Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu làm giàu các chất ức chế enzyme tyrosinase từ chiết xuất rễ cây dâu tằm (Morus alba L.)

Tổng quan về cây dâu tằm

Nguồn gốc

Cây dâu tằm có tên khoa học là Morus alba L là một loại thực vật họ Moraceae

Morus alba L có nguồn gốc ở phía đông Châu Á, là một loài cây có giá trị kinh tế và dược lý cao Loài này được Carl Linnaeus mô tả khoa học lần đầu tiên vào năm 1753 [1]

Tên đồng nghĩa: White mulberry, Common mulberry, Silkworm mulberry, Shahtoot (Urdu, Persian, Hindi) [1] Ở Việt Nam thường gọi Morus alba L là dâu tằm trắng, dâu tằm thường, dâu ta, dâu cang, tang để phân biệt với các loài dâu khác cũng thuộc chi Dâu tằm như dâu đỏ, dâu đen [2].

Về đặc điểm phân bố, cây dâu tằm trắng thuộc loại cây ưa ẩm và sáng, thường được trồng trên diện tích lớn ở bãi sông, đất bằng, cao nguyên.

Trên thế giới, dâu tằm trắng phân bố ở Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ thuộc vùng ôn đới ấm hoặc cận ôn đới Ở Việt Nam, dâu tằm phân bố khắp cả nước, tuy nhiên được trồng nhiều ở các vùng như đất bãi sông Hồng, sông Đáy, Tây Nguyên và cao nguyên Lâm Đồng [2].

Đặc điểm thực vật

Đặc điểm thực vật ở của dâu tằm là các mô tả thể hiện đặc trưng của cây dâu tằm phân biệt với các loại khác bao gồm [2]:

- Rễ: rễ ăn sâu và rộng có thể lên đến khoảng 3m, phân bố nhiều ở tầng đất 10 –

- Thân: cây thân gỗ nhỏ, chiều cao khoảng 2 – 3 m; thân nhiều nhựa không gai, trên thân cành có nhiều mầm; vỏ có nốt sần, mủ trắng như sữa

- Cành: cành mềm, khi còn non có lông, sau nhẵn có màu xám trắng, chồi nách nhỏ màu nâu vàng

- Lá: Lá mọc so le, hình bầu dục hoặc hình tim, có mũi nhọn ở đầu, phiến nguyên hay đôi khi chia 3 – 5 thùy, mỏng và mềm, dài khoảng 5 – 10 cm, rộng 4 – 8 cm, mép có răng cưa đều Mặt trên của lá màu lục sẫm hay lục xám, mặt dưới màu lục nhạt hơn, nổi rõ các gân lớn chạy từ cuống lá và nhiều gân nhỏ hình mạng lưới, có lông tơ mịn rải rác trên gân lá; cuống lá dài 2 – 4 cm, mảnh và có lông thưa

- Hoa: Hoa đơn tính, vô cánh, các hoa cái hợp thành đuôi sóc dài 1 – 1,5 cm Cụm hoa đực là chùm hoặc gié, dài 1,5 – 2 cm riêng mỗi hoa cuống ngắn; bốn lá đài tù, có lông thưa; bốn nhị đối diện với các lá đài, dài gấp đôi lá đài; hạt phấn hình bầu dục, hai đầu nhọn, nhiều rãnh

- Quả: Quả khi sống có màu trắng xanh, khi chín có màu đỏ hồng hoặc đen với chiều dài 1 – 2 cm, đường kính quả 7 – 10 mm Cuống quả dài 1 – 1.5 mm, có vị ngọt và hơi chua Đặc điểm sinh trưởng: Dâu tằm là loài cây ưa ẩm và ánh sáng, thường được trồng trên diện tích lớn ở bãi sông, đất bằng, cao nguyên; thích hợp với nhiệt độ 25 – 32 o C, hạn chế sinh trưởng nếu nhiệt độ trên 40 o C hoặc dưới 12 o C Mùa hoa tháng 4 – 5, mùa quả tháng 5 – 7 [2]

Hình 1.1 Cây dâu tằm a) Rễ, b) Thân, c) Cành, d) Lá, e) Hoa, f) Quả

Công dụng

Theo sách cổ y học cổ truyền, cây dâu tằm (Morus alba L.) là một loại dược liệu quý vì tất cả các bộ phận của cây dâu tằm đều được ứng dụng trong nhiều bài thuốc để chữa bệnh Lá dâu tằm (tang diệp) thường được dùng chữa sốt, cảm mạo do phong nhiệt, ho, viêm họng, đau răng, đau mắt đỏ, chảy nước mắt, đậu lào, phát ban, cao huyết áp, làm cho sáng mắt Vỏ rễ (tang bạch bì) dùng trị phế nhiệt, hen suyễn, khái huyết, phù e) f) a) b) c) d) thũng, dị ứng do ăn uống, bụng trướng to, tiểu tiện không thông Cành Dâu dùng trị phong tê thấp, đau thắt lưng, đau nhức các đầu xương, cước khí, chân tay co quắp Quả dùng trị viêm gan mạn tính, thiếu máu, suy nhược thần kinh [2, 3] Đồng thời, cây dâu tằm cũng chứng tỏ được công năng của nó với một số bài thuốc ở một số quốc gia trên thế giới Điều hình là Trung Quốc, trong dược điển của Trung Quốc có ghi lá dâu, vỏ dâu, cành dâu, quả dâu đều có công năng thanh phế nhiệt, trừ phong thấp, bổ gan thận [3] Ngoài ra, ở Philippin, người ta còn dùng cây dâu tằm để chữa rò, mụn mủ, bướu và bệnh ngoài da, các vết cắn, vết thương và bệnh lậu Ở Ấn Độ, người ta dùng quả làm thuốc mát trong cơn sốt và còn dùng làm thuốc chữa viêm họng, khó tiêu và bệnh u sầu; vỏ được dùng làm thuốc xổ và trị giun Và ở Hàn Quốc và Nhật Bản, bệnh nhân bị tiểu đường thường phải dùng lá dâu tằm như một liệu pháp trị bệnh chống lại triệu chứng tăng glucose

Và một công dụng đang được quan tâm hiện nay đó là khả năng làm trắng da, dịch chiết rễ dâu tằm được cho là có khả năng làm trắng da tốt do đó nó đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm [3].

Thành phần hóa học

Năm 2002, Jiang Du cùng các cộng sự đến từ trường Đại học Hong Kong, Trung Quốc thực hiện nghiên cứu rễ cây dâu tằm chiết với ethanol 70 % v/v thu được 180 g cao/1,7 kg NLK Sau khi tiến hành chạy sắc ký cột silica gel và các phương pháp phân tích phổ, cấu trúc của các hợp chất phân lập trong cao chiết được xác định: moralbanone

(1), kuwanon S (2), mulberroside C (3), cyclomorusin A (4), eudraflavone B hydroperoxide (5), oxydihydromorusin (6), leachianone G (7) và α-acetyl-amyrin (8)

(Hình 1.2) Trong đó, hợp chất mulberroside C chiếm hàm lượng cao nhất (53 mg/1,7 kg NLK) và moralbanone ít nhất (1 mg/1,7 kg NLK) [4]

Hình 1.2 Cấu trúc các hợp chất có ở rễ dâu tằm

Năm 2004, Hisayoshi Kofujita và cộng sự đã tiến hành phân lập cao ethyl acetate của rễ dâu tằm Nghiên cứu được thực hiện trên dịch chiết ethyl acetate Sau khi tiến hành chạy sắc kí cột với nhiều hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, kết hợp các phương pháp phân tích phổ, hợp chất mới được phân lập ra từ dịch chiết trên là 7, 2’, 4’, 6’-tetrahydoroxy-6-geranyl-flavanone (9) [5]

Năm 2010, Shu-juan Piao và cộng sự đã tiến hành phân lập cao dịch chiết rễ dâu tằm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Sau khi phân lập nhóm của Shu-juan Piao đã tìm ra năm chất trong nhóm stilbene glycosides bao gồm: mulberroside A (10), cis mulberroside A (11), resveratrol-4, 3’-di-O- β -D-glucopyranoside (12), oxyresveratrol- 2-O- β -D-glucopyranoside (13), và oxyresveratrol-3’-O- β -D-glucopyranoside (14)

Hình 1.3 Mulberroside A (10) và cis mulberroside A (11)

Năm 2014, Ji-Hae Park và cộng sự đã nghiên cứu được một phân tử glycoside flavonoid mới trong rễ cây dâu tằm bằng việc sử dụng sắc ký cột trên phân đoạn n- BuOH [7] Với phương pháp này các nhà nghiên cứu đã chiết xuất được một phân tử

7 glycoside flavonoid mới cũng như ba chất hóa học đã được công nhận Dữ liệu quang phổ MS, IR, 1D và 2D NMR chỉ ra bốn cấu trúc: (2R,3S)-guibourtinidol-3-O--D- apiofuranosy- (1→6)-O-β-D-glucopyranoside (12), quercetin-7-O-β-D- glucopyranoside (13), syringaresinol-4-O-β-D-glucopyranoside (14), và dehydrodiconiferyl alcohol 4,9’-di-O-β-D-glucopyranoside (15) [7]

Hình 1.4 Quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside (13), syringaresinol-4-O-β-D- glucopyranoside (14)

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.1.5.1 Hoạt tính kháng enzyme tyrosinase

Năm 2002, Sang Lee Hee và các cộng sự đã thực hiện nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase của mulberroside F (16) Hợp chất mulberroside F được phân lập từ dịch chiết lá dâu tằm trong methanol 85% v/v Nghiên cứu cho thấy mulberroside

F cú giỏ trị IC50 là 0,29 àg/ml cao hơn gấp 4,5 lần so với kojic acid với giỏ trị IC50 là 1,30 àg/ml Do đú tỏc giả cũng đưa ra kết luận mulberroside F là một chất cú tiềm năng ứng dụng trong việc kết hợp vào các loại mỹ phẩm với khả năng làm trắng da [8]

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của mulberroside F (16)

Năm 2015, Wang Ya cùng các cộng sự đến đã tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của cao chiết xuất của 44 loại thảo dược tại các nồng độ 1 mg/ml,

2 mg/ml và 4 mg/ml Nghiên cứu cho thấy tại nồng độ 1 mg/ml đã có bốn thảo dược có

I % > 50 % bao gồm cao chiết rễ dâu tằm với I % = 72,73 %, cao chiết quả mướp đắng (Momordica charantia L.) với I % = 54,98 %, cao chiết hạt cỏ ca ri (Trigonella foenum- graecum L.) với I % = 60,70 % và cao chiết rễ cam thảo (Glycyrrhiza uralensis Fisch) với I % = 64,59 % Trong đó, khả năng ức chế tyrosinase của rễ dâu tằm tại hai nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml cũng được xác định lần lượt là 98,78 % và 98,91 %, nổi bật hơn hẳn các loại cây khác trong bài nghiên cứu này Từ đó, Wang Ya cho thấy tiềm năng ứng dụng tuyệt vời của chiết xuất rễ dâu tằm trong công nghiệp dược – mỹ phẩm [9]

