Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện Escherichia coli 0157:H7 trên mẫu ray ăn sống bằng thực khuẩn thể tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CONG HÒA XÃ HOI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYEN THỊ TUYẾT NHUNG MSHV: 714

ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH

TRUONG DAI HOC BACH KHOAKHOA KĨ THUẬT HOA HOC

BO MON CONG NGHE SINH HOC

NGUYEN THI TUYET NHUNG

CHUYEN NGANH: Công Nghệ Sinh Học

MA SỐ CHUYEN NGÀNH: 60420201

LUAN VAN THAC SI

THANH PHO HO CHI MINH, NAM 2018

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA —DHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa hoc : TS HOANG ANH HOANG

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS NGUYEN THUY HUONG

Cán bộ cham nhận xét 2 : TS LƯƠNG THỊ MỸ NGAN

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Truong Dai học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCMngày 12 tháng 01 năm 2018.

Thành phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gôm:1 Chủ tịch: PGS.TS NGUYÊN ĐỨC LƯỢNG2 Thư ký: TS HOÀNG MỸ DUNG

3 Phản biện 1: PGS.TS NGUYÊN THÚY HƯƠNG4 Phản biện 2: TS LƯƠNG THỊ MỸ NGAN5 Ủy viên: PGS.TS LÊ PHI NGA

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CONG HÒA XÃ HOI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYEN THỊ TUYẾT NHUNG MSHV: 7140862Ngày, tháng, năm sinh: 25-03-1990 Nơi sinh: Đồng NaiChuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60420201

TEN DE TÀI: Xây dựng quy trình phát hiện Escherichia coli O157:H7 trên mẫu rau ănsống băng thực khuẩn thể tái tổ hợp

I NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:1 Xây dựng quy trình phát hiện Escherichia coli O157:H7 trên 4 mẫu rau: rau xà

lách, rau cải xanh, rau gia, rau ngò.2 Xác định thời gian phát hiện và độ nhạy của phương pháp.

Il NGÀY GIAO NHIEM VU : 10/07/2017HI NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 3/12/2017IV.CÁN BỘ HƯỚNG DÂN : TS HOÀNG ANH HOÀNG

LỜI CÁM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tại trường Đại học Bách Khoa —

ĐHQG TP Hồ Chí Minh, Tôi đã được tạo điều kiện và nhận được nhiều sự giúp đỡ, chiaSẽ.

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Hoàng AnhHoàng người đã truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện tốt cho tôi thực hiện và hoàn thành

luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học trườngĐại học Bách Khoa đã giảng dạy nhiệt tình, truyền đạt kiến thức, kỹ năng và tạo điềukiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị để tôi có thể thực hiện luận văn thuận lợi

Tôi xin chân thành cảm ơn quỹ Quốc tế về Khoa học (International Foundation forScience — IFS), Thụy Điển đã hỗ trợ tai chính cho nghiên cứu này (Mã số đề tài nhận tai

trợ E-5847-1).

Xin cảm ơn các em Thanh Xuân, Thanh Ngoan, Hoàng Yến, Thanh Trúc, Thị Hà

và các bạn, các anh chị lớp cao học Công nghệ Sinh học khóa 14 đã luôn ở bên cạnh,quan tâm và giúp đỡ tôi.

Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn của mình, con xin gửi đến ba mẹ lời tri ân sâusac, vì đã luôn thương yêu, động viên, luôn bên cạnh con và là chỗ dựa vững chắc cho

con.

TP Hồ Chi Minh, thang 01 năm 2018

Nguyén Thi Tuyét Nhung

TÓM TATE coli O157:H7 là chủng vi khuẩn gây bệnh pho biến, nhiều trường hợp ngộ độcthực phẩm do sự dụng rau nhiễm E coli O157:H7 đã được báo cáo Tại Việt Nam thóiquen ăn sống các loại rau làm tăng nguy cơ nhiễm E coli O157:H7 Do đó, trong nghiêncứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp phát hiên Escherichia coli O157:H7 trên mẫurau ăn sống băng thực khuẩn thé tái tổ hợp PPOlccp PP01ccp là thực khuẩn thé PPO1

mang gen mã hóa enzyme Cytochrome C Peroxidase (ccp), enzyme ccp được tao ra qua

quá trình xâm nhiễm đặc hiệu vào E coli O157:H7

Đề có thé phát hiện E coli O157:H7 tại nồng độ thấp, tăng sinh là giai đoạn cầnthiết, nhằm hạn chế sự cạnh tranh phát triển của các vi khuẩn có trên rau với E coliO157:H7 trong giai đoạn tang sinh sự kết hop 2 kháng sinh vancomicin và novobiocinVỚI nông độ novobiocin 5mg/L and vancomycin 10 mg/L đã được lựa chon dé str dung

trong quy trinh.

Phương pháp sử dung thực khuẩn thé tái tổ hop PPOlccp có thé phát hiện E coliO157:H7 ở nồng độ 2 CFU/g trên 4 mẫu rau ăn sống thông dụng là rau xa lách, rau cảixanh, giá và rau ngò sau thời gian 16,5 giờ Đây là phương pháp có độ nhạy cao, đồngthời có thé rút ngắn thời giai phát hiện vi khuẩn gây bệnh so với phương pháp truyềnthống sử dụng môi trường chuẩn SMAC agar hoặc các phương pháp khác dựa vào thựckhuẩn thé

E coli O157:H7 is a common pathogen Many cases of food poisoning due to theuse vegetables containing E coli O157:H7 have been reported In Vietnam, usage offresh vegetables in meals is popular resulting in the risk of E coli O157: H7 infection.Therefore,, in this study, we developed a method for the detection of FE coli O157:H7 inready-to-eat fresh vegetables by a recombinant phage Recombinant PPOlccp phage wasconstructed from PPO! phage that carries a gene encoding Cytochrome C Peroxidase(ccp) chromogenic enzyme PPOlccp produces the chromogenic enzyme through itsspecific infection into E coli O157:H7.

In order to detect E coli O157:H7 at low concentrations, pre-cultivation step wasneeded In this step, novobiocin and vancomycin, were selected to suppress backgroundbacteria without effect on EF coli O157:H7 in vegetables Concentrations of novobiocin 5mg L and vancomycin 10 mg L! were employed.

