Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Thu nhận và khảo sát một số tính chất của Protease từ trùn quế (Perionyx Excavatus)

Chúng tôi đ thực hiện đ é tài “Thu nhận và khảo sát một số tinh chat củaprotease từ trim qué Perionyx Excavatus nhằm mục đích đánh giá hoạt độnghệ protease có sẵn trong đường ruột trùn q

TÔNG QUAN

Trun quê có hàm lượng đạm cao, sông va ân nau dưới các thảm thực vật day, dưới viên gạch, hòn đá, các mi éng gô hoặc ngay dưới lớp phân, rãnh m ớc cạnh chuông gia súc, gia cam.

Phan loai: ¢ Ngành: Annelides ¢ Phân ngành: Clitellata ¢ Lớp: Olygochaeta ¢ Họ: Megascocidae ¢ Chi: Pheretima ¢ Loài: Perionyx excavatus

Trùn qué là một trong những gidng trun đã được thuân hóa, nhập nội và dua vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ, dê sinh san, dé bat băng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch.

Hình I.1: Hình thái trùn quế

Trùn qué có kích thước tương đối nhỏ, thân hoi det, bề ngang của con trưởng thành có thể đạt 0,1 — 0,2 em, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn Cơ thể trùn có hình thon dai nối với nhau bởi nhiêu dot, trên moi dot có một vành tơ.

- Co thể trùn có hình thon dài nỗi với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ Trùn qué hô hấp qua da, chúng có kha năng hấp thu oxy va thai CO, trong môi trường nước.

- Kich thước trùn qué trưởng thành từ 10 — 15 em, nước chiếm khoảng 80 — 85%, chất khô khoảng 15 — 20% Hàm lượng các chất (tính trên trọng lượng chất khô) như sau: Protein: 68 —70%, lipid: 7 — 8%, chất đường: 12 —14 %, tro 11 —12%

- Hap thu O, va thai CO, trong môi trường nước Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng amoniac va ure.

- Trin qué rat nhạy cảm, chúng phan ứng mạnh với ánh sáng nhiệt độ va biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn Nhiệt độ thích hợp nhất với trùn qué nam trong khoảng từ 20 — 30°C, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh.

- Trin qué qué rất thích sống trong môi trường 4m ướt và có độ pH ồn định, thích hợp nhất vào khoảng 7.0 — 7.5.

- Trin quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bat kỳ chất thải hữu cơ nào có thé phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm

1.1.3 Sự sinh sản và phát triển - Trin quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối 6n định và có độ âm cao như điều kiện của khu vực phía Nam Từ một cặp ban đầu trong điều kiện sống thích hop có thé tạo ra từ 1.000 —1.500 cá thé trong một năm.

- Trin qué là sinh vật lưỡng tinh, chúng có dai và các lỗ sinh dục năm ở phía đầu của cơ thể, có thể giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con, kén được hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 — 20 trứng, mỗi kén có thé nở từ 2 — 10 con.

- - Khi mới nở trùn con như dau kim có màu trang, dài khoảng 2 — 3mm, sau 5 — 7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một van đỏ thẫm trên lưng Khoảng từ 15 —30 ngay sau, chúng trưởng thành va bắt đầu xuất hiện đai sinh dục và chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản

1.1.4 Các nghiên cứu và ứng dụng trùn quế

Các nước Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc đã nghiên cứu va chiết tách thành công từ trun đất (Lumbricus Rubellus) về lumbrokinase.

Một hướng nghiên cứu khác về sự ổn định và ứng dụng các serine protease của loài trùn Lumbricus Rubellus Kết quả cho thay enzyme này 6n định trong dung dịch đệm Tris-HCI 100mM trong thời gian 5 năm ở nhiệt độ phòng và có khả năng chịu được các dung môi hữu cơ tốt, kế cả toluene va n-hexane và dich thủy phân chính protein của loài trùn đất này và tạo ra dung dịch đạm có thành phần tương tự như nước tương và được ứng dụng làm môi trường nuôi cây vi sinh vật.

Tương tự những nghiên cứu trên, trùn quế ở Việt Nam theo nghiên cứu của PGS-TS Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự ở Viện Khoa học Và Công nghệ Việt Nam nói rằng loài Peryonix Excavatus chữa hàm lượng enzyme thủy phân cao hơn loài giun khác Vi thé các tỉnh phía Nam và đồng bang sông Cửu Long tiến hành nuôi trên quy mô lớn dé cung cấp sinh khối trùn cho chăn nuôi và dich trùn dé bón cây Ngoài ra các tỉnh miền Tây sử dụng nguồn thức ăn trực tiếp từ trùn tươi cho tôm ở giai đoạn âu trùng, tăng sản lượng chăn nuôi.

Phan Thị Bích Trâm, Duong Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm thi Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Thành PhốHồ Chí Minh tiễn hành “ Tinh sạch và khảo sát các đặc tính của serin protease từ

Trùn Quế (2007).” Bước dau tinh sạch sơ bộ bang tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ 30-80%.

