 xe 30Bảng 4.1: Thành phan các chat trong các nguyên liệu trà khác nhau - 39Bảng 4.2: Hàm lượng TF, TR, TCL trong dịch chiết trà xanh và tra Oolong 40Bảng 4.3: Cac mức giá tri của các biến thực hiện thí nghiệm sàng lọc 48Bảng 4.4: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tỐ -. 5- + 25555: 49Bảng 4.5: Mức độ ảnh hưởng và ý nghĩa thong kê từng yếu tỐ . - +: 53Bang 4.6: Điều kiện chiết tối ưu theo mô hình - + 2 2 255 + £2££+£££z£z£z£szx2 55Bảng 4.7: Kết quả thực nghiệm kiểm chứng giá trị tối ưu -55- s2 s55: 56Bang 4.8: So sánh hiệu quả một số phương pháp chiẾt - + 255555255252 58Bang 4.9: Ảnh hưởng điều kiện trích ly đến khả năng kháng oxy hóa của cao trà 59Bảng 4.10: Đường kính vòng kháng khuẩn (MM) - + + 2s 2 s+s+sz s52 61

Hình 2.2: Cau trúc phân tử acid gallic và acid syringiC - + 5s + s+s+secscxe2 6Hình 2.3: Cau trúc phân tử nhóm acid hydroxycinnaimic - + 5 ss+ss 55s: 6Hình 2.4: Cau trúc phân tử nhóm flavonoid - + 2+5 2 ++x+E£e+x+xzzezxexererree 7Hình 2.5: Cau trúc phân tử một số polyphenol khác - 5s 2 s+s+sz+szs+¿ 7

Hình 2.6: Cac polyphenol có nhóm N- trong phân tỬ - «75-1 sssesss 8Hình 2.7: Dot trà Kim TUYÊN - - 25G <1 1101100191990 ng 9

Hình 2.8: Cánh đồng trà Kim Tuyên tại nhà máy Cau Tre — Bảo Lộc - 9Hình 2.9: Thành phan hóa học chủ yếu trong lá trà tươi - 555525555: 10Hình 2.10: Hợp chat polyphenol trong tra cccccsescsscscssssessesesesesscsesessesssessesesesseseeeeees IIHình 2.11: Thành phan chính trong trà xanh và trà đen - 555525555: 13Hình 3.1: Cánh đồng tra trước và sau khi thu hoạch w cccccececeeesesseseseseseeeeeeeseees 22Hình 3.2: Quy trình sản xuất trà Oolong tại nhà máy công ty Cau Tre 23

Hình 3.3: Tra xén cành Kim TUyÊN G000 ngờ 24

Hình 3.4: Sơ đỗ tiễn hành thí nghiệm ¿©2252 252 +E+E+E2EE£E£E£E+ESEEErzrxrerree 27

Hình 3.5: Quy trình xác định hàm lượng TF và TIE - «5 «5< +*<*ssseeeess 33

Hình 4.1: Sự khác nhau về màu sắc các dịch chiẾt trà 2s s + x+x+x£eEsesezxe AlHình 4.2: Anh hưởng của tỷ lệ chiẾT ¿2-6 2522223 3E E121 15125 121111 xe 42Hình 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng Viscozyme ÌL + 25552 s+s+xcscsee 43Hình 4.4: Anh hưởng của nhiệt độ . - ¿+ 2 %6 +E+E#E#EEEEEEEE E1 EEEEEEErErrrrkred 44Hình 4.5: Ảnh hưởng của thời gian - - + 6 52 SE 2E2EEEEEEEEEEEEEEErrkrkrrrrrrrrree 46Hình 4.6: Anh hưởng của chế độ lắc ¿-¿- + + 256 +E+E+E2EEEEEE£ESEEEEEEEEEEErErrrrkred 47Hình 4.7: Mức độ ảnh hưởng của các yếu tô đến quá trình trích ly thu nhận PPT 50Hình 4.8: Kết quả thí nghiệm trung tâm ¿-2- 5-52 552SS£2E+E+EE£EvEererrrrererree 51Hình 4.9: Kết qua phân tích phương sai + 225 + 2 2 £E£E+E+E£EE£E£E£EzEererrsred 52Hình 4.10: Bề mặt đáp ứng của hàm lượng PPT theo từng cặp yếu tố ảnh hưởng 54Hình 4.11: Các giá trị tối ưu theo mô hình - ¿+5 2 2+2 ££+x+xe£ezxvxerscxee 55Hình 4.12: Quy trình sản xuất cao trà Oolong cccscsscssssssessssesessesescsessesssessssesesseseeeeees 57Hình 4.13: Mối tương quan giữa hàm lượng PPT và khả năng chống oxy hóa 60

SODCCD

SC-CO;HHPD.L-CL-ECD,L- GCL- EGCL-ECGL-GCGL- EGCGFBGMRSARSMTRFTRDPPHHPLCSDPPTPPOPODTCL

HydroxylSuperoxideSuperoxide dimutase

Thiết kế hỗn hợp tâm xoay

Oxy đơn bộiCarbon dioxide siêu tới hạn

Áp suất thủy tĩnh cao (High Hydrostatic Pressure)

D,L catechinL epicatechinD,L gallocatechinL epigallocatechinL epicatechingallateL gallocatechingallateL epigallocatechingallateFungal Beta-GlucanaseMethicillin-resistant Staphylococcus aureus

Phuong pháp bề mat đáp ứng

TheaflavinThearubigin

Màu tổng (Total Colour Liquid)

