Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Khảo sát ảnh hưởng của enzyme và vi sinh vật đến quá trình làm giàu saponin từ dịch chiết quả bồ hòn (Sapindus mukorossi Gaertn.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ENZYME VÀ VI SINH VẬT ĐẾN QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU SAPONIN

TỪ DỊCH CHIẾT QUẢ BỒ HÒN (Sapindus mukorossi Gaertn.)

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 8520301

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2024 NGUYỄN KHÁNH LINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Lê Xuân Tiến Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS TS Trần Văn Hiếu Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS TS Hà Cẩm Anh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM ngày 23 tháng 01 năm 2024

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 PGS.TS Nguyễn Thị Phương Phong (Chủ tịch) 2 PGS.TS Trần Văn Hiếu (Phản biện 1)

3 PGS.TS Hà Cẩm Anh (Phản biện 2) 4 TS Phan Thị Hoàng Anh (Ủy viên) 5 TS Phan Nguyễn Quỳnh Anh (Thư ký)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS.TS Nguyễn Thị Phương Phong PGS TS Nguyễn Quang Long

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Khánh Linh MSHV: 2170968 Ngày, tháng, năm sinh : 10/05/1999 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số : 8520301 I TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát ảnh hưởng của enzyme và vi sinh vật đến quá trình làm giàu saponin từ dịch chiết quả bồ hòn (Sapindus mukorossi Gaertn.)

Investigation of enzyme-assissted and fermentation extraction of saponin from Sapindus mukorossi Gaertn

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Khảo sát điều kiện chiết với sự hỗ trợ của enzyme pectinase và amylase  Khảo sát điều kiện lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae  Đánh giá khả năng hoạt động bề mặt và cảm quan dịch chiết sau xử lý III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/09/2023

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/12/2023 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Lê Xuân Tiến

Tp HCM, ngày… tháng … năm 2024

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký)

TS Lê Xuân Tiến PGS TS Lê Thị Hồng Nhan TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

PGS TS Nguyễn Quang Long

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến trường Đại học Bách Khoa, khoa Kỹ thuật Hóa học và khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện, cơ sở vật chất thuận lợi cho em có thể hoàn thành luận văn này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành cùng sự kính trọng đến thầy Lê Xuân Tiến và cô Nguyễn Kim Minh Tâm Cảm ơn thầy cô đã cho em cơ hội được nghiên cứu, làm việc và đồng hành cùng thầy Dù thời gian trao đổi không nhiều nhưng thầy cô vẫn luôn sẵn sàng lắng nghe ý kiến của em, định hướng cách tư duy, cách làm việc khoa học, cũng như luôn theo dõi và hỗ trợ em giải quyết những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu Thầy cô đã luôn nhiệt tình hỗ trợ cơ sở vật chất, chỉ bảo thêm những kiến thức quý giá giúp em hoàn thiện đề tài này hơn Chúc quý thầy cô luôn khỏe mạnh, nhiệt huyết dạy bảo, giúp đỡ các thế hệ sinh viên tiếp theo nên thợ, nên người

Đặc biệt hơn, em xin dành lời cảm ơn sâu sắc đến những người bạn luôn đồng hành và hỗ trợ em là bạn Kiều Phương Trang, Nguyễn Thị Giang, Võ Phương Đài và Nguyễn Đan Tân Luận văn này sẽ không thể hoàn thiện nếu thiếu đi sự giúp đỡ và đồng hành của các bạn cũng như của các bạn tại phòng thí nghiệm 108 Em luôn trân trọng và biết ơn mọi người rất nhiều, chúc những điều tốt đẹp nhất sẽ luôn đồng hành với mọi người

Cuối cùng, đặc biệt hơn hết, em xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, những người luôn ở bên cạnh động viên, ủng hộ và là nguồn động lực to lớn giúp em vững bước tiếp trên con đường đã chọn Do thời gian và trình độ còn hạn chế, luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được chỉ bảo và đóng góp ý kiến từ quý thầy cô để bài báo cáo của em được hoàn thiện hơn

Nguyễn Khánh Linh

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát một số điều kiện chiết xuất dịch chiết nước từ quả bồ hòn (Sapindus mukorossi Gaertn.) với sự hỗ trợ của enzyme cũng như khảo sát nồng độ và điều kiện lên men dịch chiết nhằm thu được dung dịch sau cùng có chất lượng và tính tẩy rửa cao Pectinase và amylase được sử dụng nhằm giảm bớt rảo cản cơ học từ nhiên trong quá trình chiết Không những thế, chúng còn dùng với mục đích giảm đường tổng, tăng đường khử trong dịch chiết nước bồ hòn để quá trình lên men sau đó được thuận lợi hơn Kết quả cho thấy pectinase có hiệu quả ở khi chiết ở 50 oC trong 60 phút với nồng độ 1%, trong khi amylase không có tác động đáng kể Dịch chiết bồ hòn được lên men bằng Saccharomyces cerevisiae nhằm mục đích giảm hàm lượng đường, pectin và một số tạp chất ảnh hưởng đến khả năng tẩy rửa của dịch Quá trình lên men đạt hiệu quả tốt khi nồng độ nấm men sử dụng là 7.5% trong 2 ngày lên men Hàm lượng đường tổng và đường khử giảm lần lượt là 29.53% và 75%, hàm lượng saponin giảm 8.32% Ngoài ra, độ đục, khả năng tạo bọt và khả năng duy trì bọt sau lên men được cải thiện đáng kể

ABSTRACT

This study aimed to investigate the extraction conditions for enzyme – asisstant extraction, as well as the fermentation conditions of the extract from Sapindus mukorossi Gaertn Pectinase and amylase are used to reduce natural mechanical barriers during the extraction process Not only that, they are also used for the purpose of reducing the amount of total sugar and increasing the amount of reducing sugar in the extract so that the later fermentation process is more convenient The results showed that pectinase was effective when extracted at 50 oC for 60 minutes at a concentration of 1%, while amylase had no obvious effect The extract is fermented with Saccharomyces cerevisiae to reduce the content of sugar, pectin and some impurities that affect the cleaning ability of the solution The fermentation process is effective when the yeast concentration used is 7.5% for 2 days Total sugar and reducing sugar content decreased by 29.53% and 75%, respectively, and saponin content decreased by 8.32% In addition, turbidity, foaming ability and ability to maintain foam after fermentation are significantly improved

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, có sự hỗ trợ từ Giảng viên hướng dẫn là TS Lê Xuân Tiến Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các thực nghiệm Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng

Học viên thực hiện Nguyễn Khánh Linh

1.2.3 Một số nghiên cứu về ứng dụng tẩy rửa của bồ hòn 11

1.3 Tổng quan về phương pháp làm giàu saponin 12

1.3.1 Về phương pháp chiết có hỗ trợ enzyme 13

1.3.2.2 Một số nghiên cứu về ứng dụng lên men 19

1.4 Mục tiêu, đối tượng và nội dung nghiên cứu 21

1.4.1 Mục tiêu nghiên cứu 21

1.4.2 Đối tượng nghiên cứu 21

1.4.3 Nội dung nghiên cứu 21

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 22

2.1 Hóa chất và thiết bị 22

2.1.1 Hóa chất 22

2.1.2 Thiết bị 22

2.2 Quy trình thực hiện 23

2.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu 23

2.2.2 Chiết xuất saponin từ quả bồ hòn 23

2.2.6 Đánh giả khả năng tạo bọt và duy trì bọt 30

2.2.7 Đánh giá khả năng tẩy rửa 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 Khảo sát quá trình chiết có sử dụng enzyme 33

3.1.1 Khảo sát các loại enzyme 34

3.1.2 Khảo sát điều kiện chiết khi sử dụng enzyme pectinase 36

3.1.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 36

3.1.2.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết 38

3.1.3 Kết luận chung 40

3.2 Khảo sát quá trình lên men 41

3.2.1 Khảo sát hàm lượng men cấy 42

3.2.2 Khảo sát thời gian lên men 44

3.2.3 Kết luận chung 46

3.3 Đánh giá cảm quan dịch chiết sau lên men 47

3.3.1 Đánh giá khả năng tạo bọt và duy trì bọt 47

3.3.2 Đánh giá khả năng tẩy rửa 49

Phụ lục 1 Số liệu xây dựng đường chuẩn saponin 65

Phụ lục 2 Số liệu xây dựng đường chuẩn đường tổng 65

Phụ lục 3 Số liệu xây dựng đường chuẩn đường khử 65

Phụ lục 4 Kết quả khảo sát các loại enzyme 66

Phụ lục 5 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết 67

Phụ lục 6 Kết quả khảo sát thời gian chiết 69

Phụ lục 7 Kết quả khảo sát tỉ lệ men cấy (% v/v) 70

Phụ lục 8 Kết quả khảo sát thời gian lên men 71

Phụ lục 9 Khảo sát khả năng tạo bọt và duy trì bọt 71

Phụ lục 10 Kết quả đo độ biến động pH 72

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 73

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Danh mục hóa chất sử dụng 22 Bảng 2 2 Các thông số khảo sát quá trình lên men 26 Bảng 3 1 Kết quả đánh giá độ tạo bọt và duy trì bọt 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Cây và trái bồ hòn 3

