Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Xây dựng quy trình định lượng alanine trong mẫu thử và khảo sát ảnh hưởng của alanine đến quá trình kết tinh glutamic acid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ CÔNG MINH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALANINE TRONG MẪU THỬ VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ALANINE ĐẾN QUÁ TRÌNH KẾT TINH GLUTAMIC ACID

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 8520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Huỳnh Khánh Duy

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Bùi Tấn Nghĩa

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Trương Vũ Thanh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG Tp HCM ngày 05 tháng 02 năm 2023

Thành phần hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Hoàng Thị Kim Dung 2 Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Bùi Tấn Nghĩa

3 Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Trương Vũ Thanh 4 Ủy viên: TS Phan Thị Hoàng Anh 5 Thư ký: TS Nguyễn Đăng Khoa

Xác nhận của Chủ tịch hội đồng đánh giá LV và Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Lê Công Minh MSHV: 2070036 Ngày, tháng, năm sinh: 10/04/1997 Nơi sinh: Trà Vinh Chuyên ngành: Kỹ thuật Hoá học Mã số: 8520301

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Phát triển phương pháp phân tích sắc ký đầu dò huỳnh quang nhằm phân tích được 2 đồng phân L-Alanine và D-Alanine; định lượng hàm lượng của chúng trong mẫu thử - Khảo sát ảnh hưởng của Alanine đến quá trình kết tinh Glutamic acid

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2022

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 25/11/2022 IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Huỳnh Khánh Duy

Tp HCM, ngày … tháng ….năm

TS Huỳnh Khánh Duy PGS.TS Lê Thị Hồng Nhan

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc và chân thành nhất đến TS Huỳnh Khánh Duy, thầy đã hướng dẫn bằng sự tận tình trong quá trình tôi thực hiện luận văn Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy cô, cán bộ đang công tác tại Khoa Kỹ thuật Hóa học đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức chuyên môn cần thiết trong suốt khoá học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị em đồng nghiệp đã hỗ trợ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành tốt luận văn này

Cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên, ủng hộ và trở thành chỗ dựa vững chắc cho con trên con đường học vấn Cảm ơn những người bạn đã luôn giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Đề tài tiến hành xây dựng quy trình định lượng Alanine trong mẫu thử và khảo sát ảnh hưởng của Alanine đến quá trình kết tinh Glutamic acid Thông qua kết quả thực hiện, luận văn đã xác định điều kiện sắc ký phù hợp để định lượng Alanine trong mẫu thử: pha tĩnh là cột MCI Gel CRS10W (3 µm, 50 x 4,6 mm), pha động dung dịch CuSO4 0,1 mM Phương pháp đã được thẩm định và đạt được các tiêu chí đánh giá Với ưu điểm phân tách được đồng phân L-Alanine và D-Alanine trong mẫu thử với độ nhạy và độ chính xác cao giúp nâng cao hiệu quả phân tích Đề tài cũng đã khảo sát được ảnh hưởng của Alanine đến quá trình kết tinh Glutamic acid, từ đó kết luận Alanine có vai trò kích thích sự tăng trưởng kích thước tinh thể, nâng cao hiệu suất li tâm giảm thất thoát sản phẩm

ABSTRACTS

The topic of this thesis is to develop a quantification process for Alanine in the sample and investigate the influence of Alanine on the crystallization process of Glutamic acid Based on the results obtained, the thesis identified the appropriate chromatographic conditions to quantify Alanine in the sample: the stationary phase is MCI Gel CRS10W column (3 µm, 50 x 4.6 mm), and the mobile phase is CuSO4 0,1 mM solution The method has been evaluated and met the evaluation criteria With the advantage of separating L-Alanine and D-Alanine isomers in the sample with high sensitivity and accuracy, the efficiency of the analysis is enhanced The thesis also investigated the effect of Alanine on the crystallization process of Glutamic acid and concluded that Alanine plays a role in stimulating the growth of crystal size, increasing the efficiency of centrifugation and reducing the loss of products

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện nghiên cứu này đã được cảm ơn, các số liệu sử dụng phân tích có nguồn gốc và trích dẫn rõ ràng theo đúng quy định

TP.Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 11 năm 2022 Tác giả

Lê Công Minh

1.1.3 Ứng dụng và vai trò của glutamic acid 2

1.1.4 Phương pháp sản xuất Glutamic acid 4

1.1.5 Những nghiên cứu về quá trình kết tinh Glutamic acid 6

1.2 Tổng quan về Alanine 8

1.2.1 Cấu trúc hóa học 8

1.2.2 Tính chất hóa lý 8

1.2.3 Ứng dụng và vai trò của của Alanine 10

1.2.4 Những nghiên cứu trước đây về định lượng Alanine 12

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng 15

1.4 Thông số đánh giá hiệu quả sắc ký 17

1.5 Sắc ký trao đổi ligand 19

1.6 Thẩm định phương pháp 20

1.6.1 Tính đặc hiệu 21

1.6.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 22

1.6.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 25

1.6.4 Độ chính xác (accuracy) 27

1.6.5 Độ chụm (precision) 28

1.6.6 Độ đúng (trueness) 29

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 32

2.1 Mục tiêu – nội dung nghiên cứu 32

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 32

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 32

2.2 Hóa chất – thiết bị 32

2.2.1 Hóa chất 32

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 32

2.3 Phương pháp thực nghiệm 33

2.3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình định lượng Alanine trong mẫu thử 33

2.3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp 33

2.3.1.2 Thẩm định phương pháp 37

2.3.1.3 Khảo sát độ bền của dung dịch chuẩn 39

2.3.1.4 So sánh kết quả phân tích giữa phương pháp nội bộ và phương pháp đối chứng 39

2.3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của Alanine đến quy trình kết tinh Glutamic acid 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 45

3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình định lượng Alanine trong mẫu thử 45

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp 45

3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích 48

3.1.3 Khảo sát độ bền dung dịch chuẩn 54

3.1.4 So sánh kết quả phân tích giữa phương pháp nội bộ và phương pháp phân tích đối chứng 55

3.2 Nội dung 2 : Khảo sát ảnh hưởng của alanine đến quy trình kết tinh glutamic acid 56 3.2.1 Khảo sát điều kiện kết tinh phù hợp 56

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của đồng phân quang học Ala 58

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ala 60

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

4.1 Kết luận 64

4.2 Kiến nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 70

HPLC High Performance Liquid Chromatography – Sắc ký lỏng hiệu năng cao L-Ala L-Alanine

L-Glu L-Glutamic acid

LEC Ligand exchange chromatography – Sắc ký trao đổi ligand LOD Limit of detection – Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification – Giới hạn định lượng MSG Monosodium Glutamate – Bột ngọt/mì chính

UV – VIS Ultra Violet – Visible

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cấu tạo phân tử glutamic acid 2

Hình 1.2: Sản lượng các amino acid (đơn vị: nghìn tấn) [3] 3

Hình 1.3: Tỷ lệ tinh thể dạng a-Glu khi có sự hiện diện của các amino acid [15] 7

