-Tổng quan về tình hình kháng kháng sinh của Helicobacter pyloriđối với các loại kháng sinh nói chung và kháng sinh đi đầu Clarythromycin nói riêng.Tìm hiểu các nghiên cứu ở Việt Nam cũn
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Bệnh lý dạ dày -tá tràng, bao gồm viêm dạ dày-tá tràng, loét dạ dày-tá tràng, ung thƣ dạ dày, ung thƣ tá tràng, là một trong những vấn đề sức khỏe của xã hội hiện đại
Viêm loét dạ dày là một bệnh thường gặp ở Việt Nam cũng như trên thế giới Tỉ lệ viêm dạ dày nói chung từ 50%-60% trong các bệnh lý dạ dày, tá tràng [25] Viêm dạ dày mãn tính là một bệnh tiến triển tiềm tàng cùng với tuổi của bệnh nhân Theo một nghiên cứu ở Phần Lan, có tới 80% những người trên 50 tuổi bị viêm dạ dày mãn tính ở các mức độ khác nhau và khoảng 50% có viêm teo dạ dày Với những người trên 65 tuổi, tỉ lệ viêm teo nặng thân dạ dày là 6% [28] Ở Việt Nam, các tác giả cũng cho thấy viêm dạ dày mãn tính chiếm tỉ lệ cao nhất tới 51% ở lứa tuổi 30-49 tuổi [8] Nguy cơ ung thƣ dạ dày ở những đối tƣợng có viêm teo nặng vùng thân vị cao hơn 5 lần so với những người cùng tuổi trong cộng đồng, Khoảng 10% những người này sẽ tiến triển thành ung thư dạ dày trong vòng 10 năm sau Nguy cơ ung thư dạ dày còn cao hơn ở những trường hợp viêm teo nặng hang vị và cao nhất ở viêm teo nặng toàn bộ dạ dày Những nghiên cứu dịch tễ học ở Nhật Bản cũng cho thấy tiêm teo hang vị có liên quan đến sự phát triển của ung thƣ biểu mô dạ dày
Hình 1.1 Các dấu hiệu viêm loét dạ dày ban đầu
Vi khuẩn Helicobacter pylori là một trong những tác nhân ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình viêm loét dạ dày Theo thống kê mới nhất của Viện tiêu hóa Việt Nam, có tới 70% người trưởng thành nhiễm vi khuẩn này Vi khuẩn Helicobacter pylori là dạng xoắn khuẩn hình chữ S, sau khi xâm nhập vào cơ thể, chúng chui vào lớp nhầy bảo vệ niêm mạc dạ dày Tại lớp nhầy bảo vệ niêm mạc dạ dày, chúng tiết ra một số chất làm kích thích dạ dày tiết acid nhiều hơn nên lƣợng acid dƣ thừa lớn là yếu tố dẫn tới viêm loét dạ dày
Không chỉ vậy, vi khuẩn Helicobacter pylori còn làm suy yếu lớp chất nhầy bảo vệ niêm mạc dạ dày bằng cách tiết ra độc tố làm tổn thương các tế bào nằm dưới lớp chất nhầy Do vậy, những tế bào bị tổn thương này càng dễ dàng bị acid dư thừa phá hủy, lâu ngày dẫn tới viêm loét dạ dày
Nhiễm H pylori là một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất ở người Đường lây nhiễm chủ yếu là đường ăn uống (phân- miệng) hoặc lây trực tiếp (miệng-miệng) qua nước bọt Ở nững nơi có điều kiện vệ sinh kém, nguồn lây lan quan trọng là nước và thức ăn bị nhiễm khuẩn [1]
Một số nghiên cứu trong nước cho biết tỉ lệ nhiễm H pylori ở Việt Nam khoảng 60-70%, thuộc vùng có tỉ lệ nhiễm H pylori cao Ở Việt Nam, các nghiên cứu cho thấy viêm dạ dày mãn tính chiếm tỉ lệ 51% ở lứa tuổi từ 30-49 tuổi [4], [7], [12] Đi sâu nghiên cứu về mặt sinh học phân tử của H pylori , nhiều tác giả đã phát hiện rằng những chủng H pylori mang gene cagA(+) (cytotoxin associated gene A) gây độc tế bào, thường chiếm tỉ lệ rất cao trong các thể bệnh nặng như loét dạ dày tá tràng, viêm teo, dị sản ruột, loạn sản, ung thƣ dạ dày Nếu các chủng H pylori có cả gene cag A(+) và gene vacA(+) (vacuolatinh cytotoxin gene A), gene gây rỗng tế bào, thì khả năng gây bệnh càng cao hơn Những chủng có biểu hiện đồng thời của cả CagA và VacA có vai trò gây bệnh rõ rệt, những chủng này đƣợc gọi là chủng độc [5]
Hiện nay trong điều trị viêm loét dạ dày-tá tràng, ngoài sử dụng thuốc kháng tiết, người ta còn dùng kháng sinh để tiêu diệt căn nguyên vi khuẩn H pylori , thường dùng 2 loại kháng sinh phối hợp nhƣ Metronidazol hoặc Tinidazol với Amoxicilline hoặc Clarithromycin thì hiệu quả tác dụng tốt hơn là dùng một loại [3], [4], [8]
Thực tế điều trị cho thấy vi khuẩn H pylori , cũng nhƣ các loại vi khuẩn khác , sau một thời gian nhạy cảm với kháng sinh, đã có tình trạng kháng thuốc.Vi khuẩn H pylori có khả năng kháng rất nhanh với những thuốc kháng sinh đƣa vào điều trị, ở cả in vivo và invitro Do vậy, tình trạng kháng thuốc của H pylori đang là vấn đề rất đƣợc quan tâm
Do H pylori có khả năng kháng thuốc nhanh chóng nên việc điều trị cần phải tuân theo các phát đồ phối hợp thuốc Phát đồ đƣợc lựa chọn đầu tiền là phát đồ bộ 3, gồm một thuốc ức chế bơm axit (PPI-proton pump inhibitor) hoặc RBC (ranitidine bismuth citrate), kết hợp với Clarithromycin và Amoxicilin hoặc Metronidazol Phát đồ thứ hai đƣợc lựa chọn sau đó là phát đồ bộ 4 gồm có thuốc ức chế bơm proton H + (PPI), Bismuth, Metronidazol và Tetracyclin Khi không có Bismuth, phát đồ lựa chọn thứ hai là bộ ba dựa trên PPI
Sự đề kháng kháng sinh là yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu quả của các phát đồ điều trị hiện dùng Tỉ lệ lưu hành của vi khuẩn kháng thuốc thay đổi tùy theo từng khu vực địa lý khác nhau và tương quan với việc sử dụng kháng sinh trong dân số chung
Trên thế giới, cũng nhƣ tại Việt Nam nói chung và khu vực phía Nam nói riêng, hàng năm có nhiều ca viêm loét dạ dày, viêm loét tá tràng điều trị thất bại
Vì vậy, việc nghiên cứu đề tài “Xây dựng giải pháp toàn diện cho H pylori bằng kỹ thuật Real-time PCR” là một yêu cầu vừa mang tính cấp thiết, vừa có ý nghĩa lâu dài, vừa có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn, góp phần xây dựng dữ liệu cho việc lựa chọn kháng sinh bước đầu, hạn chế thất bại trong điều trị có thể dẫn đến kháng thuốc thứ phát.
MỤC TIÊU VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Xác định kiểu gene độc tố của vi khuẩn H pylori Xác định kiểu gene CYP2C19 của người hỗ trợ cho chuyển hóa PPI
Xác định kiểu gene đột biến của H pylori kháng kháng sinh Khảo sát mối tương quan giữa kiểu gene kháng kháng sinh và giá trị MIC trên E-test
Tổng quát các yếu tố liên quan trong việc điều trị bệnh viêm loét dạ dày-tá tràng do H pylori kháng kháng sinh
Tất cả các bệnh nhân có viêm loét dạ dày –tá tràng (bao gồm viêm, loét dạ dày, tá tràng hoặc viêm loét hỗn hợp) đƣợc điều trị H pylori lần đầu hay lần sau và kháng thuốc gởi đến công ty Nam Khoa từ 7-2014 đến 12-2015.
Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
Hơn 60-70% dân số Việt Nam có nguy cơ bị viêm loét dạ dày và 30-40% trong số đó có nguy cơ chuyển sang ung thƣ dạ dày Vì vậy, vấn đề điều trị triệt để H pylori , xóa sạch viêm loét dạ dày là vấn đề cấp thiết hơn bao giờ hết
1.3.2 Tính khoa học và tính mới của đề tài Đã có rất nhiều phát đồ điều trị đƣợc đƣa ra, tuy nhiên đại bộ phận bênh nhân nhiễm khuẩn H pylori sau một thời gian điều trị dẫn đến kháng thuốc Và những phát đồ điều trị khi ấy không còn hiệu quả nửa Vấn đề cấp thiết đƣợc đặt ra là nhanh chóng tìm đƣợc cơ chế kháng thuốc cũng nhƣ những đôt biến gene kháng thuốc của H pylori
Do đó, cần một giải pháp vừa đảm bảo độ nhạy, độ đặc hiệu và nhất là thời gian phát hiện sớm, để kịp thời điều trị sau lần thất bại đầu tiên Ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu về kiểu hình kháng thuốc dựa trên thử nghiệm MIC, tuy nhiên chƣa thực sự có công trình nghiên cứu nào về kiểu gene kháng thuốc Vì vậy, đây là một đề tài hoàn toàn có ý nghĩa về khoa học và tính mới, tính sáng tạo trong nghiên cứu.
TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM LOÉT DẠ DÀY VÀ UNG THƢ DẠ DÀY
Loét dạ dày – tá tràng là tình trạng có sự hiện diện của tổn thương loét trên niêm mạc dạ dày hoặc tá tràng.Các thuật ngữ thường dùng của viêm loét dạ dày- tá tràng trong tiếng Anh:
Duodenal ulcer (loét tá tràng)
Gastric ulcer (loét dạ dày)
Stomach ulcer (loét dạ dày)
Peptic ulcer (loét dạ dày – tá tràng)
Loét dạ dày – tá tràng xảy ra khi có sự mất quân bình giữa 2 lực đối kháng tác động lên niêm mạc dạ dày – tá tràng :
1 Lực tấn công: làm phá huỷ niêm mạc dạ dày- tá tràng mà tiêu biểu là Hcl và pepsin của dịch dạ dày
2 Lực bảo vệ: đảm bảo sự nguyên vẹn của thành dạ dày- tá tràng là nhờ vào hàng rào nhầy và lớp tế bào niêm mạc dạ dày – tá tràng
Theo quan niệm này, bất cứ một tác nhân nào làm gia tăng lực tấn công, hoặc làm giảm lực bảo vệ đều có thể gây ra bệnh loét dạ dày – tá tràng
Hình 2.1 Các nguyên nhân gây loét dạ dày – tá tràng
Trong số các tác nhân gây bệnh nêu trên, Helicobacter pylori là nguyên nhân quan trọng nhất Các thuốc NSAID, Steroides có thể gây loét ở người phải điều trị dài
NHẦY ngày với các thuốc này Các Stress về tâm lý thần kinh cũng có thể gây loét, thuốc lá làm tăng nguy cơ loét, tăng tỷ lệ tái phát và biến chứng của bệnh loét dạ dày – tá tràng
Rƣợu cũng làm tăng tỷ lệ tái phát bệnh
Viêm loét dạ dày là bệnh phổ biến hàng đầu trong các bệnh đường tiêu hóa, bệnh xuất hiện ở nhiều quốc gia và ở mọi lứa tuổi Nếu không đƣợc điều trị sớm và đúng cách bệnh có thể gây ung thƣ dạ dày Ở Việt Nam, áp lực trong cuộc sống và chế độ ăn uống chƣa hợp lý khiến tỉ lệ mắc bệnh ngày càng tăng
Viêm loét dạ dày - tá tràng là đang là 1 bệnh khá phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam Đặc biệt ở các nước đang phát triển, tỷ lệ người bệnh ước tính khoảng 10%, hàng năm tăng khoảng 0,2% Ở Việt Nam, theo điều tra trong những năm gần đây, bệnh chiếm khoảng 26% và thường đứng đầu trong các bệnh ở đường tiêu hóa và có chiều hướng ngày càng gia tăng Theo Hội Khoa học Tiêu hóa Việt Nam, 70% người Việt có nguy cơ bị đau dạ dày
Viêm dạ dày do nhiễm H pylori diễn biến qua 2 giai đoạn
+ Giai đoạn cấp tính: Quá trình nhiễm H pylori có thể chia làm hai giai đoạn
Giai đoạn cấp tính, vi khuẩn xâm nhập, nhân lên và gây hiện tƣợng viêm niêm mạc, giảm tiết acid và một số triệu chứng dạ dày tá tràng xuất hiện Sau vài tuần, giai đoạn viêm mạn tính bắt đầu với hiện tƣợng giảm các đáp ứng viêm, pH dạ dày trở về bình thường và người nhiễm trở nên không có triệu chứng Sự xâm nhập của vi khuẩn H pylori ở niêm mạc dạ dày dẫn đến sự xâm nhập các bạch cầu trung tính và mono ở cả hang vị và thân vị, dẫn đến quá trình viêm mạn tính và loét
+ Giai đoạn mạn tính: trong giai đoạn viêm cấp, nếu điều trị H pylori sẽ đƣợc tiệt trừ, tình trạng viêm có thể chấm dứt nhanh chóng Nhưng phần lớn các trường hợp chuyển sang viêm mạn tính do H pylori tồn tại lâu dài ở niêm mạc dạ dày Giai đoạn này các triệu chứng lâm sàng có thể giảm đi hoặc mất nhƣng về mô bệnh học quá trình viêm mạn tính biểu hiện rõ với những biến đổi mô, có hiện tƣợng bong tróc niêm mạc và xâm nhập nhiều tế bào viêm
Cơ chế sinh bệnh là sự mất cân bằng giữa yếu tố tấn công của acid dạ dày (yếu tố gây loét) và sự bảo vệ niêm mạc dạ dày (yếu tố bảo vệ chống loét)
Hình 2.2 Các yếu tố tấn công và bảo vệ của dạ dày
Yếu tố tấn công H+ và pepsin: Khi bị kích thích, tế bào thành (parietal cell) tiết 1 dung dịch axit mà chứa khoảng 160mmol/l HCl (pH của dung dịch này ~ 0.8!) Khi pepsinogene đầu tiên đƣợc tiết ra, nó chƣa có tác dụng tiêu hoá protein ngay Tuy nhiên, ngay khi tiếp xúc với dung dịch axit HCl, nó biến thành dạng hoạt động là pepsin
Hình 2.3 Cơ chế của các yếu tố tấn công
Sau khi xâm nhập cơ thể, Helicobacter pylori sẽ chui vào lớp nhầy bảo vệ niêm mạc dạ dày, tại đây chúng tiết ra những chất làm kích thích dạ dày tiết nhiều acid hơn.Không những thế chúng còn làm suy yếu lớp nhầy bảo vệ và tiết ra một số độc tố làm tổn thương các tế bào nằm bên dưới lớp nhầy Do đó niêm mạc dễ dàng bị ăn mòn bởi chất acid có trong dịch tiêu hóa của dạ dày, gây ra viêm loét dạ dày hay tá tràng
Lớp chất nhầy: có thành phần là chủ yếu là mucin (glycoprotein cao phân tử), phospholipids, chất điện giải và nước (chiếm 95%) Lớp chất nhầy này được tiết ra từ 3 loại tế bào tiết nhầy khác nhau làsurface mucous cells (trên bề mặt dạ dày), mucous neck cells (ở vị trí mà gastric pit nối liền với gastric gland) glandular mucous cells (ở gastric gland trong hang vị).Nhiệm vụ của nó là hình thành một hàng rào bảo vệ, ngăn cách biểu mô dạ dày với chất phá huỷ
Hình 2.4 Các yếu tố bảo vệ dạ dày
+ HCO 3 - : đƣợc tiết ở cả tế bào biểu mô thân vị và hang vị Mặc dù sự tiết HCO 3 - là thấp so với sự tiết axit, nhƣng HCO 3 - đóng một vai trò cực kì quan trọng trong việc duy trì pH lớp chất nhầy ~ 7.0 Chúng trung hoà axit khuếch tán vào lớp nhầy trước khi axit có thể “chạm tới” tế bào biểu mô Hơn thế nữa, nếu pepsin “chui vào” lớp nhầy này, nó sẽ bị bất hoạt bởi vì đây là môi trường kiềm (nồng độ HCO 3 - cao)
+ Prostaglandins: đóng vai trò chính trong việc duy trì tình trạng nguyên vẹn của lớp chất nhầy (lớp nhầy liên tục bị bào mòn và đƣợc tái tạo liên tục – chúng không “tĩnh”
TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI
Helicobacter pylorilà vi khuẩn Gram õm, dài từ 1,5-5 àm, đường kớnh từ 0,3-1 àm, lỳc mới phõn lập từ mẫu sinh thiết niờm mạc dạ dày thỡ cú hỡnh cong hoặc hỡnh chữ S, đứng thành đám Nếu cấy chuyền nhiều lần thì có hình que Vi khuẩn này rất di động nhờ có 2-6 lông ở một đầu Vi khuẩn không sinh nha bào Nhờ có cấu tạo này mà vi khuẩn có thể chui sâu vào và sống trong lớp nhầy bao phủ niêm mạc dạ dày, ngoài ra nó còn khả năng tiết ra men urease làm thủy phân uree thành CO 2 và amoniac (NH 3 ) tạo nên một lớp có tính kiềm bao bọc xung quanh nó Khi gặp môi trường thuận lợi, vi khuẩn có thể biến đổi thành dạng hình cầu, tạm ngƣng hoạt động và ngƣng tiết men urease, đến khi gặp điều kiện thích hợp, nó sẽ hoạt động trở lại [1], [5] Đặc điểm sinh vật học của H pylori đƣợc xếp phân loại nhƣ sau:
Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Epsilon Proteobacteria
Bộ (ordo) Campylobacterales Họ (familia) Helicobacteraceae Chi (geneus) Helicobacter Loài (species) H pylori
Hình 2.5 Vi khuẩn Helicobacter pylori trong dạ dày
Vi khuẩn Helicobacter pyloriđòi hỏi điều kiện vi hiếu khí Do yêu cầu dinh dưỡng cao, nên môi trường nuôi cấy cần có máu động vật hoặc huyết thanh Vi khuẩn mọc chậm, đƣợc nuôi trong điều kiện có 5% O 2 , 10%CO 2 , 85% N 2 , độ ẩm cao, trên môi trường thạch máu Colombia hoặc thạch máu tryptose sau 3 ngày (mẫu chậm có thể kéo dài đến 14 ngày), ủ ở 35-37 0 C, có thể thấy khuẩn lạc nhỏ, không màu, có đinh nhọn Môi trường chọn lọc có thêm kháng sinh như Vancomycin, Trimethoprin, Amphotericin B để ức chế tạp nhiễm Vi khuẩn không lên men đường, có oxydase và catalase, urease dương tính mạnh Urease dương tính mạnh là tính chất dùng để phân biệt Helicobacter pylorivới các vi khuẩn hình cong khác nhƣ Campylobacter [30]
Hình 2.6 Gram và test hóa sinh của Helicobacter pylori
H pylori có thểsinhtồn lâu dài trong dạ dày, với độ pH thường xuyên từ 2,5-3, nhờ vào một enzyme của H pylori là urease Enzyme urease của H pylori có hoạt tính rất mạnh, làm phân hủy ure dạ dày thành một lớp đệm amoniac bao quanh vi khuẩn, giúp vi khuẩn sống sót trong môi trường acid Khi ra khỏi cơ thể, vi khuẩn này dễ bị tiêu diệt trong môi trường bình thường, nên chỉ tồn tại bên ngoài khoảng 1-2 ngày Trong điều kiện bảo quản ở -70 0 C, với môi trường tryptone soy broth có chứa 15% glycerol H pylori có thể sống tới 12 tháng.
CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM H PYLORI
Test thở với C phóng xạ (Urea breath tests)
Nguyên tắc của phương pháp là cho bệnh nhân uống một lượng nhỏ ure có gắn đồng vị phóng xạ 14C (hoặc 13C) vào trong dạ dày Enzyme urease của H pylori
(nếu có) sẽ nhanh chóng phân hủy ure-14C (hoặc ure-13C) thành ammoniac và dioxide carbon phóng xạ 14 CO 2 (hoặc 13CO 2 ) Dioxide carbon có hoạt tính phóng xạ này sẽ nhanh chóng chuyển vào máu và đi tới phổi, chúng sẽ đƣợc phát hiện qua khí thở ra Gần đây, người ta thường dùng 13C thay cho 14C, an toàn hơn Trở ngại chính của phương pháp này là cần phải có dụng cụ để phân tích nồng độ 13CO 2 (hoặc 14CO 2 ) trong khí thở ra nên hiện nay phương pháp này mới chỉ được ứng dụng ở một số trung tâm chẩn đoán Độ nhạy thay đổi theo từng loại test và thời gian đọc kết quả, gia tăngkhi đƣợc ủ ở 37- 42 0 C, các test tốt đọc trong vòng 4 giờ cho độ nhạy cảm85-90% và độ đặc hiệu từ 95-98% Trong điều kiện hiện nay người ta thừanhận ngưỡng phát hiện vi khuẩn là 104-105 vi khuẩn/ml [4], [7]
Xét nghiệm nước bọt và nước tiểu:
Các xét nghiệm này dựa trên việc phát hiện IgA hoặc IgG kháng H pylori có trong nước bọt và nước tiểu Tuy nhiên, do độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này thấp nên ít phổ biến
Xét nghiệm huyết thanh tìm kháng thể kháng H pylori:
Xét nghiệm này có giá trị trong lần chẩn đoán nhiễm đầu tiên (độ chính xác chẩn đoán khoảng 90%) nhƣng không thể dùng xét nghiệm này để theo dõi sau khi điều trị
H pylori vì kháng thể vẫn tồn tại trong máu trong nhiều tháng
Tìm kháng thể đơn dòng của H pylori trong phân: Độ nhạy là 91% và độ chuyên biệt là 93% Lưu ý phải ngưng kháng sinh ít nhất 6-12 tuần trước khi làm xét nghiệm Năm 1999, công ty Meridian Diagnostics (USA) đã phát triển kĩ thuật ELISA tìm kháng nguyên H pylori trong phân và đƣa ra một loại kit chẩn đoán đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Đó là kit H pylori SA, kit này tiến hành đơn giản, không đòi hỏi thiết bị phụ trợ nào, có thể đọc bằng mắt thường hoặc bằng máy, độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 83-100% Loại kit này rất thích hợp để phát hiện H pylori ở trẻ em cũng như theo dõi H pylori trước và sau điều trị, nhưng do giá thành cao nên chƣa phổ biến
2.3.2 Các phương pháp xâm lấn + Nội soi
Nội soi dạ dày tá tràng là phương pháp chẩn đoán có giá trị cao vì phương pháp này không chỉ cung cấp hình ảnh tổn thương dạ dày tá tràng mà còn cho phép lấy mảnh sinh thiết để làm các thăm dò khác Nội soi để xác định tình trạng viêm dạ dày
H pylori qua hình ảnh đại thể (bình thường, viêm nốt lần sần, loét chợt nông, loét sâu mới, đang chảy máu hay loét cũ, sẹo loét Nội soi cho phép tìm hiểu nguyên nhân đau bụng và lấy mảnh sinh thiết làm kháng sinh đồ, một xét nghiệm có ý nghĩa trong điều trị, nhất là với những bệnh nhân điều trị không hiệu quả hoặc tái phát nhiều lần Hình ảnh tổn thương trên nội soi khi nhiễm H pylori thường là viêm lần sần dạng hạt Tuy nhiên khoảng 50% các trường hợp viêm dạ dày ở trẻ em không có hình ảnh tổn thương đại thể trên nội soi
+Phương pháp sinh học phân tử (PCR)
Phương pháp PCR: sử dụng để phát hiện vi khuẩn H pylori từ các mẫu bệnh phẩm như mảnh sinh thiết, phân, dịch dạ dày, nước bọt Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR là 85% - 98% và 100% PCR áp dụng chủ yếu cho các trường hợp vi khuẩn chuyển dạng không hoạt động nên không nuôi cấy đƣợc hoặc mẫu bệnh phẩm bị nhiễm các vi khuẩn khác không phân lập đƣợc PCR còn đƣợc áp dụng để chẩn đoán tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn do phát hiện các đột biến điểm
Khảo sát tế bào học: Phương pháp mô bệnh học Đây là phương pháp cho kết quả nhanh chóng, được thực hiện bằng cách chải quét hoặc ấn mẫu sinh thiết lên lam kính rồi cố định bằng cồn hoặc để khô tự nhiên sau đó đƣợc nhuộm:
+ Nhuộm huỳnh quang acridine orange: Vi khuẩn hiện lên rõ nét, rất dễ nhận thấy Song phương pháp này tốn kém và đòi hỏi kỹ thuật cao
+Nhuộm Giéma là một phương pháp nhanh và rẻ tiền để phát hiện sự có mặt của H.P Phương pháp này nhanh chóng, đơn giản và dễ thực hiện ở các tuyến nội soi nhưng kết quả phụ thuộc vào người được
Phương pháp cấy tổ chức sinh thiết
Lấy mẫu mô niêm mạc dạ dày đem nhuộm Gram để tìm sự hiện diện của vi khuẩn Tuy nhiên, độ nhạy không cao Để xác định chính xác nhiễm H pylori về mặt phương diện vi trùng học cần phải nuôi cấy vi khuẩn
Test này xác định hoạt độ men urease của H pylori bằng việc đặt mẫu mô dạ dày vào môi trường lỏng (test maison, CU test) hoặc bán đặc (CLOtest, HUT màu theo pH Nguyên tắc của thử nghiệm là nhằm phát hiện men urease của H pylori , H pylori gần nhƣ là loại vi khuẩn duy nhất trong dạ dày tiết men urease với khối lƣợng lớn (ngoại trừ một số rất ít bệnh nhân bị nhiễm Helicobacter helmanii) Men urase của H pylori có trong mẫu mô dạ dày sẽ làm biến đổi urease thành amoniac (NH 3 ), NH 3 làm môi trường thuốc thử có pH kiềm, vì vậy làm thay đổi màu của chất chỉ thị và theophản ứng sau:
NH 3 pH đổi màu chỉ thị từ vàng sang đỏ
Hình 2.7 H pylori test của công ty Nam Khoa
Bảng 2.1: Các xét nghiệm để chẩn đoán nhiễm trùng hoạt động của H pylori
Xét nghiệm H pylori Xét nghiệm xác định sự hiện diện của: Độ nhạy Độ đặc hiệu
Nghiệm pháp thở ure C13 - không phóng xạ
Nhiễm trùng hoạt động Cao Cao
Huyết thanh chẩn đoán – máu hoặc huyết thanh
Kháng thể - Nhiễm trùng đang hoạt động hoặc đã nhiễm trước đó
Xét nghiệm kháng nguyên phân
Nhiễm trùng hoạt động Cao Cao
Nội soi sinh thiết dạ dày – bệnh lý học
Nhiễm trùng hoạt động Cao Cao
ĐẶC ĐIỂM SHPT LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA H
Helicobacter pylori là một trong các vi sinh vật thể hiện tính đa dạng sinh học rất cao do quá trình đột biến, tái tổ hợp, trao đổi DNA xảy ra trong hệ genomes
Genomes của H pylori có khoảng 1.600 gene, trong đó 10% có vai trò quan trọng sống còn đối với H pylori Kích cỡ genomes của H pylori1,6-1,73 Mb, trung bình là 1,67Mb Khoảng 40% các chủng H.P có chứa plasmid kích thước 1.5-23.3Kb
Nhƣng không phát hiện thấy yếu tố gây độc trong plasmid Các chức năng của hơn 60 gene khác nhau trong bản đồ gene củaH pylori đã đƣợc xác định, Trong đó, một số gene liên quan đến gây bệnh đƣợc quan tâm là vacA, cagA
Hình 2.8 Độc lực của vi khuẩn H pylori
Sự kết hợp giữa các gene cagA và các type gene vacA có thể liên quan đến nguy cơ với các mức độ biểu hiện lâm sàng khác nhau của bệnh Gene cagA có thể không có ở tất cả các chủng H pyori Protein cagA, có kích thước từ 128 đến 140 kDa, có khả năng kích thích phản ứng phosphoryl hóa tyrosine trong tế bào ký chủ, dẫn đến sự tăng sinh bất thường của các tế bào biểu mô dạ dày Gene vacA có chứa ít nhất hai vùng biến đổi gồm vùng tín hiệu và vùng giữa Vùng giữa (middle) của gene vacA có các type gene là m1/m2 và vùng tín hiệu (signal) có thể có các type gene là s1/s2 Mức độ độc tố cao hay thấp của gene vacA phụ thuộc vào các type gene của hai vùng này
Chủng H pylori với type gene vacA s1/m1 có độc tố trên tế bào mạnh hơn type gene vacA s1/m2, trong khi chủng H pylori với type gene vacA s2/m2 không gây độc tố [5]
CagA (Cytotoxin associated gene A) là 1 protein có tính độc của H pylori đƣợc mã hóa bởi gen cagA đƣợc nghiên cứu kỹ nhất Vi khuẩn H pylori có CagA thì độc hơn vi khuẩn không có 60% chủng H pylori phân lập ở phương Tây mang gen CagA, trong khi đó gần nhƣ tất cả các chủng ở Đông Á có CagA (+) Nó đƣợc chuyển vào tế bào vật chủ qua hệ thống tiết type 4 (T4SS), CagA biểu hiện tác động trực tiếp lên tế bào sinh vật có nhân CagA cần để H pylori xâm lấn hiệu quả bề mặt của các lớp tế bào đơn CagA (+) thường liên quan với bệnh lý loét dạ dày tá tràng, viêm teo phì đại tràng và ung thƣ tuyến dạ dày hơn so với các chủng âm cagA (-), nhƣng mối quan hệ này không đƣợc quan sát thấy trong nhiều quần thể có tỉ lệ ung thƣ dạ dày cao nhƣ Đông Á Kể từ giữa những năm 1990, các nghiên cứu đã cố gắng tìm mối liên quan với sự có mặt độc lập của cagA, vacA, và một số yếu tố độc lực khác với tình trạng bệnh, đôi khi kết quả cho thấy có sự kết hợp Bệnh nhân có vacA(+) đã đƣợc chứng minh là có nguy cơ gia tăng ung thƣ dạ dày xảy ra khi có kiểu hình s1/ m1 Những nghiên cứu cho thấy phần lớn chủng H pylori có cagA dương tính được liên kết với vacA s1 và hoặc m1 genotype Cùng những nghiên cứu này ủng hộ quan điểm rằng những người nhiễm H pylori mang cagA (+), vacA s1/ m1 cần điều trị tiệt trừ H pylori để ngăn chặn bệnh nặng (loét tá tràng, loét dạ dày, tiến triển của tổn thương tiền và ung thư dạ dày) Nghiên cứu trên trẻ em Slovenia nhiễm H pylori thấy tỉ lệ cagA (+) là 61,2%, vacAs1/m1 chiếm 42%, s1m2 chiếm 28% và s2m2 (24%) Nghiên cứu trên 33 trẻ Hàn Quốc viêm dạ dày tá tràng H pylori thấy 94% chủng có cagA (+), chủng vacAm1 chiếm 82% và vacAm2chiếm 15%
VacA (Vacuolating associated gene A)là độc tố quan trọng và có mặt trong hầu nhƣ tất cả chủng H pylori Gen mã hóa cho độc tố này đã đƣợc xác định và đƣợc kí hiệu là VacA Độc tố không bào giải phóng ban đầu dưới dạng tiền độc tố có trọng lượng 29.140 kDa, sau đó được phân tách thành một độc tố trưởng thành có trọng lƣợng 88 kDa tiết toxin Sau đó độc tố đƣợc tiết ra này tiếp tục tách ra để tạo thành những mảnh 33 kDa và 55 kDa và được gọi là p33 và p55, tương ứng VacA gây ra sự hình thành không bào trong màng ty thể chịu trách nhiệm cho cảm ứng của tế bào chết tự nhiên [59] Phân tích huyết thanh của bệnh nhân với loạn sản ruột, ung thƣ dạ dày, loét tá tràng, và viêm dạ dày không teo lại cho thấy một mối liên hệ giữa kháng thể trung hòa vacA và ung thƣ dạ dày VacA chứa đa dạng alen mà thay đổi qua từng chủng H pylori VacA chứa bốn vùng nhận dạng, mỗi vùng trong số đó đƣợc chia nhỏ thành các túyp Những vùng có tính chất đặc trƣng nhất là vùng tín hiệu (signal), trong đó bao gồm các N-terminus và một phần của chuỗi tín hiệu và đƣợc kí hiệu s1 hoặc s2
Vùng giữa của gen (m) đƣợc kí hiệu m1 hoặc m2 Vai trò của các vùng trung gian (i) ít đƣợc biết đến hay vùng xóa (d) khi bệnh tiến triển I là khu vực nằm giữa vùng s và m và đƣợc đánh dấu là i1, i2, i3 Vùng d nằm giữa vùng I và vùng m, khu vực đƣợc kí hiệu d1 nếu không có xóa, hoặc d2 nếu một 69-89 cặp base hiện diện VacA có thể kết hợp lại để tạo thành một loạt các kết hợp, một số trong số đó ít phổ biến hơn so với những cặp khác Kiểu gen vacA s1/m1 là sự kết hợp có độc lực mạnh nhất, trong khi kiểu gen s2/ m2 hầu nhƣ không gây độc.
