TỔNG QUAN
Tổng quan về Glutamic acid
Glutamic acid là một a-amino acid có công thức hóa học C5H9O4N
Hình 1.1: Cấu tạo phân tử glutamic acid
Cũng như hầu hết các amino acid khác (trừ glycine), glutamic acid cũng có hai đồng phân là L- Glutamic acid và D- Glutamic acid Thông thường chỉ tìm thấy đồng phân L- trong tế bào, đồng phân D- được tìm thấy trong thành tế bào của một số loại vi khuẩn và trong tế bào gan [1]
Khối lượng phân tử: 147,14 g/mol
Khối lượng riêng: 1,4601 g/mL (20 o C) Điểm nóng chảy: 199 °C Độ hòa tan trong nước: 0,84 g/100g (25 o C), tan tốt trong nước, tan kém trong ethanol 0.00035 g/100 g ethanol (25 °C) [2]
Góc quay cực riêng: +46,8 o (5M HCl) [2] Điểm đẳng điện: pH 3,24 [2]
1.1.3 Ứng dụng và vai trò của glutamic acid a) Ứng dụng
Glutamic acid là amino acid đầu tiên được sản xuất ở quy mô công nghiệp vì khả năng làm tăng hương vị của nó, bản thân nó được sử dụng như một chất điều vị tự nhiên và là nguyên liệu chính để sản xuất bột ngọt Bột ngọt là muối mono natri của glutamic acid, thường gặp dưới dạng bột hoặc tinh thể màu trắng ngậm một phân tử
3 nước, đây là chất điều vị phổ biến và có giá trị trong ngành công nghiệp thực phẩm, trong nấu nướng thức ăn hằng ngày đặc biệt là trong ẩm thức ở các nước châu Á [2] Theo đó, glutamic acid được phân lập từ các nguồn dồi dào glalidin như lúa mì (có 47.3% L- glutamic acid) [3]
Hình 1.2: Sản lượng các amino acid (đơn vị: nghìn tấn) [3] b) Vai trò sinh học
Glutamic acid rất cần thiết cho sự sống, đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi chất ở người và động vật, trong việc xây dựng protid và xây dựng cấu trúc của tế bào [4] Trong sinh lý cơ thể, glutamic acid có thể tham gia vào cơ chế tổng hợp nên các amino acid khác như alanine, cysteine, proline,… nó có thể phản ứng chuyển amine, giúp cho cơ thể tiêu hóa nhóm amine và tách NH3 ra khỏi cơ thể [2] Glutamic acid là thành phần chủ yếu của protid và phần xám của não, có vai trò quan trọng trong các biến đổi sinh hóa ở hệ thần kinh trung ương Nhờ những khả năng đó, trong y học còn sử dụng nó để điều trị các trường hợp suy nhược thần kinh nặng, mệt mỏi, mất trí nhớ, nhiễm độc NH3, các bệnh về tim và cơ bắp [5]
L-Glu còn được dùng làm thuốc chữa các bệnh thần kinh và tâm thần, bệnh chậm phát triển trí óc ở trẻ em, bệnh bại liệt và hôn mê gan [6]
Trong công nghiệp, L-Glu là nguyên liệu đầu để tổng hợp một số hóa chất quan trọng như: N-acetylglutamate là chất hoạt động bề mặt vi sinh vật phân giải được, dùng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm như xà phòng và dầu gội đầu Oxopyrolidin carboxylic acid là một dẫn xuất khác của glutamic acid làm chất giữ ẩm trong mỹ phẩm Acetylglutamate được dùng trong xử lý ô nhiễm nước biển do sự cố tràn dầu hỏa và dầu thực vật gây ra [7]
L-Glutamic acid phân bổ rộng rãi trong tự nhiên dưới dạng tự do và dạng hợp chất, có trong thành phần cấu tạo của protein động thực vật Trong mô, L- Glu được tạo thành từ NH3 và a-xetoglutaric acid Trong sinh vật, đặc biệt là trong vi sinh vật, L- Glu được tạo thành theo con đường lên men từ nhiều nguồn carbon [7]
1.1.4 Phương pháp sản xuất Glutamic acid
Có nhiều phương pháp sản xuất glutamic acid khác nhau, hiện có 4 phương pháp phổ biến như sau: a) Phương pháp tổng hợp Ứng dụng các phản ứng tổng hợp hóa học để tạo ra glutamic acid cũng như các amino acid khác từ khí khải của công nghiệp dầu hỏa hoặc các ngành công nghiệp khác
- Ưu điểm: sử dụng các nguồn nguyên liệu không phải thực phẩm để sản xuất và tận dụng được các phụ phẩm của những ngành công nghiệp khác
- Nhược điểm: chỉ thực hiện được ở những quốc gia có nền công nghiệp phát triển kỹ thuật cao Bên cạnh đó, sản xuất bằng phương pháp hóa học có thể tạo ra một hỗn hợp gồm L -Glu và D -Gluvà việc tách L- Glu khó khăn dẫn đến tăng chi phí sản xuất và giá thành của sản phẩm [8] b) Phương pháp thủy phân protid
Phương pháp này sử dụng hóa chất như những tác nhân xúc tác để thủy phân một nguồn nguyên liệu giàu protid (khô đậu, khô lạc,…) tạo ra một hỗn hợp amino acid, từ đó tách glutamic acid [9]
Quá trình này có thể tóm tắt như sau: gluten của bột mì được thủy phản bằng axit HCl để giải phóng ra tất cả các axit amin ở 150 o C Tiếp theo, dịch thuỷ phân sẽ được lọc, cô đặc và giữ ở nhiệt độ thấp để làm giảm độ tan của chất tan, từ đó các hạt tinh thể kết tinh của hydroclorat plutamic nami quả bão hòa sẽ dân đần được tạo thành Những tinh thể này sẽ được lọc để tách riêng và sau đó được hòa tan trong nước Dung dịch này sẽ được trung hòa bằng Na2CO3, cho tới pH = 3,2 (pH đẳng điện), ở pH này tinh thể glutamic acid sẽ kết tinh ra khỏi dung dịch và được tách riêng bàng phương pháp ly tâm [10]
- Ưu điểm: Dễ khống chế quy trình sản xuất và áp dụng được vào các cơ sở thủ công, bán cơ giới, cơ giới dễ dàng
+ Cần phải sử dụng nguyên liệu giàu protid, hiếm và đắt
+ Tiêu tốn nhiều hoá chất và cần sử dụng các loại thiết bị chống ăn mòn + Hiệu suất thấp, đưa đến giá thành cao c) Phương pháp lên men
Phương pháp này sử dụng một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ra các amino acid từ các nguồn carbohydrate và đạm vô cơ Phương pháp này đang có nhiều triển vọng phát triển ở khắp các nước, nó tạo ra được nhiều loại amino acid như: glutamic acid, lysine, alanine, tryptophan,….[3]
Phương pháp lên men có nguồn gốc từ Nhật Bản vào năm 1956 khi mà Shukuo và Kinoshita sử dụng môi trường có chứa glucoza và amoniac để sản xuất glutamate từ chủng Micrococcus glutamicus Sau đó, cùng với sự phát triển của công nghệ vi sinh, một số loài vi sinh vật khác cũng được sử dụng như Brevibacterium và Microbacterium [11]