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Alanine 8

Hình 1.5: (S)-Alanine (trái) và (R)-Alanine (phải) 9

Hình 1.6: Chu trình Alanine [18] 12

Hình 1.7: Sắc kí đồ phân tích amino acid bằng GC-qMS [23] 13

Hình 1.8: Sắc kí đồ phân tích amino acid bằng HPLC đầu dò huỳnh quang [24] 14

Hình 1.9: Hình minh họa peak kéo đuôi [26] 18

Hình 1.10: Cơ chế tạo dẫn xuất phù hợp [26] 20

Hình 1.11: Minh họa chỉ số S/N [26] 26

Hình 1.12: Minh họa khái niệm độ chụm, độ đúng, độ chính xác [26] 28

Hình 2.1: Quy trình kết tinh glutamic acid 42

Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn DL-Ala 4,0 ppm 49

Hình 3.9: Đường chuẩn D-Ala 50

Hình 3.10: Đường chuẩn L-Ala 50

Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu Ala nguyên liệu 56

Hình 3.12: Thí nghiệm kết tinh Glu trong bể điều nhiệt 57

Hình 3.13: Khảo sát điều kiện kết tinh Glu 57

Hình 3.14: Ảnh hưởng của đồng phân Ala đến hiệu suất kết tinh 58

Hình 3.15: Ảnh hưởng của đồng phân Ala đến hiệu suất li tâm 59

Hình 3.16: Ảnh hưởng của đồng phân Ala đến kích thước tinh thể Glu 59

Hình 3.17: Ảnh chụp kính hiển vi tinh thể Glu (độ phóng đại: 10 lần) a) Mẫu đối chứng b) D-Ala c) DL-Ala d) L-Ala 59

Hình 3.18: Nồng độ Ala trong tinh thể Glu sau li tâm 60

Hình 3.19: Ảnh hưởng của nồng độ Ala đến hiệu suất kết tinh 61

Hình 3.20: Ảnh hưởng của nồng độ Ala đến hiệu suất li tâm 61

Hình 3.21: Ảnh hưởng của nồng độ Ala đến kích thước tinh thể Glu 62

Hình 3.22: Ảnh chụp kính hiển vi tinh thể Glu (độ phóng đại: 10 lần) a) Mẫu đối chứng b) L-Ala 100 ppm c) L-Ala 200 ppm d) L-Ala 400 ppm 62

Hình 3.23: Nồng độ Ala trong tinh thể Glu sau li tâm 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tính chất hóa lý của một số loại dung môi [26] 16

Bảng 1.2: Độ lệch chuẩn tương đối chấp nhận được (AOAC) [26] 29

Bảng 1.3: Độ thu hồi chấp nhận được (AOAC) [26] 30

Bảng 2.6: Khảo sát thể tích tiêm mẫu 37

Bảng 2.7: Nồng độ các dung dịch chuẩn DL-Ala 38

Bảng 2.8: Khảo sát điều kiện kết tinh phù hợp 43

Bảng 2.9: Khảo sát ảnh hưởng của đồng phân Ala đến quá trình kết tinh Glu 43

Bảng 2.10: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ala đến quá trình kết tinh Glu 44

Bảng 3.1: Tổng hợp đường chuẩn D-Ala và L-Ala 51

Bảng 3.2: Khảo sát LOD, LOQ 51

Bảng 3.3: Khảo sát độ đúng D-Ala 52

Bảng 3.4: Khảo sát độ đúng L-Ala 52

Bảng 3.5: Khảo sát độ lặp lại 53

Bảng 3.6: Khảo sát độ tái lặp 53

Bảng 3.7: Khảo sát độ bền dung dịch chuẩn 54

Bảng 3.8: So sánh nồng độ Ala trong mẫu sản xuất 55

Bảng 3.9: So sánh hàm lượng D-Ala và L-Ala trong mẫu nguyên liệu 56

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của thế giới, các sản phẩm từ amino acid được quan tâm với khả năng ứng dụng ngày càng lớn Theo xu hướng phát triển đó, glutamic acid (Glu) là một amino acid được sử dụng phổ biến trong ngành thực phẩm, dược phẩm và thức ăn chăn nuôi Trong lĩnh vực thực phẩm, Glu là tiền chất quan trọng của Monosodium Glutamate (MSG) hay bột ngọt với vai trò là nguyên liệu chính để sản xuất MSG Đã có một số nghiên cứu trước đây về ảnh hưởng của Alanine (Ala) đến sự kết tinh glutamic acid, đặc biệt là các nghiên cứu tập trung khảo sát về quá trình chuyển dạng tinh thể khi có mặt Ala Tuy nhiên, các nghiên cứu này vẫn chưa khảo sát sự ảnh hưởng của Ala đến quá trình kết tinh glutamic acid cũng như ảnh hưởng đến hiệu suất li tâm sản phẩm từ hỗn hợp huyền phù Mặt khác, Ala được chứng minh có vai trò như một chất kích thích sự phát triển kích thước tinh thể MSG Trong quy trình sản xuất MSG, Glu được kết tinh từ dung dịch và ly tâm Do đó, nó có cũng có tiềm năng kích thích sự phát triển kích thước tinh thể Glu giúp nâng cao hiệu suất sản xuất Đối với quy trình sản xuất bột ngọt (MSG), Ala thêm vào quy trình sản xuất và trở thành tạp chất trong sản phẩm cuối nên cần phải được được kiểm soát chặt chẽ để đạt tiêu chuẩn về giới hạn hàm lượng Bên cạnh đó, nồng độ Ala trong các sản phẩm trung gian cũng cần được theo dõi định kỳ để điều chỉnh kịp thời nhằm đạt được mục tiêu sản xuất Như vậy, nhu cầu phân tích hàm lượng Ala trong các mẫu sản xuất là rất lớn

Hiện tại doanh nghiệp chưa có phương pháp nội bộ để phân tích hàm lượng Ala trong các mẫu thử, cần phải định kỳ gửi mẫu phân tích ở các trung tâm phân tích bên ngoài, điều này gây tốn chi phí lớn cho doanh nghiệp và thời gian chờ kết quả gây khó khăn trong việc theo dõi quy trình sản xuất cũng như kiểm soát chất lượng sản phẩm Hơn nữa, phương pháp được các trung tâm này áp dụng hiện tại chỉ phân tích được hàm lượng Ala tổng, không phân tách được các đồng phân quang học Việc xác định chính xác hàm lượng của các đồng phân quang học này có ảnh hưởng lớn đến các điểm kiểm soát trong quy trình sản xuất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Glutamic acid

1.1.1 Cấu trúc hóa học

Glutamic acid là một a-amino acid có công thức hóa học C5H9O4N

Hình 1.1: Cấu tạo phân tử glutamic acid

Cũng như hầu hết các amino acid khác (trừ glycine), glutamic acid cũng có hai đồng phân là L-Glutamic acid và D-Glutamic acid Thông thường chỉ tìm thấy đồng phân L-trong tế bào, đồng phân D- được tìm thấy trong thành tế bào của một số loại vi khuẩn và trong tế bào gan [1]