THUỐC ỨC CHẾ BƠM PROTON PPI VÀ ENZYME CYP2C19
Sau khi xác định đƣợc kiểu gene độc lực của vi khuẩn H pylori và mức độ gây độc trong dạ dày của nó, người ta tiến hành xét nghiệm xác định kiểu gene CYP2C19 và mức độ chuyển hóa PPI của bệnh nhân để cho liều thuốc phù hợp và tránh tình trạng kháng thuốc trong lần điều trị đầu tiên
2.5.1 Thuốc ức chế bơm proton PPI
Trong chuyên ngành tiêu hóa, giải quyết các vấn đề liên quan tới acid dạ dày luôn là một việc hay gặp và cần thiết Các bệnh có liên quan đến acid dạ dày là kết quả những cơ chế sinh bệnh khác biệt nhƣng chồng chéo nhau dẫn dến sự bài tiết acid thái quá hay làm suy giảm sự bảo vệ niêm mạc Cho tới nay chƣa biết rõ nguyên nhân vì sao có sự tăng tiết acid mà chỉ biết rõ hậu quả của nó Đó là biểu hiện những bệnh phổ biến hiện nay nhƣ loét dạ dày tá tràng, trào ngƣợc dạ dày thực quản, rối loạn tiêu hóa thường gặp trên thực tế hàng ngày mà tùy tính chất mạn tính của nó sẽ gây thiệt hại tốn kém đáng kể cho gia đình và xã hội Từ hàng ngàn năm trước các thầy thuốc đã nghĩ tới vai trò của dịch vị chua gây bệnh dạ dày và chữa bệnh bằng các chất trung hòa acid Đầu thế kỉ 19 người ta thường biết đến câu nói nổi tiếng của Schwarz (1910) "No gastric acid juice, no ulcer" (không có dịch vị acid thì không có loét) Thực ra trong dịch vị không chỉ có acid mà còn có pepsin, một trong hai yếu tố quan trọng gây loét [7,9]
Hình 2.7 Thuốc ức chế bơm proton
Tới giữa thế kỉ 20, sự phát triển của các kĩ thuật sinh học tế bào tạo nên những tiến bộ quan trọng cho phép hiểu rõ những hệ thống vận chuyển ion, đặc biệt là H+,K+/ATPase tác động ở màng tế bào, các thụ thể điều chỉnh các hệ thống này ở cực đối diện tế bào, cơ chế tác động của các chất ức chế bài tiết acid Thụ thể histamin H2 đã đƣợc nghiên cứu kĩ và cho phép tìm ra các chất đối kháng đặc hiệu Các thuốc đối kháng thụ thể H 2 ra đời đƣợc xem là một cuộc cách mạng trong việc điều trị các bệnh lí liên quan đến acid dạ dầy tuy nhiên sự phát hiện các thuốc ức chế bơm proton (PPI) tác động lên các hệ thống vận chuyển ion ra đời là một bước tiến nhảy vọt trọng việc điều trị bài tiết acid dạ dày Cho tới nay đã có khoảng 5,6 thế hệ thuốc PPI ra đời với hiệu quả và tính an toàn cao hơn nhiều so với các loại thuốc ức chế H 2 trước đó
Các thuốc này đã rút ngắn đợt điều trị, làm sớm liền sẹo loét, giảm biến chứng, giảm tỉ lệ phẫu thuật [2,4,7,21]
Vai trò của PPI trong việc điều trị các biến chứng của các bệnh lí ngoài đường tiêu hóa nhƣ tai biến khi dùng các thuốc giảm đau nonsteroid hoặc trong các thể bệnh lí tim mạch, tai mũi họng cũng đã đƣợc báo cáo rất nhiều trong các hội nghị tiêu hóa trong và ngoài nước gần đây
Hiện nay 5 loại PPI đƣợc dùng rộng rãi trong lâm sàng là omeprazole, lansoprazole, pantoprazole, rabeprazole và esomeprazole đều đang có mặt tại Việt
Quá trình gắn và làm bất hoạt H+, K+/ATPase của các PPI
Các PPI sau khi đƣợc hoạt hóa thì đích tác dụng của nó là các cysteine nằm ngoài bào tương thuộc chuỗi α Cho tới nay có 5 cysteine được coi là đích tác dụng của các PPI và đang đƣợc tập trung nghiên cứu rất nhiều Đó là các cysteine 321,813, 821,822 và 892 Tất cả các PPI đều tương tác với cys 813 nằm giữa TM5/TM6 và liên kết này có vai trò cố định enzyme ở cấu hình E2
Cầu nối disulfide giữa PPI và bơm H+, K+/ATPasekhông phải là một mối liên kết thật bền vững Các PPI hoạt hóa nhanh thì dễ gắn vào các cysteine ở bề mặt bơm nhƣng cũng dễ bị phân tách làm enzym hồi phục hoạt tính trở lại Trái lại các PPI hoạt hóa chậm thường gắn vào các cystein ở sâu trong màng tế bào nên hiện tượng phân ly khó xảy ra Nguyên nhân của tình trạng này là do ở tế bào thành có các glutathion có thể phân tách các cầu nối dissulfide, nếu các glutathion tiếp cận với các cầu nối disulfide nó có thể tách đƣợc các PPI ra và giúp khôi phục lại hoạt tính của các enzyme [17,21]
Từ 1 số vấn đề trên người ta nhận thấy thời gian tác dụng của thuốc và việc phục hồi bài tiết acid phụ thuộc vào 3 yếu tố:
Tốc độ chuyển từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động của bơm
Sự thoát ức chế do hủy cầu nối disulfide giữa PPI và bơm
Khi tế bào ở trạng thái nghỉ (ban đêm) 90-95% các enzyme trong tình trạng bất hoạt và đƣợc chứa trong các túi chế tiết Khi tế bào ở trạng thái kích thích (bữa ăn) 60- 70% enzyme ở trạng thái hoạt động và nằm ở màng của tiểu quản chế tiết Có khoảng 70% enzyme được hoạt hóa sau khi PPI đạt nồng độ tối đa trong huyết tương (khoảng 30-60 phút sau khi dùng) Với liều tiêu chuẩn 1 lần/ ngày lƣợng acid tiết ra giảm đi khoảng 66% Do tác dụng phụ thuộc vào tỉ lệ bơm được hoạt hóa nên thuốc thường không đạt tác dụng tôí đa trong ngày đầu tiên mà thường phải mất từ 3-5 ngày [16,18]
Các PPI có thời gian bán hủy ngắn vào khoảng 1 giờ nhƣng thời gian để đạt nồng độ đỉnh lại dao động khá mạnh từi 1-5 giờ do phụ thuộc vào công nghệ điều chế và bản chất của thuốc Vì các PPI bị phá hủy rất mạnh trong môi trường acid nên người ta phải điều chế giúp thuốc qua dạ dày đến ruột non rồi mới hấp thu (dạng viên nang, phân rã chậm), có hãng còn kết hợp với một lƣợng nhỏ antacid để giúp PPI đi qua dạ dày xuống ruột PPI đƣợc chuyển hóa tại gan qua cytochrome P450 với 2 enzyme CYP2C19 và CYP3A4.Tính đa hình của CYP2C19 cũng là 1 yếu tố quan trọng trong tác dụng của thuốc
Các PPI đều đƣợc chuyển hóa qua CYP2C19 và CYP3A4.nhƣng ái lực của CYP2C19 mạnh hơn rất nhiều so với CYP3A4 do vậy nó chịu trách nhiệm chính trong chuyển hóa trừ rabeprazole (do chỉ có một phần nhỏ đi qua 2 enzyme này)
2.5.2 Enzyme CYP2C19 và tương quan PPI trong điều trị H pylori
Cytochrome P450 2C19 (CYP2C19 viết tắt) là một enzyme Protein này là một thành viên của hệ thống cytochrome P450, tham gia vào quá trình chuyển hóa của xenobiotics, trong đó có nhiều thuốc ức chế bơm proton và antiepileptics Ở người, các protein CYP2C19 đƣợc mã hóa bởi CYP2C19 gene.CYP2C19 là một enzyme ở gan mà tác động lên 10-15% các loại thuốc sử dụng trong lâm sàng hiện tại, trong đó có gia đình PPI
Vậy tại sao đa dạng kiểu hình CYP2C19 lại quan trọng đối với các thuốc PPI?