Năm 2016, Long Zhang và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ cành dâu tằm trên dịch chiết EtOH 70 % v/v Nhóm tác giả đã xác định được cấu trúc của một flavonoid mới cùng 16 hợp chất đã biết bao gồm bốn flavonoid, bốn dẫn xuất của benzofuran, ba flavanone, hai chalcone, hai phenolic acid và một dẫn xuất của stilbene Bốn hợp chất được liệt kê trong Bảng 1.1 cho thấy khả năng kháng enzyme tyrosinase mạnh gấp khoảng 58 lần so với kojic acid [10]

Bảng 1.1 Các chất ức chế enzyme tyrosinase cành dâu tằm

Hợp chất Giỏ trị IC 50 (àM)

Trong đó, hai hợp chất ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất là 2,4,2’,4’- tetrahydroxychalcone (17) và morachalcone A (18) cũng được chứng minh hiện diện trong vỏ rễ dâu tằm Những kết quả này cho thấy chiết xuất từ dâu tằm có tiềm năng lớn để sử dụng như một chất ức chế tyrosinase tự nhiên sử dụng trong các sản phẩm trắng da [10]

Năm 2017, nhóm tác giả Nguyễn Thị Hạnh và các cộng sự đã tiến hành khảo sát khả năng làm trắng da của bảy loài thảo dược trên cao chiết EtOH 80 % v/v Trong đó, lõi rễ dâu tằm - bộ phận được chứng minh có hoạt tính cao - tiếp tục tiến hành chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ khác nhau: n-hexane, chloroform, ethanol abs và nước Kết quả nghiên cứu cho thấy, lõi rễ dâu tằm thể hiện hoạt tính kháng enzyme tyrosinase là tốt nhất trong các loại thảo dược với giá trị IC50 = 3,91 ± 0,50 ppm gấp khoảng 1,5 lần so với kojic acid (IC50 = 5,40 ± 0,37 ppm) Qua nghiên cứu này, Nguyễn Thị Hạnh và các cộng sự cũng cho rằng, bộ phận lõi rễ dâu tằm có hoạt tính trắng da tốt hơn các loài cây khác [11]

Năm 2018, Vũ Đức Lợi và các cộng sự đã công bố kết quả phân lập được 11 hợp chất trên cao tổng MeOH và các phân đoạn n-hexane, EtOAc và nước của lá dâu tằm Kết quả cho thấy khả năng ức chế enzyme tyrosinase là tốt nhất với hợp chất (S)-5,5’,7-

(17) (18) trihydroxy-2’,4’-dimethoxy-6-methylflavanon (19) với IC50 bằng 15,48 ± 2,96 μg/ml [12]

Bên cạnh đó, nhóm tác giả tiếp tục nghiên cứu phát triển các hợp chất nổi bật trên ở quy mô in vivo cho thấy hiệu quả trắng da tốt và khá tương đồng với kết quả in vitro Cụ thể, trong thí nghiệm in vivo theo đường bôi ngoài da với chứng dương hydroquinone 2 % trong vaseline; chỉ số trắng da L của các mẫu thử đều tăng sau 21 ngày khảo sát, trong đó giá trị của mẫu 1 là cao nhất (54,3), sau đó là mẫu 2 (53,8) cao hơn so với giá trị ban đầu là dưới 49 Bên cạnh đó, trong thí nghiệm in vivo theo đường uống với chứng dương là L-ascorbic acid có giá trị delta L = 4,3, nhóm chuột uống mẫu

1 cũng có kết quả tốt nhất (delta L = 3,2) Liều 12 g mẫu thử/kg thể trọng chuột cũng được xác định là liều tối đa để mỗi cá thể chuột uống một lần trong ngày mà vẫn không có biểu hiện bất thường [12]

Từ các kết quả trên, Vũ Đức Lợi và các cộng sự nhận thấy được ứng dụng tuyệt vời của dâu tằm và sử dụng cao chiết của nó tiếp tục nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang cứng và kem thoa Hiện tại, đề tài đã đăng ký hai sản phẩm là thực phẩm chức năng viên nang trắng da Morus và mỹ phẩm kem trắng da Melagen

Từ đây có thể thấy dâu tằm đang dần trở thành loài thảo dược được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm [12]

1.1.5.2 Khả năng làm giảm nhăn da

Collagenase là enzyme tham gia quá trình phân cắt các liên kết peptide trong collagen khiến cho cấu trúc sợi collagen và elastin trên da bị phá vỡ, dẫn đến các tổn thương da kéo dài và hình thành nếp nhăn Các phenolic từ thực vật trở nên tiềm năng với tác động ức chế collagenase nhằm ngăn ngừa lão hóa da và hình thành nếp nhăn [13]

Năm 2004, Un-Kyo Seo và cộng sự đã thực hiện sàng lọc hoạt động ức chế metalloproteinase-9 (MMP-9), một loại enzyme collagenase, từ các cây thuốc Hàn Quốc và nhận thấy cao chiết BuOH của toàn bộ M alba có hiệu quả ức chế MMP-9 đạt 19,5% [14] Từ đây nhận thấy tiềm năng của chiết xuất dâu tằm trong việc làm giảm nhăn da người dùng

Năm 2015, Amal Kumar Ghimeray và cộng sự đã phát triển một công thức phối trộn giữa các chiết xuất thảo dược khác nhau, bao gồm bạch quả (Ginkgo biloba), lựu (Punica granatum), vả tây (Ficus carica) và quả dâu tằm (Morus alba L.) Sau đó đánh giá khả năng kháng oxy hóa, kháng collagenase (in vitro) và chống nhăn (in vivo) của các công thức Kết quả của các nghiên cứu trong ống nghiệm cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các công thức phối trộn cao hơn so với chiết xuất từ trái cây riêng lẻ và khả năng ức chế enzyme collagenase phụ thuộc vào liều lượng của từng loại chiết xuất (nồng độ 5 àg/ml dịch chiết cho hiệu quả ức chế enzym 67,45 %) Nghiờn cứu in vivo được thực hiện trên 21 đối tượng nữ từ 45 đến 54 tuổi Kết quả cho thấy giảm đáng kể độ sâu, chiều dài và diện tích nếp nhăn 11,5 %, 10,07 % và 29,55 % (sau 56 ngày) so với giả dược Nghiên cứu chỉ ra khả năng chống oxy hóa và chống collagenase được cải thiện cũng như tác động đáng kể đến hoạt động chống nếp nhăn của công thức chiết xuất từ trái cây hỗn hợp trên da người Điều này cho thấy tiềm năng đầy hứa hẹn của M alba được sử dụng như một thành phần bổ sung cho các sản phẩm mỹ phẩm chiết xuất từ thực vật khác [15]

Năm 2013, Yoo Seok Jeong và cộng sự đã nghiên cứu in vivo tác dụng bảo vệ khỏi tia cực tím gây ra tia UVB từ chiết xuất dâu tằm Việc sản xuất MMP-1 trong các tế bào HS68 trên chuột 6 tuần tuổi khi tiếp xúc với UVB giảm 68 % đối với 200 μg/ml chiết xuất M alba 7 % Đồng thời, độ sâu nếp nhăn trên da giảm xuống còn 30 % so với nhóm đối chứng [16] Những kết quả này chỉ ra chiết xuất dâu tằm là một nguyên liệu mỹ phẩm hữu ích để bảo vệ da khỏi tác hại của tia UVB

1.1.5.4 Hoạt tính kháng oxy hóa

Tổng quan về nhựa hấp phụ

Đặc tính của nhựa hấp phụ

Hạt nhựa hấp phụ macroporous là hạt polymer hình cầu, màu trắng, cấu trúc xốp với các lỗ xốp với đường kính lớn hơn 50 Å Với đường kính này cho phép các phân tử lớn đi qua, hấp phụ nhờ vào tương tác tĩnh điện, liên kết hydro và tạo phức [23]

Ba đặc tính quan trọng đặc trưng cho khả năng hấp phụ của các hạt nhựa là: tổng diện tích bề mặt (trong và ngoài), đường kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt Diện tích bề mặt thường trong khoảng 100 đến 1000 m 2 /g, đường kính lỗ xốp trong khoảng từ

100 đến 300 Å, độ phân cực trong khoảng từ không phân cực, phân cực yếu, trung bình và mạnh tùy theo monomer sử dụng trong hoặc xử lý sau quá trình polymer hóa [23]

Hạt nhựa hấp phụ được sử dụng để phân tách và làm giàu polyphenol và một số hợp chất khác Việc hấp phụ những hợp chất hóa học đòi hỏi cần lựa chọn vật liệu hấp phụ có kích thước mao quản, độ phân cực và diện tích bề mặt phù hợp Nhựa hấp phụ hiện đang được coi là một vật liệu khả thi để phát triển một kỹ thuật đơn giản và hiệu quả để tách, cô lập và tinh chế các hợp chất phenolic từ nhiều loại chiết xuất thực vật khác nhau [23]

Dựa vào điều kiện hiện có, đề tài này sẽ sử dụng 5 loại nhựa hấp phụ có độ phân cực từ không phân cực đến phân cực trung bình Các thông số khác của 5 loại nhựa này được thể hiện qua Bảng 1.2

Bảng 1.2 Thông số vật lý của 5 loại nhựa hấp phụ [24]

Kích thước hạt (mm) Đường kính trung bình lỗ xốp (Å) Độ phân cực

2 ADS-17 90 – 150 0,3 – 1,25 250 – 300 Phân cực trung bình

5 DM-301 330 – 380 0,3 – 1,25 90 – 110 Phân cực trung bình

Một số nghiên cứu ứng dụng của nhựa hấp phụ

Năm 2011, Dongdong Jia và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu quy trình chiết xuất lá cây dâu tằm (Morus alba L.) bằng phương pháp siêu âm; dịch chiết sau đó được hấp phụ bằng nhựa macroporous để làm giàu flavonoid H – 103 là loại macroporous không phân cực, được chọn từ tám loại nhựa macroporous khác nhau Kết quả cho thấy trong điều kiện tối ưu, hàm lượng flavonoid tổng thu được có thể lên đến 36,3%, với độ thu hồi là 83,4% Các flavonoid như rutin và isoquercitrin đã được xác định trong dịch chiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, và độ thu hồi của chúng là hơn 80% [25]