Những loài vi khuẩn được sử dụng đều có một số đặc điểm sau:
+ Hình dạng tế bào từ hình cầu đến hình que ngắn;
+ Không chuyển động được, không có tiên mao;
+ Yếu tố cần thiết cho sinh trưởng và phát triển là Biotin;
+ Tích tụ một lượng lớn glutamic từ carbohydrate và NH4 +, trong môi trường có sục không khí
+ Không sử dụng trực tiếp nguyên liệu protid;
+ Không cần sử dụng nhiều hóa chất và thiết bị chịu ăn mòn;
+ Hiệu suất cao, chi phí sản xuất thấp;
+ Tạo được glutamic acid dạng L- , có hoạt tính sinh học cao
Sản lượng L- Glu sản xuất bằng phương pháp lên men trực tiếp là khoảng 370 nghìn tấn/năm [12] Phân khúc ứng dụng thực phẩm và đồ uống thống trị thị trường glutamic acid với tỷ lệ doanh thu hơn 80% vào năm 2020 Điều này là do việc sử dụng ngày càng nhiều axit glutamic trong ngành thực phẩm và đồ uống như một chất điều vị Một số công ty lớn trong thị trường Glutamic acid gồm Ajinomoto Co., Inc., Akzo Nobel N.V., Evonik Industries AG, Sichuan Tongsheng Amino acid Co., Ltd., Global Bio-chem Technology Group Company Limited, and Ningxia Yipin Biological Technology Co., Ltd
Nhu cầu thức ăn chăn nuôi ngày càng tăng, cùng với việc sử dụng ngày càng nhiều phụ gia thực phẩm và chất tăng cường thực phẩm trong ngành thực phẩm và đồ uống, được ước tính sẽ thúc đẩy tăng trưởng thị trường glutamic acid [12]
1.1.5 Những nghiên cứu về quá trình kết tinh Glutamic acid
Nhóm nghiên cứu của Zhi-hua Li, Cheng-lin Zhang and Qing-yang Xu đã khảo sát quá trình kết tinh L- Glu trong phòng thí nghiệm với kết quả cho thấy điều kiện kết tinh L-Glu phù hợp là: tốc độ khuấy 200 vòng/phút, thời gian siêu âm 10 phút, tốc độ thêm acid 0.5 mL/phút Nghiên cứu cũng chỉ ra, với các điều kiện phù hợp trên thì hiệu suất kết tinh đạt 95.4% (cao hơn 6.5% so với các nghiên cứu trước), độ tinh khiết của L- Glu trên 99% (cao hơn 4% so với các nghiên cứu trước) [13]
Tổng quan về Alanine
Alanine (ký hiệu Ala) là một axit α-amino acid có công thức hóa học C3H7NO2 phổ biến, được sử dụng trong quá trình sinh tổng hợp protein Alanine chứa một nhóm α- amino (ở dạng proton, −NH3 +, trong điều kiện sinh học), một nhóm axit α-carboxylic (ở dạng giảm proton, −COO−, trong điều kiện sinh học), và một nhóm methyl, làm cho Alanine trở thành một amino acid mạch hở, không phân cực Đây là amino acid không thiết yếu của con người vì cơ thể có thể tự tổng hợp được, nó không cần nhất thiết phải có mặt trong chế độ ăn uống [16]
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Alanine
L-Alanine là đồng phân phổ biến nhất của alanine trong tự nhiên vì nó là thành phần cấu tạo nên protein, với 7,8% trong cấu trúc bậc một trong 1.150 mẫu protein được khảo sát, chỉ đứng sau L- leucine [8]
Dạng: bột tinh thể màu trắng, có vị ngọt
Khối lượng phân tử: 89,1 g/mol
Khối lượng riêng: 1,424 g/mL Độ hòa tan: 16,5g/100g (trong nước, 25 o C) [1]
Góc quay cực riêng: +13,0 o (5M HCl) Điểm đẳng điện: pH 6,01 [1]
Hình 1.5: (S)-Alanine (trái) và (R)-Alanine (phải)
Alanine có thể bị phân hủy bởi những tác nhân oxy hóa khử hoặc các xúc tác tương tự enzyme Chiều hướng của quá trình này phần lớn được kiểm soát bởi nồng độ tương đối của các cơ chất và sản phẩm của các phản ứng [12]
Alanine rất hữu ích trong các thí nghiệm mất chức năng liên quan đến quá trình phosphoryl hóa Một số kỹ thuật liên quan đến việc tạo ra một thư viện gen, mỗi gen có một đột biến điểm ở một vị trí khác nhau trong vùng quan tâm, đôi khi thậm chí mọi vị trí trong toàn bộ gen: đây được gọi là “quét đột biến” Phương pháp đơn giản nhất, và là phương pháp đầu tiên được sử dụng, được gọi là quét Alanine, trong đó mọi vị trí lần lượt bị đột biến thành Alanine [7]
Quá trình hydro hóa Alanine tạo ra rượu amin alaninol, là một khối cấu tạo bất đối hữu ích Quá trình khử amin của phân tử alanin tạo ra gốc tự do Sự khử có thể được tạo ra trong alanin rắn hoặc nước bằng bức xạ gây ra sự phân cắt đồng nhất của liên kết cacbon-nitơ [17]
Tính chất này của Alanine được sử dụng trong các phép đo liều lượng trong xạ trị Khi Alanine bình thường được chiếu xạ, bức xạ làm cho một số phân tử trở thành gốc tự do, và khi các gốc này ổn định, hàm lượng gốc tự do sau đó có thể được đo bằng phương pháp cộng hưởng từ điện tử để tìm ra bức xạ mà Alanine đã tiếp xúc [18] Đây được coi là một phép đo có liên quan về mặt sinh học đối với mức độ tổn thương
10 do bức xạ mà mô sống sẽ phải chịu trong cùng một mức độ phơi nhiễm bức xạ Các kế hoạch điều trị xạ trị có thể được gửi ở chế độ thử nghiệm tới Alnine, sau đó chúng có thể được đo để kiểm tra xem hệ thống điều trị có phân phối đúng dạng liều bức xạ dự kiến hay không [19]
1.2.3 Ứng dụng và vai trò của của Alanine a) Ứng dụng
Alanine có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm khi nó được dùng làm các chất phụ gia có tác dụng điều vị, chất kích thích quá trình kết tinh, làm ngăn sự mất màu (đặc biệt là màu nâu) trong sản phẩm,… [11] Cụ thể, Ala đóng vai trò quan trọng trong các ngành sau:
- Trong ngành y học: Alanine được sử dụng để điều trị tình trạng suy giảm cơ bắp và viêm khớp Nó cũng có thể được sử dụng để cải thiện chức năng gan và giảm đau trong các trường hợp bệnh thận
- Trong ngành thể thao: Alanine được sử dụng để tăng cường sức mạnh và sức bền cơ bắp, cải thiện sức chịu đựng và giảm sự mệt mỏi trong các hoạt động thể thao