The method was able to detect E coli O157:H7 at very low concentration of 2CFU per gram of each vegetable; i.e lettuce, mustard greens, seed sprouts, or coriander;within 16.5 hours This is a highly sensitive and rapid method compared to conventionalmethod using the standard SMAC agar medium or orther existing phage-base methods

LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan những số liệu được trình bảy trong phân kết quả của luận vănnày là do tôi thực hiện, không sao chép của bất kỳ người nào khác.

Nguyễn Thị Tuyết Nhung

MỤC LỤC

LOL CAM ON ioecccccccscscscscscscscscscesesesesescscsvsvsvsvavsvavacacacscscscscscssssssssrssvsvavavassesssseseseseaeatanans iTĨM Os 6 G1115 111111111111 1101515 1111111111101 T110 00 1xx iiLOI CAM ĐOAN -G- TT 5 5 5111111111111 11111 T TT TH TT rờg ivDANH MỤC CHU VIET TAT 6s sEs SE St SE 91911 1E 9181151 1E 11115128 3 1g: viiDANH MUC 9-0 2 viii

LOI MỞ DAU Gv 5 5 1111111111111 1 111cc TT TT TH TH |CHƯƠNG 1 TONG QUAN TALI LIỆU 6 SG G662 E9E9EEE2EEESESEEESESEExEekekreresed |

l.] Escherichia Coli (EL CỌH) Q91 111 111111111 11 vớ 2

1⁄2 Hiện trạng nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm 3

1.3 Cac phương pháp phát hiện Escherichia Coli O1 57:HÏ7 c2 5

1.3.1 Phát hiện E coli O157:H7 bang mơi trường đặc hiệu + 5

1.3.2 Phuong pháp PC: Ăn 6

1.3.3 | Phương pháp phân tách miễn dich (IMS) 5-52 25252 +c+cseseseeesed 71.3.4 Phương pháp sử dụng thực khuẩn thỂ ¿- + - + 252 2E2E+E+E£E£EzEzverrsred 81.4 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp thực khuẩn thé trong phát hiện vi khuẩn gây

bệnh -.- Gv 1191915151515 111110101 1111111101110 1111111111110 001cc 9

CHUONG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 6s + E282 ESESEEE+ESEEeEseserees 142.1 Vật liệu — Thiết Div ce G1111 1911 1 1E 9111919110 0111115111 1101112 ng ng ưu 152.2.2 — Thiết bị - dụng CU cececccccccsccsccscscscsscsescscsesscscscscssssesessscsssescssscssssssessessseeees 15

2.2 Phương pháp nghiÊn CỨU G00 vn 17

22.1 Sơ đồ tơng quát 55c SE 2v SEE 2111112111111 1 1111 cke 172.2.2 Thuyết minh quy trình ¿+ - + s+++S++E+E+EE£E+EEEEEEEEEEEEErkrkrrkrkrrrrrrree 182.2.3 Thiết kế thí nghi@m oo cccsescscscssssescscsssscscscssssssesessscsssssscscesssesees 19A Tai kiểm tra hoạt tính thực khuẩn thé PP0Iccp - 2 255 525s+s+cs£cscs2 19i Tái kiỂm tra @€H CCP vevescesssssesesvssssssessssesssssesesesssssvssssescsssssssscsesssssssscsesvsssssseseess 19ii Tái kiểm tra hoạt tinh enzyme CCP được tơng hợp từ bộ gen thực khuẩn thê

[m009,8G:diddiđiâầđđiẳaẳiẳẳẳ 21B Lựa chon kháng sinh .- - - << << < «+ S999 9000 ke 22i Lựa chọn kháng sinh trên mơi trưởng BHI xa 22

li Lựa chọn kháng sinh trên ”8r/REEREREERR 23

C Xác định độ nhạy của phương pháp - c1 ng re 24

i Xác định nông độ E coli Q157: H7 sau khi tăng SIHÌH ĂĂĂĂSSSSss+ss++2 24ii Thử nghiệm hoạt tính phage trên MAU LAU 5-5-5525 SEsEsEsEseseseeered 26

D Xác định thời gian thử nghiỆm << 5 100199901 ng ke 28

CHUONG 3 KET QUÁ - BIEN LUẬN - - - - s E5E1SE E312 SE gvgerkes 303.1 Kết quả kiểm tra hoạt tính thực khuẩn thé PPOLCCp - - 2 2 25s s+s+cscee: 313.1.1 Kiém tra gen CCD vececscscssesesssssssssssessesssesscsescscsesesscsesecscsesecscsesssscsesesssaseeeseeeees 313.1.2 Kiém tra hoat tinh enzyme CCP duoc tong hợp từ bộ gen thực khuẩn thể

PPPO CC _ G Gà 32

3.2 Kết quả lựa chọn kháng sinh ¿- - - +52 3S E11 3 E51 5 1211171151111 e 333.2.1 Kết quả lựa chọn kháng sinh trên môi trường BHI - 5-5-5: 333.2.2 _ Kết quả lựa chọn kháng sinh trên mẫu rau 2- + 2 s52 s+s+xecszx+ẻ 353.3 Kết quả xác định độ nhạy ¿5-5256 2E+S2 E293 EEEE9E1 1211121211121 111 1111 cxyeU 363.3.1 _ Xác định nồng độ E.coli O157:H7 sau giai đoạn tăng sinh 363.3.2 Thử nghiệm hoạt tinh phage tren MGU VAU vecccccccccecesesesesssssesssssesssssssseseseseees 373.4 Kết quả xác định thời gian thử nghiệm c.cccccccscscssesescseseescsessesesessesesesseseseeseseeen 42CHUONG 4 KẾT LUẬN — KIÊN NGHỊ -G- + E12 EESESESESEEeEsEsEeEekesererees 444.1 KKẾt luận QC S1 T 1111 1111111 111111 TT ng net 45AQ Kiến nghị -c-c-S ST tEH T T1 11121 11 1111112111111 1111211101111 g re 45TÀI LIEU THAM KHHẢO óc 11x 569191 6 E5 11115111 E11 81 511113 11111211 re rrgkg 46