Năm 2016, nhóm nghiên cứu của Yang Chao và các cộng sự đã tiến hành khảo sát khả năng hấp phụ và giải hấp anthocyanins của dịch chiết lá dâu tằm (Morus alba L.) trên 5 loại nhựa macroporous bao gồm XAD-7HP, AB-8, HP-20, D-101, X-5 Kết quả cho thấy XAD-7HP và AB-8 là hai loại nhựa thể hiện khả năng hấp phụ tốt hơn 3 loại nhựa còn lại Các thử nghiệm động học được thực hiện tiếp theo trên cột XAD-7HP và AB-8, độ tinh khiết của phân đoạn bằng cách rửa giải với ethanol 40% trên XAD-7HP đạt đến 93,6%, sau đó cyanidin-3-glucoside và cyanidin-3-rutinoside được xác định bằng HPLC – ESI-MS / MS Nghiên cứu này chỉ ra rằng có thể phân lập anthocyanin có độ tinh khiết cao từ quả dâu tằm cũng như các loại cây khác bằng phương pháp này [26]

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu làm đẹp theo phương pháp an toàn, gần gũi với thiên nhiên của con người ngày càng cao đặt ra yêu cầu phát triển các sản phẩm ứng dụng hoạt chất tự nhiên có khả năng trắng da Thấy được nhu cầu đó, đề tài này nghiên cứu, đánh giá độ ổn định của cao và dịch chiết rễ cây dâu tằm, khảo sát làm giàu polyphenol từ dịch chiết rễ dâu tằm với phương pháp hấp phụ trên các loại nhựa macroporous và giải hấp trên cột, khảo sát khả năng kháng enzyme tyrosinase từ các phân đoạn giải hấp với mục tiêu ứng dụng hoạt chất này vào sản phẩm mỹ phẩm

Với mục tiêu trên, nghiên cứu này thực hiện các nội dung sau:

- Chiết xuất rễ dâu tằm theo điều kiện tối ưu và đánh giá hoạt tính kháng enzyme tyrosinase và tính tổng hàm lượng polyphenol trong dịch chiết

- Khảo sát điều kiện hấp phụ tĩnh và giải hấp bao gồm dung môi pha loãng mẫu, thời gian hấp phụ, loại nhựa hấp phụ và dung môi giải hấp

- Tiến hành nâng cao hàm lượng polyphenol trong dịch chiết dâu tằm với các điều kiện đã khảo sát bằng sắc ký cột (hấp phụ động và giải hấp)

- Đánh giá hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính kháng enzyme tyrosinase của dịch chiết sau khi đã làm giàu

- Thử nghiệm phối dịch chiết vào nền serum.

Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

Hóa chất Nhà sản xuất Xuất xứ

Na2CO3 Xilong Trung Quốc

Thuốc thử Folin-Ciocalteau Merck Đức

DPPH Sigma Chemical Co Mỹ

Enzyme tyrosinase Sigma Chemical Co Mỹ

L-DOPA Sigma Chemical Co Mỹ

Kojic acid Sigma Chemical Co Mỹ

17; HPD-100; D-101; DM-301 Xilong Trung Quốc

Thiết bị đo

Máy quang phổ Thermo Scientific - Genesys 30

Máy đọc đĩa Thermo Scientific – SkanIt

Máy phá mẫu siêu âm Sonicator - Q700

Cân điện tử Sartorius – CPA224S

Máy đo độ ẩm Satorius – MA 35

Cô quay chân không – RE 301W

Hệ thống lọc chân không

Phương pháp nghiên cứu

Chuẩn bị nguyên liệu

Rễ dâu được xay nhỏ và sấy khô đến độ ẩm dưới 12 % Độ ẩm của rễ khô được xác định bằng máy phân tích độ ẩm hồng ngoại sartorius MA-35 Sau đó, rễ khô của dâu tằm được bảo quản trong túi zip, đặt ở nơi khô và thoáng.

Phương pháp đo độ ẩm

Độ ẩm được xác định bằng máy đo độ ẩm Satorius MA-35

Cách tiến hành: Cân khoảng 0,1 g nguyên liệu trải thành một lớp mỏng trên đĩa nhôm, cho vào máy đo độ ẩm Nguyên liệu được sấy ở 105 o C đến khối lượng không đổi Khi màn hình máy hiện chữ END, quá trình đo kết thúc và ta đọc độ ẩm hiện trên máy

Phép đo được thực hiện 3 lần và lấy kết quả trung bình Từ độ ẩm 𝑊 %, khối lượng nguyên liệu khô (𝑚 𝑛𝑙𝑘 ) được tính theo công thức:

Quy trình chiết xuất

Điều kiện chiết tối ưu đối với rễ dâu tằm đã được khảo sát bởi nghiên cứu trước của nhóm Do đó, quy trình chiết xuất rễ dâu tằm sẽ được thực hiện lại như sau: 25 g rễ dâu tằm khô được chiết xuất bằng dung dịch nước ethanol 93 % (v/v) và tỷ lệ rắn - lỏng là 1: 6 (g/ml) Quá trình chiết xuất được thực hiện ở 45 ℃ trong 47 phút mỗi mẻ Dung dịch được lọc trong điều kiện chân không Tương tự, phần cặn sau khi lọc lại được mang đi chiết thứ hai Dịch chiết cả 2 lần được gom chung, đuổi dung môi bằng cô quay ở áp suất chân không, sau đó tiến hành đo hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase trên các mẫu cao chiết Tóm tắt quy trình chiết xuất dịch dâu tằm như sơ đồ Hình 2.1

Hình 1.10 Quy trình chiết cao tổng

Hiệu suất cao tổng được tính theo công thức:

Tỷ lệ rắn:lỏng = 1:6 (g/ml)

Dịch chiết Bã sau chiết

Tỷ lệ rắn:lỏng 1:6 (g/ml)

Trong đó: H : hiệu suất thu cao tổng (%)

𝑚 𝑐𝑎𝑜 : khối lượng cao khô thu được sau quá trình chiết (g)

𝑚 𝑛𝑙𝑘 : khối lượng nguyên liệu khô đem chiết (g)

Quy trình hấp phụ và giải hấp

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ và giải hấp của năm loại nhựa khác nhau (AB-8, ADS-17, HPD-100, D-101, DM-301) nhằm phát triển một phương pháp hiệu quả để làm giàu polyphenol trong chiết xuất dâu tằm bao gồm: khảo sát quá trình hấp phụ tĩnh và động, xác định thời gian cân bằng hấp phụ polyphenol bằng đường cong đẳng nhiệt, xác định dung môi và thể tích giải hấp, xác định loại nhựa hấp phụ để chuyển sang giải hấp và hấp phụ động Phần rửa giải thu được thông qua quá trình hấp phụ động sẽ được xác định hàm lượng polyphenol tổng và xem xét khả năng ức chế enzym tyrosinase của dịch chiết Quá trình khảo sát được tiến hành như sau:

2.3.4.1 Khảo sát điều kiện hấp phụ tĩnh và giải hấp

Tiền xử lý hạt nhựa macroporous

Theo phương pháp của Dong và các cộng sự [27], quá trình tiền xử lý của nhựa macroporous được thực hiện với một số sửa đổi Đầu tiên hạt nhựa được ngâm trong ethanol tuyệt đối trong vòng 24 giờ để loại bỏ các monomer và tác nhân gây độc tố bị mắc kẹt bên trong các lỗ xốp trong quá trình tổng hợp, sau đó rửa nhiều lần bằng nước khử ion để loại bỏ hoàn toàn ethanol Kế tiếp, nhựa macroporous được ngâm trong NaOH 1,0 M trong 6 giờ, và rửa bằng nước khử ion trước khi tiếp tục ngâm trong HCl 1,0 M trong 6 giờ Sau khi ngâm trong HCl, nhựa được rửa bằng nước khử ion Cuối cùng, tất cả các loại nhựa được sấy khô ở 60 °C để đạt trọng lượng không đổi trước khi sử dụng

Lựa chọn dung môi để pha loãng dịch chiết

11 loại dung môi được chọn để khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết rễ dâu tằm bao gồm: H2O, EtOH 20%, EtOH 40%, EtOH 60%, EtOH 80%, EtOH 90%, EtOH

99,5 %, ethyl acetate, acetone, propanol, isopropanol Hỗn hợp gồm 0,1 g dịch chiết và

10 ml dung môi được khuấy trong nhiệt độ phòng (30 o C) trong vòng 10 phút Quan sát hiện tượng và so sánh với nhau để chọn dung môi pha loãng phù hợp

Thời gian đạt cân bằng hấp phụ

Nhựa sau xử lý (2 g, trọng lượng khô) và dung dịch mẫu (50 ml; 0,5 g chiết xuất) với nồng độ 2,25 mg GAE / ml được đưa vào bình erlenmeyer để thu được đường cong động học hấp phụ của polyphenol trên nhựa Bình được lắc ở nhiệt độ phòng (30 o C) trong 360 phút với tốc độ 150 vòng/ phút Sau mỗi thời điểm 10, 20, 40, 50, 60, 90, 120,

240 và 360 phút, lấy 1,5 ml mẫu và xác định hàm lượng polyphenol của mỗi mẫu Sau một thời gian hấp phụ, khả năng hấp phụ của hạt nhựa đạt cực đại Dựa vào quá trình khảo sát để xây dựng đường cong động học hấp phụ để xác định thời gian cân bằng cho quá trình hấp phụ và giải hấp phụ

Lựa chọn nhựa hấp phụ macroporous

Quá trình hấp phụ tĩnh được thực hiện để kiểm tra tỷ lệ hấp phụ và giải hấp phụ của polyphenol trong dịch chiết với năm loại nhựa macroporous (AB-8, ADS-17, HPD-

100, D-101, DM-301) Nhựa khô sau xử lý (2 g) và dịch chiết rễ cây dâu tằm (50 ml; 2,02 mg GAE/ml) được thêm vào bình erlenmeyer đặt ở nhiệt độ phòng (30 o C), lắc trong thời gian cân bằng hấp phụ (150 vòng/phút)

Sau khi hạt nhựa đạt tới trạng thái cân bằng hấp phụ sẽ được tráng bằng nước khử ion Quá trình giải hấp được thực hiện trong 50 ml dung dịch nước ethanol 90 % v/v khuấy trong khoảng thời gian đạt cân bằng hấp phụ được khảo sát ở phần 2.3.4.1 mục c (150 vòng/phút) Toàn bộ quá trình được thực hiện 3 lần đối mỗi mỗi loại nhựa

Khả năng hấp phụ, tỷ lệ hấp phụ và tỷ lệ giải hấp được tính theo công thức:

Qe : khả năng hấp phụ của hạt nhựa ở trạng thái cân bằng (mg GAE/g nhựa khô)

E : là tỷ lệ hấp phụ (%)

Vi : là thể tích dung môi ban đầu (ml)

Co, Ce : nồng độ polyphenol ban đầu và sau khi đạt trạng thái cân bằng hấp phụ (mg/ml)