1.1.2 Tính chất hóa lý

Khối lượng phân tử: 147,14 g/mol Khối lượng riêng: 1,4601 g/mL (20oC) Điểm nóng chảy: 199 °C

Độ hòa tan trong nước: 0,84 g/100g (25oC), tan tốt trong nước, tan kém trong ethanol 0.00035 g/100 g ethanol (25 °C) [2]

Góc quay cực riêng: +46,8o (5M HCl) [2] Điểm đẳng điện: pH 3,24 [2]

1.1.3 Ứng dụng và vai trò của glutamic acid

a) Ứng dụng

Glutamic acid là amino acid đầu tiên được sản xuất ở quy mô công nghiệp vì khả năng làm tăng hương vị của nó, bản thân nó được sử dụng như một chất điều vị tự nhiên và là nguyên liệu chính để sản xuất bột ngọt Bột ngọt là muối mono natri của glutamic acid, thường gặp dưới dạng bột hoặc tinh thể màu trắng ngậm một phân tử

nước, đây là chất điều vị phổ biến và có giá trị trong ngành công nghiệp thực phẩm, trong nấu nướng thức ăn hằng ngày đặc biệt là trong ẩm thức ở các nước châu Á [2] Theo đó, glutamic acid được phân lập từ các nguồn dồi dào glalidin như lúa mì (có 47.3% L-glutamic acid) [3]

Hình 1.2: Sản lượng các amino acid (đơn vị: nghìn tấn) [3]

b) Vai trò sinh học

Glutamic acid rất cần thiết cho sự sống, đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi chất ở người và động vật, trong việc xây dựng protid và xây dựng cấu trúc của tế bào [4] Trong sinh lý cơ thể, glutamic acid có thể tham gia vào cơ chế tổng hợp nên các amino acid khác như alanine, cysteine, proline,… nó có thể phản ứng chuyển amine, giúp cho cơ thể tiêu hóa nhóm amine và tách NH3 ra khỏi cơ thể [2] Glutamic acid là thành phần chủ yếu của protid và phần xám của não, có vai trò quan trọng trong các biến đổi sinh hóa ở hệ thần kinh trung ương Nhờ những khả năng đó, trong y học còn sử dụng nó để điều trị các trường hợp suy nhược thần kinh nặng, mệt mỏi, mất trí nhớ, nhiễm độc NH3, các bệnh về tim và cơ bắp [5]

L-Glu còn được dùng làm thuốc chữa các bệnh thần kinh và tâm thần, bệnh chậm phát triển trí óc ở trẻ em, bệnh bại liệt và hôn mê gan [6]

Trong công nghiệp, L-Glu là nguyên liệu đầu để tổng hợp một số hóa chất quan trọng như: N-acetylglutamate là chất hoạt động bề mặt vi sinh vật phân giải được, dùng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm như xà phòng và dầu gội đầu Oxopyrolidin carboxylic acid là một dẫn xuất khác của glutamic acid làm chất giữ ẩm trong mỹ phẩm Acetylglutamate được dùng trong xử lý ô nhiễm nước biển do sự cố tràn dầu hỏa và dầu thực vật gây ra [7]

L-Glutamic acid phân bổ rộng rãi trong tự nhiên dưới dạng tự do và dạng hợp chất, có trong thành phần cấu tạo của protein động thực vật Trong mô, L-Glu được tạo thành từ NH3 và a-xetoglutaric acid Trong sinh vật, đặc biệt là trong vi sinh vật, L-Glu được tạo thành theo con đường lên men từ nhiều nguồn carbon [7]

1.1.4 Phương pháp sản xuất Glutamic acid

Có nhiều phương pháp sản xuất glutamic acid khác nhau, hiện có 4 phương pháp phổ biến như sau:

a) Phương pháp tổng hợp

Ứng dụng các phản ứng tổng hợp hóa học để tạo ra glutamic acid cũng như các amino acid khác từ khí khải của công nghiệp dầu hỏa hoặc các ngành công nghiệp khác

- Ưu điểm: sử dụng các nguồn nguyên liệu không phải thực phẩm để sản xuất

và tận dụng được các phụ phẩm của những ngành công nghiệp khác

- Nhược điểm: chỉ thực hiện được ở những quốc gia có nền công nghiệp phát

triển kỹ thuật cao Bên cạnh đó, sản xuất bằng phương pháp hóa học có thể tạo ra một hỗn hợp gồm L-Glu và D-Gluvà việc tách L-Glu khó khăn dẫn đến tăng chi phí sản xuất và giá thành của sản phẩm [8]

b) Phương pháp thủy phân protid

Phương pháp này sử dụng hóa chất như những tác nhân xúc tác để thủy phân một nguồn nguyên liệu giàu protid (khô đậu, khô lạc,…) tạo ra một hỗn hợp amino acid, từ đó tách glutamic acid [9]

Quá trình này có thể tóm tắt như sau: gluten của bột mì được thủy phản bằng axit HCl để giải phóng ra tất cả các axit amin ở 150oC Tiếp theo, dịch thuỷ phân sẽ được lọc, cô đặc và giữ ở nhiệt độ thấp để làm giảm độ tan của chất tan, từ đó các hạt tinh thể kết tinh của hydroclorat plutamic nami quả bão hòa sẽ dân đần được tạo thành Những tinh thể này sẽ được lọc để tách riêng và sau đó được hòa tan trong nước Dung dịch này sẽ được trung hòa bằng Na2CO3, cho tới pH = 3,2 (pH đẳng điện), ở pH này tinh thể glutamic acid sẽ kết tinh ra khỏi dung dịch và được tách riêng bàng phương pháp ly tâm [10]

- Ưu điểm: Dễ khống chế quy trình sản xuất và áp dụng được vào các cơ sở thủ

công, bán cơ giới, cơ giới dễ dàng

- Nhược điểm:

+ Cần phải sử dụng nguyên liệu giàu protid, hiếm và đắt

+ Tiêu tốn nhiều hoá chất và cần sử dụng các loại thiết bị chống ăn mòn + Hiệu suất thấp, đưa đến giá thành cao

c) Phương pháp lên men

Phương pháp này sử dụng một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ra các amino acid từ các nguồn carbohydrate và đạm vô cơ Phương pháp này đang có nhiều triển vọng phát triển ở khắp các nước, nó tạo ra được nhiều loại amino acid như: glutamic acid, lysine, alanine, tryptophan,….[3]

Phương pháp lên men có nguồn gốc từ Nhật Bản vào năm 1956 khi mà Shukuo và Kinoshita sử dụng môi trường có chứa glucoza và amoniac để sản xuất glutamate từ

chủng Micrococcus glutamicus Sau đó, cùng với sự phát triển của công nghệ vi sinh, một số loài vi sinh vật khác cũng được sử dụng như Brevibacterium và

Microbacterium [11]

Những loài vi khuẩn được sử dụng đều có một số đặc điểm sau: + Hình dạng tế bào từ hình cầu đến hình que ngắn;