510858 21: ÒÔÒÒ-ö-ö-::55-ỌỌaa

DAECEAECEHECEIECELISA

EPECETECHCHUSIMSIPECLBMAECUPECPCR

SMAC

DANH MUC CHU VIET TAT

‘Brain Heart Infusin Broth (Môi trường BHI)

: Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát va

phòng ngừa dịch bệnh Hoa Ky):Diffusely adherent EF coli:Enteroaggregative E coli:Enterohaemorrhagic FE coli:EnteroinvasiIve E coli

:Enzyme Linked Imunosortben Asssay (Thử nghiệm hấp thụ miễn dichgăn enzyme)

:Enteropathogemic E coli:EnterotoxIgenIc E coli

‘Hemorrhagic Colitis (Bệnh viêm dai tràng xuất huyết)‘Hemolytic Uremic Syndrome (Hội chứng tan huyết urê): Immunomagnetic separation (phân tách miễn dịch)

:Íntestinal pathogenic E coli‘Luria Bertani (Môi trường LB):Meningitidis-associated E coli:Uropathogenic E coli

‘Polymerase chain Reaction (Phan ứng trùng hợp chuỗi nhờ

polymerase)Mac Conkey Sorbitol agar (Môi trường SMAC agar)

DANH MỤC HÌNHSTT NOI DUNG TRANGHinh 1.1 Escherichia coli O157:H7 qua kính hiên vi điện tử 2

(CDC.gov)Hình I2 coli O157:H7 trên môi trường Mac Conkey Sorbitol agar 5

Hình 13 Nguyên tac phát hiện E coli O157:H7 băng IMS (Bacbara va 7

Hình 3.6 — Sự thay doi ABSsso trong quá trình thử nghiệm enzyme với 39

dịch ly giải thu được sau quá trình xâm nhiễm của PP01ccp

Sự thay đổi ABSsso trong quá trình thử nghiệm enzyme vớidịch ly giải thu được sau quá trình xâm nhiễm của PP01ccphoặc PP01wt ở mẫu rau ngò.

Sự thay đối nồng độ E coli O157:H7 theo thời gian

40

4]

43

DANH MỤC BANG

STT NOI DUNG TRANGBang 2.1 Các cặp môi oligonucleotide sử dung PCR 20Bang 3.1 Phat hiện E coli O157:H7 tai nồng độ ban dau là 103 CFU/5 35

gram rau

Bảng 3.2 Nong độ E coli O157:H7 sau quá trình tang sinh với nồng độ 36

ban dau là 102 CFU/5g rau và 10! CFU/5g rau

DANH MỤC SƠ DO

STT NOI DUNG TRANGSơ đô 2.1 Sơ đồ tông quát phương pháp nghiên cứu 17Sơ đồ 2.2 Phương pháp tái kiểm tra hoạt tính enzyme CCP được tổng 21

hop từ bộ gen thực khuẩn thé PPO1ccpSơ đồ 2.3 Phương pháp lựa chọn kháng sinh trên môi trường BHI 22Sơ đồ 2.4 Phương pháp lựa chọn kháng sinh trên mẫu rau 23Sơ đồ 2.5 Phương pháp xác định nông độ E coli O157:H7 sau giai đoạn 24

tăng sinh

Sơ đồ 2.6 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính thực khuẩn thể PP01ccp 26

trên mẫu rau.Sơ đồ 2.7 Phương pháp xác định thời gian thử nghiệm 28

LỜI MỞ ĐẦUEscherichia coli (E coli) tồn tại một cách tự nhiên và hầu hết không gây hại trongđường tiêu hóa, Tuy nhiên, một số chủng E coli có thé gây bệnh cho người va một sốloài động vật Điển hình là chủng E coli 0157: H7 có kha năng sản xuất độc tổ Shiga,chúng là nguyên nhân chính gây hội chứng tan huyết urê với tỉ lệ tử vong 3-5% và tỉ lệbiến chứng là 25% trường hợp nhiễm.

E coli O157:H7 có ở động vật nhai lại đặc biệt là bò, cừu, một số động vật khácnhư thỏ, heo Chúng lây truyền sang người chủ yếu qua việc tiêu thụ thực phẫm bị ônhiễm như thịt, sữa, chưa nau chín Sự nhiễm E coli O157:H7 cũng liên quan đến việctiêu thụ trái cây và rau quả (bao gồm giá, rau bina, rau xà lách, salad ) bị ô nhiễm dotiếp xúc với phân từ động vật hoang dã hoặc gia súc trong giai đoạn nào đó trong quátrình trồng trọt hoặc xử lý (Hugh Pennington, 2010)

Theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật (CDC) ước tính rang E coliO157:H7 gây ra 73.000 trường hợp nhiễm bệnh, 2.200 trường hợp nhập viện, và 60trường hợp tử vong hang năm ở Hoa Kỳ E coli O157:H7 cũng gây ra nhiều vụ ngộ độctại nhiều nơi trên thé giới

Tại Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm đã xảy ra, đặc biệt là ngộ độc tập thé,rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại các bếp ăn tập thé không đảm bao vệ

sinh, an toàn chất lượng thực phẩm) Bộ Y tế cho biết năm 2016 cả nước xảy ra 129 vụ

ngộ độc thực phẩm với 4.139 người mắc, và 12 trường hợp tử vong, trong đó, 80% sé cangộ độc thực phẩm là do vi sinh vật

Trước tình hình an toản vệ sinh thực phẩm trên thế giới và Việt Nam đang diễn rahết sức phức tạp, yêu cầu kiếm soát mam bệnh này ngày càng lớn Do đó, việc xây dựngmột kỹ thuật có thé phát hiện E coli O157:H7 nhanh chóng, đơn giản với có độ nhạy caođang được tập trung nghiên cứu Bên cạnh các kỹ thuật truyền thống, kỹ thuật sử dụngthực khuẩn thể (bacteriophage) đang hứa hẹn là một kỹ thuật tối ưu trong phát hiện vikhuẩn gây bệnh

Thực khuẩn thé tái tổ hợp PPOlccp do TS Hoang Anh Hoàng và công sự xâydựng năm 2015, có khả năng phát hiện E coli O157:H7 trên môi trường chuẩn với độnhanh và độ nhạy cao Tuy nhiên, để có ứng dụng thực tế trong các mẫu thực phẩm cầnphải tiến hành nhiều thử nghiệm Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiêncứu dé tai: Xây dựng quy trình phát hiện E coli O157:H7 trên mẫu rau ăn sốngbằng thực khuẩn thé tái tổ hợp.