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vẫn đề

Trong sản xuất trà Oolong tại Công Ty Cầu Tre, nguyên liệu sử dụng phảilà dot trà (1 tôm 2 lá) Do đó, những phan còn lại của cây trà — trà xén cành (từtầng lá thứ 3, thứ 4 trở xuống gốc cây trà) hầu như được tiêu thụ với giá thànhkhông cao, mặc dù hàm lượng các chất trong trà xén giảm không đáng ké so vớidot trà [8.9] Chính vi thé việc tim ra giải pháp dé nâng cao giá trị trà xén cành làmột vẫn đề rất có ý nghĩa kinh tế và thực tiễn

Hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong trà

Polyphenol chính trong trà là các flavonoid (catechin-C, epicatechin-EC,gallocatechin-GC, epigallocatechin-EGC, gallocatechingallate-GCG, epicatechingallate-ECG, epigallocatechin gallate-EGCG, va proanthocyanidin) [6,33] Do đó

việc trích ly thu nhận polyphenol từ tra xanh nói riêng và một số nguyên liệukhác nói chung như lá sakê, lá dâu để b6 sung vào thực phẩm, mỹ phẩm hoặcdược phẩm đang là hướng nghiên cứu va phát triển mang lại nhiều giá trị cho nhàsản xuất (đa dạng hóa sản phẩm) cũng như người tiêu dùng (sản phẩm có lợi cho

sức khỏe).

Để trích ly polyphenol có trong trà, nhiều phương pháp khác nhau đã đượcthực hiện [8,20,33] Tuy nhiên, kết quả đạt được vẫn còn hạn chế bởi có thé làhiệu suất trích ly thấp, dung môi sử dụng nhiều không đảm bảo tính an toàn hoặcchỉ phí cao để loại bỏ dung môi ra khỏi sản phẩm Trong nghiên cứu này, chúngtôi tiến hành phương pháp sinh học trích ly trà Oolong xén cành có sự hỗ trợ củaenzyme nhăm thu nhận hàm lượng polyphenol cao nhất

Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn, chúng tdi thực hiện đề tài luận văn“Ứng dụng enzyme Viscozyme L trích ly hợp chất polyphenol trà Oolongsan xuât từ trà xén cành Kim Tuyên".

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài này thực hiện nhăm 2 mục tiêu chính:- Ứng dụng công nghệ enzyme trong việc trích ly các hợp chất sinh học từthiên nhiên cụ thé là hợp chất polyphenol

- Tối ưu hóa quá trình trích ly hop chat polyphenol, thu nhận cao trà Oolong

có hoạt tính sinh học cao.

1.3 Nội dung nghiên cứuDé dat được 2 mục tiêu này, nội dung nghiên cứu của dé tài bao gồm:- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly: tỷ lệ nguyênliệu/nước, hàm lượng Viscozyme L, nhiệt độ, thời gian va chế độ lắc

- Xác định mối quan hệ tương tác giữa các yếu tố dé đi đến tối ưu hóa quátrình trích ly băng phần mềm Minitab16

- Xây dựng quy trình sản xuất cao trà Oolong và đánh giá chất lượng caothông qua hoạt tính sinh học (khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn)

CHUONG 2

TONG QUAN TAI LIEU

2.1 Hop chat polyphenolPhenol là các nhóm chat khác nhau rat phố biến trong thé giới thực vật,chúng thường tôn tại dưới dang glycoside dễ tan trong nước và thường tập trungở các không bào của tế bào thực vật Các hợp chất này chứa vòng thơm mangmột hoặc nhiễu nhóm hydroxyl Sự đa dạng và phân bố rộng rãi trong thực vật đãdẫn đến nhiều cách phân loại khác nhau: theo nguồn gốc, chức năng sinh học,cau trúc hóa học Tuy thuộc vào SỐ lượng và vi trí của các nhóm hydroxyl mà cáctính chất lý hoá học hoặc hoạt tính sinh học thay doi Một cách phân loại đơngiản là dựa vào số lượng nhóm hydroxyl phân biệt thành: nhóm phenol đơn giảnvà nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol) [3.9].

e Nhóm phenol đơn giản gồm các chất trong phân tử được cấu tao từmột vòng benzen và một hay nhiều nhóm OH, được chia thành các monophenol;

diphenol (pyrocatechin, rezoxyn ); triphenol (pyrogalon, oxyhydroquinon ).

e Nhóm hợp chat phenol phức tap (polyphenol): trong thành phan cấu

tạo ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, được phân thành các nhóm:monome và polyme Monome hay polyphenol đơn giản được chia thành:

- Nhóm Có — C1 (acid hydroxybenzoic) gồm acid gallic, acid hydroxybenzoic, acid protocatechuic, acid vanillic và acid syringic trong cau trúc

p-phân tử có thêm nhóm carbonyl.

fj Oh `

— OH

R—-O Protocatechux acid, R = H,

Vanilic acid R * OCH,

Hình 2.1: Cầu trúc phân tử acid protocatechuic, acid vanillic [66]

— OH

Gallic acid, R = H,Syriagkc acid R * OCH,

Hình 2.2: Cau trúc phân tử acid gallic và acid syringic [66]

- Nhém C6 — C3 (acid hydroxycinnamic) như acid caffeic, acidferulic, acid p-coumaric và acid sinapic có gôc carbonyl được nôi với nhânbenzen qua hai nguyên tử carbon.

HạCO O

HO } OH

senapac acid

H3CO

Hình 2.3: Cau trúc phân tử nhóm acid hydroxycinnamic [66]

- Nhóm C6 — C3 — C6 (gọi là các flavonoid): flavonoid là hợp chấtcó phân tử lượng thấp, chứa 15 nguyên tử carbon, sắp xếp trong một cau hìnhC6-C3-C6 Cau trúc bao gồm 2 vòng thom A và B nối với nhau bằng cầu nối 3

carbon thường ở dang dị vòng C (vòng pyron) (hình 2.4) Trong thực vật,

flavonoid tổn tại ở 2 dạng tự do (gọi là aglycon) và liên kết với đường(glycoside) Các glycoside khi bị thủy phân bang acid hoặc enzyme sẽ giải phóngra đường và aglycon Dựa vào các biến thể thay thế trong vòng C, flavonoid có

thê chia thành các nhóm chính anthocyanin, flavone, isoflavone, flavanone,flavonol và flavanol (hay catechin).