Cd : nồng độ polyphenol trong dung dịch giải hấp (mg/ml)

Vd : Thể tích dung môi giải hấp (ml)

Lựa chọn dung môi giải hấp

Quy trình hấp phụ được tiến hành tương tự như đã mô tả ở trên (2.3.4.1 mục d) Sau đó, tỷ lệ giải hấp phụ của phenol trên loại nhựa được lựa chọn theo phần 2.3.4.1.c được khảo sát bằng cách sử dụng các dung môi giải hấp khác nhau (nước, EtOH 10 %, EtOH 20 %, EtOH 30 %, EtOH 40 %, EtOH 50 %, EtOH 60 %, EtOH 70 %, EtOH 80

Các thí nghiệm được thực hiện 3 lần và tính được kết quả trung bình đối với mỗi dung môi giải hấp Phương trình tại 2.3.4.1 mục d được sử dụng để tính toán tỷ lệ giải hấp từ đó lựa chọn dung môi giải hấp thích hợp

2.3.4.2 Khảo sát động học quá trình hấp phụ và giải hấp

Quá trình hấp phụ động sẽ được khảo sát tiếp theo dựa trên loại nhựa đã được lựa chọn Sau khi hấp phụ, hạt nhựa sau đó sẽ được tiếp tục giải hấp để thu dịch chiết phân đoạn Dịch chiết phân đoạn sẽ được mang đi đánh giá hàm lượng polyphenol và khả năng ức chế enzyme tyrosinase Quy trình được thực hiện theo các bước sau: a) Lựa chọn thể tích rửa giải

Các thí nghiệm hấp phụ giải hấp phụ động được thực hiện trong một cột thủy tinh (dài 30 cm và đường kính 2,5 cm) chứa đầy hạt nhựa (15 g) Thể tích hạt nhựa (Vhn) là 80 ml Dịch chiết dâu tằm 3,75 g/ml (10,63 mg GAE/ml) được cho vào cột với tốc độ dòng 2,5 ml/phút Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng (30 o C) Cột nhựa sau đó được rửa ở chế độ rửa giải gradient bằng nước cất và ethanol với nồng độ 10,

20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 99,5 % (v/v) ở tốc độ dòng quy định là 2,5 ml/phút Trong quá trình giải hấp, thể tích rửa giải của mỗi phần sau đó được xác định bằng sự thay đổi màu sắc bằng việc phản ứng với FeCl3 (màu nâu lục cho thấy sự có mặt của các hợp chất phenol) b) Hấp phụ và giải hấp phụ bằng sắc ký cột

Sắc ký cột tinh chế polyphenol trên hạt nhựa macroporous (15 g hạt nhựa khô; thể tích hạt nhựa 80 ml) được tiến hành bằng cách sử dụng cột thủy tinh (2,5 cm x 30 cm) 80 ml dịch chiết thô từ rễ cây dâu tằm (10,63 mg GAE/ml) được cho vào cột và giữ ở nhiệt độ phòng (30 °C) theo thời gian cân bằng hấp phụ đã khảo sát ở phần 2.3.4.1 mục c để đạt được trạng thái cân bằng hấp phụ Sau khi hấp phụ, quá trình giải hấp được tiến hành tại các nồng độ khác nhau của ethanol (0 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %,

60 %, 70 %, 80 %, 90 % và 99,5 %) Tốc độ dòng của pha động được giữ không đổi ở 2,5 ml/phút và thể tích rửa giải được tiến hành như kết quả của phần trước Phần thu được sau đó được cô đặc bằng thiết bị cô quay c) Đánh giá định tính bằng sắc ký bản mỏng

Phân tích sắc ký được thực hiện bằng cách sử dụng dịch chiết ban đầu và các phân đoạn làm giàu của rễ cây dâu tằm Thí nghiệm này được thực hiện trên silica gel

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.3.5.1 Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase

Quy trình đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase được thực hiện theo phương pháp của Narisa Kamkaen và các cộng sự (năm 2007) [28] a) Nguyên tắc

Khi có mặt enzyme tyrosinase, L-DOPA sẽ bị oxy hóa thành dopachrome có màu, bước sóng hấp thu cực đại tại 475 nm Khi có mặt chất ức chế tyrosinase, lượng dopachrome sinh ra sẽ giảm xuống Do đó màu cũng sẽ giảm xuống phụ thuộc vào nồng độ thử của mẫu Độ hấp thu mẫu đo ở bước sóng 475 nm để xác định % ức chế enzyme tyrosinase của mẫu theo nồng độ Kojic acid được dùng làm chất đối chiếu b) Quy trình đo

- Chuẩn bị: enzyme tyrosinase 200 U/ml và cơ chất L-DOPA 0,80 mM hòa tan trong đệm sodium phosphate 0,1 M (pH 6,8) Mẫu đo và chất chuẩn hòa tan trong DMSO

5 % thành các nồng độ khác nhau

- Đo mẫu: Hỗn hợp 40 àL tyrosinase và 240 àL mẫu tạo thành dung dịch mẫu cú enzyme Dung dịch mẫu khụng cú enzyme thỡ 40 àL tyrosinase thay bằng 40 àL đệm phosphate Song song đó, ta thực hiện thao tác tương tự với dung dịch mẫu trắng có và khụng cú enzyme trong đú mẫu 240 àL mẫu thay bằng 240 àL DMSO 5 % Để hỗn hợp phản ứng trong 10 phỳt, sau đú thờm vào 40 àL dung dịch L-DOPA vào tất cả các mẫu, tiếp tục ủ ở 25 o C trong 10 phút Sự giảm màu của dopachrome được đo ở 475 nm

- Đo chất chuẩn kojic acid thực hiện quy trình như trên tại các nồng độ 4; 6; 8; 9; 10; 12; 15 àg/ml Đường chuẩn kojic acid được thể hiện trờn Hỡnh 2.3

Hình 1.11 Quy trình thực hiện đo tyrosinase Bảng 1.3 Thông số đo tyrosinase

Kết quả % ức chế được tính theo công thức:

Phản ứng 40𝜇𝐿 enzyme 200U/ml Ủ 40𝜇𝐿 L-dopa 0,8 mM Đo mật độ quang

Hình 1.12 Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của kojic acid

2.3.5.2 Hoạt tính kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa được khảo sát theo phương pháp kháng gốc tự do DPPH DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền được tìm ra lần dầu tiên bởi Goldschmidt và Renn vào năm 1922 [29] Gốc tự do DPPH có màu tím, không tan trong nước, tan trong một số dung môi hữu cơ, sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazine (DPPH-H) có màu vàng cam

Trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng oxy hóa được khảo sát theo phương pháp của Sharma (2009) [30] a) Nguyên tắc

Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng 517 nm, màu của dung dịch phản ứng nhạt dần và chuyển từ màu tím sang vàng nhạt Giá trị mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do càng cao b) Quy trình

Chuẩn bị dung dịch DPPH 30 àg/ml trong methanol 80 % sao cho OD = 0,7 ± 0,2

Chuẩn bị dung dịch cao chiết ở cỏc nồng độ từ 0 – 1000 àg/ml

Mẫu chứng dương vitamin C chuẩn bị ở nồng độ 0 -10 àg/ml trong methanol 80

Cách tiến hành thử nghiệm:

- Cho 120 àL dung dịch cao chiết vào 180 μL dung dịch DPPH, lắc đều và ủ 30 phút trong phòng tối ở 25 o C và đo mật độ quang ở bước sóng 517 nm

- Mẫu trắng được thực hiện với 120 μL methanol 80 % và 180 μL dung dịch DPPH

- Chứng dương được thực hiện với 120 àL vitamin C và 180 μL dung dịch DPPH

- Mẫu đo màu của cao chiết được thực hiện với 120 μL dung dịch cao chiết và 180 μL methanol 80 % (Hình 2.4)

Phần trăm ức chế gốc tự do được tính theo công thức:

Trong đó: 𝐴 𝑏 : Mật độ quang của mẫu trắng

𝐴 𝑠 : Mật độ quang của mẫu

𝐴 𝑐 : Mật độ quang của mẫu “color”

Hình 1.13 Hoạt tính ức chế DPPH của ascorbic acid

2.3.5.3 Định lượng hàm lượng polyphenol tổng a) Nguyên tắc Định lượng polyphenol tổng theo phương pháp Folin – Ciocalteau được mô tả bởi Singlenton và Rossi năm 1999 Sự trao đổi điện tử trong môi trường kiềm của hợp chất phenolic bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin – Ciocalteau sẽ tạo thành hợp chất có màu xanh (molydenium) Đo độ hấp thu ở bước sóng 760 nm kết hợp với đồ thị đường chuẩn theo gallic acid, tính được hàm lượng tổng các hợp chất phenolic có trong mẫu phân tích [31] b) Phương pháp tiến hành

Chuẩn bị các dung dịch sau:

Dung dịch Na2CO3 20 %: 20 g Na2CO3 được khuấy với 80 ml H2O cất Dung dịch gallic acid 1 mg/ml: hòa tan 10 mg acid gallic trong 1 ml DMSO 100%, sau đó định mức lên 10 ml bằng nước cất Từ dung dịch trên pha ra các dung dịch có nồng độ sau bằng nước cất: 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 và 0,1 (mg/ml)

Lập đường chuẩn : Cho 200 μL thuốc thử Folin – Ciocalteau vào 40 μL dung dịch gallic acid ở các nồng độ khác nhau, đồng nhất bằng bể lắc siêu âm trong 5 phút nhiệt độ phòng Thêm 600 μL dung dịch Na2CO3 20 % và 3160 μL nước cất vào hỗn hợp trên, tiếp tục đồng nhất bằng siêu âm trong 30 phút cũng ở nhiệt độ phòng Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng λ = 760 nm Lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ, lấy giá trị trung bình Đo mẫu : Hòa tan 10 mg cao chiết trong 1 ml DMSO 100 %, sau đó pha ra các nồng độ phù hợp để thu được độ hấp thu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn acid gallic Tiến hành đo mẫu tương tự như bước dựng đường chuẩn Lặp lại ba lần cho mỗi mẫu cao, lấy giá trị trung bình

Ghi nhận các giá trị độ hấp thu của mẫu và tính toán hàm lượng ước lượng của polyphenol tổng có trong mẫu theo công thức:

𝑚 Trong đó: TPC (mg GAE/g cao): khối lượng polyphenol tổng tính trên 1 g cao

𝑣: thể tích mẫu (ml) 𝑚: hàm lượng mẫu GAE (mg/L) GAE (mg/L) chính là giá trị x trong công thức đường chuẩn gallic acid (Hình 2.5), được tính bằng công thức thay độ hấp thu của mẫu vào giá trị y