Hình 1 2 Hình Các loại triterpenoid saponin được phân lập từ quả bồ hòn 5

Hình 1 3 Cấu trúc điển hình của hợp chất saponin 6

Hình 1 4 Cấu trúc của triterpenoid (30C) 7

Hình 1 5 Phân loại triterpenoid dựa trên số nhóm đường 7

Hình 1 6 Cấu trúc của steroid (27C) 8

Hình 2 1 Sơ đồ quy trình chiết bồ hòn 24

Hình 2 2 Sơ đồ hoạt hóa chủng nấm men 25

Hình 2 3 Quy trình lên men bằng vi sinh vật 25

Hình 2 4 Quy trình xác định hàm lượng saponin tổng 27

Hình 2 5 Quy trình xác định hàm lượng đường khử 28

Hình 2 6 Quy trình xác định hàm lượng đường tổng 29

Hình 3 1 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu 32

Hình 3 2 Kết quả khảo sát enzyme pectinase và amylase 35

Hình 3 3 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết 38

Hình 3 4 Kết quả khảo sát thời gian chiết 39

Hình 3 5 pH dịch chiết bồ hòn theo thời gian 42

Hình 3 6 Kết quả khảo sát tỉ lệ men cấy (v/v) 43

Hình 3 7 Kết quả khảo sát thời gian lên men 45

Hình 3 8 Kết quả khảo sát độ tạo bọt và duy trì bọt sau 15 phút 48

Hình 3 9 Hình tấm vải trước và sau khi giặt 49

Hình 3 10 Kết quả khảo sát khả năng tẩy rửa 50

Hình 3 11 Kết quả khảo sát độ đục của các mẫu dịch chiết 51

Hình 3 12 Độ đục của dịch chiết 52

LỜI MỞ ĐẦU

Các loại nước tẩy rửa dùng trong sinh hoạt hằng ngày đã và đang trở thành một phần không thể thiếu trong cuộc sống Tuy nhiên, hầu hết những sản phẩm tẩy rửa này đều có thành phần chính là các chất hóa học tổng hợp Đây là những chất gây ô nhiễm môi trường, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe khi sử dụng lâu dài Chính vì vậy, việc sử dụng các loại nước tẩy rửa có nguồn gốc từ thiên nhiên, an toàn đang là xu hướng được nhiều người tiêu dùng lựa chọn

Bồ hòn (Sapindus mukorossi Gaertn.) là một trong những nguồn thực vật tiềm năng đang được sử dụng để thay thế các sản phẩm tẩy rửa hóa học bởi các đặc tính nổi trội liên quan đến khả năng hoạt động bề mặt cùng một số hoạt tính sinh học khác Hiện nay, trên thị trường đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến việc tách chiết saponin từ bồ hòn và đã dần thương mại hóa

Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng, ngoài saponin, dịch chiết bồ còn chứa lượng lớn các tạp chất khác như pectin, carbohydrate… Khi pectin có mặt trong dịch chiết, nó dễ dàng tương tác với các chất khác trong dịch chiết gây ra hiện tượng keo tụ tương hỗ Sự keo tụ của pectin có thể dẫn đến các vấn đề về tính ổn định hay tính đồng nhất của dịch chiết Ngoài ra, carbohydrate có khả năng trương trong nước, hàm lượng càng cao càng cản trở quá trình chiết xuất saponin Chính các thành phần này sẽ làm ảnh hưởng đến chất lượng tổng thể của dịch chiết và có khả năng làm giảm hiệu quả trong việc làm sạch của bồ hòn

Do đó, việc xử lý các tạp chất trong dịch chiết bồ hòn rất quan trọng Đề tài lựa chọn phương pháp lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae để loại bỏ đường tự do, giúp gia tăng hàm lượng hoạt chất chính là saponin Tuy nhiên, các nghiên cứu tiền đề cho thấy rằng thời gian lên men tương đối dài, có thể do cấu tạo tạp chất trong dịch chiết phức tạp Vì vậy, đề tài lựa chọn thêm phương pháp chiết có sự hỗ trợ của enzyme pectinase và amylase Hai enzyme này hỗ trợ phân giải các hợp chất pectin và carbohydrate trong dịch chiết, tạo thuận lợi cho quá trình lên men phía sau

Chính vì lẽ đó, mục đích của đề tài là khảo sát ảnh hưởng của enzyme và vi sinh vật đến quá trình làm giàu saponin Từ đó, nghiên cứu đề ra được những giải pháp xử lý dịch chiết bồ hòn phù hợp, nâng cao chất lượng và ngoại quan, định hướng đưa ra sản xuất thương mại trong tương lai

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về bồ hòn 1.1.1 Về cây bồ hòn

Sapindus mukorossi Gaertn thường được gọi là bồ hòn, thuộc họ Sapindaceae Juss., chi Sapindus., đây là một loại cây có giá trị ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á [1] Ở Việt Nam, họ Bồ hòn (Sapindaceae Juss.) có khoảng 70 loài, phân bố rải rác khắp cả nước, chủ yếu các tỉnh phía Bắc thuộc vùng núi thấp (thường dưới 1000 m) và trung du bao dồm các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn (Than Mọi), Bắc Cạn, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Hà Tây, Phú Thọ, Hà Giang, Tuyên Quang

Hình 1 1 Cây và trái bồ hòn

Cây có thể đạt chiều cao từ 12 đến 15 m, đôi khi đạt tới 20 m và đường kính 1.8 m Thân cây được bao phủ bởi lớp vỏ màu vàng sẫm, khá nhẵn, có nhiều vân dọc và các vết nứt tróc vảy gỗ không đều Cây ra quả vào tháng 5 và chín vào tháng 6 – 7 Tháng 10 – 11 quả chín chuyển màu từ vàng cam sang nâu sẫm Quả có dạng hình cầu với đường kính 1.8 – 2.5 cm Hạt hình cầu, màu đen có đường kính từ 0.8 – 1.3 cm và ở

dạng dẻo trong quả khô [2] Các loài cây thuộc họ này hầu hết là cây gỗ hoặc cây bụi, chứa nhiều hoạt chất sinh học chuyển hóa thứ cấp, đặc biệt là saponin

Bồ hòn được biết đến nhờ hợp chất saponin được tìm thấy trong cả quả, rễ và lá Trong đó, quả là bộ phận có hàm lượng saponin nhiều nhất từ 6 – 18% tùy thuộc vào giống và nơi trồng [3] [4] Việt Nam là một trong những quốc gia có diện tích trồng cây bồ hòn lớn và quả bồ hòn ở nước ta chứa hàm lượng saponin cao Người Việt từ xưa đã biết dùng quả bồ hòn như một chất tẩy rửa tự nhiên để giặt quần áo hay gội đầu [4] Không những thế, trong y học, bồ hòn còn được dùng để điều trị bệnh chàm, mụn nhọt, bệnh vẩy nến, các vấn đề về răng, viêm khớp, cảm lạnh, buồn nôn và táo bón [5]

Chiết xuất saponin từ quả bồ hòn đã được quan tâm nghiên cứu và cho thấy một loạt các hoạt tính nổi bật trong lĩnh vực tẩy rửa [6], dược phẩm, mĩ phẩm [7] và xử lý môi trường [8] Cùng với lợi thế nguồn cung cấp dồi dào và giá thành rẻ như ở Việt Nam, bồ hòn đang dần được xem là nguồn chất HĐBM tự nhiên đem lại giá trị kinh tế để nghiên cứu và phát triển các sản phẩm tẩy rửa gia dụng [1]