Trong nghiên cứu tại đại học Huế (2012) về tạo dòng và phân tích trình tự serin protease của trùn qué Doan cDNA có kích thước 726 bp được tao dòng với vector pCR®2.1 Trinh tự nucleotide của cDNA được so sánh với trình tự của gen lumbrokinase của các loài giun dat Eisenia fetida, Lumbricus bimastus va Lumbricus rubellus có độ tương đồng lần lượt là 52/02%; 50,06% va

PHUONG PHAP NGHIEN CUU

Nguyên liệu trùn được lẫy từ trại chăn nuôi An Phú ở Củ Chỉ

- Coomasie Brilliant Blue, Acid Phosphoric

- _ Hóa chất dùng trong sắc ký lọc gel

2.3 Thiết bị - May đo quang phố UV - Vis - May khuấy từ

- May ly tâm - May do pH

- Bé6n nhiệt, tủ say - _ Hệ thống sac ký cột hãng Biorad

Trun quê mua về còn sông, rửa sạch, loại bỏ tạp chat, xay nhuyén, đem trữ lạnh rôi tiên hành quá trình tôi ưu hóa.

2.4.2 Khảo sát đơn yếu tổ anh hưởng đến hoạt động của protease trong quá trình tự phần

- Trun qué duoc nghién min, xác định ham lượng âm.

- Pha loãng trùn — nước cất từ 11%-15%, b6 sung 0.02% NaN;

- Dé trùn tự phan từ 8-14 ngày.

- - Đánh giá mức tương quan thong qua hàm lượng protein, hoạt tinh protease tong và hoạt tính riêng protease.

2.4.3 Khảo sát đơn yếu tố ảnh hướng đến quá trình thu nhận protease - Ty lệ giữa enzyme và aceton

- Để yên ở nhiệt độ 4°C, trong thời gian 30 phút; 60, 90, 120, 150 phút

- Lay dich đem ly tâm 5000g/10 phút ở 4°C.

- Thu tủa - Hoa tan tủa trong 10 ml đệm phosphate pH 7.4.

- Luu trữ va bảo quản ở 4°C.

- - Xác định ham lượng protein bang phương pháp Bradford và hàm lượng protease bằng phương pháp Anson cải tiến.

Sau đây chúng toi thực hiện toi ưu hóa bằng phan mên Design Expert cho các giá trị don yếu lô trên Design Expert có ưu điểm là có thé phân tích dong thời toi da 999 hàm mục tiêu, cùng với số biến có thé đạt tới 50 biến Design Expert cho phép ta lựa chọn mô hình toán học trong đó có sự tương tác giữa các biến, việc này không làm được trên MS.Excel.

2.4.4 Tối ưu hóa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm ảnh hưởng đến hoạt động của protease trong quá trình tự phân

Dựa vào khảo sát đơn yếu tố mục 2.4.2 chúng tôi chọn giá trị tâm

Hai yếu tổ nồng độ pha loãng và thời gian tự phân được chọn để thực hiện qui hoạch thực nghiệm vi chúng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thu enzyme protease.

16 Áp dụng phần mềm tối ưu hoá Design Expert 8.0.5.2 ta chọn các thông số làm điểm tâm Ở đây chúng tôi không kháo sát yếu tố nhiệt độ vì muốn khảo sát điều kiện tự nhiên tạo điêu kiện thuận lợi cho nhà sản xuât.

Each numeric factor is varied over 5 levels: plus and minus alpha (axial points), plus and minus 1 (fac duplicated for every combination of the categorical factor levels.

Categoric factors: |0 xv | (0 to 10) _) Vertical

Name Units | Low Hinh -alpha +alpha A [Numeric] % 11 15 10.1716 188284

Hình 2.1: Các giá tri tâm điều kiện tự phân protease

@) Enter factor ranges in terms of +/- 1 levels ©) Enter factor ranges in terms of alphas

Center points i alpha = 1.41421 | Options | 13 Runs

Hình 2.2: Giá trị sai số ngẫu nhiên điều kiện tự phân protease Alpha = 1.41421 là giá trị sai số ngẫu nhiên

2.4.4.2 Thông số đấu ra: 3 yếu to

- Ham lượng protein (mg/ml)

- Hoat tinh riéng (U/mg protein)

HLprotein mg/ml _HT protease U/ml

Hình 2.3: Lựa chọn giá trị đầu ra điều kiện tự phân protease

Hình 2.4: Ma trận quy hoạch thực nghiệm điều kiện tự phân protease

Chúng tôi thực hiện 13 nghiệm thức với các điều kiện như trên

2.4.5 Tối ưu hóa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm điều kiện thu nhận

Dựa vào khảo sát đơn yếu tố mục 2.4.3 chúng tôi chọn giá trị tâm

- Hai yếu tố tỷ lệ enzyme và aceton, thời gian được chọn để thực hiện qui hoạch thực nghiệm vì chúng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất chiết enzyme protease. Áp dụng phần mém tối ưu hoá Design Expert 8.0.5.2 ta chọn các thông sô làm diém tâm

Name Units | Low High -alpha +alpha

A [Numeric]} |*/ 3\Ä4/ ,Š:/\©ẤUJŸ |, 16.7 50 9.80334 56.8967 B [Numeric] |Thoi gian phut 30 150 5.14719 174.853