Hình 1.14 Đường chuẩn galic acid

Thử nghiệm phối trộn công thức nền serum và công thức dịch chiết

a) Quy trình xây dựng công thức chế phẩm dịch chiết

Quy trình phối trộn chế phẩm dịch chiết dâu tằm được thực hiện như sau:

Cao rắn được khuấy trong dung môi cho đến khi phân tán hoàn toàn vào trong dung môi Sau đó chất hoạt động bề mặt được thêm vào để phân tán hoàn toàn cao chiết, giúp hệ ổn định và bền hơn Sau cùng chất bảo quản được thêm vào và khuấy từ từ cho đến khi đạt được một hệ đồng nhất b) Quy trình xây dựng công thức nền serum

Công thức pha trộn nền serum được đề xuất theo quy trình sau:

• Đầu tiên, cân chất tạo gel rồi thêm từ từ vào nước cất và ngâm trong khoảng 5 phút

• Bước 2: Khuấy hỗn hợp trên với máy khuấy ở tốc độ 300 rpm cho đến khi quan sát thấy hệ đồng nhất rồi từ từ giảm tốc độ về 200 rpm, đồng thời thêm chất điều chỉnh độ pH để chất tạo gel trương nở hoàn toàn

• Bước 3: Thêm các chất dưỡng ẩm và bảo quản

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả định danh thực vật

Kết quả định danh được thực hiện bởi TS Đặng Lê Anh Tuấn thuộc Bộ môn Sinh học và Công nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM xác định tên khoa học của cây dâu tằm là Morus alba L Quá trình định danh bằng phương pháp vi phẫu các bộ phận: rễ, thân và lá dâu tằm cũng được thực hiện dưới sự hỗ trợ của các giảng viên trường Đại học Nguyễn Tất Thành (Phụ lục 1).

Quy trình chiết xuất

Rễ dâu tằm 1,5 năm tuổi được thu hoạch tại Lâm Đồng vào tháng 2 năm 2020

Rễ dâu tằm nghiền nhỏ và sấy khô đến khi đạt độ ẩm dưới 12 % Sự thay đổi hình thái trước và sau khi chế biến được thể hiện trong Hình 3.1

Hình 3.1 Rễ dâu tằm a Sau khi thu hoạch b Sau khi nghiền

Bột rễ khô (25 g) được ngâm với dung dịch nước ethanol 93 % (v/v), tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:6 g/ml Hỗn hợp được khuấy và gia nhiệt ở 45 ℃ trong 47 phút Dịch chiết sau đó được lọc trong điều kiện chân không thu được dịch chiết lần 1 và cặn lọc rắn sau khi chiết lần 1; theo cách tương tự, quá trình chiết được tiến hành lại lần thứ hai với cặn lọc lần 1 Dịch chiết lần 1 và lần 2 sau đó được trộn lẫn nhằm đạt trạng thái không đổi Cuối cùng, dịch chiết tổng sẽ được tiến hành đuổi dung môi bằng cô quay chân không (Hình 3.2) a) b)

Hình 3.2 Cao chiết rễ dâu tằm

Bảng 3.1 Các đặc tính của chiết xuất dâu tằm

Khối lượng cao chiết (g) Độ ẩm của cao chiết (% cao ướt – w.b.)

Hiệu suất chiết (% w/w – cao chiết khô/khối lượng thô)

Giá trị ức chế tyrosinase IC 50

Hiệu suất chiết cao, hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính kháng enzyme tyrosinase (IC50) được minh họa trong Bảng 3.1 Kết quả cũng cho thấy hàm lượng polyphenol tổng trong dịch chiết từ rễ cây dâu tằm là 226,70 mg GAE/g cao khô.

Khảo sát điều kiện của quá trình hấp phụ và giải hấp tĩnh

Lựa chọn dung môi pha loãng dịch chiết

Theo Wang và các cộng sự, dung môi phù hợp để pha loãng chiết xuất cây dâu tằm phụ thuộc vào nguyên liệu thực vật cụ thể và các hợp chất được phân lập [32] Do đó, trong nghiên cứu này, hiệu quả pha loãng của các dung môi khác nhau (H2O, EtOH

20 %, EtOH 40 %, EtOH 60 %, EtOH 80 %, EtOH 90 %, EtOH 99,5 %, ethyl acetate, acetone, propanol, isopropanol) để hòa tan các hợp chất phenolic trong chiết xuất rễ cây dâu tằm đã được kiểm tra Bảng 3.2 cho thấy sự khác biệt đáng kể về độ pha loãng của dịch chiết khi sử dụng 10 dung môi

Bảng 3.2 Khả năng hòa tan của cao chiết rễ dâu tằm trong các dung môi khác nhau

Quan sát hiện tượng và Kết luận

H2O EtOH 20 % EtOH 40 % EtOH 60 % EtOH 80 % EtOH 90 %

Rất ít tan Rất ít tan Ít tan Ít tan Ít tan Hòa tan hoàn toàn

Quan sát hiện tượng và Kết luận (tiếp theo)

EtOH 99,5 % Acetone Propanol Isopropanol Ethyl acetate

Hòa tan, có ánh mờ

Hòa tan, có ánh mờ

Hòa tan, có ánh mờ

Hòa tan, có ánh mờ Dựa vào Bảng 3.2, có 3 hiện tượng chính xảy ra khi pha loãng cao chiết:

- H2O, EtOH 20 %, EtOH 40 %, EtOH 60 %: cao chiết hòa tan một phần trong các dung môi này

- EtOH 80 %, ethyl acetate, acetone, propanol, isopropanol: các dung môi này cho độ tan tốt nhưng cao chiết không tan hết

- EtOH 90%, EtOH 99,5%: cao chiết hòa tan hoàn toàn trong các dung môi này Kết quả đã chứng minh rằng các dung môi phân cực như hỗn hợp nước:ethanol có nồng độ ethanol cao (EtOH 90 %, EtOH 99,5 %) có thể hòa tan hiệu quả các hợp chất phenolic trong khi các dung môi phân cực yếu không thể pha loãng hoàn toàn các polyphenol

Mặt khác, dung môi EtOH 80%, ethyl acetate, acetone, propanol, isopropanol hòa tan không hoàn toàn cao chiết dẫn đến trong hỗn hợp còn chứa nhiều hạt kích thước nhỏ không tan Chúng có thể di chuyển đến lỗ rỗng của nhựa macroporous và mắc kẹt trong đó, điều này làm hạn chế quá trình tinh chế polyphenol Do đó, các dung môi này không thể pha loãng hiệu quả như EtOH Trong số các dung môi được thử nghiệm, ethanol 90% được coi là dung môi thích hợp nhất để hòa tan các hợp chất phenolic trong dịch chiết dâu tằm và do đó, nó được chọn để tiến hành tiếp ở các thí nghiệm tiếp theo.

Lựa chọn thời gian cân bằng hấp phụ

Nghiên cứu hấp phụ polyphenol trong dịch chiết rễ đã được thực hiện bằng cách sử dụng nhựa hấp phụ Trong thí nghiệm này, mỗi loại nhựa hấp phụ (2 g) và một thể tích xác định trước (50 ml) của dung dịch chiết xuất (2,25 mg GAE/ml) được đặt vào trong tủ ấm lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (30 ℃) Các mẫu được tiến hành trong các khoảng thời gian cụ thể trong các mốc thời gian 10, 20, 40, 50, 60, 90,

120, 240 và 360 phút để xác định nồng độ cân bằng Đường cong động học hấp phụ của 5 loại nhựa được thể hiện trên Hình 3.3, quá trình hấp phụ của 5 loại nhựa trải qua 3 giai đoạn là hấp phụ nhanh, hấp phụ chậm và cân bằng Ở giai đoạn hấp phụ nhanh, khả năng hấp phụ của nhựa là tuyến tính và nhanh chóng trong 50 phút đầu tiên Sự hấp phụ của các loại nhựa AB-8, HPD-100 và DM-

301 nhanh hơn so với các loại nhựa khác Trong giai đoạn đầu, polyphenol dường như gắn nhanh vào bề mặt nhựa trước khi khuếch tán vào các lỗ xốp Tuy nhiên, cấu trúc phức tạp đã ngăn cản phân tử polyphenol di chuyển vào nhựa Kết quả là, quá trình hấp phụ trở nên chậm hơn và trải qua giai đoạn tiệm cận

Tốc độ hấp phụ của tất cả các loại nhựa tăng nhẹ trong giai đoạn thứ hai (từ 50 phút đến 120 phút), cuối cùng đạt được trạng thái cân bằng sau 120 phút

Hình 3.3 Đường cong động học hấp phụ của 5 loại nhựa theo thời gian (phút)

Dựa trên đường cong động học hấp phụ, thời gian hấp phụ được lựa chọn là 120 phút Trên giá trị này, sự gia tăng đáng kể thời gian hấp phụ chỉ cải thiện một lượng nhỏ không đáng kể Chẳng hạn, khi khoảng thời gian tăng từ 120 lên 180 phút, hiệu suất DM-301 chỉ thay đổi nhẹ 2 %, từ 69 lên 71 %.

Lựa chọn nhựa macroporous

Trong nghiên cứu này, năm loại nhựa (2 g nhựa khô) được phân tán vào 50 ml dung dịch chiết xuất (2,02 mg GAE/ml) ở nhiệt độ phòng (30 ℃) Do thực tế là các polyphenol chứa các vòng benzen và các nhóm hydro có thể có các cực khác nhau, năm loại nhựa đã được sàng lọc về khả năng hấp phụ và giải hấp các hợp chất phenolic từ chiết xuất dâu tằm trong Hình 3.4

Hình 3.4 Khả năng hấp phụ và giải hấp phụ của polyphenol trên 5 loại nhựa Bảng 3.3 Tỷ lệ/khả năng hấp phụ và giải hấp phụ của năm loại nhựa

Tên nhựa Tỷ lệ hấp phụ

Khả năng hấp phụ (mg GAE/ g dịch chiết)

Khả năng giải hấp (mg GAE/ g dịch chiết)

Như có thể thấy từ Hình 3.4 và Bảng 3.3, năm loại nhựa macroporous thể hiện khả năng hấp phụ hợp chất phenolic và giải hấp phụ khác nhau Nhựa DM-301 cho khả

% Giải hấp năng hấp phụ các hợp chất phenolic tốt nhất là 79,2 % Kết quả này đặc biệt cao hơn so với các loại nhựa khác là AB-8, HPD-100, D-101 (lần lượt là 67,6 %; 68,8 %; 67,7 %) Trong số các loại nhựa hấp phụ macroporous, hầu hết tất cả các loại nhựa đều có khả năng hấp phụ khá tốt, trong khi chỉ có ADS-17 cho thấy hiệu suất kém hơn so với các loại nhựa khác (63,3 %)