Hình 2.4: Cau trúc phân tử nhóm flavonoid [66]

Nhóm hợp chất polyphenol polymer có cầu tạo khung carbon (C¿ — C3)n, (Coda,

(Ce — Ca — Co)n, được chia thành các nhóm: tannin, lignin, melanin,catecholmelanin, acid humic.

Ngoài ra, một số polyphenol được tìm thay trong các loại thực phẩm có vaitrò quan trọng đối với sức khỏe con người Đại diện chính là resveratrol có mặt

trong hơn 70 loại thực vật như nho, dâu, đậu phộng: curcumin trong củ nghệ:acid ellagic trong qua mam xôi

CurcuminHO Resveratrol

GingerolRosmarinic acid

Hình 2.5: Câu trúc phân tử một số polyphenol khác [66]

Một số polyphenol mà trong phân tử có chứa nhóm chức N- như

capsaicinoid trong ớt và avenanthramide trong yên mạch.

Hình 2.6: Cac polyphenol có nhóm N- trong phan tử [9]

Những năm gan đây, các hop chat phenol nhận được sự quan tâm dang kể

do hoạt tính sinh học của chúng Trong đó, polyphenol là nhóm tạo chú ý mạnh

mẽ với khả năng chống oxy hóa và nhiều trong số chúng đã được tìm thấy trong

các loại thực vật như trái cây, rau, các loại thảo mộc khác nhau và cây trà

(Camellia sinensis) một đối tượng không mới nhưng vẫn còn mang nhiều giá trịcần khám phá Cây trà và những sản phẩm của nó đã được nghiên cứu nhiều để

xác định mức độ lợi ích tích cực lâu dài cho sức khỏe.

2.2 Giới thiệu chung về trà2.2.1 Đặc điểm sinh thái của cây trà (Camellia sinensis) và giỗng trà Kim Tuyên

Phân loại thực vật, trà thuộc |4]:

Ngành Hạt kín (Angiospermae)Lớp Song diệp tử (Dicotylednae)Bộ Sơn trà (Theals)

Họ Trà (Theacea)Chi Trà (Camenllia)

Loai Camenllia sinensis

Trà sống chủ yếu ở vùng nhiệt đới, ôn đới Căn cứ vào đặc tinh sinh trưởng

và hình thái của cây trà, người ta phân thành 3 loại cây khác nhau: cây bụi, cây

trung bình và cây to [7] Dua theo đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hóa,nguồn gốc phat sinh cây tra, Cohen Stuart (1919) đã chia Camellia sinensis thành4 loại: trà Trung Quốc lá to (Camellia Sinensis var.macrophylla), trà Trung Quéc

lá nhỏ (Camellia sinensis var.Bohea), tra Shan (Camellia Sinensis var.Shan), tra

An Độ (Camellia sinensis var.Assamica).Tại nhà máy trồng và chế biến tra Oolong của công ty Cau Tre ở Bảo Lộc,giống trà Kim Tuyên 27 được chọn dé sản xuất trà Oolong Kim Tuyên 27 đượcnhập từ Đài Loan, chọn lọc từ tổ hợp lai giữa giống trà lá to của địa phương vớigiống trà của Ấn Độ Giống Kim Tuyên 27 có dạng thân bụi, mật độ cành dày,

Hình 2.7: Đọt trà Kim Tuyên

Hình 2.8: Cánh đồng trà Kim Tuyên tại nhà máy Cau Tre — Bảo Lộc

2.2.2 Thanh phan hóa học chi yếu trong traThành phan hóa hoc của trà phụ thuộc vào giống độ tuôi, thổ nhưỡng, kỹthuật canh tác và mùa thu hoạch Thành phân hoá học của trà rất đa dạng vàphong phú Trong đó, có một SỐ lượng lớn các chất có giá tri sinh học cao Cachợp chất này vừa quyết định đến chất lượng trà thành phẩm, vừa quyết định đếntính chất được lý của trà [5].

Thành phần Hàm lượng (%}

Nước 75 —80

Elayonol:

(-) Epigallocatechin gullate (EGCG) 8-12

(-) Epicatechin gallate (ECG) 3-6

(-) Epigallo catechin (EGC) 3-6

(-) Epicatechin (EC) 1-3(+) Catechin (C) 1-2(+) Gallocatechin (GC) 3-4Caffeine 3-4Acid hữu cơ (citric, malic, oxalic, ) 05—06Đường 4-5Xo (cellulose, hemicellulose, lignin) 4-7Protein va acid amin 14-17

Lipid 3-5

Khoáng 5-6

Chat mau (carotenoid, chlorophyll) 05-06

Enzyme

Hình 2.9: Thành phan hóa học chủ yếu trong lá trà tươi [9]

Mỗi thành phần hóa học trong trà đều có một hàm lượng và vai trò khácnhau (hình 2.9) Nước là thành phan chủ yếu, vừa là môi trường vừa trực tiếp

tham gia vào các phản ứng thủy phân và oxy hóa - khử không ngừng xảy ra

trong tế bào lá trà, có ảnh hưởng quan trọng đến quy trình công nghệ và các chỉtiêu kinh tế kỹ thuật của quá trình chế biến Caffein một đại diện của nhómalkaloid là một trong những chỉ số chất lượng quan trọng trong trà thành phẩm do

tác dung kích thích than kinh Các đường hòa tan trong lá trà dù hàm lượng rấtthấp nhưng chúng góp phần điều hòa vị trà, tạo cho trà có hương thơm đặc trưng.Pectin có tác dụng kết dính khi vò, làm xoăn chat lá trà và tạo vị ngọt dịu của tràsản phẩm Chất béo là chất có tính hấp phụ và là chất giữ mùi — đây là cơ sở choviệc đa dạng hóa mùi hương các sản phẩm trà Nhưng quan trọng nhất và có ýnghĩa quyết định đến chất lượng cũng như giá trị trà thành phẩm phải là hợp chấtpolyphenol — flavonoid — catechin và các dẫn xuất của nó (hình 2.10).