+ Vi khuẩn Gram (+); + Hô hấp hiếu khí; + Không tạo bào tử;

+ Không chuyển động được, không có tiên mao;

+ Yếu tố cần thiết cho sinh trưởng và phát triển là Biotin;

+ Tích tụ một lượng lớn glutamic từ carbohydrate và NH4+, trong môi trường có sục không khí

- Ưu điểm:

+ Không sử dụng trực tiếp nguyên liệu protid;

+ Không cần sử dụng nhiều hóa chất và thiết bị chịu ăn mòn; + Hiệu suất cao, chi phí sản xuất thấp;

+ Tạo được glutamic acid dạng L-, có hoạt tính sinh học cao

Sản lượng L-Glu sản xuất bằng phương pháp lên men trực tiếp là khoảng 370 nghìn tấn/năm [12] Phân khúc ứng dụng thực phẩm và đồ uống thống trị thị trường glutamic acid với tỷ lệ doanh thu hơn 80% vào năm 2020 Điều này là do việc sử dụng ngày càng nhiều axit glutamic trong ngành thực phẩm và đồ uống như một chất điều vị Một số công ty lớn trong thị trường Glutamic acid gồm Ajinomoto Co., Inc., Akzo Nobel N.V., Evonik Industries AG, Sichuan Tongsheng Amino acid Co., Ltd., Global Bio-chem Technology Group Company Limited, and Ningxia Yipin Biological Technology Co., Ltd

Nhu cầu thức ăn chăn nuôi ngày càng tăng, cùng với việc sử dụng ngày càng nhiều phụ gia thực phẩm và chất tăng cường thực phẩm trong ngành thực phẩm và đồ uống, được ước tính sẽ thúc đẩy tăng trưởng thị trường glutamic acid [12]

1.1.5 Những nghiên cứu về quá trình kết tinh Glutamic acid

Nhóm nghiên cứu của Zhi-hua Li, Cheng-lin Zhang and Qing-yang Xu đã khảo sát quá trình kết tinh L-Glu trong phòng thí nghiệm với kết quả cho thấy điều kiện kết tinh L-Glu phù hợp là: tốc độ khuấy 200 vòng/phút, thời gian siêu âm 10 phút, tốc độ thêm acid 0.5 mL/phút Nghiên cứu cũng chỉ ra, với các điều kiện phù hợp trên thì hiệu suất kết tinh đạt 95.4% (cao hơn 6.5% so với các nghiên cứu trước), độ tinh khiết của L-Glu trên 99% (cao hơn 4% so với các nghiên cứu trước) [13]

M Kitamura trong nghiên cứu công bố 1989 đã khảo sát quá trình kết tinh của L-Glu với sự nhận xét việc chuyển dạng đa hình của L-Glu khi thực hiện kết tinh tại 45oC Kết quả cho thấy có sự chuyển từ dạng a sang dạng b trong quá trình kết tinh, tuy nhiên tại 25oC quá trình chuyển dạng này hầu như không xảy ra và chỉ quan sát được sự hình thành và phát triển của tinh thể L-Glu ở dạng a [14]

Năm 1961, Yoshiki Sakata đã nghiên cứu về quá trình kết tinh L-Glu với sự hiện diện đồng thời của những amino acid khác Theo đó, các amino acid như L-aspartic acid, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-leucine and L-cystine có tác dụng kích thích sự hình thành và lớn lên của L-Glu ở dạng a, cũng như những chất ức chế quá trình chuyển dạng tinh thể sang b [5]

Năm 2011, một nghiên cứu từ Đại học Thiên Tân (Trung Quốc) thực hiện bởi Yuxin Mo và cộng sự đã đánh giá được ảnh hưởng của các amino acid khác đến quá trình kết tinh glutamic acid

Hình 1.3: Tỷ lệ tinh thể dạng a-Glu khi có sự hiện diện của các amino acid [15]

Khả năng ức chế quá trình chuyển dạng tinh thể glutamic acid giảm dần theo thứ tự: L-Trp > L-His >> L-Thr > L-Val > L-Leu > L-Ala Như vậy, Ala có ảnh hưởng thấp nhất đối với sự chuyển dạng tinh thể Kết quả của nghiên cứu này có thể cung cấp dữ liệu cần thiết và các phương pháp tiềm năng để kết tinh có chọn lọc đối với hình dạng tinh thể Glu trong công nghiệp [15] Bên cạnh kết quả đạt được, nghiên cứu này vẫn chưa làm rõ được vai trò của các amino acid này đối với sự phát triển kích thước tinh thể Glu

1.2 Tổng quan về Alanine 1.2.1 Cấu trúc hóa học

Alanine (ký hiệu Ala) là một axit α-amino acid có công thức hóa học C3H7NO2 phổ biến, được sử dụng trong quá trình sinh tổng hợp protein Alanine chứa một nhóm α-amino (ở dạng proton, −NH3+, trong điều kiện sinh học), một nhóm axit α-carboxylic (ở dạng giảm proton, −COO−, trong điều kiện sinh học), và một nhóm methyl, làm cho Alanine trở thành một amino acid mạch hở, không phân cực Đây là amino acid không thiết yếu của con người vì cơ thể có thể tự tổng hợp được, nó không cần nhất thiết phải có mặt trong chế độ ăn uống [16]

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Alanine

L-Alanine là đồng phân phổ biến nhất của alanine trong tự nhiên vì nó là thành phần cấu tạo nên protein, với 7,8% trong cấu trúc bậc một trong 1.150 mẫu protein được khảo sát, chỉ đứng sau L-leucine [8]

1.2.2 Tính chất hóa lý

Dạng: bột tinh thể màu trắng, có vị ngọt Khối lượng phân tử: 89,1 g/mol

Khối lượng riêng: 1,424 g/mL

Độ hòa tan: 16,5g/100g (trong nước, 25oC) [1] Góc quay cực riêng: +13,0o (5M HCl)

Điểm đẳng điện: pH 6,01 [1]

Hình 1.5: (S)-Alanine (trái) và (R)-Alanine (phải)

Alanine có thể bị phân hủy bởi những tác nhân oxy hóa khử hoặc các xúc tác tương tự enzyme Chiều hướng của quá trình này phần lớn được kiểm soát bởi nồng độ tương đối của các cơ chất và sản phẩm của các phản ứng [12]

Alanine rất hữu ích trong các thí nghiệm mất chức năng liên quan đến quá trình phosphoryl hóa Một số kỹ thuật liên quan đến việc tạo ra một thư viện gen, mỗi gen có một đột biến điểm ở một vị trí khác nhau trong vùng quan tâm, đôi khi thậm chí mọi vị trí trong toàn bộ gen: đây được gọi là “quét đột biến” Phương pháp đơn giản nhất, và là phương pháp đầu tiên được sử dụng, được gọi là quét Alanine, trong đó mọi vị trí lần lượt bị đột biến thành Alanine [7]