Khả năng giải hấp cũng có xu hướng tương tự với hấp phụ, ngoại trừ HPD-100 Để có hiệu quả tinh chế, các hợp chất phenolic được hấp phụ phải dễ dàng giải hấp trong các điều kiện thích hợp Nhựa macroporous DM-301 vẫn cho thấy tỷ lệ giải hấp cao nhất với tỷ lệ 70%, tiếp theo là AB-8 và D-101 (63,6% cho AB-8 và 62,6% cho D- 101), trong khi tỷ lệ giải hấp ở các loại nhựa khác thấp hơn một chút (57,5% đối với HPD-100 và 51,8% đối với ADS-17)

Theo Li và các cộng sự [33] và Yang cùng các cộng sự [34], khả năng hấp phụ phụ thuộc vào tính chất hóa học và vật lý của nhựa, chẳng hạn như lực tương tác, độ phân cực bề mặt, kích thước hạt và diện tích bề mặt, là một trong những yếu tố quan trọng nhất Các tính chất chính của nhựa macroporous được thể hiện trong Bảng 3.4

Bảng 3.4 Tính chất của năm loại nhựa [35, 36]

Kích thước lỗ xốp trung bình (Å)

Khả năng phân cực Cấu trúc

ADS – 17 90 – 150 0.3 – 1.25 250 – 300 Phân cực trung bình

DM-301 330 – 380 0.3 – 1.25 90 – 110 Phân cực trung bình

Như thể hiện trong Hình 3.4 và Bảng 3.4, DM-301 có độ phân cực trung bình thể hiện khả năng hấp phụ và hệ số giải hấp cao nhất so với các loại nhựa khác Một số yếu tố có thể được đề cập để giải thích những kết quả này:

Xét về độ phân cực, nhựa phân cực yếu (AB - 8) hoặc nhựa không phân cực (HPD - 100 và D - 101) cho khả năng hấp phụ tương đương nhau (67,6 % đối với nhựa AB-8; 68,8 % đối với nhựa HPD - 100; 67,7 % đối với nhựa D - 101) Đối với các chất hấp phụ phân cực trung bình như DM-301 và ADS-17 thì DM-301 lại thể hiện khả năng hấp phụ tốt nhất, trong khi ADS-17 cho hiệu suất kém nhất Do đó, có thể kết luận rằng các yếu tố khác cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm, bên cạnh sự phân cực

Ngoài ra khi nhận xét sự tương quan giữa kích thước lỗ xốp, diện tích bề mặt với khả năng hấp phụ và giải hấp của các loại nhựa có thể thấy rằng:

- Kết quả hấp phụ và giải hấp tốt nhất (lần lượt là 79,2 và 70,0 %) được thể hiện ở nhựa DM-301 với kích thước lỗ xốp 90 - 110 Å và diện tích bề mặt 330 – 380 m 2 /g nằm trong khoảng trung bình so với các loại nhựa đang khảo sát

- Ngoài ra, thông qua khảo sát cũng cho thấy với diện tích bề mặt nhỏ, kích thước lỗ xốp lớn, điển hình là nhựa ADS-17 (diện tích bề mặt 90-150 m 2 /g, và kích thước lỗ xốp 250 – 300 Å) thì khả năng hấp phụ và giải hấp là kém nhất trong các loại nhựa

- Cuối cùng, các loại nhựa với diện tích bề mặt nằm trong khoảng từ 480 – 550 m 2 /g (nhựa AB-8, HPD-100 và D-101) thì cho khả năng hấp phụ và giải hấp tương đương nhau

Kết hợp những kết quả nhận xét trên cho thấy có thể kích thước phân tử của nhóm phenolic trong dịch chiết rễ dâu tằm nằm trải rộng trong khoảng giống với kích thước lỗ xốp của nhựa DM-301 hoặc lớn hơn

Tóm lại, nhựa DM-301 được xác định là loại nhựa tốt nhất để làm giàu polyphenol từ dịch chiết rễ dâu tằm, do tính chất hấp phụ và giải hấp phụ tốt nhất.

Lựa chọn dung môi giải hấp

Chất rửa giải trong quá trình giải hấp phụ là một yếu tố quan trọng và tỷ lệ giải hấp phụ của phenolic trên tất cả các loại nhựa được chọn, sử dụng các dung môi giải hấp phụ khác nhau (nước, EtOH 10 %, EtOH 20 %, EtOH 30 %, EtOH 40 %, EtOH 50%, EtOH 60 %, EtOH 70 %, EtOH 80 %, EtOH 90 %, EtOH 99,5 %) được thể hiện trong Hình 3.5

Hình 3.5 Tỷ lệ giải hấp với các nồng độ khác nhau của EtOH

Kết quả theo Hình 3.5 cho thấy hiệu suất giải hấp của polyphenol tăng lên khi tăng nồng độ ethanol Không phải tất cả các dung môi giải hấp được sử dụng đều cho thấy hiệu quả giải hấp tốt Trong mẫu dịch chiết thu được sau khi giải hấp với dung môi có tỷ lệ ethanol thấp từ 0 % đến 20 % ethanol cho thấy hiệu suất giải hấp thấp (9,8% đối với dung môi chỉ có nước; 15,59 % đối với EtOH 10 %; 21,55 % đối với EtOH 20

%) Trong phạm vi tăng dần ethanol từ 30 % đến 60 %, hiệu suất giải hấp tăng nhẹ từ 31,92 % lên 40,02 % và đặc biệt hiệu suất giải hấp trên 50 % đối với các dung dịch ethanol 70 %, 80 %, 90 % và 99,5 % (lần lượt là 51,18 %; 54,95 %; 69,78 % và 70,04

%) Từ khảo sát trên có thể rút ra được với dung dịch Nước:EtOH (v/v) trong khoảng

70 – 99,5 % cho hiệu quả tốt hơn trong quá trình giải hấp các hợp chất phenolic

Hi ệ u s u ất gi ải h ấp Po ly p h en o l s au kh i l àm gi àu (%)

Tuy nhiên, hiệu quả rửa giải là tốt nhất khi 90 % và 99,5 % ethanol được sử dụng làm chất rửa giải Khi tính đến việc tiết kiệm chi phí, 90 % ethanol đã được chọn làm chất rửa giải thích hợp.

Sắc ký cột

Lựa chọn phân đoạn thể tích rửa giải

Quá trình hấp phụ động được thực hiện trong cột thủy tinh được nhồi bằng nhựa DM-301 (15 g, khối lượng khô) Thể tích hạt nhựa (BV) là khoảng 80 ml Dung dịch mẫu được nạp cẩn thận vào cột nhựa với tốc độ dòng chảy 2,5 ml/phút Nhiệt độ được duy trì ở nhiệt độ phòng

Trong quá trình giải hấp phụ động, các phân đoạn sau giải hấp được khảo sát bằng các thí nghiệm phản ứng với FeCl3 Thuốc thử này sẽ khiến dung dịch chuyển sang màu xanh dưới sự có mặt của nhóm phenolic, màu sắc càng đậm chứng tỏ sự xuất hiện của nhóm này càng nhiều (Bảng 3.5)

Bảng 3.5 Giải hấp phụ động với nhựa DM-301

Thể tích dung dịch rửa giải

Phản ứng với thuốc thử

Khối lượng sản phẩm thu hồi (g) Bắt đầu đoạn

Như thể hiện trong Bảng 3.5, khi tăng nồng độ ethanol thì khả năng giải hấp phụ cũng có xu hướng tăng Điều này được giải thích dưới sự khác biệt về màu sắc của thuốc thử FeCl3 Ở nồng độ ethanol cao hơn, thuốc thử chuyển cũng sang màu xanh đậm hơn Điều này là do số lượng hợp chất phenolic tạo phức với FeCl3 nhiều hơn Cụ thể:

- Xét theo chiều tăng dần nồng độ Ethanol có thể thấy được, ở các phân đoạn nước, ethanol 10 %, 20 %, 30 %, 40 % hàm lượng polyphenol chưa nhiều do đó màu sắc của dung dịch chỉ dừng ở mức thay đổi sang màu vàng đậm (do polyphenol tạo phức với thuốc thử FeCl3) Tuy nhiên khi chuyển sang phân đoạn ethanol từ

50 – 90 %, hàm lượng polyphenol đã tăng rõ rệt do có sự chuyển đổi màu của dung dịch sang màu xanh đậm dưới tác dụng của thuốc thử Và ở đoạn cuối cùng, rửa giải với ethanol 99,5 %, vẫn còn một lượng nhỏ polyphenol còn sót lại với sự xuất hiện của màu xanh nhạt hơn ở đoạn này

- Xét theo từng phân đoạn riêng lẻ, 1 BV là thể tích giải hấp tối đa cho các đoạn từ 0% EtOH – 40% EtOH, điều này được kết luận do khi bắt đầu phân đoạn, thuốc thử có khiến dung dịch thay đổi màu sắc nhẹ (màu vàng đậm), tuy nhiên khi kết thúc phân đoạn sau 1 BV thể tích thì dung dịch không còn bị thay đổi màu sắc bởi thuốc thử do dung môi đã đạt trạng thái rửa giải tối đa ở nồng độ này Đối với các đoạn từ 50 – 99,5 % EtOH, dung dịch vẫn còn màu xanh rất đậm khi kết thúc hết 1 BV thể tích Do đó quá trình rửa giải tiếp tục được tiến hành thêm với 1 BV thể tích để có thể thu hồi thêm lượng polyphenol trong dung dịch Quá trình rửa giải kết thúc ở thể tích tổng là 3 BV, sau 3 lần rửa giải thì dung môi thu được cũng không còn chuyển đổi màu sắc do dung môi không còn rửa giải thêm được lượng polyphenol

Kết luận, thể tích dung dịch giải hấp được chọn là 3 BV Ở điều kiện trên, dịch rửa giải ethanol 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % và 99,5 % (v/v) được thu và cô để thu được sản phẩm tinh chế.

Đánh giá hàm lượng polyphenol tổng

Hàm lượng polyphenol trong các phân đoạn rửa giải khác nhau được thể hiện như trong Hình 3.6 bên dưới

Hình 3.6 Hàm lượng polyphenol tổng số của các phân đoạn rửa giải bằng ethanol

Như thể hiện trong Hình 3.6, hàm lượng polyphenol cao nhất (669,18 mg GAE/g dịch chiết khô) thu được ở phân đoạn rửa giải bằng dung dịch ethanol 60 % Giá trị này cao gấp ba lần so với cao tổng trước khi làm giàu (226,70 ± 8,20 mg GAE/g cao khô), tiếp theo là hàm lượng polyphenol trong dung dịch ethanol 70%, 80% và 50% (lần lượt

Weight yield là 475,85, 396,52 và 207,99 mg GAE/g cao khô) Hơn 90% hợp chất phenolic đã được phân lập trong các phân đoạn ethanol 50%, 60%, 70% và 80% Trong khi tổng hàm lượng polyphenol trong dung dịch rửa giải ethanol 0 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 90 % và 99,5 % thấp hơn nhiều Tóm lại, sáu phân đoạn rửa giải với dung dịch ethanol 50 %,

60 %, 70 %, 80 %, 90 % và 99,5 % (v/v) đã được chọn để tinh chế polyphenol trong dịch chiết rễ dâu tằm

Theo dữ liệu, lượng cao thu được sau khi làm giàu cùng cho xu hướng tương tự như trong khảo sát thể tích rửa giải ở mục 3.3.1 Lượng polyphenol thu được trong phân đoạn rửa giải với ethanol 60 % là cao nhất (28,80 % w/w), tiếp theo là phần 70 và 80 % (lần lượt là 16,27 và 11,47 %) Ngược lại, chỉ một lượng nhỏ được thu thập từ các phần khác.