- Trong ngành sản xuất thực phẩm: Alanine được sử dụng làm chất bảo quản và là thành phần của các sản phẩm thực phẩm như mì ăn liền, bánh mì và thức ăn cho thú cưng
- Trong ngành sản xuất hóa chất: Alanine được sử dụng để sản xuất các sản phẩm hóa học như axit amin và các hợp chất hữu cơ khác
- Trong nghiên cứu khoa học: Alanine được sử dụng để nghiên cứu các quá trình sinh hóa trong cơ thể, đặc biệt là quá trình chuyển hóa chất béo b) Vai trò sinh học Ở động vật có vú, Alanine đóng một vai trò quan trọng trong chu trình Glucose- Alanine giữa các mô và gan Trong cơ và các mô khác phân hủy các amino acid để làm nhiên liệu, các nhóm amin được tạo ra dưới dạng glutamate [20] Glutamate sau đó có thể chuyển nhóm amin của nó thành pyruvate, một sản phẩm của quá trình
11 đường phân ở cơ, thông qua hoạt động của alanine aminotransferase, tạo thành alanine và α-ketoglutarate [17] Alanine đi vào máu và được vận chuyển đến gan Phản ứng alanine aminotransferase diễn ra ngược lại trong gan, nơi pyruvate tái sinh được sử dụng trong quá trình tạo gluconeogenesis, tạo thành glucose trở lại cơ thông qua hệ tuần hoàn Glutamate trong gan đi vào ty thể và bị glutamate dehydrogenase phân hủy thành α-ketoglutarate và amoni, lần lượt tham gia vào chu trình urê để tạo thành urê được thải qua thận [19]
Chu trình Glucose-Alanine cho phép loại bỏ pyruvate và glutamate khỏi cơ và vận chuyển đến gan một cách an toàn Khi đó, pyruvate được sử dụng để tái tạo glucose, sau đó glucose trở lại cơ để chuyển hóa thành năng lượng: điều này chuyển phần lớn năng lượng của quá trình tạo gluconeogenesis đến gan thay vì cơ và tất cả ATP có sẵn trong cơ có thể được dành cho sự co lại [18] Cơ chế này đi theo con đường dị hóa và dựa vào sự phân hủy protein trong mô cơ Bên cạnh đó, những bằng chứng xác nhận nó có xảy ra ở động vật không có vú hay không và ở mức độ nào vẫn chưa rõ ràng [18] Hiệu suất của chu trình Alanine có phần sút kém hơn so với chu trình Cori, nguyên do là một phần năng lượng do chu trình alanine sản sinh ra được dùng trong công đoạn sản sinh urê Tức là, việc loại bỏ urê tiêu tốn năng lượng vì lượng ATP nhìn chung được sản sinh từ chu trình Alanine thấp hơn so với chu trình Cori Tuy nhiên, trái với chu trình Cori, NADH trong chu trình Alanine được bảo tồn vì chu trình không sản sinh ra axit lactic, điều này giúp cho NADH có thể được oxy hóa trong chuỗi chuyển điện tử [17] Chu trình Alanine yêu cầu sự hiện diện của enzyme alanine aminotransferase, vốn chỉ tồn tại trong các cơ quan như cơ, gan hay ruột Vì vậy, chu trình Alanine chỉ được thực thi thay cho chu trình Cori dưới sự hiện diện của enzyme này và khi cơ thể phát sinh nhu cầu chuyển ammonia đến gan
Chu trình Alanine cũng có các chức năng sau:
- Phục hồi mạch carbon giữa gan và cơ
- Vận chuyển NH4 + đến cơ và để được chuyển hóa thành urê
1.2.4 Những nghiên cứu trước đây về định lượng Alanine
Nhóm nghiên cứu của ThS Trần Diễm Phúc và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp định lượng đồng thời amino acid trong viên nang Doragon bằng phương pháp HPLC-DAD Công trình được công bố năm 2011 Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời 6 amino acid là alanine, proline, valine, lysine và tyrosine Tuy nhiên, quy trình phân tích định lượng này chưa tách được đồng phân quang học D -Ala và L -Ala và định lượng chúng [21]
Tổng quan về sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là kĩ thuật phân tích dựa trên sự tương tác giữa chất phân tích với pha động (chất lỏng) và pha tĩnh (chất rắn) Các hợp chất có sự tương tác khác nhau với pha động và pha tĩnh sẽ được tách ra nhờ thời gian lưu giữ trong cột khác nhau Do đó hai yếu tố quan trọng để thực hiện vai trò của pha tĩnh (cột nhồi) và pha động cho quá trình chạy chất phân tích [27]
Việc lựa chọn pha động ảnh hưởng lớn đến phương pháp phân tích sắc kí Thông thường, dung môi phân tích được chọn theo các tính chất thỏa mãn các điều kiện sau:
- Hòa tan được mẫu phân tích
- Bền vững trong thời gian chạy sắc ký
- Phù hợp với đầu dò
- Có độ tinh khiết cao
Trong sắc ký pha thuận, pha động là các dung môi không phân cực như benzene, n-hexan, toluene, … Trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi phân cực có thể là nước, methanol, acetonitrile, … Tuy nhiên, người ta thường dùng hỗn hợp hai hay ba dung môi để có một pha động có độ phân cực phù hợp với phép phân tích, đặc biệt đối với các hỗn hợp mẫu phức tạp
Bảng 1.1: Tính chất hóa lý của một số loại dung môi [28]
Vùng UV tới hạn (nm)
Nhiệt độ Sôi ( o C) Độ nhớt (cP) Độ phân cực iso-octane 197 99 0,47 - n-heptane 195 98 0,4 0,2 n-hexane 190 69 0,4 0,1 cyclohexane 200 81 0,9 -0,2
Dioxane 215 101 1,2 5,27 tert-butanol - 82 3,6 0,03 n-butanol 210 118 2,6 3,9 iso-propanol 205 82 1,9 4,0
Dựa vào độ phân cực của pha tĩnh có thể chia thành sắc kí pha thuận và sắc kí pha đảo
Sắc ký pha thuận: sử dụng pha tĩnh phân cực, phổ biến nhất là silicagen, thường dùng phân tích đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực Khi silicagen được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực như các aminopropyl: -(CH2)3NH2, cyanopropyl: -(CH2)3CN, propyldiol: -(CH2)3-O-CH2- CH(OH)-CH2OH, để được những pha tĩnh phân cực mang những tính chất khác nhau
Sắc ký pha đảo: sử dụng pha tĩnh kém phân cực, thường là silicagen có gắn gốc ankyl mạch dài, không phân cực, loại thông dụng nhất là -C18H37 Nó được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng, từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực.