Mục tiêu của đề tài:

Xây dựng quy trình phát hiện E coli O157:H7 trên bốn mẫu rau ăn sống là rau xàlách, rau cải xanh, rau giá và rau ngò băng thực khuẩn thé tái tổ hợp PP01ccp

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

— Xây dựng phương pháp giúp phát hiện E coli O157:H7 với độ nhạy cao trong

thời gian ngăn

— Đề tài góp phần bảo đảm an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng,

phòng tránh tác nhân gây bệnh.

Nội dung nghiên cứu:

— Kiểm tra hoạt tính của thực khuẩn thể tái tổ hợp PP0Ilccp;

— Lựa chọn kháng sinh phù hợp cho giai đoạn tăng sinh FE coli O157:H7 trên các

mẫu rau xà lách, rau cải xanh, rau giá và rau ngo;

— Xác định độ nhạy của phương pháp;— Xác định độ nhanh của phương pháp.

CHƯƠNG 1 TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Escherichia coli (E coli)

E coli là vi khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3zm x 0.5wm; E colithường có hình que, không tao bào tử, có khả năng di động, có thé phát triển ở nhiệt độ từ5-40°C, nhiệt độ thích hợp nhất là 37°C Chúng được mô tả lần dau tiên bởi TheodorEscherich vào năm 1885 (Trần Linh Thước, 2003)

Hầu hết các chủng E coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hai trong đườngtiêu hóa, chúng còn đóng vai trò quan trong trong việc 6n định sinh lý đường tiêu hóa.Tuy nhiên, một số chủng E coli có thé gây bệnh cho người và một số loai động vật.Những chủng E coli gây bệnh được phân loại dựa trên nhóm huyết thanh, cơ chế gâybệnh, các triệu chứng lâm sàng, hoặc các yếu tố động lực (James và cộng sự, 2004)

Dựa vào cau trúc kháng nguyên, E coli được chia thành các kiểu huyết thanh Vớisự tổ hợp của các yếu tô kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều kiểu huyết thanh khácnhau Mỗi kiểu huyết thanh được ký hiệu bang kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7 (yếutố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại Bì)

Dựa vào vi tri gây bệnh các E coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành

2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E coli) hay

E coli gay tiên chảy (DEC-Dierrheagenic FE coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoàiđường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E coli).

Các loại E coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:

EPEC (Enteropathogenic E coli): E coli gay bệnh đường ruột

ETEC (Enterotoxigenic E coli): E coli sinh độc tô ruột

EIEC (Enteroinvasive E coli): E coli xam nhập ruộtEAEC (Enteroaggregative EF coli): E coli ngưng tap ruộtDAEC (Diffusely adherent EF coli): E coli bám dính phân tan

EHEC (Enterohaemorrhagic E coli): E coli gây xuất huyết ruột

Hai loại E coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trong nhất là:

MAEC (Meningitidis-associated E coli): E coli gầy viêm mang não

UPEC (Uropathogenic E coli): E coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu

Trong số đó, Enterohemorrhagic E coli (EHEC) gồm hon 100 serotype có khanăng san xuất độc tô Shiga và độc tổ giống Shiga (Shiga toxin-producing E coli) hay còngọi E coli có khả năng sản xuất độc tố Vero[VTEC]), chúng gây bệnh viêm đại tràngxuất huyết (Hemorrhagic Colitis_HC) và hội chứng tan huyết urê (Hemolytic UremicSyndrome_HUS) ở người Một số type huyết thanh EHEC thường gây bệnh ở người như

026:H11, 091:H21, O111:H8,O157:NM, và O157:H7 (Angela và cộng sự, 1996).

Trong đó, E coli O157:H7 là serotype thường xuyên gây bệnh ở người nhất, việcnhiễm E coli O157:H7 có thé xảy ra ở mọi lứa tuổi, và pho biến nhất là ở trẻ em vàngười gia Vì vậy E coli O157:H7 sẽ được tập trung nghiên cứu trong đề tai này

12 Hiện trạng nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm

E coli O157:H7 có ở động vật nhai lại, đặc biệt là bò, cừu, một số động vật khácnhư thỏ, heo Con người có thé bị nhiễm E coli O157:H7 do việc sử dụng các thực phẩm,nước bị bi ô nhiễm hay khi tiếp xúc với động vật, phân, đất bị nhiễm E coli O157:H7

E coli O157:H7 được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1982 như là một tác nhângây bệnh ở người liên quan đến vụ bùng phát tiêu chảy xuất huyết ở Oregon vàMichigan, Hoa Kỳ (Riley và cộng sự, 1983) và cũng liên quan đến những trường hợpHUS vao năm 1983 (Karmali và cộng sự, 2005) Kế từ đó, nhiều vụ bùng phát bệnh liênquan đến EHEC đã được báo cáo ở Hoa Ky và E coli O157:H7 là một trong những mambệnh chính trong thực phẩm Sự bùng phát bệnh do nhiễm E coli O157:H7 lớn nhất ở

Mỹ được báo cáo váo tháng 1 năm 1993 với hơn 700 trường hợp nhiễm bệnh và 4 trẻ emtử vong (Rangel et al., 2005) Tại Anh trong tháng 8 và tháng 9 năm 2009 có 96 ca nhiễm

bệnh 78 bệnh nhân có các triệu chứng va 17 trường hợp HUS Sự bùng phát dịch lớn

nhất đã xảy ra ở thành phố Sakai, Nhật Bản vào năm 1996, với 7966 trường hợp nhiễmkhuẩn (2764 đã được xác minh băng vi sinh học, 106 trường hợp HUS) do sự dụng củ cảitrang nhiễm E coli O157:H7 trong các bữa ăn của trường Các trường hợp nhiễm E coli