Quá trình hydro hóa Alanine tạo ra rượu amin alaninol, là một khối cấu tạo bất đối hữu ích Quá trình khử amin của phân tử alanin tạo ra gốc tự do Sự khử có thể được tạo ra trong alanin rắn hoặc nước bằng bức xạ gây ra sự phân cắt đồng nhất của liên kết cacbon-nitơ [17]

Tính chất này của Alanine được sử dụng trong các phép đo liều lượng trong xạ trị Khi Alanine bình thường được chiếu xạ, bức xạ làm cho một số phân tử trở thành gốc tự do, và khi các gốc này ổn định, hàm lượng gốc tự do sau đó có thể được đo bằng phương pháp cộng hưởng từ điện tử để tìm ra bức xạ mà Alanine đã tiếp xúc [18] Đây được coi là một phép đo có liên quan về mặt sinh học đối với mức độ tổn thương

do bức xạ mà mô sống sẽ phải chịu trong cùng một mức độ phơi nhiễm bức xạ Các kế hoạch điều trị xạ trị có thể được gửi ở chế độ thử nghiệm tới Alnine, sau đó chúng có thể được đo để kiểm tra xem hệ thống điều trị có phân phối đúng dạng liều bức xạ dự kiến hay không [19]

1.2.3 Ứng dụng và vai trò của của Alanine

a) Ứng dụng

Alanine có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm khi nó được dùng làm các chất phụ gia có tác dụng điều vị, chất kích thích quá trình kết tinh, làm ngăn sự mất màu (đặc biệt là màu nâu) trong sản phẩm,… [11] Cụ thể, Ala đóng vai trò quan trọng trong các ngành sau:

- Trong ngành y học: Alanine được sử dụng để điều trị tình trạng suy giảm cơ bắp và viêm khớp Nó cũng có thể được sử dụng để cải thiện chức năng gan và giảm đau trong các trường hợp bệnh thận

- Trong ngành thể thao: Alanine được sử dụng để tăng cường sức mạnh và sức bền cơ bắp, cải thiện sức chịu đựng và giảm sự mệt mỏi trong các hoạt động thể thao - Trong ngành sản xuất thực phẩm: Alanine được sử dụng làm chất bảo quản và là thành phần của các sản phẩm thực phẩm như mì ăn liền, bánh mì và thức ăn cho thú cưng

- Trong ngành sản xuất hóa chất: Alanine được sử dụng để sản xuất các sản phẩm hóa học như axit amin và các hợp chất hữu cơ khác

- Trong nghiên cứu khoa học: Alanine được sử dụng để nghiên cứu các quá trình sinh hóa trong cơ thể, đặc biệt là quá trình chuyển hóa chất béo

b) Vai trò sinh học

Ở động vật có vú, Alanine đóng một vai trò quan trọng trong chu trình Alanine giữa các mô và gan Trong cơ và các mô khác phân hủy các amino acid để làm nhiên liệu, các nhóm amin được tạo ra dưới dạng glutamate [20] Glutamate sau đó có thể chuyển nhóm amin của nó thành pyruvate, một sản phẩm của quá trình

Glucose-đường phân ở cơ, thông qua hoạt động của alanine aminotransferase, tạo thành alanine và α-ketoglutarate [17] Alanine đi vào máu và được vận chuyển đến gan Phản ứng alanine aminotransferase diễn ra ngược lại trong gan, nơi pyruvate tái sinh được sử dụng trong quá trình tạo gluconeogenesis, tạo thành glucose trở lại cơ thông qua hệ tuần hoàn Glutamate trong gan đi vào ty thể và bị glutamate dehydrogenase phân hủy thành α-ketoglutarate và amoni, lần lượt tham gia vào chu trình urê để tạo thành urê được thải qua thận [19]

Chu trình Glucose-Alanine cho phép loại bỏ pyruvate và glutamate khỏi cơ và vận chuyển đến gan một cách an toàn Khi đó, pyruvate được sử dụng để tái tạo glucose, sau đó glucose trở lại cơ để chuyển hóa thành năng lượng: điều này chuyển phần lớn năng lượng của quá trình tạo gluconeogenesis đến gan thay vì cơ và tất cả ATP có sẵn trong cơ có thể được dành cho sự co lại [18] Cơ chế này đi theo con đường dị hóa và dựa vào sự phân hủy protein trong mô cơ Bên cạnh đó, những bằng chứng xác nhận nó có xảy ra ở động vật không có vú hay không và ở mức độ nào vẫn chưa rõ ràng [18] Hiệu suất của chu trình Alanine có phần sút kém hơn so với chu trình Cori, nguyên do là một phần năng lượng do chu trình alanine sản sinh ra được dùng trong công đoạn sản sinh urê Tức là, việc loại bỏ urê tiêu tốn năng lượng vì lượng ATP nhìn chung được sản sinh từ chu trình Alanine thấp hơn so với chu trình Cori Tuy nhiên, trái với chu trình Cori, NADH trong chu trình Alanine được bảo tồn vì chu trình không sản sinh ra axit lactic, điều này giúp cho NADH có thể được oxy hóa trong chuỗi chuyển điện tử [17] Chu trình Alanine yêu cầu sự hiện diện của enzyme alanine aminotransferase, vốn chỉ tồn tại trong các cơ quan như cơ, gan hay ruột Vì vậy, chu trình Alanine chỉ được thực thi thay cho chu trình Cori dưới sự hiện diện của enzyme này và khi cơ thể phát sinh nhu cầu chuyển ammonia đến gan

Chu trình Alanine cũng có các chức năng sau: - Phục hồi mạch carbon giữa gan và cơ

- Vận chuyển NH4+ đến cơ và để được chuyển hóa thành urê

Hình 1.6: Chu trình Alanine [18].

1.2.4 Những nghiên cứu trước đây về định lượng Alanine

Nhóm nghiên cứu của ThS Trần Diễm Phúc và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp định lượng đồng thời amino acid trong viên nang Doragon bằng phương pháp HPLC-DAD Công trình được công bố năm 2011 Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời 6 amino acid là alanine, proline, valine, lysine và tyrosine Tuy nhiên, quy trình phân tích định lượng này chưa tách được đồng phân quang học D-Ala và L-Ala và định lượng chúng [21]

Năm 1994, tác giả Hong Ji Liu đã công bố nghiên cứu phương pháp xác định amino acid bằng cách tạo dẫn xuất trước cột với 6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamate (AQC) sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò UV (HPLC-UV) Kết quả thu được cho thấy, 19 loại amino acid (trong đó có Alanine) đã được phân tích trong vòng 35 phút có hệ số tương quan tốt trong khoảng nồng độ 25-500 µM Giới hạn phát hiện các amino acid phổ biến như tryptophan và cysteine theo quy trình này là 0.07-0.3 pmol [22] Cũng như nghiên cứu [21], phương pháp này cũng chưa tách được đồng phân D-Ala và L-Ala