Gallic acid (GA) Gaillocatechin (GC) Epigalloeatechin (EGC) Gallocatechin gallate (GCG) piga cca) gallate

Hinh 2.10: Hop chat polyphenol trong tra [27]

Trong số hàng nghìn hop chat polyphenol trong cây đã được biết rõ cau trúcthì flavonoid là nhóm hợp chất quan trọng hơn, nồi trội nhất về hoạt tính sinh họcvà phạm vi ứng dụng Flavonoid phân bố pho biến trong thực vật bậc cao Ngườivà động vật không có khả năng tự tổng hợp các flavonoid Cho tới nay, có hơn4000 flavonoid được tìm thấy từ thực vật [68] Flavonoid là nhóm hợp chấtpolyphenol chủ yếu đóng vai trò quan trọng trong thành phần hóa học của tràxanh, chính vì vậy, nói đến hợp chất polyphenol trong trà là nói đến các hợp chấtflavonoid, trong đó catechin chiếm ty lệ lớn [9] Catechin có vi trí quan trọng

trong việc tạo màu sac, mùi, vi cho trà thành phầm Trong lá trà, các hợp chat

catechin tôn tại ở trạng thái tự do và dang ester phức tạp với acid gallic Hiện naytrong lá trà đã tìm thấy được các loại catechin khác nhau (bang 2.1).

Bang 2.1: Ký hiệu các catechin trong trà

Tên các catechin trong trà Ký hiệu

D, L catechin D,L-CL epicatechin L-ECD, L gallocatechin D,L-GCL epigallocatechin L— EGCL epIcatechingallate L—ECGL gallocatechingallate L—GCGL epigallocatechingallate L- EGCG

Hàm lượng các catechin nói trên trong lá trà luôn thay đối, phụ thuộc vàogiống trà, thời kì sinh trưởng, vị trí các lá trên búp và nhiều yếu tô khác EGCGlà thành phan chỉ được tìm thay trong tra, EGCG có thé chiếm đến hơn 50% tongkhối lượng các hợp chất catechin và khoảng 10% tổng khối lượng khô của trà,tiếp theo là EGC, ECG và GC (chiếm khoảng 10 — 20% tổng catechin) Các hợpchất catechin còn lại có hàm lượng thấp và không phải là thành phần đặc trưngcủa trà do còn được tìm thay trong cacao, nho, táo, hanh, , với mức độ phan bố

rộng hơn [7].

Từ nguyên liệu trà tươi, tùy vào quá trình chế biến sẽ tạo thành những loạitrà thành phẩm khác nhau: trà xanh (không lên men), trà Oolong (lên men mộtphân) và trà đen (lên men triệt để) Theo đó, thành phần hóa học các chất cótrong mỗi sản phẩm trà cũng thay đổi do mức độ oxy hóa các hợp chất

polyphenol khác nhau [24].

Compound Green tea* Black tea* InfusionProteins 15 1S lraceAminoacids + 4 3.5Fibre 26 26 0Others carbohydrates 7 7 :Lipids 7 7 lracePigments 2 2 traceMinerals 5 5 4.5Phenolic compounds” 30) 5 45

Oxidised phenolic compounds’ 0 25 4.5

* Data refereed to dry weight of tea leaves.Black tea; infusion time: 3 mun

Especially Mavonoids

? Especially thearubigins and theaflavins

Hinh 2.11: Thanh phan chinh trong tra xanh va tra den [14]

2.2.3 Một số tính chat chung của hop chat polyphenol trong traHop chat polyphenol trong cây trà thuộc nhóm tannin không thủy phânđược hay còn gọi là nhóm tannin ngưng tụ, rất phân cực Các polyphenol có chứagốc pyrocatechic hoặc pyrogalic nên chúng có thé tham gia phản ứng oxy hóa —

khử, phản ứng cộng và phản ứng ngưng tụ.

Trong điều kiện có mặt các enzyme oxy hóa như polyphenol oxidase,

peroxidase, các polyphenol sẽ bi oxy hóa thành các quinon.

Khi có mặt các acid amin thì các quinon mới được tạo thành sẽ tiễn hànhphản ứng cộng với các acid amin dé tạo thành các octoquinon tương ứng

Các octoquinon là những chat rất hoạt động Chúng dễ dàng kết hợp vớinhau thành các hợp chất ngưng tụ phân tử lớn tạo thành sản phẩm có màu gọi

chung là flobafen.

2.3 Tác dụng sinh học và tiềm năng ứng dụng của hợp chất polyphenol tràHợp chất polyphenol trong trà, đại diện là nhóm catechin là một trongnhững nhóm chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao và có giá tri ứng dụng thựctiễn lớn, đặc biệt trong lĩnh vực y dược Một trong những hoạt tính sinh học quantrọng là khả năng chống oxy hóa

Theo nghiên cứu cua các nhà sinh học như Harman (1984), Wolford (1983),

Tauban (1986) đã đồng kết luận rang phan lớn các gốc tự do tạo thành trong cơthể con người là do quá trình phản ứng sinh hóa trong cơ thể như quá trình oxyhóa phân tử Trong cơ thé, ion superoxide (O°) sản phẩm của quá trình hô hap tế

bào sẽ được các enzyme superoxide dimutase (SOD), catalase, hoặc glutathion

peroxidase xúc tác phản ứng chuyên thành nước

SOD

2O; + 2H” ———> HO; + O;

catalase

HO; ———* 2H,0 +O,glutathion peroxidase

Trén thuc té, ca superoxide (O, ) va H2O0> van cùng ton tại trong cơ thể mặcdù nồng độ oxy rất thấp Chúng tương tác với nhau để tạo thành oxy đơn bội('O,), đồng thời còn xảy ra phản ứng Fenton [44]