Hình 2.5: Các giá tri tâm điêu kiện thu nhận protease

@) Enter factor ranges in terms of +/- 1 levels Enter factor ranges in terms of alphas

Center points 5 alpha = 1.41421 Options 13 Runs

Hình 2.6: Giá tri sai số ngẫu nhiên điều kiện thu nhận protease 2.4.5.2 Thông số dau ra: 3 yếu to

- Ham lượng protein (mg/ml)

- Hoat tinh riéng (U/mg protein)

HL protein mg/ml HT protease U/ml HT riéng U/mg

Hình 2.7: Lựa chọn giá trị đầu ra điều kiện thu nhận protease

Hinh 2.8: Ma tran quy hoach thuc nghiém điều kiện thu nhận protease

Chúng tôi thực hiện 13 nghiệm thức với các điều kiện như trên

2.4.6 — Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bên nhiệt 2.4.6.1 Xác định nhiệt độ toi wu

Các phân đoạn enzyme sau khi được tinh sạch, hòa tan trong đệm phosphate pH 7.4.

Khảo sát hoạt động của các phân đoạn enzyme ở các nhiệt độ khác nhau 20, 37, 45, 50, 60, 80°C trong 10 phút Xác định các hoạt tính enzyme tại các nhiệt độ khác nhau bằng phương pháp Anson cải tiến.

2.4.6.2 Xác định độ bên nhiệt

Các phân đoạn enzyme sau khi được tinh sạch, hòa tan trong đệm phosphate pH 7.4.

Khảo sát hoạt động của các phân đoạn enzyme ở các nhiệt độ khác nhau 37, 45, 50, 60, 80°C trong 3h Xác định các hoạt tinh enzyme tại các nhiệt độ khác nhau băng phương pháp Anson cải tiến.

2.4.7 Xác định pH tối ưu và độ bền pH 2.4.7.1 Xác định pH toi wu

Cac phân đoạn enzyme sau khi được tinh sạch được khảo sat ở các giá tri pH khác nhau 2, 4, 6, 8, 10, 12 với các dung dịch đệm glycine —HCI (2-4), phosphate (6-8), Tris-HCI (9-10), glycine-NaOH(10-11), KCI-NaOH(12-13)

Enzyme được khảo sát ở các pH nói trên trong 30 phút, do hoạt tinh enzyme bang phương pháp Anson cải tiến.

2.4.7.2 Xác định độ bên pH

Các phân đoạn enzyme được khảo sát ở pH từ 2-13 trong 16h ở 4°C Sau đó đưa về pH 7, xác định hoạt tính enzyme băng phương pháp Anson cải tiến.

Hoạt tính tương đối là giá trị hoạt tính cao nhất trong dãy thông số nghiên cứu

2.4.8 Tinh sạch băng sắc ký lọc gel 2.4.8.1 Thiết bị:

- _ Cột loc gel đường kính 2em, chiều cao 25cm (Bio Rad, Mỹ).

- _ Bộ phận thu mẫu Model 2110 (Bio Rad, Mỹ).

- Bom Econo Gradient (Bio Rad, Mỹ).

- Bio Gel P-30 (Bio Rad, Mỹ).

- Dung dich dém phosphate pH 7.4

Bảng 2.1: Dac điểm gel sử dung

Gel Kích thước : on Bf ở Tôc độ chảy | Khoảng phân e Sau tr nN hat (um ) (cm/gis) | doan (KDa)

2.4.8.3 Thông số - _ Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

- Phan đoạn: 3 ml/phan đoạn.

- A280: Độ hấp thụ protein ở bước sóng 280 nm

- Tinh hàm lượng protein, hoạt tính, hoạt tính riêng của các peak

2.4.9 Có định enzyme - _ Nông độ glutaradehyde 25%.

- Kha năng tái su sung.

2.5.1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford Chuẩn bị dung dịch mau Albumin chuẩn 1.5mg/ml.

Cách pha dung dich Albumin: cân chính xác 0.075g pha trong 50ml NaCl

0.15M, lac đều cho tan hết và giữ ở 20°C Khi sử dụng pha loãng được nông độ Albumin chuẩn 0.25mg/ml, 0.5mg/ml, 0.75mg/ml, Img/ml và 1.5mg/ml.

+ Cân 0,1g Coomassie Brilliant Blue vào 50ml Ethanol 96°, pha loãng với nước cất thành 5000ml: dung dich (1)

+ 100ml acid phosphoric 85%, pha loãng trong nr ớc cất thành 500ml: dung dịch (2)

+ Pha dung dich (1) + dung dịch (2) > lọc lay dịch trong Dựng đường chuẩn bang cách đo OD tại các nồng độ khác nhau như trên của albumin, trộn Iml albumin với 5ml dd Bradford Lắc đều va dé yên hỗn hop phan ứng tối thiểu trong vòng 5 phút (tối đa không quá 1 giờ) ở nhiệt độ phòng trước khi đo bang máy quang phố ở bước sóng 595nm.

Chuẩn bị ống thí nghiệm:

Ong thí nghiệm: Im] dd protein + 5ml dd Bradford Ông đối chứng: Iml NaCl 0.15M + 5ml dd Bradford Đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm và ghi nhận mật độ quang (mật độ quang phải nam trong khoảng của đường chuẩn).