+ Hầu hết các PPI đều chuyển hóa chủ yếu thông qua con đường phụ thuộc CYP2C19
+ Những người có kiểu hình CYP2C19 khác nhau sẽ có chuyển hóa PPI khác nhau
+ Chuyển hóa của PPI khác nhau sẽ có hiệu quả điều trị khác nhau và khả năng xảy ra tương tác thuốc Do đó: PPI nào có chuyển hóa ít phụ thuộc vào CYP2C19 sẽ cho hiệu quả điều trị ổn định và ít tương tác thuốc
Hiện nay, có 3 mức độ chuyển hóa PPI tương ứng với 3 kiểu hình của CYP2C19 trên exon 4 và exon 5 nhƣ sau:
+ Heterozygous: m1/wt; m2/wt + Homozygous: m1/m1; m2/m2 + Wild type: wt/wt
Kiểu hình CYP2C19 đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa của các PPI khác nhau Các enzyme này có có những kiểu gen khác nhau, do đó có thể chia thành 3 nhóm kiểu hình khác nhau tương ứng [18]:
+ Extensive metabolizer (EM: kiểu hình chuyển hóa mạnh)
+ Intermediate metabolizer (IM: kiểu hình chuyển hóa trung gian)
+ Poor metabolizer (PM: kiểu hình chuyển hóa chậm)
PM có tác dụng chuyển hóa chậm nên làm cho thuốc có hiệu quả mạnh EM có tác dụng chuyển hóa mạnh nên làm cho thuốc có tác dụng kém Hầu hết các PPI đều chuyển hóa chủ yếu qua con đường phụ thuộc vào CYP2C19.Những người có kiểu hình CYP2C19 khác nhau sẽ có những chuyển hóa PPI khác nhau Chuyển hóa của PPI khác nhau sẽ có hiệu quả điều trị khác nhau và xảy ra tương tác thuốc Do đó PPI nào có chuyển hóa ít phụ thuộc vào CYP2C19 sẽ cho hiệu quả điều trị ổn định và ít xảy ra tương tác thuốc Nghiên cứu về kiểu hình CYP2C19 của Yamada ở Việt Nam cho thấy EM chiếm 40%, IM 40% và EM chiếm 20%.Kết quả điều trị viêm, loét dạ dày tá tràng cũng bị chi phối bởi kiểu hình gen CYP2C19, với 46 cùng một liều PPI hiệu quả diệt H pylori sẽ cao hơn ở người có kiểu hình PM và IM.
CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KIỂU HÌNH VÀ KIỂU GENE KHÁNG THUỐC CỦA H PYLORI
2.6.1 Các nghiên cứu kiểu hình kháng thuốc tại Việt Nam
Nghiên cứu của Đỗ Hoàng Long và cộng sự, năm 2014, phân lập vi khuẩn và tách chiết enzyme urease từ môi trường nuôi cấy H pylori cho biết phân lập được 17 chủng H pylori từ 18 mẫu mô sinh thiết ở loét dạ dày tá tràng, tách chiết đƣợc enzyme urease với hoạt tính cao [14]
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Nguyệt và cộng sự, năm 2011, khảo sát 90 mẫu bệnh phẩm dạ dày lấy từ bệnh nhân thuộc 3 nhóm bệnh viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày và ung thƣ dạ dày, cho biết 45 chủng H pylori phân lập từ 90 mẫu bệnh phẩm có tỉ lệ kháng Ampicilin (33,3%), Amoxicilin (35,5%), Tetracyllin (17,78%), Metronidazol (95,5%) và Clarithromycin (26,67%) [13]
Nghiên cứu của Bùi Quang Di và cộng sự vào năm 2011 tại bệnh viện Hoàn Mỹ, khảo sát 116 bệnh nhân loét dạ dày tá tràng sử dụng phát đồ 3 thuốc chuẩn đầy đủ trong 10 ngày cho biết tỉ lệ tiệt trừ H pylori 75% và tác dụng phụ chiếm 67%, chủ yếu là thay đổi vị giác,đắng miệng mệt mỏi Phát đồ này tỏ ra kém hiệu quả và nhiều tác dụng phụ [14]
Nghiên cứu của trung tâm nghiên cứu sinh Y Dƣợc học Quân sự (Học viện Quân Y) vào năm 2008, ứng dụng kỹ thuật PCR xác định các gene gây bệnh của H pylori từ mẫu sinh thiết dạ dày của 20 bệnh nhân có bệnh lý dạ dày tá tràng thuộc 3 nhóm: viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày và ung thƣ dạ dày cho biết:
+ Kỹ thuật PCR để xác định các gene cagA, VacA của H pylori có độ nhạy và độ đặc hiệu 100%
+ Xác định các gene của H pylori là cơ sở để tìm nguyên nhân gây bệnh dạ dày trên những bệnh nhân nhiễm H pylori Đó cũng là cơ sở để xác định có điều trị triệt để H pylori hay không [21]
Nghiên cứu của Lê Đình Minh Nhân, năm 2006, khảo sát tính đề kháng kháng sinh của H pylori kháng với kháng sinh Clarithromycin tăng đến 38,5%, với Metronidazol là 50,8% và với Tetracycllin là 9,2% [14]
Tuy nhiên, tại Việt Nam chƣa có công trình nghiên cứu nào đƣợc công bố liên quan đến đột biến gene, kiểu gene kháng thuốc kháng sinh
2.6.2 Các nghiên cứu về kiểu gene kháng thuốc trên thế giới
Tính kháng thuốc kháng sinh thuộc họ fluoroquinolones (bao gồm ciprofloxacin, gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin,moxifloxacin và norfloxacin) đƣợc hình thành chủ yếu do sự biến đổi gene GyrA gene mã hóa AND gyrase Kết quả là các kháng sinh thuộc họ fluoroquinolones không còn khả năng ngăn chặn sự sao chép AND của
Một bước tiến quan trọng nghiên cứu kháng 5-nitroimidazole (một dẫn xuất của imidazole chứa một nhóm nitro Ví dụ điển hình nhất là metronidazole, tinidazole là những phát hiện đột biến gene mã hóa cho một nitroreductase oxy không nhạy cảm (rdxA) dẫn đến tăng sức đề kháng do sự bất hoạt của nitroreductase [29]
Nghiên cứu kháng thuốc nhóm macrolides (gồm 2 thế hệ, thế hệ cổ điển gồm có: Erythromycon, Spiramycin; thế hệ mới gồm có các thuốc nhƣ Roxithromycin, Clarithromycin và Azithromycin) cho thấy đột biến điểm (adenin-> guanidin) trong 2 vị trí cụ thể là 2142 (A2142G) và 2143 (A2143G) quyết định tính kháng thuốc nhóm macrolides [20]
Các nghiên cứu gần đây cho thấy sự đột biến gene tại vùng V của 23S rARN quyết định tính kháng thuốc clarithromycin của H pylori Cụ thể hơn là đoạn A2142G là đột biến chính Một số nghiên cứu khác cho thấy các đột biến A2143G, A2142G và A2142C quyết định tính kháng thuốc
2.6.2 Cơ chế kháng kháng sinh Clarithromycin của H pylori
Riêng đối với Clarithromycin, tỉ lệ vi khuẩn H pylori kháng kháng sinh này rất cao và cơ chế kháng đã đƣợc tìm hiểu kỹ Nhóm macrolide tác động tới vòng peptidyl transferase ở vùng 5 của 23S ribosomal RNA (rrn) và gây cản trở sự kéo dài peptide
H pylori kháng clarithromycin dẫn đến làm giảm gắn của kháng sinh vào ribosome của vi khuẩn Tính kháng cuả H pylori xảy ra do đột biến, đặc biệt ở vị trí 2142
(A2142G, A2142C) và 2143 (A2143G), điều này có thể dẫn đến thay đổi sự cấu hình của vị trí đích và giảm sự cố định Những sự đột biến này dẫn đến kháng chéo giữa tất cả các macrolide Mặc dù thực tế H pylori chứa 2 hệ thống điều hòa gen rRNA, dị hợp tử hiếm khi xảy ra Những sự đột biến có thể xảy ra ngẫu nhiên và vi khuẩn đƣợc chọn lọc khi phơi nhiễm với kháng sinh Những đột biến thường gặp 23S ARNt kháng clarithromycine bao gồm: A2143G (70%; dao động từ 53-95%), A2142G (11,7%) và
A2142C (2,6%) Ở một số nghiên cứu người ta thấy các đột biến clarithromycin thường gặp ở A2143G tạo nên tính kháng của clarithromycin chỉ tạo ra mức kháng tối thiểu MIC có giá trị thấp hơn là đột biến A2142G [41] Những đột biến khác cũng đƣợc ghi nhận ở những chủng kháng clarithromycin ở Banglades, Trung Quốc tuy nhiên sự đóng góp của một vài đột biến hiếm gặp đối với tính kháng clarithromycin còn là vấn đề tranh cãi, vì sau đó những đột biến A2115G, G2142A, và T2717C không đƣợc xác nhận đồng thời đột biến T2182C cũng đƣợc phát hiện ở những chủng nhạy cảm với clarithromycin [41].
NGUYÊN TẮC THIẾT KẾ VÀ TÍNH ƢU VIỆT CỦA PCR
Hình 2.8 Các điểm đột biến trên vùng 23S của H pylori 2.7 Nguyên tắc thiết kế và tính ưu việt của phương pháp Real-time PCR trong đề tài nghiên cứu
2.7.1 Nguyên tắc thiết kế mồi PCR trong đề tài nghiên cứu Đối với PCR cho gene độc lực của H pylori , thiết kế cặp mồi sao cho sản phẩm khuếch đại từ 70-200 bp Ở đây, các cặp primer F,R của vagA, cagA đƣợc điều chỉnh sao cho tỉ lệ GC không quá 50% và Tm khoảng từ 55-65 o C.Nguyên tắc thiết kế cụ thể nhƣ sau:
Sản phẩm #90bp Đầu 5’ của TQ probe tự do phát hùynh quang
2 Đối với PCR CYP2C19 và các đột biến vùng V 23s RNA là các đột biến điểm
Thiết kế cặp mồi F,R khuếch đại đoạn gene có chứa điểm đột biến cần tìm ( khoảng
70-200bp) Sau đó thiết kế các probe có thay đổi vị trí nucleotide cần bắt cho cả hai trường hợp bình thường và có đột biến
2.7.2 Tính ưu việt của phương pháp Real-time PCR trong đề tài nghiên cứu
Hầu hết các đột biến phát hiện trong đề tài là đột biến điểm Điều này giúp thuận tiện trong thiết kế primer và probe PCR, giúp ta phân biệt kết quả rõ ràng hơn so với PCR định tính cổ điển đòi hỏi sự khác biệt về kích thước band điện di
Hơn nửa, mỗi phản ứng PCR được kiểm soát bằng chứng dương, chứng âm và chứng nội tại – IC để tránh các trường hợp âm tính giả và dương tính giả
Giá trị LOD đƣợc thiết lập chung cho toàn bộ các phản ứng PCR là 200 RFU
Từ đây, tín hiệu nằm trên các đường base line là tín hiệu thật, giúp người làm đọc kết quả một cách dễ dàng và chính xác nhất.
VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT DÙNG CHO NGHIÊN CỨU
Mảnh sinh thiết dạ dày qua nội soi và đƣợc chẩn đoán có các dấu hiệu viêm loét dạ dày tại các bệnh viện trong tp HCM
3.1.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Micropipette dung để hỳt cỏc thể tớch nhỏ từ 1 àl đến 1000 àl Các đầu pipette tip tinh sạch
Tube nhựa Axygen 1.7ml Tube nhựa Axygen 0.2ml Strip local 8 giếng kèm nắp dung trong real-time PCR Máy ly tâm tốc độ 14000rpm của hãng Eppendorf Máy Vortex của hãng VELP
Máy ủ nhiệt của hãng Eppendorf Máy đo quang Biophotometer của hãng Eppendorf Máy ly trích tự động Kingfisher- flex và các vật dụng đi kèm quá trình tách chiết nhƣ Cum và strip Elution
Máy PCR, real-time PCR của Biorad, máy điện di Electrophoresis, máy giải trình tự gene 3130XL của ABI
3.1.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu
Bộ tách chiết Mag Bead của công ty Nam Khoa (bao gồm các thành phần sau:
Lysis Buffer, Protein K, Hạt từ, Wash1, Wash 2, Wash 3, Elution)
Master mix của hãng Qiagen Primer và probe đặc hiệu cho phát hiện:
Xây dựng dấu ấn sinh học chẩn đoán và thuốc điều trị gene
+Gene độc lực của H pylori, VacAs1/m1, CagA + Kiểu gene CYP2C19, M1 trên Exon 5 và M2 trên Exon 4
+ Các đột biến điểm tại vùng V của 23s rRNA A2142C, A2142G, A2143G, T2182C
Primer khuếch đại và GTT vùng V của 23s rRNA là DP1 và ZGE23
Và các vật dụng phòng vi sinh hỗ trợ cho việc làm KSĐ và E-test cho đối tƣợng nghiên cứu là vi khuẩn Helicobacter pylori.
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Tất cả các bệnh nhân có các triệu chứng về viêm loét dạ dày –tá tràng (bao gồm viêm, loét dạ dày, tá tràng hoặc viêm loét hỗn hợp) và các dấu hiệu nghi ngờ, đƣợc thông qua chẩn đoán và nội soi tại các bệnh viện trong tp.HCM
Các bệnh nhân này có thể đƣợc điều trị H pylori lần đầu hay lần sau và có thể kháng thuốc gửi tới công ty Nam Khoa từ 7-2014 đến 12-2015.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tất cả các bệnh nhân nằm trong đối tƣợng nghiên cứu đƣợc lấy 2 mảnh sinh thiết tại vùng rìa ổ loét Các mẫu sinh thiết đƣợc bảo quản trong glycerol lạnh (-20 0 C) trong thời gian chờ làm xét nghiệm Nếu không, phải tiến hành thí nghiệm tức thời vì vi khuẩn H pylori rất dễ chết khi ra ngoài Công tác lấy mẫu nội soi này đƣợc thực hiện tại các bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh
3.3.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát tỉ lệ nhiễm H pylori và xác định kiểu gene độc lực
Trong tất cả các mẫu gửi về Nam Khoa, sẽ được tiến hành theo 2 hướng:
+ Cấy phân lập trên môi trường BA và TSA
+ Phần mẫu còn lại sẽ đƣợc xử lý, ủ với TE và protein K qua đêm để tiến hành ly trích DNA
Phần kết quả cấy sẽ đƣợc sử dụng tiếp ở thí nghiệm 3 Còn phần mẫu sau khi ủ sẽ đƣợc load máy tách chiết DNA tự động trên King fisher-Dual nhƣ sau:
1000àLWash 3 Đặt Val-cumở đây
600àL Lysis Buffer 300àL mẫu đó ủ
30àL Hạt từ Thời gian làm việc
Trên phần mềm Bin-edit của King fisher ta sẽ thiết lập một protocol cho máy làm việc Cụ thể, thanh từ sẽ đi đến row D để cắp Cum đi làm việc, sau đó sẽ đến row A thực hiện lysis tại vị trí này trong vòng 15 phút để phá màng giải phóng DNA Các phân tử DNA sau khi trôi ra ngoài môi trường, nhờ ái lực điện tích sẽ bám lên các hạt từ bỏ sẵn trong giếng này Sau đó, thanh từ sẽ mang hạt từ qua các giếng rửa B, C, D, thời gian làm việc ở mỗi giếng rửa là 10 phút Sau đó thanh từ sẽ đi đến vị trí đặt strip elution để sấy khô và thôi DNA ra trên strip này
100àl 100àl 100àl 100àl 100àl 100àl 100àl 100àl 100àl 100àl 100àl 100àl
Sau khi máy báo quá trình ly trích kết thúc, mình sẽ hút DNA ra theo thứ tự giếng đã sắp xếp, tiến hành đo sơ bộ OD ban đầu, nồng độ OD thích hợp cho một phản ứng PCR là từ 1-10 ng Nếu nồng độ cao hơn, ta tiến hành pha loãng với một tỉ lệ thích hợp để đạt được nồng độ tương ứng
Hình 3.2 Máy King fisher Dual và các vật dụng đi kèm
3.3.1.2 Pha mix và tiến hành chạy PCR
Bảng 3.1 Pha mix PCR gene độc lực H pylori
Stock conc 1 re 50re Stock con 1 re 50re Stock con 1 re 50re
S1-FAM 5pm 0.05 2.5 M1-FAM 5pm 0.05 2.5 CAG-FAM 5pm 0.05 2.5 S2-HEX 5pm 0.05 2.5 M2-HEX 5pm 0.05 2.5
Tiến hành chạy PCR với chu trình nhiệt nhƣ sau:
95 o C – 15 phút 94 o C – 30 giây 60 o C – 1 phút 45 chy kỳ Sau khi máy kết thúc chu trình chạy, tiến hành đọc và ghi nhận kết quả Giá trị LOD được thiết lập chung cho toàn bộ các phản ứng PCR là 200 Từ đây, đường base- line sẽ cắt bỏ những tín hiệu nhiễu ban đầu
Hình 3.3 Máy real-time PCR và tín hiệu huỳnh quang
3.3.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát kiểu gene CYP2C19 và kiểu PPI
Tương tự như PCR gene độc lực, cùng một dịch ly trích ban đầu, những mẫu nào dương tính với H pylori sẽ được khảo sát tiếp theo trên mix CYP2C19 và kiểu
Pha mix CYP2C19 nhƣ sau:
Tiến hành chạy máy real-time với chu trình nhiệt nhƣ sau:
68 o C – 1 phút 45 chy kỳ Sau đó, tiến hành đọc và ghi nhận kết quả Từ kết quả đọc đƣợc của CYP2C19, ta suy ra các trường hợp có thể có của PPI tương ứng:
PPI Extensive metabolizers: Exon 5: wt/wt, Exon 4: wt/wt
PPI Intermediate metabolizers: Exon 5: m1/wt, Exon 4: wt/wt Exon 5: wt /wt, Exon 4: m2/wt
PPI Poor metabolizers : Exon 5: m1 /m1, Exon 4: wt/wt Exon 5: wt/wt, Exon 4: m2/m2
Exon 5: m1 /wt, Exon 4: m2/wt Đối với Primer CYP2C19, tỉ lệ CG nhiều hơn so với primer độc lực nên giá trị Tm cao hơn, chạy 68 o C kéo dài trong 45 chu kỳ để phân biệt rõ hai trường hợp Hete và Wt
3.3.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát giá trị MIC trên tất cả các đối tƣợng nghiên cứu thông qua E-test Clarithromycin
Từ bước cấy đầu tiên ở thí nghiệm 1, những mẫu cấy dương sẽ được phòng vi sinh tiến hành làm kháng sinh đồ với 5 loại kháng sinh đặc trị cho H pylori là:
Clarithromycin, Metronidazole,Tetracycline,Amoxicillin, Levofloxacin Đặc biệt, đối với kháng sinh Clarithromycin sẽ đƣợc tiến hành làm MIC trên E- test tẩm sẵn kháng sinh Clarithromycin Từ đó có cơ sở xác định chính xác sự kháng hay nhạy của đối tƣợng nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm tiếp theo
Hình 3.4 E-test Clarithromycin và đĩa đặt E-test
3.3.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát các đột biến điểm vùng V 23s rRNA
Song song với tiến trình kháng sinh đồ và E-test (thường khoảng 7-10 ngày), các chủng H pylori cấy dươngsẽ được tiến hành bắt khúm khuẩn, ly trích DNA tương tự nhƣ quá trình ly trích ban đầu Dịch DNA thu đƣợc sau quá trình ly trích sẽ đƣợc chạy song song 2 bước PCR để xác định và đối chiếu kết quả
Bảng 3.3 Pha mix PCR phát hiện các đột biến điểm vùng V 23s rRNA
Stock conc 1 re 50re Stock con 1 re 50re
Stock con 1 re 50re Stock con 1 re 50re
Total 15 750 Total 15 750 Đối với đột biến điểm vùng V 23S, tiến hành thiết kế primer khuếch đại chung vùng gene này và các probe được thiết kế riêng cho các đột biến điểm tương ứng
Sau đú, tiến hành bỏ mix real-time với tỉ lệ 15àl mix+5àl mẫu Chạy mỏy theo chu trình nhiệt sau:
94 o C – 30 giây 68 o C – 1 phút 45 chy kỳ Khi máy chạy xong, tiến hành đọc và ghi nhận kết quả
3.3.4.1 PCR và giải trình tự gene vùng V 23s rRNA, tìm đột biến gene trong các chủng tương ứng Ở thí nghiệm này ta dung cặp mồi DP1 và ZGE23 để khuếch đại đoạn gene 308bp ở vùng V 23s rRNA theo công thức sau:
Bảng 3.4 Pha mix GTT vùng V 23s rRNA
Tương tự như cỏc thớ nghiệm trờn chạy mix PCR với tỉ lệ :15àl mix+5àl mẫu
Tổng thể tớch phản ứng xuyờn suốt quỏ trỡnh thớ nghiệm là 20àl Đõy là PCR định tớnh, ta chạy chu trình nhiệt:
95 o C – 15 phút 94 o C – 30 giây 57 o C – 1 phút 40 chy kỳ 72 o C – 10 phút
Sau khi PCR kết thúc, ta điện di trên gel agar 2% để kiểm tra kích thước band đích trước khi sequencing
Hình 3.5 PCR khuếch đại vùng gene 23S của một số chủng nghiên cứu
So sánh kết quả đột biến gene giữa mẫu giải trình tự tương đồng với mẫu phát hiện đột biến gene bằng phương pháp Real-time PCR
Từ đó, phân tích kết quả về kiểu hình, kiểu gene của các chủng H pylori Đồng thời, đánh giá được độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Real-time PCR cho việc phát hiện gene kháng thuốc.