O157:H7 cũng được ghi nhận tại Châu Phi (tại Swaziland và Nam Phi vào năm 1990), 5

6 dịch đã được ghi nhận tai Walkerton, ON, Canada, năm 2000 (Hugh Pennington, 2010)

Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật (CDC) ước tính rang E coliO157:H7 gây ra 73.000 trường hợp nhiễm bệnh, 2.200 trường hợp nhập viện, và 60trường hợp tử vong hang năm ở Hoa Kỳ (Mead và cộng sự, 1999) Số liệu giám sát dichbệnh từ CDC cho thay, nhiễm E coli O157:H7 đang giảm sau đỉnh điểm vào năm 1999.Tuy nhiên, các vụ dịch bùng phát và các trường hợp nhiễm bệnh vẫn tiếp tục xảy ra Chỉphí bệnh tật hàng năm do nhiễm E coli O157:H7 khoang 405 triệu đô la, bao gồm chi phído mat năng suất lao động, chăm sóc y tế, và tử vong sớm (Frenzen va cộng sự, 1983)

Tại Việt Nam, từ ngày 8/7/2014 đến ngày 23/7/2014, xảy ra ô dịch tiêu chảy tại xãLê Minh Xuân, huyện Bình Chánh, TP Hồ Chí Minh Kết quả xét nghiệm 21 mẫu bệnhpham trong đó có 4 mẫu dương tính với E coli Ô dịch tiêu chảy tại ấp 5, xã Vĩnh Lộc A,

huyện Bình Chánh vào tháng 7/2014 ghi nhận 05 trường hợp tiêu chảy, trong đó có 1

trường hợp tử vong Kết quả phân tích của viện Pasteur TP HCM cho thay nguyên nhângây bệnh là do nhiễm E coli

Theo thống kê của bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có khoãng 250 — 500 vụ ngộ độcthực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 — 200 ca tử vong Trong đó, nguyên nhânngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm 34 - 49% Theo số liệu thống kê đến năm 2012của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, năm 2007 xảy ra nhiều nhất với 247 vụ với 7.239trường hợp ngộ độc, số nhập viện là 5.584 ca trong đó có 55 ca tử vong Năm 2008, có205 vụ ngộ độc với số trường hợp nhập viện là 7.829 và 62 trường hợp tử vong, cao nhấttrong cả giai đoạn Nhà nước đã chi trả rất nhiều tiền cho việc điều trị, xét nghiệm và điều

tra nguyên nhân.

Chi phí bệnh tật cao đòi hỏi những nỗ lực bố sung để kiểm soát mầm bệnh nay.Phát hiện nhanh và nhạy E coli O157:H7 là điều cần thiết để giảm thiểu sự bùng phátcủa các trường hợp bệnh, và hỗ trợ cho quá trình giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm.

1.3 Cac phương pháp phát hiện Escherichia coli O157:H7

1.3.1 Phát hiện E coli O157:H7 bang môi trường đặc hiệuKhác với hầu hết các chủng E.coli khác E coli O157:H7 chỉ sử dụng nguồn dinhdưỡng là peptone, không lên men sorbitol, do đó, băng cách sử dụng môi trường MacConkey Sorbitol agar (SMAC) có thé phát hiện E coli O157:H7 E coli O157:H7 sẽ tạokhuẩn lạc tròn trong suốt khác với các vi khuẩn khác Phát hiện E coli O157: H7 bằng

môi trường SMAC có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 85% và độ chính xác 86% (Sandra vàSamuel, 1986).

Đề tăng tính chọn lọc agar SMAC đã được cải thiện với việc bổ sung cefixime vàtellurite (CT-SMAC) Sự kết hợp của các phương pháp cefixime-tellurite sorbitolMacConkey (CT-SMAC), xét nghiệm miễn dịch enzyme E.coli (EHEC) và PCR đã đượcFey và cộng sự sử dụng để kiểm tra sự có mặt của của Escherichia coli sản xuất độc tỗShiga trong các mẫu phân tiêu chảy từ Nebraska (Paul và cộng sự, 2000)

Một phiên ban cải tiến của môi trường CT-SMAC medium được sản xuất bang

cách thêm salicin và 4-methylumbelliferyl-B-d-galactopyranoside vào môi trường

CT-SMAC; môi trường này được gọi là môi trường CT-SSMAC và được sử dụng dé phân

lập Escherichia coli O157:H7 từ củ cai củ cai (Fujisawa và cộng sự, 2000).

E coli O157:H7

Hình 1.2 E coli O157:H7 trên môi trưởng Mac Conkey Sorbitol agar

Ưu và nhược điểm của phương pháp:

Ưu điểm: phân biệt được vi sinh vật sống và vi sinh vật chết, đơn giản, it tốn kém,có thé phát hiện E coli O157:H7 ở nông độ thấp

Nhược điểm: phương pháp nay tốn nhiều thời gian vì phải mat hon một ngày détiền nuôi cay

1.3.2 Phương pháp PCR

Dựa trên nguyên tac chung của phương pháp PCR, áp dụng riêng cho đối tượngnghiên cứu là E coli O157:H7 E coli O157:H7 là vi khuẩn thuộc dòng EHEC với nhữnggen đặc trưng là stxl, stx2, eaeA, hlyA Tiến hành PCR để xác định sự hiện diện của E.coli O157:H7 bang cách sử dụng bốn cặp môi đặc hiệu nhăm phát hiện sự hiện diện củagen stxl, stx2, eaeA và hlyA Một cách tiếp cận phổ biến khác là sử dụng phương pháp

multiplex real-time PCR.

Trong nghiên cứu cua Patricia va Rosa năm 2008, multiplex single-tube real-time

PCR đã được dùng dé phát hiện đồng thời E coli O157:H7, Salmonella spp vaStaphylococcus aureus Điều kiện phản ứng đã được điều chỉnh cho sự khuếch đại vàphát hiện đồng thời các đoạn cụ thể là gen j-glucuronidase (uidA, E coli), gen

Thermonulease (nuc, aureus Sta.), và trình tự oriC (oriC, Salmonella spp.)