Hàm lượng protein = b*10°*L/m b: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (mg/ml) L: Thể tích pha lodng(ml) m: Lượng mẫu enzyme đem xác định hàm lượng (mg hoặc ml) (1 ml) 2.5.2 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp đo quang pho Nguyên liệu: dung dich protein dé do, đệm hòa tan protein, cuvet thạch anh Quy trinh duoc thuc hién gồm các bước sau:

Bước 1: Ly tâm mẫu dé loại bỏ các phân tử khác có thé trong huyền phù, lẫy dịch nỗi ( Đối với protein qua sắc ký lọc gel có thé dùng được ngay)

Bước 2: Do máy quang phố ở bước sóng 280nm và điều chỉnh độ hấp thụ về

Bước 3: Do mẫu và đọc độ hấp thụ của mẫu Nếu giá tri >2.0 thì pha loãng mẫu (1/5 hoặc 1/10)

Bước 4: Lặp lại bước 2 và bước 3 ở bước sóng 260nm.

Bước 5: Tính tỉ số hấp thụ 260nm/280nm Tỉ số này Solution, chọn ra phương pháp tối ưu theo thực nghiệm

Lower Upper Lower Upper Name Goal Limit Limit Weight Weight Importance A:Ty le pha loz ¡is in range 11 15 1 1 3 B:Thoi gian is in range 8 14 1 1 3

Number Ty le phaloar Thoigian* Desirability

Hình 3.7: Phương pháp tối ưu theo thực nghiệm điều kiện tự phân cua protease

Nhận xét: từ kết quả hình 3.7đã đưa ra nhiều phương án lựa chọn thuận lợi cho người sản xuất tối ưu, thuận lợi lựa chọn cho người sản xuất dich trùn Đánh giá mức độ hoạt động protease, xây dựng phương trình hồi quy xác định hoạt tính riêng protease(Y) như sau:

Voi A=Nông độ pha loãng (%), B= Thời gian(ngày)

Nông độ pha loãng trùn ban đầu va thời gian là yếu tố ảnh hưởng dương đối với cơ số bậc một và ảnh hưởng dương đối với cơ số bậc hai của hàm mục tiêu. Điều này có ngiĩa là ho ạt tính riêng protease được tổng hợp sẽ tỷ lệ thuận với tỷ lệ pha loãng và thời gian.

Giá trị cực đại theo kết quả quy hoạch thực nghiệm là 13%, 11 ngày Trong khi đó kết quả khảo sát đơn yếu tổ là 13%,10 ngày Cho thay sự khác nhau về thời

36 gian, qua đó cho thay phần mém quy hoạch thực nghiệm đưa ra giá trị tối ưu mà khảo sát đơn yếu tổ không thực hiện (do chọn bước nhảy lớn).

Do chúng tôi chỉ khảo sát yếu tố pha loãng và thời gian nên nếu muốn sản xuất qui mô lớn hon thì phải khảo sát thêm các yếu tố khác như nhiệt độ, pH dé đạt giá trị và hiệu quả cao hơn

3.5 Tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm (phần mềm

Design Expert 8.0.5.2) của giai đoạn thu nhận protease

Ap dụng phần mém tối ưu hoá Design Expert 8.0.5.2 ta chọn các thông số làm điểm tâm từ kết quả đơn yếu t6 ở mục 3.3 e Kết quả chương trình khảo sát theo bố trí thí nghiệm theo chương tình ở mục 2.4.5

Hình 3.8: Kết quả thực nghiệm điều kiện thu nhận protease theo ma trận quy hoạch

Nhận xét: từ kết quả hình 3.9, hoạt tính protease và hoạt tính riêng đạt cao nhất ở ty lệ 33% trong 90 phút.

Sau khi thu nhận kết quả, Mục Summary, xem xét có cần thay đôi hàm mục tiêu không.

Study Type Response Surface Runs 13 Design Type Central Composite Blocks No Blocks Design Mode Quadratic Build Time (r 1.73

Factor Name Units Type Subtype A Dich trun-dung % Numeric Continuous B Thoi gian phut Numeric Continuous

Response Name Units Obs Analysis Y1 HL protein mg 13 Polynomial Y2 HT casein U 13 Polynomial Y3 HTR U/mg 13 Polynomial

Hình 3.9: Hộp thoại Design Summary điều kiện thu nhận protease

Trong cột Trans có giá tri None, nên không cân thay đôi ham mục tiêu

Trans Model None 2FI None Quadratic None Quadratic

Tiếp theo Analysis xem kết quả khứ hồi và phân tích phương sai ở trong mục

Response 3 HTR ANOVA for Response Surface Quadratic Model Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III]

Sum of Source Squares Model 185.77 A-Dich trun-dung ni 48.70 B-Thoi gian 7.62 AB 6.40 A? 111.78 B? 23.01 Residual 15.35

23.01 ¡Mà aa aw aw am 8 2.19

Hình 3.10: Hộp thoại Anova điều kiện thu nhận protease

Trong mục F Value giá tri 16.94 Sai lệch khoảng 16.94% so với sai lệch thực tế và Prob>F =0.0009 nhó hơn 0.05 Nên môìhh nay phi h_ op với quy luật thực nghiệm.