O, + HO ——> '0, + 20H

Nếu có sự xúc tác của các ion kim loại chuyén tiếp như Fe”*, Cu* thì phanứng Fenton sẽ xảy ra rất nhanh Các ion này còn có khả năng phân hủy cáchydroperoxide lipid thành các gốc peroxyl Như vậy, từ gốc superoxide ban đầusẽ sản sinh ra hàng loạt các sốc tự do khác: H;O; oxy đơn bội ('O,), OH Cacgốc nay được gọi là các dạng oxy hoạt động, chúng ít bền va có khả năng phảnứng rất lớn

Ngoài các gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thường cơ thé cònbị ảnh hưởng của các dạng oxy hoạt động phát sinh bởi các yếu tố bên ngoài nhưánh sáng mặt trời, tia X, phóng xạ và chất hóa học như chất sát trùng,formaldehyde, toluen, benzen được tim thấy nhiễu trong chat lỏng tay rửa, trongnước sơn và trong các vecni đánh bóng gỗ, nó cũng do nguồn thức ăn, thức uốngmang đến như chiên, nướng, rượu

Phản ứng của các gốc tự do là nguyên nhân sinh ra quá trình peroxyl hóa

các chat hữu cơ Các gôc tự do có xu hướng lây điện tử của chat khác dé trở nên

bên vững Tuy nhiên, sự bền vững này chỉ trong chốc lát, vì chính nó lại tao ramột nguyên tử không trọn vẹn khác và tiếp tục kết hợp với một nguyên tử kháctạo ra phan ứng dây chuyên khiến cho các phân tử khác bị hư hại, làm mat cácchức năng vốn có của nó Các gốc OH và 'O, thường là tác nhân khơi mao phảnứng Ứng với thời ky nay, các co quan tô chức bị phá hoại nghiêm trọng Đếngiai đoạn dập tắt mạch, các gốc phản ứng với nhau tạo ra những sản phẩm bên.Hậu quả là xảy ra quá trình polyme hóa Như vậy các phân tử sinh học đã bị biếnđổi mạnh mẽ, những protein bất thường xuất hiện trong cơ thể, phát sinh nhiềubệnh lý nguy hiểm và sự lão hóa của cơ thê.

Hợp chất polyphenol có khả năng trung hòa các gốc oxy hoạt động để triệttiêu phản ứng oxy hóa dây chuyên Vì vậy nó được gọi là "những tác nhân thudọn và hủy diệt" các gốc tự do độc hai [60.5128] Đồng thời, polyphenol cònkìm hãm sự phát triển các sốc tự do hoạt động do có khả năng tạo phức với cácion kim loại chuyển tiếp như Fe”, Cu để chúng không thé xúc tác cho phảnứng Fenton sinh ra các gốc như OH’, !O; [51,52]

Ngoài cơ chế trực tiếp nêu trên, polyphenol còn hoạt động như một chấtchống oxy hóa gián tiếp thông qua việc ức chế các yếu tố phiên mã; ức chế cácenzyme tiền quá trình oxy hóa như nitric oxide synthase, lipoxygenase,cyclooxygenase và xanthine oxidase; và cảm ứng các enzyme chống oxy hóa như

glutathione-S-transferase, superoxide dismutase [63,36].

Bên cạnh kha năng chống oxy hóa vượt trội, nhiều công trình nghiên cứu đãcho thấy tác dụng của catechin đối với một số vi khuẩn gây bệnh cho người vàcây trông [45] Takabayashi và Yee đã có báo cáo tác dụng của catechin trên vikhuẩn Helicobacter pylori nhưng không ảnh hưởng đến hệ vi sinh đường ruột

[73.67].

Với những tính chất đặc trưng và hoạt tính kháng oxy hóa cao, việc nghiêncứu ứng dụng khả năng kháng oxy hóa của trà do nhóm catechin quyết định đangrất được quan tâm, đặc biệt trong lĩnh vực y học Như đã phân tích ở trên,polyphenol cùng với một số chất chỗng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên khác nhưvitamin C, vitaminE là yếu tổ quan trọng trong việc ngăn ngừa bệnh tật, giảm ty

lệ tử vong từ bệnh tim mach và làm cham quá trình lão hóa [23] Nhiều nghiêncứu đã chứng minh răng trà xanh với thành phần chủ yếu là các polyphenol vàđặc biệt là EGCG có khả năng ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ungthư ở người [39] Một số công trình nghiên cứu khác đã chứng minh tác dụngkìm hãm của polyphenol trà lên sự hình thành, phát triển và di căn của khối u.Tác dụng này chủ yếu là do hiệu quả chống oxy hóa cao và chống tăng sinh khốiu của các hợp chất polyphenol trong trà [64] Từ năm 2000 — 2008, nhóm nghiêncứu của một số nhà khoa học (TS Đào Thị Kim Nhung, TS Hà Thị Thanh Bình,Ths Dé Thị Gam) thuộc Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ hóa sinh,đã tiến hành nghiên cứu thăm dò tác dụng của polyphenol trong lá trà Tân Cươngtrên các tế bao ung thư nuôi cấy in vitro cho thay có tác dụng gây độc đốivới cáctế bào ung thư biểu mô người Hep — 2, tế bào u tủy chuột Sp — 2/0 và tế bào ungthư mô liên kết Sarcoma — 180, nhưng không gây hủy hoại các tế bào máu ngoạivi người khỏe mạnh [6] Đối với sức khỏe răng miệng, Linke và LeGeros đã chỉra rang thường xuyên uống trà xanh có thé làm giảm đáng kế sự hình thành sâu

răng [42].