Năm 2012, nhóm nghiên cứu gồm Katja Dettmer, Axel P Stevens, Stephan R Fagerer, Hannelore Kaspar và Peter J Oefner đã tiến hành khảo sát phương pháp phân tích đồng thời các loại amino acid tự do trong mẫu sử dụng phương pháp sắc ký khí đầu dò khối phổ tứ cực (GC – qMS), phản ứng tạo dẫn xuất được thực hiện với chất tạo dẫn xuất 1 – DR1 (dung dịch alcohol) và 2 – DR2 (dung dịch propyl chloroformate) [23] Phương pháp này đòi hỏi quy trình xử lí mẫu rất phức tạp, trải qua nhiều bước nên tiêu tốn nhiều loại hóa chất, sử dụng thiết bị đắt tiền dẫn đến chi phí phân tích cao và chỉ phân tích được hàm lượng amino acid tổng

Hình 1.7: Sắc kí đồ phân tích amino acid bằng GC-qMS [23]

Một nghiên cứu khác của A Jámbor, I Molnár-Perl năm 2009 cũng đã định lượng hỗn hợp loại amino acid với chất tạo dẫn xuất là 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) bằng phương pháp HPLC đầu dò huỳnh quang, thời gian tạo dẫn xuất = 20 phút và được đặc trưng bằng phầxn trăm độ lệch chuẩn tương đối của các phản ứng của chúng (RSD ≤ 3,98%) Giới hạn định lượng (LOQ) của các dẫn xuất FMOC của amino acid được khảo sát là 1 pmol, ngoại trừ serine, glycine, valine (2,5 pmol), cystine, histidine, tyrosine (5 pmol) và tryptophan (10 pmol) [24] Phương pháp này có độ nhạy rất tốt (1 pmol) tuy nhiên vẫn chưa thể phân tách được đồng phân quang học của các amino acid đặc biệt là Alanine

Hình 1.8: Sắc kí đồ phân tích amino acid bằng HPLC đầu dò huỳnh quang [24]

Năm 2002, Patricia và các cộng sự đã nghiên cứu phương pháp định lượng hỗn hợp đồng phân amino acid bằng phương pháp HPLC đầu dò UV dựa trên nguyên lí sắc kí trao đổi ligand với ion Cu2+ được sử dụng (Cu(CH3COO)2 nồng độ 1,0 mmol/L) cùng

với chất chọn lọc đồng phân (chiral selector) là N,N-dimethyl-L-phenylalanine Đầu

dò UV phát hiện ở 254 nm Thông qua các bước khảo sát ảnh hưởng của những điều kiện sắc kí khác nhau (tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động và pH), kết quả cho thấy phương pháp này đã định lượng được hỗn hợp đồng phân quang học của Alanine, Serine, Threonine, Valine, Methionine, Norleucine, Leucine với độ chọn lọc khá tốt và quy trình phân tích tương đối đơn giản [25]

Công trình nghiên cứu của Yin Hua Li và cộng sự năm 2005 đã xây dựng phương pháp xác định hàm lượng các a-amino acid thông qua phản ứng tạo dẫn xuất với fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) bằng phương pháp HPLC-UV, pha động là hệ 2-propanol/hexane 10:90 (có chứa 0,1% TFA), bước sóng phát hiện 254 nm Tác giả đã khảo sát hiệu quả tách trên hai loại cột là Chiralpak OD và Chrialpak AD cho 18 loại amino acid khác nhau, trong đó có Alanine Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra từng loại cột sẽ có hiệu quả tách khác nhau đối với từng loại amino acid cụ thể Đối với khả năng phân tách D-Ala và L-Ala thì hai loại cột có sự khác biệt đáng kể về hiệu quả phân tách, Chiralpak OD cho độ phân giải Rs = 5,14 trong khi cột Chiralpak AD có độ phân giải Rs = 1,44 [26]

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là kĩ thuật phân tích dựa trên sự tương tác giữa chất phân tích với pha động (chất lỏng) và pha tĩnh (chất rắn) Các hợp chất có sự tương tác khác nhau với pha động và pha tĩnh sẽ được tách ra nhờ thời gian lưu giữ trong cột khác nhau Do đó hai yếu tố quan trọng để thực hiện vai trò của pha tĩnh (cột nhồi) và pha động cho quá trình chạy chất phân tích [27]

• Pha động (mobile phase)

Việc lựa chọn pha động ảnh hưởng lớn đến phương pháp phân tích sắc kí Thông thường, dung môi phân tích được chọn theo các tính chất thỏa mãn các điều kiện sau:

- Trơ với pha tĩnh

- Hòa tan được mẫu phân tích

- Bền vững trong thời gian chạy sắc ký - Phù hợp với đầu dò

- Có độ tinh khiết cao - Không quá đắt

Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi không phân cực như benzene,

n-hexan, toluene, … Trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực có

thể là nước, methanol, acetonitrile, … Tuy nhiên, người ta thường dùng hỗn hợp hai hay ba dung môi để có một pha động có độ phân cực phù hợp với phép phân tích, đặc biệt đối với các hỗn hợp mẫu phức tạp

Bảng 1.1: Tính chất hóa lý của một số loại dung môi [28]

Dung môi

Vùng UV tới hạn

(nm)

Nhiệt độ Sôi (oC)

• Pha tĩnh (stationary phase)

Dựa vào độ phân cực của pha tĩnh có thể chia thành sắc kí pha thuận và sắc kí pha đảo

Sắc ký pha thuận: sử dụng pha tĩnh phân cực, phổ biến nhất là silicagen, thường dùng phân tích đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực Khi silicagen được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực như các aminopropyl: -(CH2)3NH2, cyanopropyl: -(CH2)3CN, propyldiol: -(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2OH, để được những pha tĩnh phân cực mang những tính chất khác nhau

Sắc ký pha đảo: sử dụng pha tĩnh kém phân cực, thường là silicagen có gắn gốc ankyl mạch dài, không phân cực, loại thông dụng nhất là -C18H37 Nó được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng, từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực

1.4 Thông số đánh giá hiệu quả sắc ký • Độ phân giải (resolution)

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Công thức tính độ phân giải:

𝑅! = 2 𝑡"− 𝑡#𝑤#+ 𝑤"Trong đó: RS – Độ phân giải

t2, t1 – thời gian lưu của 2 chất phân tích w2, w1 – độ rộng chân peak tại ½ chiều cao Theo yêu cầu của sắc ký, RS tối thiểu bằng 1,5 [27]

• Số đĩa lý thuyết (theoretical plates)

Công thức tính:

𝑁 =16 × (𝑡!)"