Trong nghiên cứu cua Markus va cộng sự năm 2011, phan ứng real-time PCR với

các gen stxl, stx2, eaeA, ehx A, O-antigen đã được nghiên cứu dé phát hiện các chủngEHEC ở nông độ 1-10 CFU/25¢ rau

Ngoài ra, khung đọc mở (ORF), Z3276, được xác định là một marker di truyền đặchiệu cho việc phát hiện E coli O157:H7 Năm 2012, Baoquang và chen, đã phát triển thửnghiệm real-time PCR với mỗi và mẫu dò ORF Z3276 và xác nhận rang thử nghiệm nàyrat nhạy cảm và đặc hiệu đối với chủng E coli O157:H7 (n = 298)

Ưu điểm va nhược điểm của phương pháp PCR

Ưu điểm: Thời gian cho kết quả nhanh, cho phép phát hiện trong 4-16 giờ, tùythuộc nông độ vi khuẩn trong mẫu ban dau cao hay thấp

Nhược điểm: Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết,do vậy có thé dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết, đồng thời

phương pháp này bị hạn chế khi kiểm tra các mẫu môi trường do sự hiện diện rộng rãicủa các gen này trong các vi khuẩn không gây bệnh (Oda và cộng sự, 2004).

1.3.3 Phương pháp phân tách miễn dịch (Immunomagnetic separation_IMS)IMS cho phép bắt và tập trung nhanh các vi khuẩn mục tiêu từ các mẫu nghi ngờnhiễm khuẩn Các hạt từ tính thường là các hạt cầu 2-3uum chứa Fe2O4 và Fe3O4 Chúngchỉ có từ tính khi có từ trường và dễ dàng tách rời nhau khi ra khỏi vùng từ trường Cáchạt từ tính được phủ với các kháng thé hoặc liên hợp kháng thé đặc hiệu với vi khuânmục tiêu Bằng cách đặt một từ trường mạnh lên bên ngoài của ống phản ứng, các hạt vàvi khuẩn có thé được cô định trên thành ống Điều này cho phép loại bỏ có chọn lọc phancòn lại của các mẫu bao gồm vi khuẩn không phải là mục tiêu và các hạt hữu cơ khác.Các hạt sau đó được giải phóng bang cách thu hồi nam châm Bước đơn giản này của thủtục IMS có thé giúp chúng tôi tách STEC khỏi các mẫu một cách dễ dàng (Jinwoo và

cộng sự, 2005).

J-r Sample Matrix GD F0/i 0157:H7PS\ Mab-EAMNP

Hình 1.3: Nguyên tac phát hiện E coli O157:H7 bang IMS (Bacbara và cộng sự,

2015)

Trong nghiên cứu của Bacbara và cộng sự năm 2015, IMS đã được phát triển để

phát hiện E.coli O157:H7, họ sử dụng các hạt nano từ hoạt động điện tử (EAMNPs) va

được cải tiễn bang cách bồ sung natri clorua trong suốt quá trình liên hợp các kháng thévào MNPs Độ nhạy của phương pháp IMS là lớn nhất khi có nồng độ kháng thể cao (1,0mg/mL) trong suốt quá trình liên hợp Nông độ EAMNP 1,0 và 0,5 mg/mL sẽ cho độnhạy phan tích va độ đặc hiệu phân tích tối ưu

Sự kết hợp IMS với phương pháp miễn dịch huỳnh quang, được gọi là phươngpháp miễn dich từ huỳnh quang (IMFA), có thé phát hiện E coli O157:H7 Dau tiên, Tếbào E coli O157:H7 được bắt giữ bởi hạt từ tính mang kháng thé kháng O157, sau đóđược nhận diện bởi một kháng thể phát huỳnh quang tạo thành một phức hợp miễn dịch-

immunosandwich (Peixuan và cộng sự, 2011).

Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp IMSƯu diém: phương pháp này cho kết quả nhanh, đơn giảnNhược điểm: vật liệu và thiết bị phát hiện dat tiền.1.3.4 Phương pháp sứ dụng thực khuẩn thé

Hình 1.4 Thực khuẩn thé T4 và thực khuẩn thé T4 đang xám nhiễm E coli

(fineartamerica.com)

Thực khuẩn thé là công cụ lý tưởng có thể được sử dung dé phát hiện vi khuẩn.Những phage này phát triển đồng thời với vi khuẩn chủ và chúng có thé nhận diénthi bòvà xâm nhiễm đặc hiệu với các vi khuẩn chủ Chu kỳ xâm nhiễm hoàn toàn của một thựckhuẩn thé độc thường chỉ mat 1-2 giờ, ngoài ra, thực khuẩn thé dé dàng nuôi cấy va sảnxuất đơn giản, kha năng phát triển mạnh (vi dụ, chúng có độ nhạy thấp với sự thay đổicủa nhiệt độ và pH, dung môi hữu cơ, va proteases) và có thé phân biệt giữa tế bào sốngvà tế bào chết (do thực khuẩn thể chỉ nhân lên trong tế bào sống) (Schmelcher và

Loessner, 2014).

kháng thể anti-E coli Dynabeads sẽ được bắt giữ E coli O157:H7, thực khuan thé LG1

sau khi b6 sung sẽ tăng sinh trong tế bao chủ Cuối cùng các tế bao E coli O157:H7 mớiđược bổ sung, được gọi là các tế bào khuếch dai tín hiệu-SACe Sự thay đôi của mật độquang sẽ phản anh nên sự xuất hiện của E coli O157:H7 trong mẫu thực phẩm

Năm 2004, Masahito và cộng sự đã tạo thực khuẩn thé PPO1 tái tổ hợp mang genphát phát huỳnh quang GFP bằng cách đưa gen GFP vùng C và N của SOC để tạo ra cácthực khuẩn thé tái tổ hợp PP01-GFP/SOC và PP01-SOC/GEP, tương ứng, thực khuẩn thétái tô hợp này giúp phát hiện E coli O157:H7 một cách nhanh chóng với độ nhạy cao

Cũng vào năm 2004, Tanji và cộng sự đã tạo thực khuẩn thé T4 tái tổ hợp manggen huỳnh quang GFP (T4e-/GFP) cho phép nhận biết E coli K12 với các tế bào khác

chỉ trong vòng | giờ Trên vỏ của T4e—/GFP sẽ trình diện protein phát huỳnh quang mau

xanh (GFP) Đồng thời phage tái tổ hop này sẽ không sản xuất lysozyme chịu tráchnhiệm cho sự ly giải tế bào chủ Tế bào E coli K12 bị xâm nhiễm bởi T4e-/GEP sẽ tạotín hiệu huỳnh quang khác biệt với các tế bao vi khuẩn không bị xâm nhiễm.