1.1.2 Về thành phần hóa học

Các nghiên cứu hóa thực vật của chi bồ hòn đã xác định được hơn 103 hợp chất, bao gồm flavonoid, triterpenoid, glycoside, carbohydrate, acid béo, phenol và saponin Trong số các hợp chất này, triterpenoid saponin của olaenane, dammarane và tirucullane được coi là nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học [9]

Thành phần chính của quả Sapindus mukorossi là saponin (10% - 11.5%), đường (10%) và chất nhầy [10] Hạt bồ hòn chứa 23% dầu, trong đó 92% là chất béo trung tính, phần tryglycerid chứa 30% oleo-palmito-arachidin glycerid, 13.3% oleo-diarachidin glycerid và 56.7% glycerid loại di-olein như dioleo-palmitin, dioleostrearin và dioleo-arachidin [11] Quả bồ hòn được báo cáo là có chứa glycosid sesquiterpenoidal và sáu este béo khác nhau của triterpenoid tứ vòng Chiết xuất lá của cây bồ hòn có chứa các loại flavonoid khác nhau như quercetin, apigenin, kaempferol và rutin [12]

Trong các bộ phận của cây bồ hòn, quả bồ hòn chiếm hàm lượng saponin cao nhất, đặc biệt là lớp vỏ chứa nhiều saponin có hoạt tính bề mặt cao [1] Huang cùng cộng sự (2008) đã phân lập được bốn saponin loại oleanane, sapinmusaponin K – N (1 – 4), và bảy saponin đã biết (7 – 13) từ chiết xuất ethanol (EtOH) của quả bồ hòn Ngoài ra, họ còn cô lập thêm các phân đoạn có hoạt tính khác từ mật và phân lập được hai saponin loại dammarane, sapinmusaponin O (5) và sapinmusaponin P (6) Cấu trúc của tất cả các saponin được phân lập (1 – 6) đã được xác định bằng các phân tích quang phổ, chủ yếu là các kỹ thuật 2D NMR và các phương pháp hóa học Kuo và cộng sự (2001) cũng đã phân lập được hai hợp chất saponin loại lanostan (14-15) [13] (Hình 1.2)

2830 29

Hình 1 2 Các loại triterpenoid saponin được phân lập từ quả bồ hòn 1 Ara2-Rha3-Ara3-OAc2 Ara2-Rha3-Ara4-OAc3 Ara2-Rha3-Xyl OAc

8 Ara2-Rha3-Xyl2-OAc9 Ara2-Rha3-Xyl3-OAc

9 Ara2-Rha3-Xyl4-OAc

1 Ara2-Rha3-Ara

1 Ara2-Rha3-Xyl

1 Ara2-Rha10

4 Ara2-Rha3-Xyl OAcOAc

7 Ara2-Rha3-Xyl OAcOAc

5 6 14 15

OH CH3

H

CH3 CH3

CH3 OH OH OH

OH OH H

H H H OH

1.2 Tổng quan về saponin 1.2.1 Cấu tạo hóa học

Saponin thuộc nhóm glycoside, là một chất chuyển hóa thứ cấp thường gặp trong nhiều loài thực vật và loài sinh vật biển [4] [14] Trong tiếng latin, chữ “sapo” nghĩa là xà phòng, vì chúng tạo bọt như xà phòng khi lắc với nước [15] Đây là một chất hoạt động bề mặt (HĐBM) không độc hại và có khả năng phân hủy sinh học [16] Các nghiên cứu cho thấy phân tử saponin chứa đồng thời cả hai nhóm kị nước và nhóm ưa nước, đặc trưng của một chất HĐBM Saponin gồm phần aglycone kị nước, còn được gọi là sapogenin, liên kết với phần ưa nước là các nhóm đường monosacharide [3] [17] Công thức cấu tạo của saponin bồ hòn được trình bày trong Hình 1.3

Hình 1 3 Cấu trúc điển hình của hợp chất saponin

Dựa theo aglycone, saponin được chia thành hai nhóm chính là triterpenoid và steroid [18] Đặc điểm cấu trúc của chúng thay đổi tùy theo số lượng đơn vị đường gắn vào các vị trí khác nhau

 Triterpenoid

Loại saponin này được phân bố rộng rãi nhất trong giới thực vật Thuật ngữ triterpene có nghĩa là ba monoterpen (10 nguyên tử carbon) gồm 30 nguyên tử carbon được phân bố dưới dạng sáu phân tử isoprene [14]

Hình 1 4 Cấu trúc của triterpenoid (30C)

Theo số lượng gốc đường gắn vào nhân aglycone, triterpenoid có thể được phân thành hai loại là monodesmosidic và bidesmosidic Các monodesmosidic triterpenoid glycoside có một chuỗi đường đơn, thường được gắn ở C-3 Bidesmosidic triterpenoid glycoside có hai chuỗi đường, thường với một chuỗi được gắn thông qua liên kết ether ở C-3 và chuỗi còn lại được gắn thông qua liên kết ester ở C-28 [19]

O

Hình 1 5 Phân loại triterpenoid dựa trên số nhóm đường

(a)Monodesmosidic triterpenoid glycoside (b) Bidesmosidic triterpenoid glycoside  Steroid

Steroid phân bố trong tự nhiên ít hơn triterpenoid Steroid gồm 27 nguyên tử carbon, là các triterpenoid biến đổi cấu trúc thành một vòng sáu cạnh và hai vòng năm cạnh

Steroid có hai vòng dị vòng chứa oxy là vòng furan và vòng pyran Hai vòng này nối với nhau bởi một carbon chung ở C-22 Mạch nhánh này được gọi là mạch nhánh spiroacetal [19]

Hình 1 6 Cấu trúc của steroid (27C)

Ngoài ra, saponin còn có một nhóm alkanoid có cấu trúc tương tự như steroid, nhưng alkaloid có vòng piperidine (vòng sáu cạnh chứa nguyên tử N) thay vì vòng pyran (vòng sáu cạnh chứa nguyên tử O) trong cấu trúc phân tử [14]

1.2.2 Hoạt tính sinh học

 Hoạt tính chất hoạt động bề mặt

Ngoài các ứng dụng trên, saponin đã được sử dụng trong công nghiệp tẩy rửa như một chất hoạt động bề mặt tự nhiên có khả năng tạo bọt tốt và có thể bị phân hủy sinh học dễ dàng [20] Saponin có tính chất hoạt động bề mặt, đặc tính này được giải thích bởi tính chất vừa ưa nước vừa kỵ nước trong cấu trúc của phân tử saponin Phần carbohydrate của phân tử là hòa tan trong nước, trong khi phần aglycon là tan trong chất béo Nhờ đặc tính này mà saponin tương tự như xà phòng, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hóa và tẩy rửa Từ lâu, con người đã sử dụng saponin trong các sản phẩm tẩy rửa và mỹ phẩm vì chất này không gây ra bất kỳ tác dụng độc hại nào đối với da và mắt người [21]

 Hoạt tính kháng nấm

Việc sử dụng thường xuyên thuốc trừ sâu tổng hợp hóa học gây ra những rủi ro đối với sức khỏe con người và môi trường [22] Ngoài ra, nhiều mầm bệnh thực vật đã phát triển khả năng chống lại thuốc trừ nấm tổng hợp hóa học [23] Để kiểm soát nấm bệnh một cách hiệu quả và giảm nguy cơ tác động đến môi trường của thuốc diệt nấm tổng hợp hóa học, các nhà khoa học sử dụng những hợp chất đã được đánh giá có khả năng kháng nấm hiệu quả bao gồm các chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật và các dẫn xuất của chúng [24]

Các nghiên cứu đã được công bố tập trung vào hoạt tính sinh học của saponin như một loại thuốc trừ sâu sinh học thay thế tiềm năng [25] [26] Rafi và cộng sự (2015) đã báo cáo tác dụng ức chế mạnh mẽ của chiết xuất quả bồ hòn chống lại các loại nấm lây nhiễm qua rễ Rhizoctonia solani, Fusarium spp., và Macrophomina phaseolina [27]

Một nghiên cứu khác của Porsche cùng cộng sự (2018) đã thử nghiệm các chiết xuất từ vỏ quả bồ hòn chống lại các loại nấm gây bệnh cho cây trồng V.inaequalis và B.cinerea – hai tác nhân gây bệnh phổ biến trên cây đặc biệt là táo và nho Thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm cho thấy việc phun dịch saponin bồ hòn trong dung môi là cloroform-methane (1% v/v) làm giảm đáng kể các triệu chứng bệnh và khả năng hình thành bào tử của V.inaequalis (99%) trên lá cây táo (P ≤ 0.05) Trong các thử nghiệm thực thế, việc sử dụng dịch chiết bồ hòn với dung môi là nước (1% v/v) đã làm giảm mức độ gây bệnh của nấm B cinerea trên quả nho trung bình là 63% [28]