Trong thực phẩm, đặc tính kháng oxy hoá của catechin trà có thể được sửdụng như những chất kháng oxy hoá tự nhiên trong bảo quản, hoặc được sử dụngdé tạo ra các thực phẩm chức năng Kết qua trong một nghiên cứu cho thay rangchất chiết trà xanh ở nỗng độ 5% (5g trà/100ml nước) có thé ngăn can sự oxy hoálipid và protein đồng thời vẫn giữ được chất lượng cá ngừ bảo quản băng phương

pháp lạnh đông [21].

Do tác dụng chống oxy hóa nên polyphenol trong trà xanh được đặc biệtchú ý trong ngành mỹ phẩm Ngoài những thành phan như vitamin Ba, vitamin P,vitamin K, polyphenol trong trà có khả năng chống lại được tia cực tím khi tiếpxúc với ánh sáng mặt trời [37,70] và là tác nhân chống oxy hóa mạnh bảo vệ choda chống lão hóa

Với xu hướng sử dụng ngày càng nhiều các sản phẩm chiết xuất từ thiên

nhiên, trà xanh sẽ ngày càng được chú ý, ưa chuộng và trong tương lai sẽ ngày

càng có nhiễu các sản phẩm từ tra phục vu trong mọi lĩnh vực của đời sống con

người.

2.4 Một số phương pháp trích ly polyphenolTrong nhiều năm qua, các công trình liên quan đến việc trích ly các hợpchất polyphenol trong các sản phẩm tự nhiên đã thu hút được sự quan tâm đặcbiệt Trích ly bang dung môi và chất lỏng siêu tới hạn là kỹ thuật tách hợp chấtpolyphenol được sử dụng pho bién nhat nhung thiết bị đắt tiền [53,13,26]

2.4.1 Phương pháp trích bằng các dung môiHiệu quả trích ly phụ thuộc vào điều kiện của quá trình tách chiết Một sốyếu tố ảnh hưởng đến nông độ của các thành phần mong muốn trong dịch chiết:nhiệt độ, ty lệ dung môi - nguyên liệu, tốc độ dòng chảy và kích thước nguyên

liệu [30].

Dung môi chiết pho biến nhất là methanol va ethanol [11] Trong đó, tríchly polyphenol bang dung môi methanol là đem lại hiệu quả nhất [36] Trong thựctế, hiệu quả trích ly anthocyanin từ nho băng methanol tăng 20% so với ethanol,và tăng 73% so với nước [17] Tuy nhiên, trong công nghiệp thực phẩm ethanolđược ưa chuộng hơn do độc tính của methanol Thông thường dịch chiết thuđược còn chứa những chất không phải phenolic như đường, acid hữu cơ,protein đòi hỏi quá trình tinh sạch tiếp theo

2.4.2 Phương pháp trích bằng các chất long siêu tới hanĐối với mỗi một chất đang ở trạng thái khí, khi bị nén đăng nhiệt với mộtáp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng và ngược lại Tuy nhiên, có một gia tri ápsuất mà tại đó, néu tăng nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không hóa hơi trở lại màtrở thành một dạng đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn Vật chất ở dạng này cótính chất trung gian, mang nhiều đặc tính của chất khí và chất lỏng

Quá trình trích ly các hợp chất sinh học bằng chất lỏng siêu tới hạn cónhững ưu điểm nhất định so với trích ly bằng dung môi hữu cơ: nhanh chóng, cóthé tự động hóa, chọn lọc và tránh việc sử dụng một lượng lớn dung môi độc hại.Ngoài ra, sự vắng mặt của ánh sáng và không khí trong quá trình trích ly làm

giảm nguy co thoái hóa các hợp chat sinh học có thé xảy ra trong quá trình trích

ly [15].

Chat lỏng siêu tới hạn đang ngày càng thay thé các dung môi hữu co trongcông nghiệp tách chiết, tinh chế vì những quy định về môi trường Chat lỏng siêutới hạn có đặc tính tương tự dung môi hữu cơ lỏng nhưng độ khuếch tán cao, độnhớt thấp, Sức căng bề mặt nhỏ Hiện nay, carbon dioxide siêu tới hạn (SC—CO2)được sử dụng phố biến nhất vì tính ôn hòa với môi trường độc tính thấp, dé dàngtách ra từ các chất hòa tan mà không tốn kém Tuy nhiên các nghiên cứu trướcđây đã chỉ ra rằng, việc trích ly anthocyanin bang cách sử dụng SC-CO; can áplực cao và cần sự hiện diện của một đồng dung môi hữu co (methanol, ethanol)

với ty lệ cao do sự phân cực cua anthocyanin [15].

2.4.3 Các phương pháp trích ly khác

Quá trình trích ly thông thường như nước 4m, đun sôi, hoặc dòng chảyngược có thé được sử dụng để trích ly các hợp chat phenolic tự nhiên, tuy nhiên,nhược điểm là sự thất thoát các polyphenol do thủy phân và quá trình oxy hóa,cũng như thời gian trích ly dai [32] Trong những năm gan day, các kỹ thuật tríchly ngày càng được phát triển, bao gồm trích ly có hỗ trợ siêu âm, trích ly có hỗtrợ vi sóng, trích ly áp suất thủy tĩnh cao [69]