Thông số đánh giá hiệu quả sắc ký
• Độ phân giải (resolution) Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Công thức tính độ phân giải:
Trong đó: RS – Độ phân giải t2, t1 – thời gian lưu của 2 chất phân tích w2, w1 – độ rộng chõn peak tại ẵ chiều cao Theo yêu cầu của sắc ký, RS tối thiểu bằng 1,5 [27]
• Số đĩa lý thuyết (theoretical plates)
Trong đó: t R : thời gian lưu W: bề rộng chân peak
W 1/2 bề rộng peak ở vị trớ ẵ cường độ tớn hiệu của peak
Số đĩa lý thuyết biểu diễn hiệu quả tách của cột, số đĩa lý thuyết càng lớn thì cột cho hiệu quả tách càng tốt
• Hệ số kéo đuôi (Tailing factor)
Hình 1.9: Hình minh họa peak kéo đuôi [28]
Hệ số kéo đuôi (TF) được tính theo công thức:
Hệ số kéo đuôi dùng để đánh giá tính đối xứng của peak Theo lý thuyết, peak cân xứng sẽ có hệ số kéo đuôi TF ≈ 1 Tuy nhiên vì nhiều lý do như xuất hiện bọt khí trong cột, bề mặt cột không đồng nhất, nhiệt độ không ổn định,… khiến peak không đối xứng Các peak có hệ số kéo đuôi thỏa mãn: 0,5 ≤ TF ≤ 2 được chấp nhận
Sắc ký trao đổi ligand
Sắc ký trao đổi ligand (Ligand - exchange chrotomatography - LEC) được giới thiệu vào thập niêm 1960 bởi Davankov và Rogozhin, sau đó được ứng dụng vào sắc ký lỏng đầu những năm 1970 [29]
Cơ chế phân tách của LEC dựa vào quá trình trao đổi ligand Những phân tử hoặc ion có đặc tính cho hoặc nhận electron Ví dụ, những ion kim loại có tính chất nhận electron và chúng được gọi là “chất nhận điện tử”, đóng vai trò như một Lewis acid Nếu một hợp chất cho điện tử (còn gọi là “nguồn cho điện tử”) đứng gần một ion kim loại, xảy ra một sự trao đổi ion giữa chúng từ đó hình thành một phức chất trên cơ sở liên kết phối trí Ở đây nguồn cho điện tử gọi là ligand Một ví dụ cho hiện tượng này là hầu hết ion kim loại trong thủy dung đều tạo phức với các phân tử nước (hay phức chất aqua) Khi ligand khác tồn tại cùng lúc với các ion kim loại trong thủy dung, ligand sẽ cạnh tranh với các phân tử nước để tạo phức với các ion kim loại Phản ứng này được trình bày bằng biểu thức sau:
Theo đó, ion kim loại M có số phối trí n và L là ligand có số phối trí m Phản ứng này được biết đến là phản ứng trao đổi ligand Sắc ký trao đổi ligand dựa trên phản ứng này để phân tách các thành phần bằng cách sử dụng lực liên kết khác nhau của từng thành phần (ligand) với những ion kim loại cố định trong cột (cũng có nghĩa là, sự khác biệt về độ bền của phức chất tạo thành) Các ion kim loại được cố định trên những hạt nhựa pha tĩnh có sẵn các nhóm chức, như nhóm sulfone, carboxyl hoặc amine, bởi liên kết ion hoặc liên kết phối trí Trong một vài trường hợp những ligand thích hợp với mục đích phân tích sẽ được cố định lên vật liệu nhựa nhồi [30] Pha động là dung môi chứa các ligand cạnh tranh phù hợp đối với phản ứng trao đổi Sự rửa giải các hợp chất mục tiêu được kiểm soát bằng việc điều chỉnh nồng độ của các ligand cạnh tranh và pH [31]
Ion kim loại phổ biến nhất là Cu (II) hình thành phức chất với 6 liên kết từ tâm đến các ligand LEC được ứng dụng rộng rãi để phân tách các a-amino acid, b-amino acid, a-hydroxy acid, hợp chất diols, amino alcohols, quinolones, peptides,…[32]
Các yếu quan trọng của phương pháp sắc ký trao đổi ligand gồm: bản chất và nồng độ ion kim loại M, tỷ lệ ion kim loại và số phối tử liên kết,…[33]
Một số cơ chế tạo dẫn xuất đối với các đối quang amino acid được mô tả như hình bên dưới Trong đề tài nghiên cứu này, các chất phản ứng được lựa chọn là OPA và N-acetyl -L -cysteine [34]
Hình 1.10: Cơ chế tạo dẫn xuất phù hợp [28].
Thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp phân tích hay xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan cho thấy phương pháp được lựa chọn đáp ứng được mục đích sử dụng Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích [28]
Phòng thử nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau Dựa vào nguồn gốc có thể phân loại các phương pháp thành hai nhóm:
- Các phương pháp tiêu chuẩn: các phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như TCVN, ISO, ASTM, AOAC…
- Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ (non- standard/alternative/in-house method): là các phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị, phương pháp theo các tạp chí, tài liệu chuyên ngành
Theo yêu cầu của ISO 17025, phương pháp phân tích phải được thẩm định (method validation) hoặc thẩm định lại khi:
- Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn (non-standard method)
- Phương pháp do phòng thử nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa vào sử dụng thành thường qui
- Khi có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp dụng của phương pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn
- Khi có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được thẩm định (ví dụ: thiết bị phân tích với các đặc tính khác biệt, nền mẫu, người phân tích,…)
Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất, Tính đặc hiệu của phương pháp tốt khi phương pháp có kết quả dương tính khi có mặt chất cần phân tích Và ngược lại, khi có mặt các tạp chất khác có cấu trúc hay tính chất tương tự chất phân tích không gây ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả là âm tính Trong phép phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác [28]
Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình Nếu chất cần xác định, định lượng phân biệt rõ với các chất khác cần phân tích thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc Do vậy, tính chọn lọc có thể được xem là bao gồm cả tính đặc hiệu Do các phương pháp phân tích dư lượng thường là phân tích đa dư lượng, phân tích đồng thời nhiều chất nên khái niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc của phương pháp định tính, định lượng cần bố trí các thí nghiệm như sau:
- Phân tích các mẫu trắng, lặp lại tối thiểu 6 lần đối với từng loại nền mẫu Mẫu trắng phải không được cho tín hiệu phân tích Nếu mẫu trắng có hơn 10% dương tính hoặc xuất hiện tín hiệu thì cần phải thay đổi phương pháp để loại trừ các ảnh hưởng
- Phân tích mẫu thử hoặc mẫu trắng thêm chuẩn ở hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần So sánh kết quả với mẫu trắng, phải cho tín hiệu chất cần phân tích
- Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu (co-chromatography), cách này thường áp dụng đối với các phương pháp sắc ký Sau khi chuẩn bị mẫu (mẫu trắng hoặc mẫu thực) và phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký thu được các pic sắc ký, ta thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu/chọn lọc
- Phân tích mẫu không có chất phân tích nhưng có chất cấu trúc tương tự chất phân tích (nếu có): Phải cho kết quả âm tính (đối với phương pháp định tính) và không được ảnh hưởng đến kết quả định lượng của chất phân tích (đối với phương pháp định lượng) Trong trường hợp những chỉ tiêu phân tích không thể có mẫu trắng (sample blank) để xác định tính chọn lọc/đặc hiệu, có thể thực hiện các thí nghiệm trên các mẫu trắng thuốc thử (reagent blank), tức là thực hiện phân tích các bước tương tự như khi phân tích mẫu nhưng không có mẫu thử [35]
1.6.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo và kết quả nồng dộ chất phân tích Đối với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện việc xác định khoảng tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) Xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau [28] Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo lần lượt các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Khoảng tuyến tính phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, nhưng chủ yếu là do tính chất của chất phân tích cũng như kỹ thuật dùng phân tích
Trong thực tế phân tích mẫu, khoảng nồng độ xây dựng đường chuẩn không nhất thiết phải là khoảng tuyến tính Việc lựa chọn khoảng nồng độ xây dựng đường chuẩn phụ thuộc vào nồng độ thường gặp của các mẫu phân tích Đường chuẩn được xây dựng sao cho nồng độ mẫu không vượt quá giới hạn thấp nhất và cao nhất Tốt nhất là nồng độ của mẫu phân tích nằm ở khoảng giữa của đường chuẩn Ngoài đường chuẩn tuyến tính thường gặp, có các loại đường chuẩn phi tuyến khác, tuy nhiên trong phân tích, đường chuẩn tuyến tính được sử dụng phổ biến nhất [28]
• Xây dựng đường chuẩn trong dung môi
Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ) Xác định các giá trị đo được theo nồng độ Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có đường biểu diễn là một phương trình y = ax + b
• Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng Để xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng, cần chuẩn bị sẵn dịch chiết mẫu trắng như quy trình phân tích của phương pháp Lần lượt thêm các thể tích chuẩn trung gian và làm việc thích hợp vào dịch chiết mẫu trắng để được các điểm chuẩn có nồng độ khác nhau Biểu diễn sự phụ thuộc giữa giá trị đo và nồng độ chuẩn theo phương trình y = ax+b Đường chuẩn xây dựng trên nền mẫu trắng có độ tin cậy cao hơn so với đường chuẩn trong dung môi Việc xây dựng đường chuẩn trong nền mẫu nhằm loại bỏ các ảnh hưởng do các chất đồng rửa giải trong nền mẫu Tuy nhiên trong thực tế các phương pháp xác định dư lượng thường là các phương pháp xác định đồng thời nhiều chất, khoảng 50-200 chất, do đó việc chuẩn bị mẫu trắng gặp rất nhiều khó khăn Có thể sử dụng phương pháp lập đường chuẩn trên nền mẫu thực để có kết quả tốt
• Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực
Phân tích mẫu thực có cho thêm các nồng độ chuẩn khác nhau tương tự như trong phần làm với mẫu trắng Vẽ đường cong tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ chuẩn thêm Nồng độ các điểm chuẩn thường nằm trong khoảng 0,5 đến 2 lần nồng độ ước lượng trong mẫu phân tích Khi sử dụng đường chuẩn trên nền mẫu thực có thể loại trừ được các ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích như xây dựng
24 trên nền mẫu trắng Sau khi lập được phương trình đường chuẩn y = ax + b, có thể dễ dàng tính được nồng độ: X = b/a
• Đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn
THỰC NGHIỆM
Mục tiêu – nội dung nghiên cứu
- Phát triển phương pháp phân tích sắc ký đầu dò huỳnh quang nhằm phân tích được
2 đồng phân L- Alanine và D- Alanine; định lượng hàm lượng của chúng trong mẫu thử
- Khảo sát ảnh hưởng của Alanine đến quá trình kết tinh Glutamic acid
Từ mục tiêu đề ra, luận văn tập trung vào nghiên cứu 2 nội dung chính như sau:
Nội dung 1: Xây dựng quy trình định lượng Alanine trong mẫu thử
Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của Alanine đến quá trình kết tinh Glutamic acid.