𝑊" =5,54 × (𝑡!)"-𝑊#

Trong đó:

tR: thời gian lưu W: bề rộng chân peak

W1/2 bề rộng peak ở vị trí ½ cường độ tín hiệu của peak

Số đĩa lý thuyết biểu diễn hiệu quả tách của cột, số đĩa lý thuyết càng lớn thì cột cho hiệu quả tách càng tốt

• Hệ số kéo đuôi (Tailing factor)

Hình 1.9: Hình minh họa peak kéo đuôi [28]

Hệ số kéo đuôi (TF) được tính theo công thức: TF = AB

Hệ số kéo đuôi dùng để đánh giá tính đối xứng của peak Theo lý thuyết, peak cân xứng sẽ có hệ số kéo đuôi TF ≈ 1 Tuy nhiên vì nhiều lý do như xuất hiện bọt khí trong cột, bề mặt cột không đồng nhất, nhiệt độ không ổn định,… khiến peak không đối xứng Các peak có hệ số kéo đuôi thỏa mãn: 0,5 ≤ TF ≤ 2 được chấp nhận

1.5 Sắc ký trao đổi ligand

Sắc ký trao đổi ligand (Ligand-exchange chrotomatography - LEC) được giới thiệu vào thập niêm 1960 bởi Davankov và Rogozhin, sau đó được ứng dụng vào sắc ký lỏng đầu những năm 1970 [29]

Cơ chế phân tách của LEC dựa vào quá trình trao đổi ligand Những phân tử hoặc ion có đặc tính cho hoặc nhận electron Ví dụ, những ion kim loại có tính chất nhận electron và chúng được gọi là “chất nhận điện tử”, đóng vai trò như một Lewis acid Nếu một hợp chất cho điện tử (còn gọi là “nguồn cho điện tử”) đứng gần một ion kim loại, xảy ra một sự trao đổi ion giữa chúng từ đó hình thành một phức chất trên cơ sở liên kết phối trí Ở đây nguồn cho điện tử gọi là ligand Một ví dụ cho hiện tượng này là hầu hết ion kim loại trong thủy dung đều tạo phức với các phân tử nước (hay phức chất aqua) Khi ligand khác tồn tại cùng lúc với các ion kim loại trong thủy dung, ligand sẽ cạnh tranh với các phân tử nước để tạo phức với các ion kim loại Phản ứng này được trình bày bằng biểu thức sau:

M(H2O)n + L ⇄ (H2O)n-mL + mH2O

Theo đó, ion kim loại M có số phối trí n và L là ligand có số phối trí m Phản ứng này được biết đến là phản ứng trao đổi ligand Sắc ký trao đổi ligand dựa trên phản ứng này để phân tách các thành phần bằng cách sử dụng lực liên kết khác nhau của từng thành phần (ligand) với những ion kim loại cố định trong cột (cũng có nghĩa là, sự khác biệt về độ bền của phức chất tạo thành) Các ion kim loại được cố định trên những hạt nhựa pha tĩnh có sẵn các nhóm chức, như nhóm sulfone, carboxyl hoặc amine, bởi liên kết ion hoặc liên kết phối trí Trong một vài trường hợp những ligand thích hợp với mục đích phân tích sẽ được cố định lên vật liệu nhựa nhồi [30] Pha động là dung môi chứa các ligand cạnh tranh phù hợp đối với phản ứng trao đổi Sự rửa giải các hợp chất mục tiêu được kiểm soát bằng việc điều chỉnh nồng độ của các ligand cạnh tranh và pH [31]

Ion kim loại phổ biến nhất là Cu (II) hình thành phức chất với 6 liên kết từ tâm đến các ligand LEC được ứng dụng rộng rãi để phân tách các a-amino acid, b-amino acid, a-hydroxy acid, hợp chất diols, amino alcohols, quinolones, peptides,…[32]

Các yếu quan trọng của phương pháp sắc ký trao đổi ligand gồm: bản chất và nồng độ ion kim loại M, tỷ lệ ion kim loại và số phối tử liên kết,…[33]

Một số cơ chế tạo dẫn xuất đối với các đối quang amino acid được mô tả như hình bên dưới Trong đề tài nghiên cứu này, các chất phản ứng được lựa chọn là OPA

Phòng thử nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau Dựa vào nguồn gốc có thể phân loại các phương pháp thành hai nhóm:

- Các phương pháp tiêu chuẩn: các phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như TCVN, ISO, ASTM, AOAC…

- Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ standard/alternative/in-house method): là các phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị, phương pháp theo các tạp chí, tài liệu chuyên ngành

(non-Theo yêu cầu của ISO 17025, phương pháp phân tích phải được thẩm định (method validation) hoặc thẩm định lại khi:

- Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn (non-standard method)

- Phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa vào sử dụng thành thường qui

- Khi có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp dụng của phương pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn

- Khi có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được thẩm định (ví dụ: thiết bị phân tích với các đặc tính khác biệt, nền mẫu, người phân tích,…)

1.6.1 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất, Tính đặc hiệu của phương pháp tốt khi phương pháp có kết quả dương tính khi có mặt chất cần phân tích Và ngược lại, khi có mặt các tạp chất khác có cấu trúc hay tính chất tương tự chất phân tích không gây ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả là âm tính Trong phép phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác [28]

Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình Nếu chất cần xác định, định lượng phân biệt rõ với các chất khác cần phân tích thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc Do vậy, tính chọn lọc có thể được xem là bao gồm cả tính đặc hiệu Do các phương pháp phân tích dư lượng thường là phân tích đa dư lượng, phân tích đồng thời nhiều chất nên khái niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn

Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp định tính, định lượng cần bố trí các thí nghiệm như sau:

- Phân tích các mẫu trắng, lặp lại tối thiểu 6 lần đối với từng loại nền mẫu Mẫu trắng phải không được cho tín hiệu phân tích Nếu mẫu trắng có hơn 10% dương tính hoặc xuất hiện tín hiệu thì cần phải thay đổi phương pháp để loại trừ các ảnh hưởng

- Phân tích mẫu thử hoặc mẫu trắng thêm chuẩn ở hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần So sánh kết quả với mẫu trắng, phải cho tín hiệu chất cần phân tích

- Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu (co-chromatography), cách này thường áp dụng đối với các phương pháp sắc ký Sau khi chuẩn bị mẫu (mẫu trắng hoặc mẫu thực) và phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký thu được các pic sắc ký, ta thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu/chọn lọc

- Phân tích mẫu không có chất phân tích nhưng có chất cấu trúc tương tự chất phân tích (nếu có): Phải cho kết quả âm tính (đối với phương pháp định tính) và không được ảnh hưởng đến kết quả định lượng của chất phân tích (đối với phương pháp định lượng) Trong trường hợp những chỉ tiêu phân tích không thể có mẫu trắng (sample blank) để xác định tính chọn lọc/đặc hiệu, có thể thực hiện các thí nghiệm trên các mẫu trắng thuốc thử (reagent blank), tức là thực hiện phân tích các bước tương tự như khi phân tích mẫu nhưng không có mẫu thử [35]

1.6.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo và kết quả nồng dộ chất phân tích

Đối với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện việc xác định khoảng tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) Xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau [28] Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo lần lượt các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Khoảng tuyến tính phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, nhưng chủ yếu là do tính chất của chất phân tích cũng như kỹ thuật dùng phân tích