Std Dev 1.48 R-Squared 0.9237 Mean 11.00 Adj R-Squared 0.8692 CV % 13.47 Pred R-Square 0.4598 PRESS 108.64 Adeq Precisior 11.415

Hình 3.11: Giá trị hệ số tương quan R-Squared điều kiện thu nhận protease e Phương trình hồi quy được biểu diễn dưới dang dé thị đáp ứng bề mặt

Hình 3.12: Dé thị đường cong biểu thi mối tương quan giữa thời gian-ty lệ dịch trun và aceton

LALA 2542 0.2874 LTP LOL LL LL abd

LETS Fags) rag IR 40-12, vớ,

Hình 3.13: Đồ thi đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ thời gian-ty lệ dich trun và aceton

Nhận xét: Dựa vào hai đồ thị trên, cho thay gia tri cuc dai cua hoat tinh riéng protease ở ty lệ dich trun — dung môi là 1:2( tương ứng 33.35%) va 90 phút.

Trong mục Numerical > Solution, chon ra phương pháp tối ưu theo thực nghiệm

Solutions Number Dichtrun-dur Thoigian* Desirability

Hình 3.14: Phương pháp tối ưu theo thực nghiệm điều kiện thu nhận protease

Từ đó xây dựng phương tinh h ồi qw xác định hoát tính riêng protease

Với A=Ty lệ dich trùn-dung môi (v/v), B= Thời gian (phút)

Ty lệ dịch trùn-dung môi và thời gian là yếu tố ảnh hưởng dương đối với cơ số bậc một và ảnh hưởng dương đối với cơ số bậc hai của hàm mục tiêu Điều này có nghĩa là hoạt tính riêng protease được tổng hợp sẽ tỷ lệ thuận với tỷ lệ dịch trùn-dung môi và thời gian.

Trong quy hoạch thực nghiệm xác định điểm tối ưu cho giá trị hoạt tính riêng protease cao nhất tại tỷ lệ dịch trùn-aceton là 1:2, 90 phút; giá trị phù hợp với khảo sát đơn yếu tô về tỷ lệ dịch trùn-aceton, thời gian thu nhận ngăn hon, cần phải khảo sát sâu hơn giữa thực nghiệm và phần mềm tối ưu hóa; phải khảo sát thêm các yếu tố ảnh hưởng khác như nhiệt độ pH.

3.6 Khao sát các yếu tổ nhiệt độ, pH đến protease trùn

3.6.1 Khảo sát nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng đến hoạt tính protease

Sau khi thu được enzyme thô trên, ta di khảo sat ở các nhiệt độ khác nhau:

20°C, 37°C, 45°C, 50°C, 60°C, 80°C, xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp

Khi nhiệt độ phản ứng tăng từ 20°C đến 50°C thì hoạt tinh protease cũng tăng cao Hoạt tính đạt cao ở nhiệt độ 45°C đến 60°C là 100%: có hoạt tình riêng lần lượt là 20.1 U/mg, 20.4 U/mg, nhưng khi nhiệt độ lên đến 80°C chỉ đạt 69% Theo xử lý số liệu nhiệt độ tối ưu của protease là 45°C Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó, nhiệt độ hoạt động khá cao từ 50°C đến 60°C, tuong tu két quả nghiên cứu Lumbricus rebullus ở Han Quốc va Nhat Ban (2003) là 50°C.

100 Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính protease

3.6.2 Khảo sát nhiệt độ phản ứng đến độ bền protease

Thời gian(p) Đồ thị 3.6: Khao sát độ bién nhiệt của protease

Nhiệt độ 37°C , hoạt tinh protease đạt cao nhất, không thay đôi trong khoảng thời gian đến 120 phút Méc nhiệt độ 45°C, 50°C, 60°C hoạt tính profease giảm dần theo thời gian Ở nhiệt độ 80°C hoạt tính giảm nhiều sau 40 phút (26%) và mất hoàn toàn sau 80 phút ( Xem chỉ tiết phụ lục 6)

Khi gia tăng nhiệt độ với thời gian kéo dài hoạt tính protease giảm dần nhưng vẫn chịu ở mức nhiệt độ đến 60°C, điều này rất có ý nghĩa trong sản xuất

3.6.3 Khảo sat pH anh hưởng đến hoạt tinh protease

Sau khi thu nhận enzyme, khảo sat hoạt tinh enzyme ở các phân đoạn pH khác nhau từ 2-12, ủ trong 30 phút ở 60°C.

Hoạt tính phân hủy mạnh ở pH trung tính, pH tối ưu đạt cao nhất ở pH 6 lá 23.1 U/mg Hoạt tính mạnh của enzyme này ở pH trung tính rất thuận lợi ứng dụng về sau trong y học, enzyme này có thể phân giải các loại các cục máu đông trong cơ thể người Hoạt động tốt ở pH từ 6-10 phù hợp với nghiên cứu của Phan Thị Bích

Trâm và nghiên cứu của Lý Thị Bích Thủy (2006) là pH 6.5.