THÍ NGHIỆM 1 KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM H PYLORI VÀ TỈ LỆ KIỂU
4.1.1 Tỉ lệ nhiễm Helicobacter pylori tại tp HCM
Trong tổng số 303 mẫu gởi về công ty Nam Khoa trong thời gian nghiên cứu, có 110 mẫu cấy âm (chiếm 36%) và 193 mẫu cấy dương (chiếm 64%) Kết quả khảo sát ban đầu này cũng tương tự các nghiên cứu trước đây, cho thấy tỉ lệ nhiễm
Helicobacter pyloriở Việt Nam là khoảng 60-70% và chủ yếu tập trung ở người lớn
Thực tế, những mẫu gởi đến phòng xét nghiệm hầu hết là bệnh nhân đã qua nội soi và đƣợc chẩn đoán là có nhiễm Helicobacter pylori Tuy nhiên, vi khuẩn Helicobacter pylorirất yếu và dễ chết , việc cấy đƣợc vi khuẩn Helicobacter pylorirất khó khăn, mẫu thực sự không nhiễm Helicobacter pylorikhi cả kết quả cấy và PCR đều cho âm tính, còn không là do vi khuẩn đã chết trong quá trình vận chuyển mẫu ngoài không khí
Hiện nay chỉ có một số trung tâm ở thành phố Hồ Chí Minh cấy đƣợc vi khuẩn
Helicobacter pylori, trong đó có phòng vi sinh miễn dịch của công ty Nam Khoa
Hình 4.1 Tỉ lệ nhiễm Helicobacter pylori trong những mẫu gửi nghiên cứu
Số mẫu cấy dương chiếm hơn 50%, điều này cho thấy mức độ nhiễm H pylori ở tp HCM là cao và có nguy cơ lan rộng
Nhƣ đã trình bày, những mẫu cấy âm sẽ đƣợc xác định có hay không có sự hiện diện của vi khuẩn Helicobacter pyloribằng phương pháp PCR
Trong 110 mẫu cấy âm, có 65 mẫu cấy âm, PCR âm và 45 mẫu cấy âm, PCR dương tính
Nhƣ vậy, tổng cộng có 238 mẫu chứa vi khuẩnHelicobacter pyloritrong tổng số 303 mẫu, chiếm tỉ lệ lên đến 78,5% Điều này cho thấy sự có mặt thường xuyên của
Helicobacter pylori và đó là nguyên nhân chủ yếu gây ra viêm loét dạ dày và nguy cơ ung thƣ dạ dày Và PCR là giải pháp nhanh và chính xác để xác định có hay không sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh này
Hình 4.2 Tỉ lệ nhiễm Helicobacter pylori theo giới tính.Phân lập vi khuẩn
H pylori cho thấy 238 mẫu dương tính trên tổng số 303 mẫu Tỷ lệ nhiễm phân bố cao hơn ở nữ giới so với nam giới
Cùng trong 238 mẫu dương tính với Helicobacter pylori, có 134 trường hợp là nữ và 104 trường hợp là nam giới Cũng tương tự như các công bố trước đó, tỉ lệ nhiễm Helicobacter pyloriở nữ giới là cao hơn so với nam giới Một phần điều này đƣợc giải thích là do thói quen sinh hoạt và ăn uống hình thành
4.1.2 Tỉ lệ các kiểu gene độc lực của vi khuẩn Helicobacter pylori
Trong 193 mẫu cấy dương, kết quả PCR ban đầu cho thấy có nhiều type gene độc lực khác nhau Cụ thể, trên vacA gene, có 108 mẫu chứa s1/m1 chiếm 56%, 84 mẫu chứa s1/m2 chiếm 43,5 % và kiểu hiếm gặp ít độc lực nhất là s2/m2 chỉ có 1 mẫu và chỉ chiếm 0.5% trong tổng số ca nghiên cứu
Hình 4.3 Tỉ lệ các kiểu độc lực trên vacA gene Trong các type gene độc lực của vacA, type vacAs1/m1 là type có độc lực cao nhất Những vi khuẩn H pylori có kiểu gene thuộc type này có khả năng gây bào mòn thành dạ dày cao và nếu nhiễm lâu ngày dễ dẫn đến nguy cơ ung thƣ dạ dày Vì vậy, khi xét nghiệm thấy bệnh nhân nhiễm H pylori thuộc type này, các bác sĩ cần tăng liều thuốc điều trị để diệt trừ H pylori kịp thời
VacA gene kết hợp với CagA gene càng làm tăng tính độc lực của vi khuẩn
Helicobacter pylori Kết quả khảo sát trên 193 mẫu dương tính cho thấy vacA gene
1 s1/m1 kết hợp với cagA gene (+) là 106 mẫu và chiếm 55% và có 177 mẫu có chứa cagA gene trong tổng số 193 mẫu, chiếm tỉ lệ lên đến 92%
Cũng theo các khảo sát về viêm loét dạ dày và ung thƣ dạ dày, gene cagA (+) có ở tất cả các trường hợp ung thư dạ dày, và cagA (-) chỉ gặp ở viêm dạ dày Gene cagA (+) kết hợp với kiểu gene vacA của các chủng H pylori tạo ra các type với độc lực khác nhau Đặc biệt, ở chủng H pylori có gene cagA (+) và gene vacA s1/m1 cho thấy nguy cơ cao liên quan đến bệnh ung thƣ dạ dày
Hình 4.4 Tỉ lệ các type độc lực của vi khuẩn Helicobacter pylori Các nghiên cứu trước đây về H pylori ở Việt Nam cho thấy rằng, những chủng vi khuẩn có chứa cagA gene có mặt ở hầu hết các trường hợp bị ung thư dạ dày Một số ít có viêm loét dạ dày Nhƣ vậy, độc tố của cagA gene kết hợp với vacA gene là nguyên nhân chính gây nên các trường hợp loét dạ dày, ung thư dạ dày
Có nhiều trường hợp trong quá trình PCR chỉ có gene cagA hoặc một trong 2 gene s/m thuộc vacA Khi đó cần xem lại quá trình ly trích và thao tác bỏ mix, vì thực tế vacA gene đi kèm s1/m1 hoặc s1/m2 hoặc s2/m2
VacA s1/m1,cagA (-)VacA s1/m2,cagA (+)VacA s1/m2,cagA (-)VacA s2/m2,cagA (+)VacA s2/m2,cagA (-)
Bảng 4.1 Các trường hợp gene độc lực của H pylori trên real-time
PCRTrục OX thể hiện chu kỳ có sản phẩm PCR (Ct) Trục OY thể hiện giá trị nồng độ huỳnh quang RFU, tức là thể hiện số sản phẩm PCR mà probe màu bắt cặp được Như vậy, một tín hiệu PCR rõ phải lên ở chu kỳ khoảng từ 20-35 và nồng độ huỳnh quang phải >1000RFU để đảm bảo tín hiệu chính xác, không phải là tín hiệu nhiễu, dương giả trong quá trình thực hiện PCR
Nhƣ kết quả trong bảng 4.1,mẫu đƣợc coi là âm tính phải đảm bảo chứng nội tại (IC) lên để đảm bảo quá trình ly trích và chứng dương phải lên để đảm bảo chất lượng mix PCR
4.2 THÍ NGHIỆM 2 KHẢO SÁT KIỂU GENE CYP2C19 VÀ CHUYỂN HÓA PPI
4.2.1 Khảo sát kiểu gene CYP2C19 trên người
Nhƣ trên phần tổng quan đã giới thiệu, CYP2C19 một enzyme có 490 aa đƣợc mã hóa bỡi gene CYP2C19 gồm 9 exon nằm trên chromosome 10 (10q24.1-q24.3) Có nhiều loại đột biến CYP2C19 đƣợc công bố, tuy nhiên có 2 loại đột biến quan trọng dẫn đến poor metabolizer là đột biến “Splice defect” tại exon 5 (CYP2C19, G→A) và đột biến làm stop codon 636 (CYP2C19, G→A)
Và kết quả trong nghiên cứu này chỉ ra rằng, vị trí M1 trên exon 5 có đột biến điểm từ G→A và ở 3 trạng thái wild type (WT), heterozygous (HETE) và homorozygous (HOMO) Kết quả cho thấy đa số kiểu gene tại vị trí M1 là WT, có 102 mẫu và chiếm 53% trên tổng số
Hình 4.5 Tỉ lệ các kiểu gene trên M1 Tại vị trí M1, đột biến “Splice defect” trên exon 5 (CYP2C19, G→A), WT là nucleotide G, Hete là 2 nucleotide G,A chồng lên nhau và Homo là nucleotide A Nhƣ vậy, dựa trên kết quả nghiên cứu khi so sánh với giải trình tự, phương pháp Real-time PCR cho kết quả phân biệt rõ ràng giữa 3 trường hợp này
Tương tự M1, trên M2 của exon 4, WT cũng là kiểu gene điển hình, có 176 mẫu và chiếm 91%
Hình 4.6 Tỉ lệ các kiểu gene trên M2
Riêng đối với PCR CYP2C19, vì hầu hết mẫu bệnh phẩm là mẫu nội soi dạ dày ( chứa DNA người) nên không kiểm soát mix chứng nội tại, vì nếu quá trình ly trích gây ức chế mẫu thì PCR CYP2C19 sẽ không thành công Ở thí nghiệm này mỗi phản ứng chỉ chạy chứng âm, chứng dương để kiểm soát chất lượng mix PCR
Bảng 4.2 Các trường hợp real-time của CYP2C19 trên máy Biorad CFX96
THÍ NGHIỆM 3 KHẢO SÁT KIỂU GENE VÙNG V 23S RRNA CỦA H
4.3.1 Khảo sát tỉ lệ kháng các loại kháng sinh của Helicobacter pylori Để đánh giá sự kháng kháng sinh của H pylori ở Việt Nam, thử nghiệm tính nhạy cảm (MIC) đƣợc thực hiện với tỷ lệ kháng kháng sinh của từng loại liệt kê trong Bảng 4.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh đƣợc phát hiện từ cao nhất đến thấp nhất nhƣ sau: clarithromycin, metronidazole, levofloxacin, tetracycline và amoxicillin Trong tất cả các tác nhân kháng khuẩn, phần lớn các chủng đã kháng với clarithromycin, 85,5% số
ExtInterPoor bệnh nhân (84,6% ở trẻ em và 87,7% ở người lớn) Sự xuất hiện của kháng metronidazole là thấp hơn so với clarithromycin (tổng thể 37,8% so với 85,5%) Sự kháng thuốc ở người lớn là chủ yếu và cao hơn so với trẻ em, trừ amoxicillin với 12,5% ở trẻ em và 5,3% ở người lớn nhưng không có ý nghĩa thống kê Theo thống kê khác biệt đáng kể đã đƣợc quan sát thấy trong tỷ lệ kháng của levofloxacin (p 0,0108) giữa trẻ em và người lớn (Hình 4.8)