Đánh giá định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Phân tích sắc ký được thực hiện bằng cách sử dụng dịch chiết ban đầu (I) và sáu đoạn được làm giàu (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % và 99,5 % v/v rửa giải bằng ethanol) của dâu tằm, trên các bản TLC silica gel 60 F254, sử dụng hệ dung môi, bao gồm hexan: ethyl acetate: acetic acid, 5:5:0,1 (v/v/v) a b c

Hình 3.7 Trực quan hóa sắc ký của các phân số được làm giàu a Tia UV – 254 nm b Tia UV – 365 nm c Thuốc thử FeCl 3

Việc so sánh các dấu vết giữa dịch chiết ban đầu và các phân đoạn được làm giàu đã xác nhận sự hiện diện và sự phân tách của các hợp chất phenolic xuất hiện tại các vệt màu nâu đỏ Như minh họa trong Hình 3.7, có thể quan sát thấy rằng các phân đoạn ethanol 60 %, 70 % và 80 % có độ hấp thụ của các hợp chất ở cường độ khá cao so với các loại khác Điều này chứng minh rõ ràng rằng ba phân đoạn 60 %, 70 % và 80 % chứa một lượng lớn các hợp chất phenolic.

Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase

Dịch rửa giải thu được sau quá trình giải hấp phụ động được đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase Kết quả được thể hiện như trong Hình 3.8

Hình 3.8 Giá trị IC 50 của chứng dương kojic acid, dịch chiết ban đầu và các phân đoạn tinh chế

Kết quả cho thấy giá trị IC50 của các phân đoạn rửa giải bằng dung dịch ethanol

90 % và 99,5 % có giá trị cao hơn chứng dương kojic acid, điều này chứng tỏ phân đoạn

90 – 99,5 không có chứa nhiều hợp chất có thể ức chế enzyme tyrosinase Tiếp theo là các phân đoạn được rửa giải bằng các dung dịch ethanol 70 %, 50 % và 80 % (Gía trị

IC50 lần lượt là 8,08 ± 0,59 àg/ml; 8,96 ± 0,55 àg/ml; 19,66 ± 0,83 àg /ml) Trong số các phân đoạn này, giá trị IC50 của dung dịch ethanol 70 % và 50 % thấp hơn một chút so với kojic acid (9,6 ± 0,5 àg/ml) Cuối cựng, khả năng ức chế enzyme tyrosinase của phõn đoạn ethanol 60 % là tốt nhất (1,38 ± 0,04 àg/ml), giảm hơn một phần tư so với dịch chiết ban đầu (1,89 ± 0,06 àg/ml), điều đú cú nghĩa là quỏ trỡnh tinh chế đó cải thiện khả năng ức chế tyrosinase Phân đoạn ethanol 60 % có hoạt tính cao hơn 7 lần so với chứng dương – kojic acid (9,6 ± 0,5 àg/ml) Đồng thời khi xem xét kết quả đo TPC (Phần 3.3.2) của các phân đoạn có thể rút ra được kết luận các đoạn từ 50 % đến 80 % ethanol cho khả năng ứng dụng vào sản phẩm mỹ phẩm có tác dụng làm trắng da Do đó, các đoạn từ 50 – 80 % ethanol được chọn làm đối tượng để thử nghiệm phối trộn vào công thức mỹ phẩm.

Xây dựng công thức mỹ phẩm chứa chiết xuất rễ dâu tằm

Xây dựng công thức chiết xuất rễ dâu tằm

Cao chiết khi được phối trực tiếp vào trong các công thức sản phẩm như kem, lotion hoặc serum thường xảy ra hiện tượng sản phẩm có kết cấu không đồng nhất vì cao chiết khó phân tán vào nền sản phẩm Do đó việc phân tán cao chiết vào trong một nền công thức ở dạng lỏng trước rồi mới phối vào trong các công thức mỹ phẩm là cần thiết để thu được sản phẩm có kết cấu đồng nhất Công thức phối chiết xuất này được thực hiện theo nghiên cứu trước của nhóm với các thành phần và hàm lượng thể hiện như trong Bảng 3.6

Bảng 3.6 Hàm lượng và công dụng của các thành phần có trong công thức chiết xuất rễ dâu tằm

Thành phần Hàm lượng Công dụng

Cao chiết dâu tằm (độ ẩm 11,28 %) (%) 20 Hoạt chất tự nhiên

Ethanol (%) 20 Dung môi trợ phân tán

Propylene glycol (%) 20 Dung môi trợ phân tán

Polysorbate 80 (%) 30 Chất trợ phân tán

Serum là một sản phẩm mỹ phẩm với công thức bao gồm nồng độ cao các hoạt chất có tác dụng với da như dưỡng ẩm, làm trắng hay chống lão hoá Với đặc tính hấp thụ các hoạt chất nhanh chóng vào các lớp sâu hơn của da, nền serum được lựa chọn để tạo ra một công thức mỹ phẩm chứa chiết xuất Mục đích của sản phẩm serum sẽ nhắm vào khả năng làm sáng da Nghiên cứu này sẽ sử dụng lại công thức nghiên cứu trước của nhóm với công thức nền được thể hiện ở Bảng 3.7 và hàm lượng chiết xuất được phối trộn vào trong nền serum này là 1,25 %

Thành phần Nồng độ Tác dụng

2 Triethanolamine (TEA) 0,1 % Chất điều chỉnh pH

3 Hyaluronic acid 0,05 % Chất dưỡng ẩm

6 Nước cất Vừa đủ Dung môi

Hình 3.9 Mẫu serum a) Mẫu nền serum b) Mẫu serum đã được bổ sung chiết xuất rễ dâu tằm

Dựa vào Hình 3.9 có thể thấy được:

- Mẫu nền serum trong suốt, đồng nhất, không màu

- Mẫu serum sau khi phối với công thức chiết xuất rễ dâu tằm đạt trạng thái trong suốt, đồng nhất, có màu vàng, pH là 6,40 (pH này phù hợp với pH của các sản phẩm dùng cho da: 4,5 – 7,0)

Luận văn “Nghiên cứu làm giàu các chất ức chế enzyme tyrosinase từ chiết xuất rễ cây dâu tằm (Morus alba L.)” đã đạt được một số mục tiêu:

- Quá trình chiết xuất rễ dâu tằm đạt hiệu suất chiết cao 6,5% (w/w), với giá trị kháng enzyme tyrosinase IC50 đo được là 1,89 ± 0,06 g/ml và hàm lượng polyphenol tổng: 226,70 ± 8,20 mg GAE/g cao chiết khô

- Năm loại nhựa AB-8, ADS-17, HPD-100, D-101 và DM-301 đã được tiến hành nghiên cứu khảo sát các điều kiện hấp phụ/giải hấp phụ tĩnh và đưa ra các kết luận sau: dung dịch ethanol 90% được dùng làm dung môi để hòa tan dịch chiết với thời gian đạt trạng thái cân bằng hấp phụ là ở 120 phút

- DM-301 thể hiện tỷ lệ hấp phụ cao nhất và được chọn để tiến hành làm giàu polyphenol các thí nghiệm bằng sắc ký cột

- Phân đoạn rửa giải bằng 3 BV ethanol 60% được đánh giá là có hoạt tính mạnh với TPC là 669,18 mg GAE/g cao (cao gấp 3 lần so với cao chiết tổng ban đầu) và tyrosinase IC50 là 1,38 ± 0,04 àg/ml

- Hàm lượng polyphenol được thu hồi từ các phân đoạn rửa giải với 3 BV ethanol

50 % , 60 %, 70 %, 80 % (v/v) cho kết quả tốt nhất Do đó cao tổng từ các phân đoạn này được dùng để phối vào công thức dịch chiết tiện dụng và sau đó là công thức serum

- Đánh giá hoạt tính sáng da trên tình nguyện viên với nhiều nồng độ cao chiết khác nhau

- Đánh giá trên nhiều tình nguyện viên hơn

[1] M S Butt, A Nazir, M T Sultan and K Schroởn, "Morus alba L nature's functional tonic," Trends in Food Science & Technology, vol 19, pp 505

[2] N T T Ngan and N T Q Nhu, "Khoa dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí

Minh," 2009 [Online] Available: http://uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/69 [Accessed ngày 11 tháng 8 năm 2022]

[3] Q Y a L Zhao, "The Mulberry (Morus alba L.) Fruit - A Review of Characteristic Components and Health Benefits," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 65, pp 10383 - 10394, 2017

[4] J Du, Z.-D He, R.-W Jiang, W.-C Ye, H.-X Xu and P P.-H But,

"Antiviral flavonoids from the root bark of Morus alba L.,"

[5] H Kofujita, M Yaguchi, N Doi and K Suzuki, "A Novel Cytotoxic Prenylated Flavonoid from the Root of Morus alba," Journal of Insect Biotechnology and Sericology, vol 73, pp 113 - 116, 2004

[6] S.-j Piao, L.-x Chen, N Kang and F Qiu, "Simultaneous determination of five characteristic stilbene glycosides in root bark of Morus albus L (Cortex Mori) using high-performance liquid chromatography,"

Phytochemical Analysis, vol 22, no 3, pp 230 - 235, 2010

[7] J.-H Park, Y.-J Jung, J.-W Jung, S Shrestha, D W Lim, D Han and N.-

I Baek, "A new flavonoid glycoside from the root bark of Morus alba L.,"

Natural Product Research, vol 28, no 21, pp 1-5, 2014

[8] S H Lee, S Y Choi, H Kim, J S Hwang, B G Lee, J J Gao and S Y Kim, "Mulberroside F Isolated from the Leaves of Morus alba Inhibits

Melanin Biosynthesis," Biological & Pharmaceutical Bulletin, vol 25, no

[9] W Ya, Z Chun-Meng, G Tao, Z Yi-Lin and Z Ping, "Preliminary screening of 44 plant extracts for anti-tyrosinase and antioxidant activities," Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, vol 28, no 5, pp 1737-1744, 2015