Hoạt tính tương đối (%) fo) pH Đồ thị 3.7: Anh hưởng của pH đến hoạt tinh protease

3.6.4 Khảo sát pH anh hưởng đến độ bền hoạt tính protease

Sau khi thu nhận enzyme, khảo sát hoạt tính enzyme ở các phân đoạn pH khác nhau từ 2-12, ủ trong 16 giờ ở 40C. Ở pH 2-3, enzyme mat hoạt tính hoàn toàn Enzyme vẫn giữ kha năng phân giải protease ở pH từ 6-12, ở pH 12 hoạt tính còn 57%, protease này bền trong khoảng pH tối ưu của nó Điều này khác biệt so với kết quả của Lý Thị Bích Thủy (2006), protease hoạt động và bén ở pH trung tinh, ở đặc tính bền tương tự kết quả nghiên cứu Lumbricus rebullus ở Hàn Quốc và Nhật Bản từ 6-10.

2 4 ông - 10 12 Đồ thị 3.8: Khao sát độ bền pH của protease

3.7 Tinh sach protease bang sac ky loc gel

Nong độ protein(mg/ml)

D6 thi 3.9: Biéu dé loc gel

Nguyên tắc: dựa vào phương pháp xác định hàm lượng protein theo phương pháp đo quang phô.

Ta thu được hai peak Peak1: Ong 5-9 Peak 2: Ong 14-15 Chúng tôi xác định có hai loại protein Kiểm tra hoạt tính riêng của hai peak lần lượt là 16.9 U/mg,

Nhận xét: Sau quá trình lọc gel thu được hai loại protein, có ít nhất hai loại protease có hoạt tính riêng lần lượt là 16.93 U/mg và 19.92 U/mg.

Bảng 3.2: Kết quả lọc gel của dịch trùn sau tự phân

HL Protein Hoat tinh Hoạt tinh | Hiệu su até)

DD enzyme (mg/ml) protease riêng sau lọc gel (U/ml) (U/mg)

Nhận xét: trong điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi thực hiện sắc ký lọc gel đối với mẫu chế phẩm protease tách được hai peak Sau khi xác định hoạt tính protease của hai peeak, trong chế phẩm protease có ít nhất hai loại protease với hoạt tính riêng lần lượt là 16.93, 19.92 U/mg.

Sau lọc gel peak 1 có hoạt tính riêng cao gấp 1.01; peak 2 có hoạt tính riêng cao gấp 1.19 so với hoạt tính riêng trước lọc gel(16.69 U/mg)

3.8 Có định enzyme bằng phương pháp CLEA

KIÊN NGHỊ

Khao sát đơn yếu tổ ảnh hưởng đến hoạt động protease trong quá trình tự phan, hoạt tính riêng protease cao nhất sau 10 ngày, nông độ pha loãng là 13% trong nước cất, là 0.21 U/mg.

Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến việc thu nhận protease, hoạt tính riêng protease cao nhất ở tỷ lệ dịch trùn-aceton va thời gian tủa là 1:2, 120 phút, 16.7

Thông qua quá trình tinh sạch sơ bộ bằng xác định yếu tô đơn và thông qua phân mềm tối ưu hóa Design Expert, kết quả tối ưu tương ứng tương đương nhau do chọn các giá tri tâm tương ứng, xoay quanh giá tri trung tam d thông qua th ử nghiệm đơn yêu tô, xác định giá tri cực đại

- - Điều kiện hoạt động protease trong quá trình tự phân: Nông độ pha loãng là

- _ Điều kiện thu nhận enzyme: Tỷ lệ dịch trùn-dung môi là 1:2 (v/v), thời gian là 90 phút

Nhiệt độ tối ưu hoạt động cua protease trun qué la 45°C Enzyme hoạt động ở pH tốt nhất là 6.

Sắc ký lọc gel tách được hai loại protease có hoạt tính riêng lần lượt là

Bước đầu thu nhận protease dưới dang CLEA ở điều kiện glutaraldehy de 25% ,thời gian cô định 3 giờ.

- Khao sát thêm các yếu tô khác ảnh hưởng đến hoạt tính protease của trùn qué - Can thời gian tiễn hành nghiên cứu khả năng tái sử dung enzyme.

TAI LIEU THAM KHAO

Ly Thị Bích Thủy, Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Thi Ngọc Dao (2006), Tinh sạch và xác định một số tính chất của enzyme thủy phân fibrin được tách chiết từ loài trim qué (Perionyx Excavatus), Tạp chi sinh học 28(3):77-82.

Nguyễn Van Mui (2001), Hóa sinh hoc, Nhà xuất ban Dai Hoc Quốc Gia Hà

Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường (2003), Thi nghiệm Hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội.

Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, Nhà sản xuất Đại Học Quốc

Nguyễn Tiến Thắng (2003), Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học, Viện sinh học Nhiệt Đới Tp.HCM

Nguyễn Tiến Thang (2004), Giáo trình công nghệ enzyme, Tủ sách trường Dai

Nguyễn Hữu Chan (1996), Enzyme và xúc tác sinh hoc, Nha xuất bản Y hoc

Phan Thị Bích Trâm (2010), Nghiên cứu hệ protease của trim qué (Perionyx Excavatus) trong quá trình tự phân và ứng dung, Luân án tiễn 3 Hóa sinh trường Đại Học Khoa học tự nhiên Tp.HCM.