Bảng 4.3: Tỉ lệ kháng kháng sinh ở các chủng được phân lập.Trên 5 loại kháng sinh điều trị H pylori , tỉ lệ kháng clarithromycin là cao nhất, tiếp đến là metronidazole, levofloxacin, tetracycline và amoxicillin
Hình 4.8 Tỉ lệ kháng kháng sinh của H pylori trong 193 mẫu cấy phân lập Tỉ lệ kháng Clarithromycin là cao nhất và sự khác biệt đáng kể đã đƣợc quan sát thấy trong tỷ lệ kháng của levofloxacin (p = 0,0108) giữa trẻ em và người lớn
4.3.2 Khảo sát thí nghiệm MIC trên E-test để xác định cơ sở kháng nhạy của vi khuẩn Helicobacter pylori
Theo số liệu ban đầu, đa số các giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chủng kháng clarithromycin dao động từ 2 mg / ml đến 8 mg / ml Sự phân bố của các giá trị MIC đƣợc tóm tắt trong Bảng 4.4 Sự xuất hiện của kháng clarithromycin là 85,5 % (165 mẫu có MIC > 0,5 mg / ml trong trong tổng số 193 mẫu nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, phần lớn các chủng lâm sàng (105 của 193 mẫu, trong đó có 76 trẻ em và 29 người lớn) kháng clarithromycin được dao động từ 2 mg / mL đến 8 mg /ml Cũng trong 193 đối tƣợng này, chỉ có năm đối tƣợng (trong đó có bốn trẻ em và một người lớn ) cho MIC 24 microgam / ml , và một trường hợp có MIC > 256 mg / ml
Hình 4.8 Tần số tích lũy giá trị MIC Đa số lâm sàng phân lập kháng với phạm vi clarithromycin từ 2 àg / mL đến 8 àg / ml
Bảng 4.4 E-test cho Clarithromycin thực hiện trên 193 chủng nghiên cứu Đa số lõm sàng phõn lập khỏng với phạm vi clarithromycin từ 2 àg / mL đến8 àg / ml
4.3.3 Xác định kiểu gene vùng 23S thông qua real-time PCR và giải trình tự
Sau khi có kết quả về giá trị MIC đọc trên E-test, ta xác định mức độ kháng nhạy đối với kháng sinh Clarithromycin của vi khuẩn Helicobacter pylori Từ đó, kiểm tra các đột biến ở vùng 23s rRNA bằng real-time PCR và giải trình tự kiểm chứng.Tiến hành bắt khúm vi khuẩn tươi, ly trích DNA, chạy real-time PCR cho 4 loại mix A2142G, A2124C, A2143G, T2182C Đồng thời, cũng từ dịch vi khuẩn đó tiến hành chạy PCR khuếch đại đoạn gene vùng 23s để thực hiện giải trình tự kiểm chứng
Hình 4.9 PCR khuếch đại đoạn gene vùng V 23S của vi khuẩn H pylori Sản phẩm đích là band 308bp Để phân tích các đột biến điểm ở vùng gene 23S rRNA của những chủng kháng clarithromycin, thí nghiệm tiến hành khảo sát các đột biến ở vị trí 2142 (A2142G hoặc
A2142C), 2143 (A2143G), và 2182 (T2182C) Trong bảng 4.5, cả hai đột biến chủ yếu A2143G và T2182C đƣợc tìm thấy trong tất cả các chủng phân lập (181: 193 chủng kháng clarithromycin) Chỉ có hai chủng phân lập kháng clarithromycin ở người lớn có đột biến A2142G và T2182C (nhưng không đột biến A2143G) với giá trị MIC tương ứng 8 mg / mL và> 256 mg / ml Ngoài ra, 163 chủng trong tổng số 165 chủng kháng clarithromycin không có đột biến điểm ở một trong những vị trí 2142, 2143 hoặc 2182 trên gen 23S rRNA (98,8%) Trong số 28 chủng nhạy cảm, có ít nhất 26 chủng có một trong các đột biến A2142G đột biến, A2143G, T2182C (92,9%) Tỷ lệ chủng kháng có đột biến A2142G, A2143G và T2182C lần lƣợt là 98,8%, 6,1% và 4,9% Ngƣợc lại, tỷ lệ phần trăm của chủng nhạy cảm mà thực A2142G, A2143G và T2182C là 0,0%, 92,9% và 92,9% Ngoài ra, dựa trên breakpoint MIC khuyến cáo của EUCAST H pylori phân lập đƣợc coi là nhạy cảm khi MIC clarithromycin là ≤0.25 microgam / ml
Các dữ liệu nghiên cứu cho thấy rằng 22 của 24 chủng nhạy với clarithromycin-dễ bị cô lập với MIC ≤0.25 mg / mL chứa cả hai đột biến A2143G và T2182C Điều này cho thấy rằng các đột biến điểm trên kiểu gene vùng V 23S RNA thật sự không tương thích với các kiểu hình trên MIC, có nghĩa là các đột biến không thực sự quyết định việc kháng hay nhạy đối với kháng sinh của vi khuẩn này
Bảng 4.5 Giá trị MIC và những đột biến vùng V 23s rRNA của những chủng nghiờn cứu Cỏc giỏ trị này dao động từ 0.016-256 àg / ml, tuy nhiờn chủ yếu là từ
2 àg / mL đến 8 àg / ml
Trẻ em Người lớn Tổng số
Số đột biến 23S rRNA Số mẫu
Số đột biến 23S rRNA Số mẫu
Việt Nam có thể đƣợc phân loại nhƣ là một khu vực có tỷ lệ nhiễm H pylori cao và nhiều nguy cơ trung gian của bệnh ung thƣ dạ dày Do đó, việc điều trị tiệt trừ thành công H pylori là rất quan trọng để ngăn ngừa tái phát và làm giảm nguy cơ phát triển các bệnh dạ dày tá tràng Nghiên cứu hiện tại của chúng tôi cho thấy một tỉ lệ nhiễm H pylori ở tp.HCM khá cao, lên đến 78.5% Và đặc biệt, có khá nhiều chủng có gene gây độc cao, cụ thể, trên vacA gene, có 108 mẫu chứa s1/m1 chiếm 56%, 84 mẫu chứa s1/m2 chiếm 43,5 % và sự kết hợp s1/m1 với cagA gene (+) là
106 mẫu và chiếm 55% Đối với nghiên cứu về kiểu gene CYP2C19 và chuyển hóa PPI cũng cho thấy rằng, hầu hết các kiểu gene tại vị trí M1 và M2 là Wt ( 102:193 tại M1 và 176:193 tại M2), một số còn lại là Hete, rất ít trường hợp là Homo Điều này có nghĩa, đối với bệnh nhân nhiễm H pylori ở tp.HCM nói riêng và Việt Nam nói chung, tỉ lệ người phải uống thuốc nâng liều là khá cao và phải uống phối hợp kháng sinh nhiều Đối với tình hình kháng kháng sinh và các đột biến điểm vùng V 23s RNA tương quan Nghiên cứu hiện tại của chúng tôi cho thấy tỷ lệ kháng tổng thể cho clarithromycin và metronidazole tương ứng là 85,5% và 37,8% Đáng chú ý, nghiên cứu này nhấn mạnh rằng kháng clarithromycin là cao nhất trong số các loại kháng sinh điều trị
Một lợi ích nửa của nghiên cứu này là đánh giá sự biến đổi của các giá trị MIC thu đƣợc từ các chủng kháng clarithromycin Các lâm sàng đại diện từ niêm mạc dạ dày từ nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mức độ biến đổi trong giá trị MIC cho phân lập dao động từ 256μg / ml, với phần lớn các chủng kháng clarithromycin (EUCAST 2013 mẫn cảm / kháng > 0.5μg / ml) cho giá trị MIC dao động từ 2μg / ml để 8μg / mL
Mặc dù trên thế giới có sự ghi nhận rộng rãi rằng kháng clarithromycin trong các chủng H pylori có liên quan với ba đột biến điểm chính trong V miền của gen
23S rRNA: A2142C, A2142G và A2143G , tuy nhiên kết quả nghiên cứu của chúng tôi xác định rằng H pylori với các đột biến trong A2143G và T2182C không chỉ trong các chủng clarithromycin kháng mà còn trong các chủng nhạy cảm (22 của 24 mẫu phân lập clarithromycin nhạy cảm với MIC ≤0.25 mg / mL Hơn nữa, trong số 193 mẫu phân lập lâm sàng, 98,8% các chủng kháng thực không có đột biến điểm một trong những vị trí 2142, 2143 hoặc 2182 trong khi đó 92,9% các chủng nhạy cảm mang ít nhất một trong những đột biến điểm trên vùng gen 23S rRNA Nhƣ vậy, kết luận ban đầu là các đột biến này không thật sự quyết định tính kháng hay nhạy của H pylori với các kháng sinh, ngoại trừ vị trí A2142G cần nghiên cứu thêm
Kết quả hiện nay của chúng tôi xác nhận rằng các giá trị MIC là rất quan trọng để xác định chính xác các chủng kháng thuốc kháng sinh Tầm quan trọng của thử nghiệm tính nhạy cảm trước khi điều trị là cần thiết để chọn H pylori phác đồ điều trị tối ƣu tại Việt Nam Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng khác, đặc biệt là các đột biến của chủ nhà, sẽ cung cấp thêm ý vào sự phát triển của dấu ấn sinh học chẩn đoán và thuốc điều trị Đối với các nghiên cứu về kiểu gene kháng thuốcực sự, kiểu gene vùng V 23s RNA không thực sự quyết định việc này.Có thể vi khuẩn H pylori kháng kháng sinh theo một cơ chế khác chẳng hạn nhƣ cơ chế bơm kháng sinh ra ngoài bump flux Vì vậy, có thể mở rộng nghiên cứu thêm về các gene mRNA thong tin quy định cho việc này.