 Hoạt tính kháng viêm

Nhóm nghiên cứu của Deng và cộng sự [29] cũng tiến hành đánh giá các đặc tính chống viêm của saponin đối với bệnh gout Nghiên cứu được thực hiện dưới hình thức phân tích hoạt động ức chế xanthine oxidase Các nghiên cứu trong ống nghiệm về saponin của bồ hòn cho thấy hoạt động ức chế mạnh (89.87%) ở nồng độ 100 μg/mL đối với xanthine oxidase Kết quả rất gần với sự ức chế của thuốc đối chứng allopurinol (92.25%) được thử nghiệm ở cùng nồng độ

Wang và cộng sự vào năm 2017 cũng đã nghiên cứu tác dụng chống viêm của hợp chất này trên các tế bào biểu mô của chuột được kích thích bằng LPS (lipopolysaccharide – một chất gây độc tế bào) Kết quả cho thấy Uralsaponin A có khả năng ức chế LPS gây ra phản ứng viêm bằng cách chặn đường truyền tín hiệu của TLR4 đến nội bào NF-κB để sản xuất cytokine gây viêm [30]

 Hoạt tính chống ung thư

Chen cùng cộng sự (2010) đã tiến hành nghiên cứu các chiết xuất methanol (MeOH), ethyl acetate (EA) và hexane của bồ hòn để đánh giá tác dụng chống tăng sinh trên các dòng tế bào ung thư da, phổi, gan, tuyến tiền liệt, cổ tử cung, xương, bàng quang và ung thư vú ở người Kết quả cho thấy các chiết xuất đều có các hoạt tính ức chế tương đối với các dòng ung thư Đặc biệt, các chiết xuất này ức chế mạnh sự gia tăng của cả tế bào ung thư A375.S2 (di căn ác tính) và MeWo (di căn) Giá trị IC50 của chiết xuất ethyl acetate (EA) và hexane lần lượt là 218.5/153.8 mg/mL và 211.2/122.8 mg/mL Các chất chiết xuất từ EA và hexane được đánh giá là thể hiện sự ức chế vừa phải đối với các tế bào ung thư phổi và ít có tác dụng ức chế đối với các dòng tế bào ung thư gan, tuyến tiền liệt, xương, bàng quang và ung thư vú (IC50 > 300 mg/mL) [31]

Theo Heng cùng cộng sự (2014) [32] đã chỉ ra rằng thành phần saponin từ quả bồ hòn với các chuỗi đường Mukurozi-saponin E1, Sapindoside L, Mukurozi-saponin G và Sapindoside M có một đến hai nhóm acetyl liên kết có tác dụng ức chế mạnh đối với dòng tế bào ung thư vú ở người – MCF-7 Saponin từ quả bồ hòn có tiềm năng phát triển như một loại thuốc chống ung thư

 Một số hoạt tính khác

Saponin hoạt động như một lá chắn trong hệ thống bảo vệ thực vật để chống lại mầm bệnh và động vật ăn cỏ [33] Do đó, nó được tìm thấy trong các mô thực vật dễ bị nấm hoặc vi khuẩn tấn công hoặc côn trùng ăn thịt [34] Ngoài công dụng truyền thống, saponin đã trở thành một trong những đối tượng được quan tâm nhất do tiềm năng của chúng trong các quy trình công nghiệp và ngành dược phẩm Mục đích dược

phẩm của saponin xuất phát từ việc sở hữu các đặc tính kháng khuẩn [35] [36], khả năng tăng phản ứng miễn dịch [37], chống ung thư [38], trị đái tháo đường và chống béo phì [39] Các đặc tính dược phẩm khác của saponin là tán huyết, diệt nhuyễn thể, chống viêm, kháng nấm hoặc chống nấm men, kháng khuẩn hoặc kháng vi sinh vật, chống ký sinh trùng, chống khối u và kháng vi-rút [40] Saponin như một nền tảng khởi đầu cho việc bán tổng hợp các loại thuốc steroid trong ngành dược phẩm Với xu hướng sử dụng các vật liệu tái tạo và thân thiện với môi trường ngày càng tăng, saponin đã thu hút được sự quan tâm lớn trên toàn thế giới với các đặc tính sinh học nổi trội của mình

1.2.3 Một số nghiên cứu về ứng dụng tẩy rửa của bồ hòn

Saponin trong trái bồ hòn rất giàu và đa dạng hơn nữa còn có đặc tính nổi trội dưới vai trò là chất HĐBM Trong 45 loài thực vật giàu saponin được tầm soát từ nghiên cứu của Góral và Wojciechowski thì saponin từ trái bồ hòn có tính hoạt động bề mặt và khả năng tạo bọt tốt nhất, được xem là nguồn chất HĐBM đầy tiềm năng để ứng dụng vào các sản phẩm chăm sóc cá nhân và tẩy tửa trong gia đình [5]

C.H Yang và cộng sự [1] đã đánh giá các đặc tính hoạt động bề mặt của saponin được chiết xuất từ vỏ quả bồ hòn so với SDS và Tween 80 Sức căng bề mặt của dịch chiết saponin, SDS và Twên 80 ở nồng độ 0.5% lần lượt là 51.7 mN/m, 35.6 mN/m, and 41.7 mN/m, so với sức căng bề mặt của nước là 72 mN/m Do đó, saponin từ dịch chiết bồ hòn được đánh giá là một chất HĐBM tiềm năng

Không những thế, C.H Yang và cộng sự cũng nghiên cứu một số thông số khác liên quan đến khả năng tạo bọt của bồ hòn Kết quả cho thấy dung dịch với nồng độ 0.5% saponin có khả năng tạo bọt và chiều cao bọt không thay đổi đáng kể trong 5 phút Chiều cao tạo bọt của dung dịch trên đạt khoảng 65% chiều cao thu được so với SDS Pradan và cộng sự [21] cũng nghiên cứu khả năng tẩy rửa của dịch chiết từ bồ hòn Các tác giả đã chuẩn bị một chất bẩn mô phỏng trên một miếng vải, sau đó nhúng vải vào dung dịch saponin trong 10 phút, xả sạch bằng nước, sấy khô và cân để đánh giá khả năng giặt so với chất đối chứng là bột giặt Henko Kết quả cho thấy dịch chiết bồ

hòn đã rửa sạch khoảng 20% đến 80% bụi bẩn khỏi vải, trong khi bột giặt Henko cho giá trị trong khoảng 30% đến 75%

Trong những năm qua, bồ hòn cũng là một thành phần phổ biến trong dầu gội đầu, chất tẩy rửa và thuốc, dùng để trị mụn, trị tàn nhang hay để chữa các bệnh eczema, bệnh chàm, vẩy nến… [5] Hàm lượng saponin đo được bằng phương pháp vanillin – acid trong một số sản phẩm trên thị trường ghi nhận được là sản phẩm tẩy rửa đa năng từ bồ hòn (93.11 g/L), toner làm sạch chứa chiết xuất saponin từ bồ hòn (36.64 g/L), xà phòng cục từ bồ hòn (38.11 g/L), sữa tắm chiết xuất từ bồ hòn và gừng (45.17 g/L), sữa tắm bồ hòn và lavender (38.15 g/L) [41]

Tại Việt Nam, ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng tẩy rửa của bồ hòn cũng như sự ảnh hưởng của dịch chiết lên chất lượng vải, điển hình là công trình nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Thắng và cộng sự kết hợp cùng công ty Cổ phần thời trang K’s Closet [42] Nhóm nghiên cứu sử dụng dịch chiết bồ hòn trên 10 mẫu vải may quần áo trẻ em Hiệu quả giặt được đánh giá thông qua việc xác định độ co (TCVN 1755:1986), độ rủ (NF G07-109), độ mao dẫn (AATCC 198-2011) và độ trắng của vải (TCVN 5236:2002) Kết quả nghiên cứu này mở ra hướng sử dụng chất HĐBM tự nhiên saponin chiết từ quả bồ hòn làm chất giặt xanh cho các sản phẩm dệt may theo xu thế phát triển bền vững