Hóa chất – thiết bị
- Methanol 99% dùng cho HPLC, Merck
- Ethanol 99% dùng cho HPLC, Merck
- Nước cất dùng cho HPLC, Merck
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF), LC-20AD, Shimadzu
- Cột sắc ký MCI GEL CRS10W đường kính 4,6 mm, chiều dài 50 mm, kích thước hạt silica gel 3 àm, 100 A o , Mitsubishi
- Thiết bị đo kích thước hạt SALD - 2300, Shimadzu
- Thiết bị Biotech AS-210, Sakura
- Thiết bị siêu âm DR-P60, Derui
- Máy ly tâm H-112, Kokusan, Nhật Bản
- Kính hiển vi CH40RF200, Olympus, Nhật Bản
- Cân điện tử 3 số lẻ PR223/E, Ohaus
- Cốc thủy tinh 100 mL, 200 mL, 500 mL
- Bình định mức 20 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 500 mL
- Pipette 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL
- Vial 1,5 mL sử dụng một lần.
Phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình định lượng Alanine trong mẫu thử
2.3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp
Các thông số sắc ký quan trọng cần khảo sát:
- Bước sóng phát xạ: WL Em (nm)
- Bước sóng kích thích: WL Ex (nm)
- Nồng độ CuSO4 trong pha động: C (mM)
- Tốc độ dòng: F (mL/phút)
- Thể tớch tiờm mẫu: V (àL)
Từ phương pháp nội bộ đang được áp dụng, khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp dựa trên những thông số ban đầu được lựa chọn như sau:
- Bước sóng kích thích: 345 nm
- Bước sóng phát xạ: 450 nm
- Nồng độ CuSO4 trong pha động: 2 mM
- Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL a) Khảo sát bước sóng phát xạ
Hút dung dịch chuẩn DL -Alanine 4,0 ppm đã chuẩn bị bằng kim tiêm, lọc qua màng lọc 0,45 àm vào vial và đưa vào mỏy sắc ký Khảo sỏt bước súng phỏt xạ trong khoảng
435 – 465 nm, với các điều kiện ban đầu được nêu trong bảng bên dưới Tín hiệu sắc ký bao gồm sắc ký đồ và diện tích peak được ghi nhận bằng phần mềm Labsolution Bước sóng khảo sát cho diện tích peak cao nhất gọi là bước sóng phát xạ phù hợp
WLEm * và được chọn để khảo sát các yếu tố tiếp theo
Bảng 2.1: Khảo sát bước sóng phát xạ
Thí nghiệm WL Em WL Ex C F T V
345 nm 2,0 mM 0,5 mL/phỳt 40 o C 10 àL
7 465 nm b) Khảo sát bước sóng kích thích
Hút dung dịch chuẩn DL -Alanine 4,0 ppm đã chuẩn bị bằng kim tiêm, lọc qua màng lọc 0,45 àm vào vial và đưa vào mỏy sắc ký Khảo sỏt bước súng kớch thớch trong khoảng 335 – 365 nm, với các điều kiện ban đầu được nêu trong bảng bên dưới Tín hiệu sắc ký bao gồm sắc ký đồ và diện tích peak được ghi nhận bằng phần mềm
Labsolution Bước sóng khảo sát cho diện tích peak cao nhất gọi là bước sóng kích thích phù hợp WLEx * và được chọn để khảo sát các yếu tố tiếp theo
Bảng 2.2: Khảo sát bước sóng kích thích
Thí nghiệm WL Ex WL Em C F T V
WLEm * 2,0 mM 0,5 mL/phỳt 40 o C 10 àL
11 365 nm c) Khảo sát nồng độ nồng độ CuSO 4
Hút dung dịch chuẩn DL -Alanine 4,0 ppm đã chuẩn bị bằng kim tiêm, lọc qua màng lọc 0,45 àm vào vial và đưa vào mỏy sắc ký Khảo sỏt nồng độ pha động trong khoảng 0,5 – 2,0 mM, với các điều kiện ban đầu được nêu trong bảng bên dưới Tín hiệu sắc ký bao gồm sắc ký đồ và độ phân giải được ghi nhận bằng phần mềm Labsolution Nồng độ cho độ phân giải cao nhất gọi là nồng độ pha động phù hợp C * (mM) và được chọn để khảo sát các yếu tố tiếp theo
Bảng 2.3: Khảo sát nồng độ CuSO 4
Thí nghiệm C WL Ex WL Em F T V
WLEx * WLEm * 0,5 mL/phỳt 40 o C 10 àL
36 d) Khảo sát tốc độ dòng
Hút dung dịch chuẩn DL -Alanine 4,0 ppm đã chuẩn bị bằng kim tiêm, lọc qua màng lọc 0,45 àm vào vial và đưa vào mỏy sắc ký Khảo sỏt tốc độ dũng trong khoảng 0,25 – 1,5 mL/phút, với các điều kiện ban đầu được nêu trong bảng bên dưới Tín hiệu sắc ký bao gồm sắc ký đồ và độ phân giải được ghi nhận bằng phần mềm Labsolution Tốc độ dòng cho độ phân giải cao nhất gọi là tốc độ dòng phù hợp F * (mL/phút) và được chọn để khảo sát các yếu tố tiếp theo
Bảng 2.4: Khảo sát tốc độ dòng
Thí nghiệm F WL Ex WL Em C T V
4 1,5 mL/phút e) Khảo sát nhiệt độ cột
Hút dung dịch chuẩn DL -Alanine 4,0 ppm đã chuẩn bị bằng kim tiêm, lọc qua màng lọc 0,45 àm vào vial và đưa vào mỏy sắc ký Do giới hạn chịu đựng của cột sắc ký đã chọn là 40 o C nên tiến hành khảo sát nhiệt độ cột trong khoảng 30 - 40 o C, với các điều kiện ban đầu được nêu trong bảng bên dưới Tín hiệu sắc ký bao gồm sắc ký đồ và độ phân giải được ghi nhận bằng phần mềm Labsolution Nhiệt độ cột cho độ phân giải cao nhất gọi là nhiệt độ cột phù hợp T * ( o C) và được chọn để khảo sát các yếu tố tiếp theo
Bảng 2.5: Khảo sát nhiệt độ cột
Thí nghiệm T WL Ex WL Em F C V
37 f) Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Hút dung dịch chuẩn DL -Alanine 4,0 ppm đã chuẩn bị bằng kim tiêm, lọc qua màng lọc 0,45 àm vào vial và đưa vào mỏy sắc ký Khảo sỏt thể tớch tiờm mẫu trong khoảng
5 – 20 àL, với cỏc điều kiện ban đầu được nờu trong bảng bờn dưới Tớn hiệu sắc ký bao gồm sắc ký đồ và độ phân giải được ghi nhận bằng phần mềm Labsolution Thể tớch tiờm mẫu cho độ phõn giải cao nhất gọi là thể tớch tiờm mẫu phự hợp V * (àL)
Bảng 2.6: Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Thí nghiệm V WL Ex WL Em F C T
Từ các thí nghiệm đã tiến hành, chọn điều kiện phù hợp của phương pháp sắc kí:
- Bước sóng phát xạ: WL Em * (nm)
- Nồng độ pha động CuSO4: C* (mM)
- Tốc độ dòng: F* (mL/phút)
- Thể tớch tiờm mẫu: V* (àL)
2.3.1.2 Thẩm định phương pháp a) Khảo xác tính đặc hiệu