Phạm Thị Ánh Hồng (2003), KY thuật sinh hóa, Nhà xuất bản Đại Học Quốc

Trần Thị Hồng Thúy, Nguyễn Trần Giáng Hương (2003), Nghiên cứu một số tác dung được lý của Địa long dé ứng dụng điều trị bệnh tăng huyết áp, Tap chí dược học,325.

Thái Tran Bái, Nguyễn Văn Cảnh (2004), Van dé sử dung trùn đất làm thuốc trong nhán dan Việt Nam va Lao, Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc.

Bradford, MM, A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the priciple of protein-dye binding, Analytical Biochemistry 72:248-254,1995.

Cho IH, Choi ES, Lim HG, Lee HH (2004), Purification and Charactization of six fibrinolytic serin-protease, Biochemistry and Molecular Biology, Vol 199- 205.

Holtzehauer M.Basic (2006) Methods for Biochemical Lab Springer

Nakajima N, Mihara H, Sumi H (1993), Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus Rubellus, Bosci Biotechnol Biochem.

Yang J.S, RuB.G (1999), Puration and Characterization of an SDS- activated fibrinolytic enzyme from Esienia Fetida, European Journal of

Phụ lục A: Số liệu tính toán

1 Đồ thị chuẩn Albumin của phương pháp Bradford Bang 1: Số liệu xây dựng đường chuẩn Bradford

Nong độ protein(ug/mil) Đồ thị 1: Đường chuẩn protein Albumin

Từ kết quả đo OD của BSA chuẩn ở bước sóng A595nm trên máy quang phố, tôi sử dụng phần mén xử lý số liệu thống kê Excel để xây dựng đường chuẩn và phương tình tuy ến tính y=ax+b để xác định chính xác nồng độ protein trong phản ứng.

Phuong tỉnh đư Ong chuẩn thu được bình ptong h ệ số tương quan R’=0.975 dam bao mức độ tuyến tính và xác suất tin cậy của phương trình

2 Đồ thị chuẩn của Tyrosin cia phương pháp Anson cải tiến Bảng 2: Số liệu xây dựng đường chuẩn tyrosin

0.4 0.6 0.8 | L5 tyrosin (umole) Đồ thị 2: Đường chuẩn tyrosin 3 Thông số ban đầu của dung dịch trùn quế

Bảng 3: Khảo sát hàm lượng chất khô của trùn ban đầu

Chú thich:ky tu a cho thay không có sự khác biệt giữa các mẫu

Các gia tri số liệu dưới đây thực hiện lặp lại 3 lần và xử lý bang Anova cho sai số nho hon 0.05

4 Anh hưởng của tỷ lệ pha loãng, thời gian thu nhận a) Hàm lượng protein trong mẫu pha loãng

Bảng 4: Kết quả hàm lượng protein trong mẫu pha loãng

Tỷ lệ pha | Thời gian thu loãng nhận b(ug/ml) | protein(mg/ml)

Bảng 5: Giá trị Anova của hàm lượng protein trong mẫu pha loãng

Anova: Two-Factor Without Replication SUMMARY Count Sum Average Variance

8 ngay 5 0.480002 0.096 0.000777 10 ngay 5 0.856634 0.171327 0.00612 12 ngay 5 0.573903 0.114781 0.001257 14 ngay 5 0.516553 0.103311 0.000549 ANOVA

Source of Variation SS df MS FP P-value F crit Rows 0.02763 4 (0.006908 11.4916 0.000137 3.006917 Columns 0.025928 4 0.006482 10.78364 0.000196 3.006917 Error 0.009617 16 0.000601

Nhận xét: Giá trị F(row-thời gian)>F crit(3.006917): thời gian ảnh hưởng đến hàm lượng protein trong mẫu pha loãng

Giá trị F(column-ty lệ pha loãng)>F crit(3.006917): tỷ lệ pha loãng ảnh hưởng đến hàm lượng protein trong mẫu pha loãng

54 b) Hoạt tính protease trong mẫu pha loãng Bảng 6: Kết quả hoạt tính phân giải protease trong mẫu pha loãng

Tỷ lệ Hoạt tính pha Thời gian thu | umole protease Hoat tinh loãng nhận tyrosin | (U/ml) riéng(U/mg)

Bảng 7: Giá trị Anova của hoạt tính protease trong mẫu pha loãng

Source of Variation SS df MS FP P-value F crit Rows 0.02763 4 (0.006908 11.4916 0.000137 3.006917 Columns 0.025928 4 0.006482 10.78364 0.000196 3.006917 Error 0.009617 16 0.000601

Nhận xét: Giá trị F(row-thời gian)>F crit(3.006917): thời gian anh hưởng đến hoạt tính protease trong mẫu pha loãng.

Giá trị F(column-ty lệ pha loãng)>F crit(3.006917): ty lệ pha loãng ảnh đến hoạt tính protease trong mẫu pha loãng.