Khả năng phân hủy sinh học của các chất hoạt động bề mặt sinh học từ cây bồ hòn là một đặc điểm rất quan trọng của cây [21] Saponin có trong chiết xuất có thể được sử dụng làm chất xử lý nước và đất bị nhiễm kim loại nặng crom và kẽm [43] Trên cơ sở đánh giá nêu trên, chất hoạt động bề mặt từ bồ hòn có khả năng tẩy rửa đạt yêu cầu, thân thiện với môi trường và được coi là nguồn thay thế đầy hứa hẹn cho các sản phẩm tẩy rửa hóa học trên thị trường

1.3 Tổng quan về phương pháp làm giàu saponin

Trong nhiều thập kỷ qua, đã có rất nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để chiết xuất saponin Ngâm dầm và chiết soxhlet là những phương pháp chiết xuất thông dụng nhất, các kỹ thuật hiện đại như chiết xuất có hỗ trợ siêu âm, chiết xuất có

hỗ trợ vi sóng và phương pháp chiết xuất dung môi cấp tốc vẫn đang được cải tiến và nâng cao [19] Theo Y.C Choek [44] , phương pháp ngâm dầm và chiết soxhlet chiếm khoảng 60% các kỹ thuật được sử dụng trong chiết xuất saponin từ nguyên liệu thực vật, trong khi quy trình chiết xuất hiện đại chiếm khoảng 30% Sau khi chiết, saponin được tinh chế và phân lập bằng cách lắc phân đoạn và chạy sắc ký

Tuy nhiên, nhược điểm của các phương pháp này là sử dụng nhiều dung môi hữu cơ, đòi hỏi người thực hiện cần đầu tư những thiết bị đắt tiền mà chưa chắc hiệu suất cao [45] Không những thế, việc thu hồi dung môi cũng tốn nhiều thời gian và chi phí Vì thế, các nhà khoa học đang dần chuyển sang các giải pháp thay thế “xanh hơn” để tinh chế saponin, điển hình là sử dụng enzyme hỗ trợ quá trình chiết và phương pháp lên men

1.3.1 Về phương pháp chiết có hỗ trợ enzyme

Bất kể phương pháp chiết xuất nào được sử dụng đều có một số rào cản cơ học tự nhiên cản trở quá trình chiết xuất Nhiều thành phần của thành tế bào, chẳng hạn như lignin, cellulose hoặc một số protein, chúng giúp tế bào bền vững nhưng lại tạo thành trở ngại trong quá trình chiết xuất các thành phần có hoạt tính sinh học Một số chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học hiện diện trong tế bào chất hay trong không bào, hoặc một số khác được liên kết trong mạng lưới lignin – polysaccharide bằng liên kết hydro, điều này gây khó khăn cho việc chiết xuất các hoạt chất bằng dung môi thông thường [46] [47]

Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã đề xuất một phương pháp chiết xuất có sự hỗ trợ của enzyme (EAE) nhằm giảm sự cản trở của rào cản cơ học tự nhiên EAE dựa trên việc sử dụng các enzyme xúc tác cho sự phân cắt các liên kết cộng hóa trị khi có nước Điều này làm tan rã cấu trúc tế bào và tăng tính thấm của dung môi chiết Enzyme có bản chất là protein, là chất xúc tác sinh học cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống [48] Enzyme được được tổng hợp từ các tế bào sinh vật và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ của cơ thể Do nhiệt độ của cơ thể và tế bào sinh vật thường dao động trong khoảng 30 – 40 oC Chính vì vậy,

enzyme có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa Một ưu điểm đặc biệt của phản ứng có sự tham gia của enzyme là sự tiêu hao năng lượng rất ít so với các phản ứng hóa học không sử dụng chất xúc tác sinh học [48] Enzyme không chỉ có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống, mà sau khi tách khỏi tế bào, chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra bên ngoài tế bào (in vivo) [49] Nhờ những đặc tính sinh học đặc biệt, enzyme đã được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực, đặc biệt là sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học

Quá trình chiết xuất có sự hỗ trợ của enzyme có thể là một phương pháp độc lập hoặc tiền xử lý cho quá trình chiết xuất thông thường Enzyme có tính đặc hiệu cao trong điều kiện thích hợp Phản ứng enzyme diễn ra hiệu quả ở nhiệt độ tương đối thấp và độ pH vừa phải và trong thời gian tương đối ngắn (đến vài giờ) và không yêu cầu thiết bị đắt tiền Điều này cho phép giảm thiểu sự phân hủy hoặc đồng phân hóa của các hoạt chất [48] [49] Hơn nữa, quá trình phân giải enzyme diễn ra trong dung dịch nước hoặc trong dung dịch đệm [50] Do đó, không cần thêm sử dụng thêm dung môi hữu cơ Tất cả các điều kiện nêu trên làm cho quá trình tiền xử lý dung dịch bằng enzym phù hợp với các giả định của hóa học xanh

Chính vì vậy, phương pháp sử dụng enzyme đang ngày càng được quan tâm trong các nghiên cứu chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật trong những năm gần đây Các enzyme thường được dùng enzyme cellulase, pectinase, hemicellulose,… giúp phá vỡ vách tế bào bằng cách thủy phân các thành phần có trong vách Từ đó giúp dung môi dễ dàng thẩm thấu vào trong tế bào, giúp cho sự tách chiết diễn ra dễ dàng và đạt hiệu quả hơn Phương pháp này được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp thực phẩm để chiết xuất các hợp chất khác nhau saponin, carotenoid, anthocyanin… [51]

Bên cạnh việc khắc phục các nhược điểm của phương pháp chiết cổ điển, kỹ thuật tách chiết bằng enzyme còn có ưu điểm là ít làm biến đổi các hợp chất có trong tế bào, có thể dễ dàng thực hiện trong mọi điều kiện tại phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm và quy mô công nghiệp Enzyme có tính đặc hiệu cao, giúp việc chiết tách

diễn ra chính xác, đạt hiệu suất cao, an toàn đối với sức khỏe con người và bảo vệ môi trường [52]

1.3.1.1 Enzyme pectinase

Pectinase hiện là một phần không thể thiếu trong ngành công nghiệp nước ép trái cây và có nhiều ứng dụng công nghệ sinh học khác nhau [53] Các enzyme này chịu trách nhiệm phân hủy các phân tử dài và phức tạp trong cùi quả gọi là pectin – quyết định độ đục của nước quả, từ đó giúp làm trong dịch quả thu được Rombouts và cộng sự Pilknik [54] đã báo cáo rằng việc sử dụng pectinase trong quá trình thu hồi nước ép dẫn đến giảm độ nhớt và ít tạo gel hơn, điều này cho phép cô đặc nước ép ở mức độ cao, khả năng ép bã triệt để và năng suất cao

Enzyme pectinase có nguồn gốc từ quá trình chiết xuất và sàng lọc từ Aspergillus niger Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nước hoa quả, nước rau củ và sản xuất rượu vang với hoạt lực từ 60000 U/g, hoạt động trong khoảng pH 3.0 – 5.0 và khoảng nhiệt độ rộng 25 – 65 oC

1.3.1.2 Enzyme amylase

Amylase là một nhóm các enzyme được sản xuất trong tự nhiên bởi thực vật, động vật và vi sinh vật Tinh bột là một trong những nguồn năng lượng chính nên các enzyme thủy phân tinh bột cần thiết cho quá trình đồng hóa polyme sinh học này [55] Ở động vật, amylase rất quan trọng đối với quá trình thủy phân nguyên liệu tinh bột Quá trình này là bước đầu tiên để thu được mono-, di- và oligosaccharide, sau đó được đồng hóa thông qua các con đường trao đổi chất khác nhau [55]

Amylase mà đề tài sử dụng là α-amylase, là 1 trong 4 amylase chính được đưa vào công nghiệp để sản xuất Enzyme này là một endoenzyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết α-1,4-glycoside bên trong của chuỗi tinh bột Amylase được tìm thấy trong nhiều loại sinh vật, ngoài ra còn được phân lập với số lượng lớn từ thực vật, nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn Nhiệt độ tối ưu cho các α-amylase đã biết có dải rộng 25°C – 95 °C, độ pH tối ưu 1.0 - 11.5 [55]