Tiến hành phân tích mẫu trắng, các mẫu chuẩn theo các điều kiện HPLC đã khảo sát để xác nhận tín hiệu b) Khảo sát độ tuyến tính
Từ dung dịch chuẩn gốc DL -Alanine 1.000 ppm, pha loãng bằng nước cất để thu được các dung dịch chuẩn với những nồng độ như sau:
Bảng 2.7: Nồng độ các dung dịch chuẩn DL -Ala
Lọc cỏc dung dịch trờn qua màng lọc 0,45 àm rồi phõn tớch bằng mỏy HPLC Tiến hành tiêm mẫu, mỗi nồng độ tiêm 3 lần, lấy kết quả trung bình và vẽ đồ thị khảo sát sự tương quan giữa đại lượng y (diện tích peak của dung dịch chuẩn) và x (nồng độ dung dịch chuẩn) Đường chuẩn cần có hệ số tương quan r 2 đạt ít nhất 0,99 c) Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) a là hệ số gốc của đường chuẩn có dạng y = ax + b đã khảo sát ở trên
SD là độ lệch chuẩn của hệ số b trong đường chuẩn y = ax + b, xác định bằng cách lặp lại 6 lần đường chuẩn d) Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ) a là hệ số gốc của đường chuẩn có dạng y = ax + b đã khảo sát ở trên
SD là độ lệch chuẩn của hệ số b trong đường chuẩn y = ax + b, xác định bằng cách lặp lại 6 lần đường chuẩn e) Khảo sát độ chính xác
Sử dụng mẫu chuẩn DL -Alanine 4,0 ppm được chuẩn bị theo quy trình đã trình bày, tiến hành làm thí nghiệm lặp 6 lần (mỗi lần pha lại dung dịch chuẩn này từ đầu) Theo AOAC, chấp nhận RSD% < 10.3% [11]
* Độ đúng Độ đúng của phương pháp sắc ký được đánh giá thông qua độ thu hồi theo cách tính đã trình bày Theo AOAC, chấp nhận R% ít nhất đạt 80% [11] a
2.3.1.3 Khảo sát độ bền của dung dịch chuẩn
Khảo sát độ bền của dung dịch chuẩn DL -Alanine 4,0 ppm theo thời gian lưu trữ Thực hiện khảo sát lặp lại mỗi ngày trong thời gian 7 ngày Các dung dịch chuẩn được bảo quản ở 5 ± 1 o C, được phân tích đồng thời với dung dịch chuẩn vừa được pha tại thời điểm phân tích ở cùng mức nồng độ từ dung dịch chuẩn gốc Đánh giá kết quả khảo sát: Nồng độ hoặc diện tích của dung dịch chuẩn cũ và mới không được chênh lệch quá 10% Kết quả được đánh giá dựa diện tích peak dung dịch chuẩn và độ lệch chuẩn khi tiêm lặp lại [35]
2.3.1.4 So sánh kết quả phân tích giữa phương pháp nội bộ và phương pháp đối chứng
Tiến hành so sánh trên cùng loại mẫu được lấy ở quy trình sản xuất giữa phương pháp nội bộ và phương pháp đối chứng a) So sánh nồng độ Ala trong các mẫu thử
Mẫu rắn (tinh thể bột ngọt: LC-1, LC-2), mẫu lỏng (các mẫu trung gian trong quy trình sản xuất: NL, #1L, #2L, #3L)
KẾT QUẢ
Nội dung 1: Xây dựng quy trình định lượng Alanine trong mẫu thử
3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phù hợp a) Khảo sát bước sóng phát xạ
Hình 3.1: Khảo sát bước sóng phát xạ
Kết quả khảo sát cho thấy, bước sóng phát xạ có giá trị cực đại tại 445 nm Do đó, nó được được lựa chọn để khảo sát các yếu tố khác b) Khảo sát bước sóng kích thích
Hình 3.2: Khảo sát bước sóng kích thích
Di ện t íc h pe ak ( AU)
Bước sóng phát xạ(nm)
Bước sóng kích thích (nm)
Kết quả khảo sát cho thấy, bước sóng kích thích có giá trị cực đại tại 343 nm
Do đó, nó được được lựa chọn để khảo sát các yếu tố khác c) Khảo sát nồng độ pha động
Hình 3.3: Khảo sát nồng độ CuSO4
Kết quả khảo sát cho thấy, độ phân giải tăng dần khi giảm dần nồng độ CuSO4 trong pha động từ 2,0 mM xuống 0,05 mM Tuy nhiên, khi giảm nồng độ CuSO4 thì thời gian cân bằng cột trước khi phân tích sẽ kéo dài thêm Về bản chất, Cu 2+ là cầu nối tạo nên tương tác của các đối tượng cần phân tách với pha tĩnh thông qua cơ chế tạo phức Ion Cu 2+ một mặt tạo phức với các nhóm thế trên pha tĩnh, một mặt cũng tạo phức với các ligand là các đối tượng cần phân tách Do pha tĩnh có chứa các đối tượng có tâm bất đối xứng cho nên sự tạo phức này cũng dẫn đến sự tương tác khác nhau giữa các đồng phân quang học với pha tĩnh Khi nồng độ CuSO4 tăng, sự tạo phức tăng sẽ làm tăng tương tác của các đối tượng cần phân tách với pha tĩnh, kết quả là sự chênh lệnh của tương tác của các đồng phân quang học khác nhau với pha tĩnh trở nên không đáng kể, dẫn đến làm giảm khả năng tách Do đó, với mục tiêu độ phân giải đã đặt ra từ đầu, 0,1 mM CuSO4 được lựa chọn là thông số phù hợp để khảo sát các yếu tố khác
47 d) Khảo sát tốc độ dòng
Hình 3.4: Khảo sát tốc độ dòng
Kết quả khảo sát cho thấy, độ phân giải tăng dần khi giảm dần tốc độ dòng từ 1,5 mL/phút xuống 0,25 mL/phút Tốc độ thấp có thể nâng cao hiệu quả phân tách nhưng thời gian phân tích mẫu sẽ kéo dài Do đó, để cân đối giữa độ phân giải và thời gian phân tích mẫu, lựa chọn 0,5 mL/phút là tốc độ dòng phù hợp để khảo sát các yếu tố khác e) Khảo sát nhiệt độ cột
Hình 3.5: Khảo sát nhiệt độ cột
Tốc độ dòng (mL/phút)
Kết quả khảo sát cho thấy, trong khoảng nhiệt độ 30 – 40 o C, độ phân giải không thay đổi đáng kể Dựa vào thời gian lưu, thời gian phân tích mẫu nên chọn 40 o C là nhiệt độ cột phù hợp để khảo sát yếu tố tiếp theo f) Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Hình 3.6: Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Kết quả khảo sát cho thấy, độ phân giải tăng lên khi giảm thể tích tiêm mẫu Giữa 5 àL và 10 àL khụng cú sự khỏc biệt đỏng kể , nhưng đối với 10 àL sẽ cho peak nhọn và cao so với nền, do đú chọn 10 àL là thể tớch tiờm mẫu phự hợp cho phương phỏp này
3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích a) Khảo sát tính đặc hiệu
Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu trắng
Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn DL -Ala 4,0 ppm
Tại vị trí thời gian lưu của D-Ala và L-Ala lần lượt là 5,5 phút và 7,5 phút, mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu Trong khi đó, mẫu chuẩn DL- Ala ở mức nồng độ 4 ppm xuất hiện tín hiệu của ở cả 2 thời gian lưu tương ứng với D- Ala và L- Ala, không xuất hiện các peak tạp Như vậy, có thể kết luận phương pháp phù hợp về yêu cầu tính đặc hiệu Bên cạnh đó, khi so sánh với các nghiên cứu trước đây như đã được trích dẫn ở phần tổng quan, phương pháp nội bộ theo kết quả của luận văn này đã phân tách được hai đồng phân quang học của Ala là D- Ala và L- Ala Kết quả này đã giải quyết được vấn đề tồn đọng của các phương pháp hiện tại cũng như đáp ứng được yêu cầu hiện tại của doanh nghiệp
50 b) Khảo sát độ tuyến tính
Nồng độ D-Ala (ppm) Đường chuẩn D-Ala y = 146803x + 86224 R² = 0,9995
Nồng độ L-Ala (ppm) Đường chuẩn L-Ala
Bảng 3.1: Tổng hợp đường chuẩn D -Ala và L -Ala
Chất phân tích Phương trình hồi quy
Qua các kết quả phân tích và thống kê ta thấy, diện tích peak sắc ký và nồng độ phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với hệ số tương quan cao đạt yêu cầu Khoảng nồng độ tuyến tính rộng đối với cả hai đồng phân D- Ala và L- Ala từ 4 – 100 ppm Do đó, ta có thể sử dụng các phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn để định lượng hàm lượng các đồng phân trên trong mẫu thử ở khoảng tuyến tính đã khảo sát c) Khảo sát LOD, LOQ
Bảng 3.2: Khảo sát LOD, LOQ
Thí nghiệm D- Ala L- Ala Độ dốc Hệ số chặn Độ dốc Hệ số chặn
Trung bình 161824 36119 147677 102007 Độ lệch chuẩn 833 56810 303 43248
LOQ (ppm) 3,51 2,93 d) Khảo sát độ chính xác
Bảng 3.3: Khảo sát độ đúng D- Ala
Nồng độ chuẩn thêm (ppm)
Hàm lượng phân tích được (ppm)
Hàm lượng phân tích được trung bình (ppm) Độ thu hồi R
Bảng 3.4: Khảo sát độ đúng L- Ala
Nồng độ chuẩn thêm (ppm)
Hàm lượng phân tích được (ppm)
Hàm lượng phân tích được trung bình (ppm) Độ thu hồi R
Kết quả khảo sát độ đúng được trình bày ở hai bảng trên cho thấy độ hồi của 3 mẫu tại mỗi nồng độ trong khoảng từ 97,2% - 102,4% đối với D- Ala và 99,7%-100,6% đối với L- Ala Độ thu hồi trung bình tương ứng là 99,5% và 100,1%, đạt được yêu cầu độ thu hồi trong khoảng từ 80%-110%
Bảng 3.5: Khảo sát độ lặp lại
Diện tích peak Thời gian lưu
Diện tích peak Thời gian lưu
Bảng 3.6: Khảo sát độ tái lặp
Diện tích peak Thời gian lưu
(phút) Diện tích peak Thời gian lưu
Từ thí nghiệm khảo sát độ lặp lại và độ tái lặp, kết quả cho thấy phương pháp có độ lệch chuẩn trung bình của các tiêu chí đánh giá (thời gian lưu và diện tích peak) đối với D -Ala và L -Ala đều dưới 10% Như vậy, kết luận phương pháp đã đạt được yêu cầu về độ chụm
3.1.3 Khảo sát độ bền dung dịch chuẩn
Bảng 3.7: Khảo sát độ bền dung dịch chuẩn
Ngày Diện tích peak %RSD
Kết quả phân tích nồng độ dung dịch chuẩn cũ có thay đổi so với dung dịch chuẩn mới với xu hướng diện tích peak giảm dần cho cả D- Ala và L-Ala Trong vòng 7 ngày đầu tiên, độ lệch chuẩn so với dung dịch ngày đầu tiên có dao động nhưng ở mức dưới 5% Ngày thứ 8 thì D- Ala có độ lệch 10,9% và ngày thứ 9 L- Ala có độ lệch 12,6% vượt ngoài yêu cầu dưới 10% Kể từ ngày thứ 8 đến ngày thứ
14, diện tích peak có xu hướng giảm dần Từ kết quả kiểm tra dung dịch chuẩn cho thấy dung dịch chuẩn bền trong vòng 7 ngày ở nhiệt độ 5 ± 1 o C
3.1.4 So sánh kết quả phân tích giữa phương pháp nội bộ và phương pháp phân tích đối chứng a) Nồng độ Ala trong mẫu sản xuất
- Sắc ký Hải Đăng Eurofins dùng phương pháp EVN-R-RD - 1-TP-11515 (Ref AOAC 994.12, AOAC 2018.06) đã được xác nhận
- Giới hạn phát hiện của phương pháp: 100 ppm
Bảng 3.8: So sánh nồng độ Ala trong mẫu sản xuất
Phương pháp nội bộ Eurofins Độ lệch
D- Ala L- Ala Tổng Ala Tổng Ala ppm ppm ppm ppm
Dựa vào kết quả như bảng trên, phương pháp nội bộ đã phân tích được cụ thể nồng độ của từng đồng phân Ala trong mẫu Tổng nồng độ Ala ( D -Ala + L -Ala) của phương pháp nội bộ được so sánh với kết quả của trung tâm Eurofins ở hai nhóm mẫu gồm mẫu lỏng (#1L, #2L, #3L và NL) và mẫu rắn (tinh thể bột ngọt kí hiệu LC-1 và LC- 2) Độ lệch giữa hai phương pháp có sự khác biệt giữa các mẫu và giữa các nhóm mẫu, trong đó nhóm mẫu rắn cho độ lệch thấp hơn (1,8% và 2,6%), nhóm mẫu lỏng có độ lệch từ 3,9% đến tối đa 13,7% Như vậy, độ lệch trung bình giữa phương pháp nội bộ và phương pháp của Eurofins là -6,2% đạt mức kỳ vọng (dưới 10%) b) Tỷ lệ đồng phân D- Ala và L- Ala trong mẫu nguyên liệu Alanine
Quatest 3 dùng phương pháp QTTN/KT3 192:2018 đã được xác nhận trước
Bảng 3.9: So sánh hàm lượng D-Ala và L-Ala trong mẫu nguyên liệu
Phương pháp nội bộ Quatest 3 Độ lệch
Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu Ala nguyên liệu
Qua kết quả khảo sát, khi phân tích mẫu nguyên liệu Alanine, phương pháp nội bộ có thể cung cấp nồng độ của từng đồng phân Ala trong mẫu phân tích được pha ra từ mẫu gốc, từ đó có thể xác định được tỉ lệ D -Ala và L -Ala một cách nhanh chóng Trong khi đó, nếu dùng phương pháp của Quatest 3, kết quả nhận được là góc quay cực riêng của từng mẫu nguyên liệu sau đó cần sử dụng công thức liên hệ giữa góc quay cực và tỉ lệ đồng phân để tính được kết quả cuối cùng như yêu cầu
Kết quả so sánh cho thấy tỉ lệ đồng phân quang học của 2 phương pháp có độ tương đồng cao.