Một thực khuẩn thé tái tổ hợp PP01-/ux7 đặc hiệu với E coli O157:H7 đã đượcxây dung, khi xâm nhiễm vào E coli O157:H7 sẽ tổng hợp N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone (OHHL) Phage PPO1 này mang gen lux từ Vibrio fischeri được kiểmsoát bởi phage promoter PL OHHL được tong hợp bởi E coli O157:H7 bi xâm nhiễm tạora sự phát quang sinh học ở các tế bào mang operon V fischeri lux Phage tạo ra phátquang sinh học trong các tế bào trong vòng 1 giờ khi tiếp xúc với E coli O157: H7 nồngđộ 10? CFU/mL và có thé phát hiện được E coli O157: H7 nông độ 10 CFU/ml trongnuôi cay tinh khiết sau bước tăng sinh (tổng thời gian phát hiện, 4 gid) Phương pháp nàyđược áp dụng cho nước ép táo bị ô nhiễm và có thể phát hiện được 10 CFU/ml E coli

O157:H7 trong 2 giờ sau khi tăng sinh 6 giờ (Jennifer và cộng su, 2007).

Steven và cộng sự (2008) đã tạo thành công thực khuẩn thé tái tổ hợp PPO1-luxImang gen phát quang sinh học (uxI/ IuxR) kết hợp với hệ thống real-time Xenogen IVIS(hình 1.7 ), họ đã phát hiện FE coli O157:H7 ở nồng độ ban đầu của 1 CFU mL"! trongmẫu nước ép táo trong khoảng 16 giờ sau 6 giờ nuôi cay tăng sinh, phát hiện 1 CFU mL”!trong mẫu nước máy trong khoảng 6,5 giờ sau 6 giờ nuôi cay tăng sinh và phát hiện E.coli O157: H7 trong lá rau bina với nồng độ 1 CFU/mL trong khoảng 4 giờ sau 2 giờ nuôicấy tăng sinh Tuy nhiên, phát hiện E coli O157:H7 trong thịt bò đã không thành công,có thể là do sự xuất hiện tự nhiên của chất tự đông đặc hiệu nhận dạng túc số (N-3-

(oxohexanoyl)-L-homoserine lactone, OHHL), tạo ra tín hiệu bioreporter dương tính gia

trong các mẫu thịt bò

¬ i \ — AMP + PPi NADPH

AAA Le u ỉ x.n ở é — `y aAoy-ACP _— a way ` + 9o sua © 0

¬Ẳẳ vụ Alt synthase) › Ac (Transfcrase) ied 3

x AA OHHL _—— n -^¬—~ aL JO S N-G-oxohexanoyl}1.h Myristol-ACP Myristic acid eo` suy t *% LuxAB Eg, FMNH,

2010).

Juhong và cộng sự (2015) đã sử dụng thực khuẩn thé T7 liên kết với các hạt từtinh dé phát hiện E coli trong nước uống như sau: phage T7 liên kết với hạt từ tính sẽ bắtvà tach E coli ra khỏi mẫu nước uống sau đó, phage sẽ ly giải tế bào vi khuẩn giải phóngB-galactosidase (B-gal), B-gal sẽ được phát hiện bang cơ chất chlorophenol red-B-D-galactopyranoside (CRPG), màu của cơ chất sẽ thay đối từ vàng sang đỏ khi có B-gal(hình 1.8) Với phương pháp nay Chen và cộng sự đã báo cáo là có thé phát hiện E coli10! CFU/mL nước uống sau 6h tiền nuôi cay

Các phương pháp sử dụng thực khuẩn thể trên có khả năng phát hiện E coliO17:H7 với độ nhạy cao trong thời gian ngắn Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏiphải sử dụng các trang thiết bị đắt tiền Để khắc phục nhược điểm này năm 2015, TS.Hoàng anh Hoang và cộng sự đã tạo thành công thực khuẩn thé PP01ccp, có khả năng E.coli O17:H7 trong môi trường chuẩn dựa vào sự thay đổi màu sắc của cơ chất (Hình 1.8).

Giai phong enzyme sau

khi tế bào bị ly giải y “WN

CHUONG 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vat ligu — Thiết bị

Cao nam nem Peptone

Môi trường BHI CaClsTris.HCI NaCl

Gelatin Glycerol

Vancomicin Novobiocin

Mac Conkey Sorbitol agar

2.2.2 Thiết bị - dụng cụThiết bị

Nồi hấp tiệt trùng Hirayma Tủ ủ 6n nhiệt MMM GroupMay lắc 6n nhiệt JISICO Máy vortex VELP ScientificaTủ cay vô trùng ESCO Lò vi sóng SHARP

Cân điện tử Sartorius Máy đo pH HANNA

Máy đo quang phô ChromTech Máy lắc 6n nhiệt JISICO

Becher

2.2 Phương pháp nghiền cứu

2.2.1 Sơ đồ tổng quát

E coli O157:H7 vàphage PP0lccp

Lựa chọn kháng sinh

Xác định độ nhạy

`

Kiểm tra hoạt tính thực

khuân thê PPOlccp trên môi

trường chuân

Kiểm tra hoạt tính thực khuẩn

thê PP01ccp trên mâu rau

Xác định thời gian thử

nghiệm

Quy trình phát hiện E coliO157:H7 băng thực khuânthê PP01ccp trên mâu rau

Sơ đồ 2.1: Sơ đô tong quát phương pháp nghiên cứu

2.2.2 Thuyết minh quy trìnhQuy trình phát hiện E coli O157:H7 bang thực khuẩn thé PP01ccp trên mẫu rau được

xây dựng như sau:

Bước 1: Kiếm tra hoạt tính CCP của thực khuẩn thé PP01ccp đã được tao trong nghiên

cứu trước trong môi trường BHI.