Trong khi đó, dịch chiết saponin từ bồ hòn có một số tạp chất: monosaccharide, oligosaccharide, amino acid, protein, làm giảm độ tinh khiết của saponin [10] Việc áp dụng pectinase và amylase trong chiết xuất saponin từ bồ hòn là một hướng đi mới, chưa có nhiều báo cáo rõ ràng Với các ưu điểm nêu trên cùng khoảng pH hoạt động phù hợp, cũng như dựa trên cơ chế phân cắt các loại polysacharide phức tạp thành chất đơn giản hơn, đề tài hướng đến một ứng dụng enzyme trong quá trình làm đơn giản hóa các tạp chất trong dịch chiết bồ hòn, giúp cho sự lên men sau đó được thuận tiện và dễ dàng nhờ các sản phẩm hữu cơ đơn giản làm nguồn thức ăn Từ đó hàm lượng tạp chất giảm và độ tinh khiết của saponin tăng Đồng thời, enzyme góp phần làm trong dịch, tăng giá trị cảm quan về màu sắc

1.3.1.3 Một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong quá trình chiết

Nhờ nhiều ưu điểm nổi trội, phương pháp chiết xuất với enzyme đang nhận được rất nhiều sự chú ý và đã được chứng minh là một kỹ thuật tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học vô cùng hiệu quả qua nhiều nghiên cứu Một số các yếu tố quan trọng bao gồm: loại và hàm lượng enzyme, pH, nhiệt độ, thời gian chiết, dung môi chiết, tỷ lệ rắn – lỏng, tỷ lệ enzyme – cơ chất, … ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly và chất lượng dịch chiết thu được [56] Chính vì vậy, rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để khảo sát các điều kiện phù hợp với từng loại enzyme, giúp tối ưu hóa quá trình chiết và nâng cao chất lượng sản phẩm

Lieu M.D và các cộng sự [44] đã chỉ ra hiệu suất thu hồi saponin khi xử lý dịch chiết bằng enzyme amylase cao hơn so với tác dụng của vi sóng và sóng siêu âm Ngoài ra, enzyme amylase rất quan trọng đối với quá trình thủy phân nguyên liệu tinh bột Đây là bước đầu tiên để thu được mono-, di- và oligosaccharide, tạo điều kiện thuận tiện cho quá trình lên men phía sau [57]

Năm 2015, Trương Hoàng Duy và các cộng sự đã tiến hành tối ưu hóa các điều kiện trích ly thu nhận dịch saponin thô từ cây đảng sâm bằng enzyme α – amylase Năm yếu tố được chọn để tiến hành khảo sát bao gồm: tỷ lệ nguyên liệu/nước (w/v), pH, nhiệt độ chiết, thời gian chiết và hàm lượng enzyme sử dụng Mẫu đảng sâm được

xay nghiền nhỏ và bảo quản ở 40 oC Hàm lượng enzyme được khảo sát trong khoảng 0.4% đến 0.6%, và thời gian ủ trong khoảng 1 giờ đến 3 giờ Kết quả cho thấy khi thực hiện trích ly bằng enzyme α – amylase ở pH 5.5, nhiệt độ 85 oC trong thời gian tối ưu 1.9 giờ, hàm lượng enzyme sử dụng là 0.47% thì hàm lượng saponin tổng thu được 1557.23 mg/100 g Phương pháp tách chiết saponin bằng enzyme α-amylase đã cho kết quả tốt hơn so với việc chiết xuất bằng nước ở cùng điều kiện với hàm lượng saponin thu nhận được cao hơn 1.5 lần Hàm lượng enzyme và thời gian chiết đã được chứng minh là hai yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình chiết saponin [58]

Một loại enzyme khác cũng được sử dụng khá phổ biến để xử lý dịch chiết là enzyme pectinase có vai trò phân hủy các chất pectic Trước đây, các enzyme này được sử dụng để củng cố và đẩy nhanh quá trình lên men trà và loại bỏ lớp chất nhầy của hạt cà phê [59] Một ứng dụng đầy hứa hẹn khác của pectinase là ứng dụng trong ngành chế biến nước trái cây như làm trong dung dịch, tăng màu sắc và năng suất trong quá trình chiết [60] Katarzyna Rafińskavà các cộng sự đã nghiên cứu tương quan giữa hiệu quả thủy phân enzyme của nguyên liệu thực vật được chuẩn bị để chiết xuất với chất lượng của dịch chiết thu được Phổ MALDI-TOF-MS của các hợp chất được giải phóng cho thấy pectinase đặc biệt hiệu quả trong việc thu được dịch chiết chất lượng cao với hàm lượng các hợp chất gây cản trở thấp [61]

Pectinase đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, tuy nhiên, hiện tại chưa có nhiều công trình nghiên cứu việc xử lý dịch chiết bồ hòn bằng enzyme pectinase trên thế giới cũng như tại Việt Nam Như đã trình bày ở trên, bồ hòn tạo ra nhiều tạp chất gây keo tụ, làm đục hệ, ảnh hưởng đến cảm quan dịch chiết Do đó, pectinase rất giàu tiềm năng trong việc nghiên cứu làm tăng hiệu suất chiết saponin, giảm lượng tạp chất, kéo dài thời gian sử dụng

1.3.2 Về lên men

Theo quan điểm lên men hiện đại, lên men là một quá trình nuôi cấy vi sinh vật hoặc sử dụng enzyme tác dụng lên cơ chất nào đó để thu được sản phẩm mới Mục đích chính của quá trình lên men là chuyển hoá cơ chất trong môi trường dinh dưỡng (đường, hợp chất hữu cơ ) thành các sản phẩm cần thiết nhờ vi sinh vật [62]

Lên men là một phần quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, nông nghiệp Trong ngành thực phẩm, lên men giúp tăng giá trị dinh dưỡng, làm giảm các nhân tố không mong muốn có trong nguyên liệu ban đầu, giúp cải thiện hình thức và mùi vị của một số sản phẩm Bên cạnh đó, quá trình lên men còn giúp kéo dài thời gian sử dụng sản phẩm và giảm chi phí năng lượng trong chế biến [63] Saponin được chiết xuất từ S mukorossi bằng dung môi nước sẽ có một số tạp chất bao gồm: oligosaccharide, amino acid, protein, monosaccharide, chất nhầy Lên men dịch chiết saponin bởi các chủng nấm khác nhau cho phép loại bỏ đường tự do để giúp gia tăng hàm lượng saponin [45] Hơn nữa, ethanol được hình thành như một sản phẩm phụ của quá trình lên men có thể được chế biến để thu nhiên liệu ethanol, một nguồn năng lượng bổ sung, thân thiện với môi trường và giá thành rẻ [51] Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men bao gồm giống vi sinh vật, môi trường lên men và điều kiện lên men Để đạt được hiệu quả cao trong quá trình lên men, nghiên cứu cần xem xét và lựa chọn phù hợp cho cả ba yếu tố trên

1.3.2.1 Nấm men

Trong tự nhiên, sự hiện diện của nấm men khá phổ biến, đặc biệt ở các môi trường chứa đường với pH thấp (rau quả, mật, rỉ đường, mật ong bột…) Nấm men có thời gian thế hệ khoảng 120 phút nên sinh trưởng khá nhanh Ngày nay, chủng vi sinh vật này được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men để sản xuất cồn, bia, rượu vang, men bánh mì, men thức ăn chăn nuôi và nhiều thứ đồ uống khác [62]

Saccharomyces cerevisiae đã trở thành một trong những chủng nấm men được sử dụng khá phổ biến hiện nay bởi các ưu điểm như chịu được ở môi trường acid, có pH khoảng 4 – 4.5 hoặc thấp hơn, phát triển mạnh trong dịch đường lên men và chịu được độ cồn tương đối (khoảng trên 10°) Trong điều kiện yếm khí, nấm men sẽ tiến hành quá trình lên men kỵ khí để sinh ra rượu và CO2 [62]

C6H12O → 2CH3CH2OH + 2CO2

Nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng của nấm men là 25 – 30 oC, tối thiểu khoảng 2 – 3 oC và tối đa là 40 °C Ở mức nhiệt độ cao hơn, tốc độ sinh trưởng và phát triển của Saccharomyces cerevisiae giảm dần hoặc nấm men dần bị chết [62] Đối với bồ hòn, nấm men Saccharomyces cerevisiae là lựa chọn tối ưu Vì dịch chiết từ bồ hòn có pH thấp, nằm trong khoảng 3.5 – 4.5 [64], pH này ức chế hoạt động của nhiều nhóm vi sinh vật khác nhưng lại nằm trong khoảng hoạt động tối ưu của nấm men Ngoài ra, nấm men có hệ enzyme đa dạng, sử dụng được hầu hết các loại đường làm dinh dưỡng Trong khi hàm lượng đường trong dịch chiết bồ hòn chiếm khoảng 10% [10] và là những tạp chất không mong muốn, đây quả là nguồn dinh dưỡng phù hợp cho nấm men Việc sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae vừa giúp giảm lượng tạp chất, vừa giúp bảo quản dịch chiết tốt hơn, kéo dài thời gian sử dụng