Bảng 8: Giá trị Anova của hoạt tính riêng protease trong mẫu pha loãng

Anova: Two-Factor Without Replication

SUMMARY Couníi Sum Average Variance

Source of Variation SS df MS FP P-value F crit Rows 0.007361 4 0.00184 7.440755 0.001385 3.006917 Columns 0.022574 4 0.005643 22.81956 1.91E-06 3.006917 Error 0.003957 16 0.000247

Giá trị F(row-thời gian)>F crit(3.006917): thời gian anh hưởng đến hoạt tinh riêng protease trong mẫu pha loãng.

Giá trị F(column-ty lệ pha loãng)>F crit(3.006917): ty lệ pha loãng ảnh hưởng đến hoạt tính riêng protease trong mẫu pha loãng.

5 Anh hưởng giữa dung môi và dịch trùn, thời gian thu nhận a) Hàm lượng protein thu được khi kết tủa:

Bảng 9: Kết quả hoạt tính phân giải protease thu được khi kết tủa

Ty lệ dịch|Thời gian trựn- aceton | thu nhận b(ug/ml) | m](ứ) | protein(mg/ml)

Bảng 10: Giá trị Anova của hàm lượng protein thu được khi kết tủa

Source of Variation SS df MS FP P-value F crit Rows 0.114559 4 0.02864 4.401884 0.013701 3.006917 Columns 0.017929 4 0.004482 0.68893 0.610144 3.006917 Error 0.1041 16 0.006506

Total 0.236588 24 Nhận xét: F(ty lệ dich trùn-dung mô!) < F crit: ty lệ dịch trun-dung môi không anh hưởng đến hàm lượng protein trong quá trình thu nhận

F( thời gian thu nhận) > F crit: thời gian thu nhận ảnh hưởng đến ham lượng protein trong quá trình thu nhận b) Hoạt tính protease thu được khi kết tủa:

Bảng 10: Kết quả hoạt tính phân giải protease thu được khi kết tủa

Ty lệ dịch trùn- | Thời gian | umole protease Hoat tinh aceton thu nhan tyrosin (U/ml) riêng(U/mg)

Bang 11: Giá tri Anova hoạt tinh protease thu được khi kết tủa

SUMMAR Y Count Sum Average Variance

Variation SS df MS FP P-value F crit

Total 43.78805 24 Nhận xét: F(ty lệ dich trùn-dung môi) > F crit: ty lệ dich trùn-dung môi anh hưởng đến hoạt tinh protease trong quá trình thu nhận

F( thời gian thu nhận) > F crit: thời gian thu nhận ảnh hưởng đến hoạt tính protease trong quá trình thu nhận

Bảng 12: Giá trị Anova hoạt tính rieng protease thu được khi kết tủa

SUMMAR Y Count Sum Average Variance

ANOVA Source of P- Variation SS df MS value Fcri Rows 285.7476 4 71.4369 21.58202 !.77E-06 3.006917 Columns 39.7925] 4 9.948127 3.007459 ).050073 3.006917 Error 52.96032 16 3.31002

Nhận xét: F(ty lệ dịch trùn-dung môi) > F crit: tý lệ dịch trùn-dung môi ảnh hưởng đến hoạt tính riêng protease trong quá trình thu nhận

F( thời gian thu nhận) > F crit: thời gian thu nhận ảnh hưởng đến hoạt tính riêng protease trong quá trình thu nhận

6 Khảo sát nhiệt độ tối ưu Bảng 13: Kết quả nhiệt độ tối ưu umole | Hoạttính Hoạt tính Nhiệt độ tyrosin | protease(U/ml) | riêng(U/mg)

7 Khao sat d6 bén nhiét Bang 14: Két qua do bén nhiét

Thoi umole Hoat tinh Hoat tinh gian(p) tyrosin protease(U/ml) | riéng(U/mg)

Thời gian umole Hoạt tính Hoạt tính

(p) | tyrosin protease(U/ml) | riéng(U/mg)

8 Biéu đồ lọc gel Bang 15: Kết quả biểu đồ lọc gel Ống nghiệm | 1-5 : 7 § | 1 HỘ 0L 4

Bang 16: Ham lượng protein của các peeak thu được b(ug/ml) | protein(mg/ml) peak 1 18.78 0.0188 peak 2 22.34 0.0223

Phụ lục B: Các phương pháp phân tích

1 Phương pháp Bradford Định nghĩa

Protein được định lượng bang phương pháp Bradford là protein tan trong dung dịch Vì vậy, muốn xác định hàm lượng protein một mẫu ta phải trích ly protein Hàm lượng protein xác định sẽ phụ thuộc vào hiệu quả trích ly (khả năng hòa tan của protein trong dung môi trích ly).

Phương pháp nay dựa trên sự thay đổi bước sóng hap thu cực dai của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dich mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hap thu cực dai 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nông độ protein.

Dé xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dich protein chuẩn đã biết trước nông độ Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA) Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bên tới 1 giờ Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch băng máy quang pho kế 13

3asic and Aromatic Na0;$ S0;- Side Chains Xằ À

Hình 1: Phan ứng cho mau Coomassie