Hoạt tính của thực khuẩn thể PPOlccp được đánh giá dựa trên sự hiện diện của gen ccp

và hoạt tinh protein Cytochrome C Peroxidase được mã hóa bởi gen ccp trong môi trường

Bước 3: Xác định độ nhạy

Tăng sinh E coli O157:H7 ở các nồng độ 101, 10? cùng với 5g rau, sau đó kiểm tra nồngđộ E coli O157:H7 sau khi tăng sinh bang SMAC agar, từ đó xác định được nồng độE.coli O157:H7 sau khi tăng sinh làm cơ sở nhằm xác định nông độ E coli O157:H7 thấpnhất có thé phát hiện bằng phương pháp thực khuẩn thé

Tang sinh E coli O157:H7 ở các nồng độ 10!, 10? cùng với 5g rau, sau đó xâm nhiễmphage và tiến hành thử nghiệm enzyme

Bước 4: Xác định thời gian thử nghiệm

Tăng sinh E coli O157:H7 với thời gian khác nhau cùng với 5g rau, sau đó kiểm tra nồngđộ E coli O157:H7 sau khi tăng sinh băng SMAC agar, từ đó xác định được thời gianngăn nhất dé nồng độ E coli O157:H7 đạt ngưỡng có thé phát hiện bằng thực khuẩn thé,

từ đó xác định thời gian thử nghiệm.

2.2.3 — Thiết kế thí nghiệmA Tái kiểm tra hoạt tính thực khuẩn thé PP01cep

i Tai kiêm tra gen ccp

Trong nghiên cứu trước đây chúng tôi đã tiến hành xây dựng phage PP0Icep:Đoạn ADN (PP01soc-mrh2) tương ứng với gen PP0I soc và chuỗi N-terminal củagen mrh2 được khuếch đại bang cach su dung cap mỗi socF/mrh2R được thiết kế dựatrên mỗi được sử dụng trong nghiên cứu của Oda và cộng sự (2004), nơi các chuỗi choquá trình cắt giới hạn đã được thay đổi, và phage PPO1 tự nhiên (PP01wt) được sử dụnglàm khuôn Sau đó sản phẩm được cat bang enzym EcoRI/Apal, đoạn PCR được chènvào vị trí EcoRI/Apal của plasmind pCR2.1-TOPO (Invitrogen, CA, USA) để tạo raplasmid vector pCRPP01mrh2 Doan gen ccp được khuếch đại băng cặp môi cepF/ccR.Sản phẩm PCR được cắt băng Spel/EcoRI được chèn vào vị trí Spel/EcoRI củapCRPP01mrh2 để tao ra vector plasmid pCRPP01Iccpmrh2 Doan DNA (PP01g56)khuếch đại từ bộ gen PP01wt sử dung cặp môi g56F/socNR được thiết kế dựa trên cặpmôi được sử dụng trong nghiên cứu của Oda và cộng sự (2004), trong đó các trình tự cắtgiới hạn đã được thay đối Sản phẩm PCR được cắt bang băng Kpni/SacI và chèn vàopCRPP01ccpmrh2 dé tạo ra vector pCRPP0Iccp

Gen ccp đã được tích hợp vào bộ gen PP01wt bởi sự tái tổ hợp tương đồng VectorpCRPP01ccp được biến nạp vào E coli O157:H7 bang cách sử dụng điện biến nạp GenePulser II (Bio-Rad, CA, USA) với các cài đặt sau: 1.8 kV, 25 uF và 200 Q Các tế bao E.coli O157:H7 tái tổ hop được nuôi cấy trong môi trường Luria-Bertani (LB) bố sung50mg L"! ampicilin Đến ODaoo đạt 0,1, PPOlwt đã được thêm vào với giá trị M.O.I là0.01 Sau khi ủ ở 37°C, 120 vòng/phút trong 4 giờ, môi trường nuôi cấy đã được lọc quamột mảng lọc 0,45 um (Advantec, Tokyo, Nhật Bản) thu lay phage ly giải Phage ly giải

được pha loãng với đệm SM (100 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, 0,01% gelatin, và 50 mMTris-HCl [pH = 7,5]).

Phage ly giải được pha loãng được trộn với E coli O157:H7 trong môi trường LB

0.7% agar va được phủ lên các đĩa LB Phage PP01 tái tổ hợp mang gen ccp (PP01ccp)

đã được phân lập bằng cách lai với một đầu dò đánh dấu Digoxigenin (DIG) Trongnghiên cứu này chúng tôi kiểm tra sự tích hợp gen ccp vào bộ gen của phage PP01 bằngPCR sử dung các cặp mỗi trong bang 2.1

Bang 2.1 Các cặp môi oligonucleotide sử dụng PCRMỗi, mẫu dò Trình tự (5° > 3’) Tham khao

socF(EcoRI) TTCCGGAATTCCATGGCTAGTACTCGCGG Oda va cs., 2004mrh2R(Apal) TTAGGGCCCGGTTTAATCCAACGATTTAACAT Oda và cs., 2004g56F(Kpn]) CGGGGTACCGAAGAAATCTTTAAACTTTATTATCTG Oda và cs., 2004

PPO1socNR(Spel) GGACTAGTTCTCCTTTTATTTAAATTACATGAC Oda va cs., 2004

cepF(Spel) GGACTAGTATGACACCGCTCGTTCATGT Iffland va cs., 2000cepR(EcoRI) TTCCGGAATTCCTATAAACCTTGTTCCTC Iffland va cs., 2000cep probe GGGACTCTAAGAGCGGCTACATGA Hoang va cs, 2015

ii Tái kiểm tra hoạt tính enzyme CCP được tổng hợp từ bộ gen thực khuẩn thể

được trộn với đệm phosphate (50mM KHaPOa, pH 6.0), cytochrome c, và H2O2 theo hệ

số pha loãng bậc 10, với nồng độ cuối của cytochrome c, và HạO› lần lượt là 0.9uM,360M Dung dịch phan ứng được do ở bước sóng 550nm băng máy đo quang phổ saumỗi phúi