1.3.2.2 Một số nghiên cứu về ứng dụng lên men

Lên men để tinh chế saponin bồ hòn sau khi chiết xuất bằng dung môi nước là một phương pháp mới chỉ được báo cáo trong một số nghiên cứu, nhưng lại là một phương pháp được ưa chuộng trong những năm gần đây bởi những người yêu thích lối sống “xanh” Thành phần chính của quả Sapindus mukorossi là saponin (10% - 11.5%), đường (10%) và chất nhầy [10] Khi chiết xuất quả bồ hòn bằng nước, các tạp chất như monosacarit, oligosacarit, chất nhầy… cũng bị lôi kéo theo cùng với saponin Chính các tạp chất này đã làm giảm độ tinh khiết của saponin và ảnh hưởng đến ngoại quan của dịch chiết bồ hòn

Quá trình lên men bởi các chủng nấm khác nhau cho phép loại bỏ các loại đường tự do [65] để thu được saponin Jin Yueqing, Zheng Jingcheng, và Gui Xiaohua đã chứng minh saponin từ trà khi chiết bằng nước và xử lý bằng phương pháp lên men cho độ tinh cao hơn nhiều so với ban đầu và cao hơn cả khi chiết với dung môi ethanol hay n – butanol [66]

Wu Hen và các cộng sự [45] đã tiến hành nghiên cứu phương pháp tinh chế dịch chiết từ quả bồ hòn bằng cách sử dụng tám loại nấm men Các tác giả tiến hành chiết saponin ở điều kiện tối ưu như sau: nhiệt độ chiết 40 oC, thời gian chiết 7 giờ, tỉ lệ

rắn/lỏng là 1/7 và chiết ba lần Sau đó xử lý dịch chiết với tám chủng nấm men khác nhau Kết quả cho thấy, khi sử dụng nấm men khô Saccharomyces cerevisiae (BV818) ở nồng độ 1.4% trong thời gian 4 ngày, độ tinh khiết của saponin tăng từ 45.71 lên 75.50%, tổng hàm lượng đường giảm đáng kể từ 14.25 xuống 3.02%, hiệu suất ethanol tăng lên 5.33% (w/v), và hàm lượng saponin của bồ hòn giảm nhẹ từ 18.29 xuống 15.30% (w/v)

Để khai thác saponin từ bồ hòn dưới vai trò là chất HĐBM, Wei cùng cộng sự [67] đã tiến hành lên men dịch chiết saponin bồ hòn và so sánh với mẫu không lên men về khả năng HĐBM Các tính chất như nồng độ CMC, khả năng nhũ hóa, khả năng tạo bọt, khả năng tẩy vết bẩn và tính kháng khuẩn của mẫu bồ hòn lên men cũng được đánh giá khi kết hợp cùng một số chất HĐBM khác Đầu tiên, bồ hòn sau xử lý được chiết hai lần bằng nước 40 oC có hỗ trợ khuấy (lần 1 với tỉ lệ 1/3 trong 5 giờ, lần 2 với tỉ lệ 1/2 trong 3 giờ) Dịch chiết sau đó được lọc thô và đem ly tâm trong 10 phút để thu được mẫu là môi trường lên men của giai đoạn lên men sau đó (SW) Nấm A oryzae (5 mg/mL) được cấy vào mẫu SW, bình được đậy kín và lên men ở 30 oC trong vòng từ 5 – 7 ngày cuối cùng đem hấp tiệt trùng và ly tâm trong 10 phút để loại xác vi sinh vật, thu được dung dịch Kết quả thí nghiệm cho thấy mẫu sau lên men (SWF) nổi trội hơn hẳn so với mẫu không lên men (SW) về tất cả các tính chất liên quan đến khả năng hoạt động bề mặt như nồng độ CMC và γ-CMC thấp hơn, khả năng nhũ hóa, khả năng tạo bọt và độ bền của bọt đều tốt hơn

Từ đây có thể thấy việc xử lý dịch chiết bồ hòn bằng phương pháp lên men đem lại hiệu quả nổi trội khi ứng dụng vào khía cạnh tẩy rửa Phương pháp này không những đạt được mục đích tinh sạch saponin mà còn tạo ra các sản phẩm phụ có lợi, chẳng hạn như nấm mem tạo ethanol dùng làm nhiên liệu Do đó, quy trình này đặc biệt vượt trội so với các quy trình khác và có khả năng ứng dụng trong công nghiệp

1.4 Mục tiêu, đối tượng và nội dung nghiên cứu 1.4.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục đích của đề tài là nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme và vi sinh vật đến quá trình làm giàu saponin Từ đó những giải pháp xử lý dịch chiết bồ hòn phù hợp được đề ra để nâng cao chất lượng và ngoại quan, định hướng đưa ra sản xuất thương mại trong tương lai

1.4.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là quả bồ hòn (Sapindus mukorossi Gaertn.) được thu hoạch ở Đắk Lắk, Việt Nam

1.4.3 Nội dung nghiên cứu

Với mục tiêu như trên, luận văn tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

 Khảo sát điều kiện chiết với sự hỗ trợ của enzyme dựa trên hàm lượng saponin, đường tổng và đường khử

 Khảo sát 2 loại enzyme pectinase và amylase

 Sau khi lựa chọn được enzyme phù hợp, khảo sát thời gian và nhiệt độ chiết  Khảo sát điều kiện lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae với hai yếu tố nồng độ men cấy và thời gian lên men dựa trên hàm lượng saponin, đường tổng và đường khử

 Đánh giá khả năng hoạt động bề mặt của dịch chiết sau lên men dựa vào khả năng tẩy rửa, khả năng tạo bọt và duy trì bọt

 Đánh giá cảm quan dịch chiết sau lên men thông qua độ đục

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất và thiết bị 2.1.1 Hóa chất

Bảng 2 1 Danh mục hóa chất sử dụng

STT Tên hóa chất/ Chủng vi sinh vật Nhà sản xuất Xuất xứ 1 Sulfuric acid Xilong Trung Quốc 2 D-glucose Xilong Trung Quốc 3 Pectinase enzyme Angel Yeast Trung Quốc 4 Amylase enzyme Angel Yeast Trung Quốc 5 3,5-Dinitrosalicylic acid Xilong Trung Quốc 7 Sodium hydroxide Xilong Trung Quốc 8 Potassium sodium tartrate terahydrate Xilong Trung Quốc 9 Oleanolic acid AK Scientific Mỹ 10 Vanillin HiMedia Ấn Độ 11 Cồn tuyệt đối GHTech Trung Quốc 12 Saccharomyces cerevisiae Biogreen Việt Nam

2.1.2 Thiết bị

Máy quang phổ UV – VIS CT – 2200 (Chrom Tech) Tủ sấy UN110 (Memmert, Đức)

Bể ổn nhiệt WNB (Memmert, Đức) Máy vortex ZX4 (VELP, Ý)

Cân phân tích FA2004B (YOKE, Trung Quốc) Máy đo pH (Hanna, Ý)

2.2 Quy trình thực hiện 2.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Quả bồ hòn được thu hoạch ở Đắk Lắk, được phơi khô và tách bỏ hạt, đóng gói trong túi zip tránh ẩm mốc Quả bồ hòn trước khi thử nghiệm được sấy khô ở 600C trong 15 – 20 giờ, độ ẩm đạt 7 – 8% Sau đó, quả bồ hòn khô được xay nhỏ bằng thiết bị đồng hóa, rây qua rây 2 mm tạo sự đồng đều về kích thước

2.2.2 Chiết xuất saponin từ quả bồ hòn

10 g quả bồ hòn đã xay được chiết bằng dung môi nước với sự hỗ trợ của enzyme pectinase hoặc enzyme amylase với những nồng độ khác nhau

Đối với enzyme pectinase, bồ hòn được chiết với tỷ lệ chiết nguyên liệu/ dung môi là 1/6 (w/v), quá trình diễn ra ở nhiệt độ phòng (30 – 32 oC) trong thời gian 2 giờ và khuấy liên tục trên máy khuấy từ ở tốc độ 1000 rpm Sau đó, hỗn hợp đem lọc thô bằng vải lọc để loại bỏ bột bồ hòn còn lại Dung dịch thu được đun nóng ở 90 oC trong 10 phút để bất hoạt enzyme Dung dịch sau bất hoạt được loại bỏ phần cặn và tủa bằng ly tâm ở tốc độ 8000 rpm, thời gian 10 phút Dịch chiết bồ hòn được thu để thực hiện các công đoạn tiếp theo