Kỹ thuật cô điển trong quá trình trích ly chat tan của nguyên liệu dựa vàoviệc lựa chọn chính xác các loại dung môi trích ly có độ hòa tan thích hợp kếthop với sử dụng nhiệt và khuấy đảo Quá trình trích ly hợp chat băng dung môiđược cải tiễn đáng kế bằng cách sử dụng năng lượng sóng siêu âm trong quátrình tách chiết Cơ chế của sóng siêu âm giúp làm tăng khả năng trích ly của cácquy trình trích ly truyền thống là dựa trên việc tạo ra một áp lực lớn xuyên quadung môi và tác động đến tế bào vật liệu; tăng khả năng truyền khối tới bể mặtphân cách; phá vỡ thành tế bào trên bề mặt và bên trong của vật liệu, giúp quátrình thoát chất tan được dễ dàng Tuy nhiên, phương pháp này chỉ có thể ápdụng ở quy mô nhỏ và nhiệt độ sôi của các dung môi đạt được rất nhanh có thểgây nỗ [35]

Tương tự, quá trình trích có hỗ trợ vi sóng ngoài những ưu điểm so vớiphương pháp chiết thông thường thì cũng có những mặt hạn chế như không áp

dụng cho các phân tử không phân cực, khó áp dụng quy mô công nghiệp và nhiệt

độ sôi của dung môi đạt nhanh dễ gây nỗ.Áp suất thủy tĩnh cao (High Hydrostatic Pressure - HHP) là một phươngpháp mới để nâng cao quá trình truyền khối [59] Hiệu suất trích ly caffein từ càphê được tăng cao khi quá trình trích ly được hỗ trợ bởi áp suất thủy tĩnh cao

vanillin [46].

Trên đối tượng trà, các enzyme cũng đã được sử dung dé khai thác các hopchất tự nhiên R Sariri và cộng sự tại Khoa Sinh Học-Irường Dai Hoc Gilan,Iran đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của enzyme cellulase được tách chiết từ chủngnắm Aspergillus cộng sinh với cây trà ở Iran đến chất lượng trà đen Nhóm tácgiả đã tiến hành phân lập chủng Aspergillus, tách chiết thu nhận và tinh sạch

enzyme cellulase (endo- và exo-glucanase, cellobiohydrolase và cellobiase) sau

đó bố sung enzyme cellulase ngoại sinh này vào nguyên liệu trà ở giai đoạn lênmen Dé xác định hiệu quả của việc bố sung cellulase ngoại sinh trên chất lượngtrà đen, nhóm tác giả đã theo dõi các thông số như theaflavin, caffeine, màusắc Kết quả cho thay răng, việc b6 sung cellulase góp phan nâng cao chất lượngtrà về tong chat ran hòa tan, caffeine và chất khô

Năm 2010, Kim JH và cộng sự tại Khoa Thực Phẩm và Công Nghệ SinhHọc-Đại học Hàn Quốc đã sử dung enzyme cellulase từ Aspergillus niger xu lýbã trà xanh dé thu nhận các hop chất hữu cơ Ngày nay, nhu cau tiêu thụ trà xanh

ngày càng lớn và kéo theo đó là bã trà xanh được thải ra ngày càng nhiễu Saukhi khai thác một số hợp chất có hoạt tính sinh học có thể còn tôn tại trong bã trànhư các chất polyphenol và các acid amin Trà xanh được xử lý với các dung môichiết xuất khác nhau như nước lạnh, nước nóng, acid sulfuric, methanol để thudịch Phần bã còn lại sẽ tiếp tục được xử lý với cellulase được tách chiết từAspergillus niger Kết quả thu được là hàm lượng polyphenol, catechin tong sốvà lượng đường khử trong dịch chiết bằng dung môi nước nóng đã tăng lên Đặcbiệt, epigallocatechin, epicatechin, va acid gallic đã được tăng cường đáng kể sovới mẫu đối chứng không được xử lý enzyme Trong bốn dung môi khác nhau,nước nóng và acid sulfuric cho thay khả năng trích ly cao hon các nhóm khác(nước lạnh, methanol) Những kết quả nay chỉ ra rang, cellulase từ Aspergillusniger có thê tăng khả năng trích ly các chất từ bã trà khi kết hợp với một số dung

môi [38].

Năm 2013, Yang-Hee Hong và cộng sự đã sử dụng enzyme dé cải thiện khanăng chiết xuất polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết trà xanh.Trong nghiên cứu này đã cho thay sự gia tăng hiệu quả tách chiết và sự chuyênhóa sinh học của hợp chất catechin sau khi xử lý với nhiều enzyme thương mạikhác nhau Tannase cũng được sử dụng để cải thiện hoạt tính chồng các sốc tựdo của chiết xuất từ trà xanh Hàm lượng polyphenol tong số của dịch chiết trà

xanh thu được sau khi xử lý với Celluclast, Cytolase, Econase, Pectinex,Rapidases, Ultraflo, và Viscozyme tương ứng là 2.45, 2.55, 2.76, 2.48, 2.72,

2.66, và 2.82mg/ml, tăng 4-15% so với dịch chiết trà xanh không xử lý vớienzyme (2.35mg/ml) Hàm lượng flavonoid của chiết xuất trà xanh được xử lý

với Celluclast, Cytolase, Econase, Pectinex, Rapidases, Ultraflo, và Viscozyme

tương ứng là 0.37, 0.42, 0.41, 0.37, 0.42, 0.41, và 0.44mg/ml cao hơn so với mẫuchiết xuất trà xanh không xử lý với enzyme (0.33mg/ml) Hàm lượng polyphenoltong số và flavonoid trong dịch chiết trà xanh được xử lý với Viscozyme cao hơn

SO với các enzyme khác [74].

CHƯƠNG 3

VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu

3.1.1 Nguyên liệu trà xén cànhGiống trà Kim Tuyên 27 được sử dụng trong nghiên cứu này Sau khi thuhoạch dot trà (nguyên liệu chính sản xuất trà Oolong), những bộ phan còn lại củacây trà (lá thứ 3, thứ 4, lá già ) sẽ được cắt tỉa và được gọi là trà xén cành

"Trước xén cành

Hình 3.1: Cánh đồng trà trước và sau khi thu hoạch

Quy trình sản xuất trà Oolong tại nhà máy trải qua 4 công đoạn chính: làm

héo và lên men; xào diệt men; định hình; đóng gói.