Trong thực tế phân tích mẫu, khoảng nồng độ xây dựng đường chuẩn không nhất thiết phải là khoảng tuyến tính Việc lựa chọn khoảng nồng độ xây dựng đường chuẩn phụ thuộc vào nồng độ thường gặp của các mẫu phân tích Đường chuẩn được xây dựng sao cho nồng độ mẫu không vượt quá giới hạn thấp nhất và cao nhất Tốt nhất là nồng độ của mẫu phân tích nằm ở khoảng giữa của đường chuẩn Ngoài đường chuẩn tuyến tính thường gặp, có các loại đường chuẩn phi tuyến khác, tuy nhiên trong phân tích, đường chuẩn tuyến tính được sử dụng phổ biến nhất [28]

• Xây dựng đường chuẩn trong dung môi

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ) Xác định các giá trị đo được theo nồng độ Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có đường biểu diễn là một phương trình y = ax + b

• Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng

Để xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng, cần chuẩn bị sẵn dịch chiết mẫu trắng như quy trình phân tích của phương pháp Lần lượt thêm các thể tích chuẩn trung gian và làm việc thích hợp vào dịch chiết mẫu trắng để được các điểm chuẩn có nồng độ khác nhau Biểu diễn sự phụ thuộc giữa giá trị đo và nồng độ chuẩn theo phương trình y = ax+b

Đường chuẩn xây dựng trên nền mẫu trắng có độ tin cậy cao hơn so với đường chuẩn trong dung môi Việc xây dựng đường chuẩn trong nền mẫu nhằm loại bỏ các ảnh hưởng do các chất đồng rửa giải trong nền mẫu Tuy nhiên trong thực tế các phương pháp xác định dư lượng thường là các phương pháp xác định đồng thời nhiều chất, khoảng 50-200 chất, do đó việc chuẩn bị mẫu trắng gặp rất nhiều khó khăn Có thể sử dụng phương pháp lập đường chuẩn trên nền mẫu thực để có kết quả tốt

• Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực

Phân tích mẫu thực có cho thêm các nồng độ chuẩn khác nhau tương tự như trong phần làm với mẫu trắng Vẽ đường cong tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ chuẩn thêm Nồng độ các điểm chuẩn thường nằm trong khoảng 0,5 đến 2 lần nồng độ ước lượng trong mẫu phân tích Khi sử dụng đường chuẩn trên nền mẫu thực có thể loại trừ được các ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích như xây dựng

trên nền mẫu trắng Sau khi lập được phương trình đường chuẩn y = ax + b, có thể dễ dàng tính được nồng độ: X = b/a

• Đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn

Một phương pháp rất hữu ích trong phân tích, đặc biệt trong phân tích hiện đại là sử dụng nội chuẩn Nội chuẩn được thêm vào dung dịch chuẩn để đo máy, với nồng độ phù hợp và giống nhau (CIS) Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất ngoại chuẩn chia cho nội chuẩn (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ (trục hoành x) Tính các hệ số hồi quy (a,b trong phương trình hồi quy y = ax + b) và hệ số tương quan (R) tương tự như trên

Khi phân tích mẫu, nội chuẩn cũng phải được thêm (tốt nhất là từ đầu, sau khi cân đong) để sao cho tạo được nồng độ cuối cùng bằng nồng độ nội chuẩn trong các dung dịch chuẩn Với cách tiến hành như thế này, có thể hạn chế được hầu hết các ảnh hưởng trong quá trình phân tích, bao gồm từ cân mẫu, chuẩn bị mẫu đến phân tích trên thiết bị, đến kết quả phân tích Đối với các kỹ thuật phân tích hiện đại như khối phổ, đặc biệt là sắc ký lỏng khối phổ, việc sử dụng nội chuẩn là một yêu cầu tiên quyết, nếu không muốn nói là bắt buộc Ngoài ra, trong một số trường hợp có thể chọn các chất nội chuẩn khác, với điều kiện là các chất này phải có một số tính chất cơ bản giống chất phân tích, và có thể phân tích được bằng phương pháp đang thực hiện[28]

• Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn

Hệ số hồi quy tuyến tính (R): dùng để đánh giá sự tuyến tính của đường chuẩn đã khảo sát, R phải đạt theo yêu cầu sau:

0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [35]

Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Sau khi lập đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức sau:

∆%=𝐶&− 𝐶'

𝐶' × 100

Trong đó: Di : Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn Cc : Nồng độ của các điểm chuẩn

Theo quy định của nhiều tổ chức của Mỹ, Canada, châu Âu, giá trị không được vượt quá ±15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ±20% [28] Khi xây dựng đường chuẩn có dải nồng độ quá dài, hệ số hồi quy có thể đạt yêu cầu nhưng độ chệch ở mỗi điểm đặc biệt là những điểm ở đầu và cuối đường chuẩn sẽ rất lớn, vượt quá giới hạn cho phép

1.6.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ mà tại đó chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng) Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp và cho kết quả có độ chính xác mong muốn LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng

Có nhiều cách xác định LOD khác nhau, việc bố trí thí nghiệm để xác định LOQ thường kết hợp với tính LOD Thông thường giá trị LOQ gấp 3-5 lần LOD [28]

• Dựa trên độ lệch chuẩn

Thực hiện phân tích 10 mẫu thử hoặc mẫu rắng thêm chuẩn

Tính LOD: Tính giá trị trung bình xi, và độ lệch chuẩn SD: LOD=3*SD

𝑆𝐷 = =Σ(𝑥%− 𝑥̅)"𝑛 − 1Đánh giá LOD đã tính được:

𝑅 = 𝑥̅𝐿𝑂𝐷

Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

LOQ =10*SD

• Dựa trên tín hiệu nhiễu (S/N)

Cách này chỉ áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công cụ có nhiễu đường nền Thông thường cách tính này áp dụng phổ biến đối với kĩ thuật sắc kí Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại ít nhất 4 lần Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

- LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3

- LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nền S/N =10

• Dựa trên đường chuẩn

Chỉ áp dụng được cho các phương pháp có xây dựng đường chuẩn Giá trị LOD, LOQ có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo

𝐿𝑂𝐷 =3,3𝑆𝐷𝑎𝐿𝑂𝑄 = 10𝑆𝐷

Độ chính xác (accuracy) = độ chụm (precision) + độ đúng (trueness)

Hình 1.12: Minh họa khái niệm độ chụm, độ đúng, độ chính xác [28]

1.6.5 Độ chụm (precision)

Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn

Xác định độ chụm: Thực hiện phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau (thấp, trung bình, cao của khảng làm việc) Mỗi mẫu thực hiện 6-10 lần, tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD theo các công thức sau:

SD = =Σ(x( − xK)"n − 1

RSD% = 𝑆𝐷

𝑥̅ × 100

Trong đó: SD: độ lệch chuẩn n: số lần thí nghiệm

xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ i : Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối

Giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD% tính được không được lớn hơn độ lặp lại chấp nhận được Độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD càng lớn [28]

Bảng 1.2: Độ lệch chuẩn tương đối chấp nhận được (AOAC) [28]

1.6.6 Độ đúng (trueness)

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (μ) Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung là giá trị đúng)

Độ đúng thường được diễn tả bằng độ chệch Δ =𝑋&) − 𝜇

x