Đối với enzyme amylase, bồ hòn được chiết xuất với quy trình tương tự như trên Dịch chiết sau lọc được đưa vào tủ lạnh qua ngày để làm giảm hoạt lực của enzyme xuống mức thấp Dung dịch sau bất hoạt được loại bỏ phần cặn và tủa bằng ly tâm ở tốc độ 8000 rpm, 10 phút, thu dịch chiết bồ hòn để thực hiện các công đoạn tiếp theo Hiệu suất chiết saponin được tính toán theo công thức:

𝐻% =𝑚

𝑛 × 100 Với 𝑚 = 𝐶 × 𝑉 Trong đó: H%: Hiệu suất chiết saponin

𝑚 : Khối lượng saponin tổng (mg) 𝑚 : Khối lượng nguyên liệu (g) V: Thể tích dịch chiết (mL)

𝐶 : Hàm lượng saponin tổng (mg/mL)

Hình 2 1 Sơ đồ quy trình chiết bồ hòn

Quy trình chiết bồ hòn sử dụng enzyme pectinase và enzyme amylase được khảo ở cùng điều kiện chiết, đồng thời so sánh với mẫu chiết không sử dụng enzyme Mẫu sau khi chiết được khảo sát hàm lượng saponin tổng, đường tổng và đường khử để chọn loại enzyme phù hợp nhất Tiếp theo, loại enzyme phù hợp được khảo sát 2 yếu tố thời gian và nhiệt độ

2.2.3 Lên men

 Hoạt hóa giống

Chủng vi sinh vật thực hiện lên men là nấm men Saccharomyces cerevisiae ở dạng động khô Quá trình hoạt hóa diễn ra trước khi tiến hành lên men, môi trường là dịch chiết bồ hòn được pha loãng trong điều kiện tối ưu để vi khuẩn làm quen môi trường mới và hoạt động lại các chức năng sinh học, đồng thời bù nước giúp vi khuẩn chuyển từ trạng thái ngủ ở dạng đông khô sang trạng thái diễn ra hoạt động trao đổi chất 2 g nấm men khô (1.109 CFU/g) được hoạt hóa trong 20 mL dịch chiết bồ hòn, bịt kín và lắc ủ ở nhiệt độ phòng (30 – 32 oC), tốc độ 150 vòng/ phút trong thời gian 20 phút

r = 8000 rpmt = 10 phút

Hình 2 2 Sơ đồ hoạt hóa chủng nấm men  Lên men

Dung dịch nấm men sau khi hoạt hóa được cấy vào 50 mL dịch chiết bồ hòn chứa trong bình với các nồng độ khác nhau, đậy kín và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian khảo sát khác nhau Các tế bào vi khuẩn được loại bỏ bằng ly tâm với tốc độ 8000 rpm, thời gian 10 phút, thu dịch bỏ cặn, được dịch bồ hòn sau lên men

Hình 2 3 Quy trình lên men bằng vi sinh vật  Khảo sát điều kiện lên men

Quá trình lên men thực hiện theo sơ đồ như trên, các yếu tố được khảo sát về thời gian lên men, hàm lượng nấm men Các thông số khảo sát như trong Bảng 2.2 Mẫu sau lên men được đo hàm lượng saponin tổng, đường tổng và đường khử để chọn hàm lượng và thời gian thích hợp

Đậy kín

r = 8000 rpmt = 10 phútto phòng

Bảng 2 2 Các thông số khảo sát quá trình lên men Thời gian lên men Lượng men cấy (v/v) 1 – 2 – 3 – 4 – 5 ngày 0 – 2.5 – 5.0 – 7.5 – 10.0%

2.2.4 Xác định hàm lượng hoạt chất 2.2.4.1 Hàm lượng saponin tổng

Để xác định hàm lượng saponin tổng, phương pháp phản ứng màu vanillin – sulfuric acid được thực hiện Dựa trên nguyên tắc saponin sẽ phản ứng với thuốc thử vanillin – sulfuric acid và tạo màu, cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng saponin và được xác định ở bước sóng 538 nm [45] Các bước tiến hành được tóm tắt trong Hình 2.4 Hàm lượng saponin được xác định dựa trên đường chuẩn oleanolic acid Oleanolic acid dược pha loãng với nước cất thành dãy nồng độ lần lượt là 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600 ppm 0.3 mL oleanolic acid được ủ với dung dịch vanillin 8% (w/v) trong ethanol và 3 mL acid sulfuric 72% (v/v) đã được vortex trong 10 phút ở 60 oC Hỗn hợp sau khi ủ được làm mát bằng nước đá trong 10 phút Đo và ghi nhận giá trị độ hấp thụ tại bước sóng 538 nm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình

Hàm lượng saponin tổng được tính theo công thức:

C =C × vV

Trong đó: C : Hàm lượng saponin tổng tính trên 1 mL dịch chiết theo chuẩn oleanolic acid (mgOLE/mL)

v: Thể tích mẫu đem đi pha loãng (mL) V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng (mL)

C : Giá trị x trong công thức đường chuẩn saponin (mg/mL)

Hình 2 4 Quy trình xác định hàm lượng saponin tổng

Các bước xác định hàm lượng saponin được thực hiện như sau: Dịch chiết bồ hòn được pha loãng với nước cất rồi thêm 0.3 mL dung dịch vanillin 8% (w/v) trong ethanol và 3 mL acid sulfuric 72% (v/v) vào 0.3 mL dịch chiết Hỗn hợp được vortex đều và ủ trong 10 phút ở 60 oC Sau khi làm mát trong nước đá trong 10 phút, dung dịch được đo và ghi nhận giá trị độ hấp thu tại bước sóng 538 nm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình

2.2.4.2 Hàm lượng đường khử

Phương pháp dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) 3,5 – dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng và sẽ khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam trong dung dịch kiềm

Thuốc thử DNS được pha như sau: 300 g potassium sodium tartrateđược hòa tan vào 500 mL nước cất đồng thời 16 g NaOH được hòa tan vào 150 mL nước cất Sau đó 10 g DNS được hòa tan vào dung dịch NaOH ở trên Dung dịch NaOH có chứa DNS được cho vào dung dịch potassium sodium tartrate và khuấy ở nhiệt độ không quá 50

0C, chú ý phải bịt kín cốc pha hóa chất Sau khi hòa tan hoàn toàn, dung dịch được định mức đến 1 L và trữ trong chai tối

0.3 mLMẫu/ Oleanolic acid

0.3 mL Vanilin 8%3 mL acid sulfuric 72%

 = 538 nmỦ

Làm lạnh

Đo mật độ quang

T = 60 oCt = 10 phútt = 10 phút

Các bước xác định hàm lượng đường khử được thực hiện như sau: Hàm lượng đường được xác định dựa trên đường chuẩn glucose Glucose 10 mg/mL được pha loãng trong nước cất với nồng độ lần lượt là 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL Dịch chiết bồ hòn được pha loãng với nước cất với nồng độ thích hợp Sau đó, 3 mL glucose/dịch chiết bồ hòn được thêm 1 mL thuốc thử DNS vào trong các ống nghiệm có nắp vặn Các ống nghiệm được đặt vào nồi cách thủy đang sôi trong vòng 5 phút, sau đó các mẫu được làm nguội về nhiệt độ phòng Độ hấp thu được đo và ghi nhận tại bước sóng 540 nm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình

Hình 2 5 Quy trình xác định hàm lượng đường khử 2.2.4.3 Hàm lượng đường tổng

Hàm lượng đường tổng được xác định theo phương pháp phenol – acid sulfuric, độ hấp thu được đo ở bước sóng 490 nm Phản ứng dựa trên nguyên tắc sulfuric acid đậm đặc sẽ phân hủy các polysaccharide, sau đó các hợp chất tạo thành sẽ phản ứng với phenol tạo màu

Quy trình xác định hàm lượng đường tổng theo sơ đồ Hình 2.6 0.3 mL

Mẫu/ Oleanolic acid 1 mL DNS

 = 540 nmĐun cách thủy

Làm lạnh

Đo mật độ quang

t = 5 phút

t = 10 phút