C Trà xén cành/đọtPhơi dưới nắng (có lưới che) / thôi ham Ap

Tra đã được làm héoĐưa vào phòng mát } Đảo 2-3 lần, 2-3 giờ/lần

Trà lên men

V Quay thơm 2 lần, mỗi lần cách nhau 3 giờ

Trà sau lên men

Xào diệt men }

Trà Oolong bán thành phẩm PP Nguyên liệu cho nghiên cứu

v Ep dinh hinh va say

Vién tra Oolong

Hình 3.2: Quy trình thu nhận nguyên liệu tra Oolong xén cành

(theo quy trình sản xuất trà Oolong chính phẩm tại nhà máy công ty Câu Tre)Trà xén cành Kim Tuyên 27 sau khi thu hoạch sẽ tiến hành chế biến theođúng như quy trình sản xuất trà Oolong chính phẩm hình 3.2 và kết thúc sau giai

đoạn xào diệt men Bán thành phẩm trà Oolong này là nguyên liệu sử dụng trong

như cellulase, hemicellulase, xylanase; hoạt động ở pH 3.5-5.5 và nhiệt độ

25-55°C.3.1.3 Giống vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật từ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học —

Khoa Công nghệ sinh học - Trường DH Quốc Tế - DH Quốc Gia TP.HCM:

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25213,Enterococcus faecalis ATCC 29212, Methicillin-resistant Staphylococcusaureus (MRSA) ATCC 43300, Candida albicans ATCC 1413.

3.1.4 Hóa chat

Na;HPO,, KH;PO¿, FeSO4, KNaC„HaOs, ethyl acetate, ethylic, natri

hydrocarbonat (NaHCO2), acid oxalic, NaCl, cén, indigocacmin, H,SO, dam đặc,

EGCG, DPPH, methanol, vitamain C.

3.1.5 Thiết bị và dụng cụSử dụng thiết bị và dụng cụ được trang bị trong hệ thống phòng thí nghiệm côngnghệ sinh học Trường ĐH Bách Khoa TP.HCM bao gồm:

Máy cô quay chân không (RE300 Anh)Cân kỹ thuật (CP 22025-Satorius, Đức)Cân phân tích (CP 2245-Satorius, Đức)

Máy nước cất (Anh)Máy đo độ âm 119DAVS MX-50

Máy vortex (USA)

Nồi hap tiệt trùng (HIRAYAMA, HV 110)

Tu cay vi sinhTủ lạnh SANYO

Tú say (MOV-212F SANYO, Nhật)

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Bang 3.1: Các bước tiễn hành thí nghiệmThứ tự Bước thí nghiệm Nội dung tiên hành

Kiểm tra một sô chỉ tiêu của nguyên liệu

trà tươi Kim Tuyên 27 (đọt trà và trà xén

l Khảo sát nguyên liệu cành) và trà Oolong bán thành phẩm được

sản xuât từ hai nguồn nguyên liệu (hình3.2).

Khảo sát điều kiện trích ly

2 polyphenol từ trà Oolongcó bô sung Viscozyme L

Lan lượt khảo sát ảnh hưởng của các đơnyếu tố: ty lệ nước(rà/ nông độViscozyme, nhiệt độ, thời gian, tốc độ lắcđến quá trình trích ly

3 Tôi ưu hóa

Những yếu tô ảnh hưởng chính đến quátrình trích ly sẽ được tối ưu hóa với matran CCD trong Minitab dé xác định đượcđiều kiện trích ly tối ưu nhất — Kiểm trabăng thực nghiệm tại điều kiện trích ly tối

ưu.

Thu nhận cao trà dạngpaste và dạng bột

Đánh giá một số chỉ tiêu đặc trưng

Độ âm, tro

Khao sát nguyên liệu aan PPT chat tan

CN TFTR.tamninđườngkhở

Ỷ Tỷ lệ chiết

Khao sát các yêu tô anh hưởng

Nội dung nghiên cứu } J

Thí nghiệm sang lọc

Tôi ưu hóa ¬ xố Thí nghiệm trung tâm

Thí nghiệm tôi ưu hóaHàm lượng Viscozyme L

Nhiệt độ

Chế độ lắc

Khả năng kháng khuân

Khả năng chống oxy hóa

Hình 3.4: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm

3.2.1 Khảo sát thành phần nguyên liệuTra tươi (dot trà va trà xén cành đã bất hoạt enzyme) và tra Oolong bánthành phẩm (được sản xuất từ dot và tra xén) được xay nhỏ, bố sung tỷ lệ nước1/20 (w/v), đun sôi 10 phút, lọc thu dịch Quá trình chiết được tiếp tục như vậy

cho tới khi nào dịch trà không còn phản ứng màu xanh với FeCl, 5% Hoa chung

các dịch chiết thu được và định mức lên cùng một thể tích dùng dé kiểm tra mộtsố chỉ tiêu của nguyên liệu ban đầu như: hàm lượng chất tan, TF, TR, polyphenoltong, đường khử

3.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hoạt động của enzymeViscozyme trong quá trình trích ly polyphenol từ tra Oolong

Trà Oolong sản xuất từ trà xén cành được xay nhỏ dùng làm nguyên liệucho thí nghiệm Sự phụ thuộc của quá trình trích ly vào điều kiện trích ly đượcđánh giá dựa vào hàm lượng polyphenol tổng thu nhận được trong dịch chiết

Cân chính xác một lượng trà Oolong, bô sung nước và enzyme Viscozyme phù