Nội dung 2 : Khảo sát ảnh hưởng của alanine đến quy trình kết tinh glutamic acid 56
3.2.1 Khảo sát điều kiện kết tinh phù hợp
Hình 3.12: Thí nghiệm kết tinh Glu trong bể điều nhiệt
Hình 3.13: Khảo sát điều kiện kết tinh Glu
Dựa theo kết quả khảo sát, trong khoảng thời gian lưu từ 0 đến 6 giờ, diễn biến của quá trình kết tinh theo xu hướng tăng dần hiệu suất, đạt cực đại ở 3 giờ (57,4%) và không tăng thêm nữa Tốc độ khuấy tăng từ 100 đến 200 vòng/phút thì hiệu suất kết
58 tinh tăng lên, tuy nhiên khi tốc độ khuấy tăng đến 300 vòng/phút thì hiệu suất kết tinh lại giảm xuống
Về mặt lý thuyết, ở các tốc độ dòng khuấy thấp như 100 vòng/phút hoặc 150 vòng/phút, khả năng khuếch tán kém làm quá trình kết tinh bị hạn chế Ngược lại, ở tốc độ dòng lớn (300 vòng/phút trở lên), sự va chạm giữa cánh khuấy với tinh thể và giữa các tinh thể với nhau làm tinh thể bị vỡ thành hạt nhỏ
Như vậy, thời gian lưu 3 giờ tốc độ khuấy 200 vòng/phút là điều kiện kết tinh phù hợp để khảo sát ở các bước tiếp theo
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của đồng phân quang học Ala
Hình 3.14: Ảnh hưởng của đồng phân Ala đến hiệu suất kết tinh
Mẫu đối chứng L-Ala D-Ala DL-Ala
Hi ệu s uấ t kế t ti nh ( % ) Đồng phân Ala
Hình 3.15: Ảnh hưởng của đồng phân Ala đến hiệu suất li tâm
Hình 3.16: Ảnh hưởng của đồng phân Ala đến kích thước tinh thể Glu
Hình 3.17: Ảnh chụp kính hiển vi tinh thể Glu (độ phóng đại: 10 lần) a) Mẫu đối chứng b) D- Ala c) DL- Ala d) L- Ala
Mẫu đối chứng L-Ala D-Ala DL-Ala
Hi ệu s uấ t li tâ m (% ) Đồng phân Ala
Mẫu đối chứng L-Ala D-Ala DL-Ala
Kí ch t hư ớc h ạt t ru ng b ìn h (mi cr on ) Đồng phân Ala a) b) c) d)
Hình 3.18: Nồng độ Ala trong tinh thể Glu sau li tâm
Kết quả khảo sát đã chỉ ra các đồng phân Ala có những tác động khác nhau đến quá trình kết tinh Glu Cụ thể, hiệu suất kết tinh hầu như thay đổi không đáng kể giữa mẫu đối chứng và các mẫu khảo sát Tuy nhiên, kích thước tinh thể ở mẫu thêm L-Ala
200 ppm là cao nhất với 203,3 micron; mẫu DL- Ala đạt 154,2 micron; mẫu D- Ala không có sự khác biệt đáng kể đối với mẫu đối chứng Do trong thành phần DL- Ala chứa 50% đồng phần L- Ala và 50% đồng phân D- Ala nên kích thước tinh thể tạo thành cũng phù hợp với xu hướng này Bên cạnh đó, kết quả cho thấy kích thước tinh thể lớn sẽ nâng cao hiệu suất li tâm Trong đó, mẫu thêm L- Ala đạt hiệu suất li tâm cao nhất 95,3%, tiếp đến là DL- Ala với 93,8% và mẫu D- Ala cho hiệu suất li tâm không đổi so với mẫu đối chứng Như vậy, L- Ala có tác dụng tăng kích thước tinh thể Glu và cho hiệu suất li tâm cao nhất, do đó nó được lựa chọn để khảo sát yếu tố tiếp theo
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ala
Mẫu đối chứng L-Ala D-Ala DL-Ala
Hà m lư ợn g A la t ro ng t in h th ể (p pm) Đồng phân Ala
Hình 3.19: Ảnh hưởng của nồng độ Ala đến hiệu suất kết tinh
Hình 3.20: Ảnh hưởng của nồng độ Ala đến hiệu suất li tâm
Hi ệu s uấ t kế t ti nh ( % )
Hi ệu s uấ t li tâ m (% )
Hình 3.21: Ảnh hưởng của nồng độ Ala đến kích thước tinh thể Glu
Hình 3.22: Ảnh chụp kính hiển vi tinh thể Glu (độ phóng đại: 10 lần) a) Mẫu đối chứng b) L- Ala 100 ppm c) L- Ala 200 ppm d) L- Ala 400 ppm
Kí ch t hư ớc h ạt t ru ng b ìn h (mi cr on )
Hình 3.23: Nồng độ Ala trong tinh thể Glu sau li tâm
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ala cho thấy ở mức nồng độ L- Ala khảo sát
0 – 400 ppm hiệu suất kết tinh không bị ảnh hưởng Mặt khác, kích thước tinh thể và hiệu suất li tâm tăng dần Trong khoảng nồng độ 0 – 200 ppm, kích thước tinh thể tăng từ 122,1 micron lên 203,3 micron và hiệu suất li tâm tăng từ 89,9% lên 95,3% Ở nồng độ 400 ppm, kích thước tinh thể Glu thay đổi không đáng kể so với nồng độ
200 ppm nhưng hiệu suất li tâm có cải thiện hơn với 98,1%
Như vậy, kết luận nồng độ L- Ala phù hợp là 400 ppm
Mẫu đối chứng L-Ala D-Ala DL-Ala
Hà m lư ợn g A la t ro ng t in h th ể (p pm) Đồng phân Ala