[10] L Zhang, G Tao and J C a Z.-P Zheng, "Characterization of a New Flavone and Tyrosinase Inhibition Constituents from the Twigs of Morus alba L.," Molecules, vol 21, no 9, p 1130, 2016

[11] N T M Hanh, N K P Phung and Q N D Phuong, "Studying on Tyrosinase Inhibition Activity Some Vietnamese Folk Plants Aims to use skin-whitening cosmetics," American Journal of Plant Sciences, vol 9, pp

[12] V D Loi, D T N Tinh, B T Xuan, V K Oanh, T N Trung and N T Vung, "Chemical constituents and tyrosinase inhibitory activity of aqueous," Int J Pharmacognosy, vol 5, no 7, pp 399 - 403, 2018

[13] W D Shingleton, D J Hodges, P Brick and T E Cawston, "Collagenase: a key enzyme in collagen turnover," Biochem Cell Biol, vol 74, no 6, pp 759-775, 1996

[14] U.-K Seo, Y.-J Lee, J.-K Kim, B.-Y Cha, D.-W Kim, K.-S Nam and C.-H Kim, "Large-scale and effective screening of Korean medicinal plants for inhibitory activity on matrix metalloproteinase-9," Journal of Ethnopharmacology, vol 97, no 1, pp 101-106, 2005

[15] A K Ghimeray, U S Jung, H Y Lee, Y H Kim, E K Ryu and M S Chang, "In vitro antioxidant, collagenase inhibition, and in vivo anti- wrinkle effects of combined formulation containing Punica granatum,

Ginkgo biloba, Ficus carica, and Morus alba fruits extract," Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology, vol 8, pp 389 - 396, 2015

[16] Y S Jeong, H K Jung and J.-H Hong, "Protective Effect of Mulberry and Lithospermum erythrorhizon Extracts on Anti-aging against Photodamage," Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, vol 42, no 11, pp 1744-1752, 2013

[17] L.-W Chang, L.-J Juang, B.-S Wang, M.-Y Wang, H.-M Tai, W.-J Hung, Y.-J Chen and M.-H Huang, "Antioxidant and antityrosinase activity of mulberry (Morus alba L.) twigs and root bark," Food and Chemical Toxicology, vol 49, no 4, pp 785-790, 2011

[18] P Paudel, S H Seong, A Wagle, B S Min, H A Jung and J S Choi,

"Antioxidant and anti-browning property of 2-arylbenzofuran derivatives from Morus alba Linn root bark," Food Chemistry, vol 309, p 125739,

[19] K Park, J You, H Lee, N Baek and J Hwang, "Kuwanon G: an antibacterial agent from the root bark of Morus alba against oral pathogens," Journal of Ethnopharmacology, vol 84, no 2-3, pp 181-185,

[20] H.-Y Sohn, K Son, C.-S Kwon, G.-S Kwon and S Kang, "Antimicrobial and cytotoxic activity of 18 prenylated flavonoids isolated from medicinal plants: Morus alba L., Morus mongolica Schneider, Broussnetia papyrifera (L.) Vent, Sophora flavescens Ait and Echinosophora koreensis Nakai,"

[21] Y.-X Wu, Y.-J Kim, T.-H Kwon, C.-P Tan, K.-H Son and T Kim,

"Anti-inflammatory effects of mulberry ( Morus alba L.) root bark and its active compounds," Natural Product Research, vol 34, no 12, pp 1786-

[22] M S C Zain, S Y Lee, C Y Teo and K Shaari, "Adsorption and Desorption Properties of Total Flavonoids from Oil Palm (Elaeis guineensis Jacq.) Mature Leaf on Macroporous Adsorption Resins,"

[23] T T Biên, L H Huy and N V Hân, "Ứng dụng nhựa macroporous D101 trong phân lập geniposid từ quả dành dành (Gardenia jasminoides Ellis),"

Tạp chí Dược học, vol 57, no 4, 2017

[24] B Liu, J Ouyang, X Yuan, L Wang and B Zhao, "Adsorption properties and preparative separation of phenylethanoid glycosides from Cistanche deserticola by use of macroporous resins," Journal of Chromatography B, vol 937, pp 84 - 90, 2013

[25] J Dongdong, S Li and Z Gu, "Preparative isolation of flavonoids from mulberry (MORUS ALBA L.) leaves by macroporous resin adsorption,"

Journal of Food Process Engineering, vol 34, no 4, 2011

[26] J Wang, F A Wu, H Zhao, L Liu and Q S Wu, "Isolation of flavonoids from mulberry (Morus alba L.) leaves with macroporous resins," African journal of biotechnology, vol 7, no 13, 2010

[27] J Ren, Y Zheng, Z Lin, X Han and W Liao, "Macroporous resin purification and characterization of flavonoids from Platycladus orientalis (L.) Franco and their effects on macrophage inflammatory response," Food

& Function journal, vol 8, no 1, pp 86-95, 2017

[28] N Kamkaen, N Mulsri and C Treesak, "Screening of Some Tropical Vegetables for Antityrosinase Activity," Thai Pharmaceutical and Health

Science Journal, vol 2, no 1, pp 15-19, 2007

[29] M C Foti, "Use and Abuse of the DPPH(•) Radical," Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 63, no 40, pp 8765-8776, 2015

[30] O P Sharma and T K Bhat, "DPPH antioxidant assay revisited," Food Chemistry, vol 113, no 4, pp 1202-1205, 2009

[31] E Roura, C Andrés-Lacueva, R Estruch and R M Lamuela-Raventós,

"Total polyphenol intake estimated by a modified Folin-Ciocalteu assay of urine," Clinical Chemistry, vol 52, no 4, pp 749-752, 2006

[32] Z Wang, S Peng, M Peng, Z She and Q Y a T Huang, "Adsorption and desorption characteristics of polyphenols from Eucommia ulmoides Oliv leaves with macroporous resin and its inhibitory effect on α-amylase and α-glucosidase," Annals of Translational Medicine, vol 8, no 16, p 1004,

[33] A Li, Q Zhang, J Chen, Z Fei, C Long and W Li, "Adsorption of phenolic compounds on Amberlite XAD-4 and its acetylated derivative MX-4," Reactive and Functional Polymers, vol 49, no 3, pp 225-233,

[34] Q Yang, M Zhao and L Lin, "Adsorption and desorption characteristics of adlay bran free phenolics on macroporous resins," Food Chemistry, vol

[35] J Li and H A Chase, "Development of adsorptive (non-ionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologically- active natural products from plant sources," Natural Product Reports, vol

[36] H Yang, X Wang, J Liu, W Liu, Y Gong and Y Sun, "Amine- impregnated polymeric resin with high CO2 adsorption capacity for biogas upgrading," Chemical Engineering Journal, vol 430, no 2, p 132899,

Phụ lục 1 Vi phẫu rễ dâu tằm

Quá trình định danh các bộ phận: rễ, thân và lá dâu tằm được thực hiện dưới sự hỗ trợ của các giảng viên trường Đại học Nguyễn Tất Thành Để quan sát cấu tạo bên trong, các cơ quan được cắt ra thành từng khoanh (vi phẫu) bằng tay trước khi quan sát, sử dụng phương pháp phẫu thức ngang - lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục mẫu cắt Vi phẫu sau khi nhuộm xong thì được ngâm trong nước cất, quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X và hình ảnh được ghi nhận lại bằng các thiết bị điện tử cho kết quả a) Rễ b) Cành c) Cuống lá

Hình 4.1 Mẫu vi phẫu các bộ phận dâu tằm

Phụ lục 2 Kết quả động học hấp phụ của nhựa AB-8 theo thời gian (phút)

(Phút) Độ hấp thu A tb C (mg GAE/ml) % Hấp phụ

Phụ lục 3 Kết quả động học hấp phụ của nhựa ADS-17 theo thời gian (phút)

(Phút) Độ hấp thu A tb C (mg GAE/ml) % Hấp phụ

Phụ lục 4 Kết quả động học hấp phụ của nhựa HPD-100 theo thời gian (phút)

(Phút) Độ hấp thu A tb C (mg GAE/ml) % Hấp phụ

Phụ lục 5 Kết quả động học hấp phụ của nhựa D-101 theo thời gian (phút)

(Phút) Độ hấp thu A tb C (mg GAE/ml) % Hấp phụ

Phụ lục 6 Kết quả động học hấp phụ của nhựa DM-301 theo thời gian (phút)

(Phút) Độ hấp thu A tb C (mg GAE/ml) % Hấp phụ

Phụ lục 7 Độ hấp thu của dung dịch chiết sau quá trình hấp phụ polyphenol trên 5 loại nhựa (Lần 1)

A màu A A màu A A màu A A màu A A màu A

Phụ lục 8 Độ hấp thu của dung dịch chiết sau quá trình giải hấp phụ polyphenol trên

A màu A A màu A A màu A A màu A A màu A

Phụ lục 9 Tỷ lệ hấp phụ và giải hấp phụ polyphenol của 5 loại nhựa (Lần 1) Loại nhựa AB-8 ADS-17 HPD-100 D-101 DM-301

Phụ lục 10 Độ hấp thu của dung dịch chiết sau quá trình hấp phụ polyphenol trên 5 loại nhựa (Lần 2)

A màu A A màu A A màu A A màu A A màu A

Phụ lục 11 Độ hấp thu của dung dịch chiết sau quá trình giải hấp phụ polyphenol trên

A màu A A màu A A màu A A màu A A màu A

Phụ lục 12 Tỷ lệ hấp phụ và giải hấp phụ polyphenol của 5 loại nhựa (Lần 2)

Loại nhựa AB-8 ADS-17 HPD-100 D-101 DM-301

Phụ lục 13 Độ hấp thu của dung dịch chiết sau quá trình hấp phụ polyphenol trên 5 loại nhựa (Lần 3)

A màu A A màu A A màu A A màu A A màu A

Phụ lục 14 Độ hấp thu của dung dịch chiết sau quá trình giải hấp phụ polyphenol trên

A màu A A màu A A màu A A màu A A màu A

Phụ lục 15 Tỷ lệ hấp phụ và giải hấp phụ polyphenol của 5 loại nhựa (Lần 3)

Loại nhựa AB-8 ADS-17 HPD-100 D-101 DM-301

Phụ lục 16 Tỷ lệ hấp phụ và giải hấp phụ polyphenol trung bình trên 5 loại nhựa Stt Loại nhựa AB-8 ADS-17 HPD-100 D-101 DM-301

Phụ lục 16 Hàm lượng poly phenol tổng theo phân đoạn khi đi qua sắc ký cột

Phân đoạn Hàm lượng polyphenol tổng

TPC (mg GAE/ g cao chiết)

99.5% Ethanol 44.37 ± 0.89 Dịch chiết ban đầu 226.70 ± 8.20

Phụ lục 17 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các phân đoạn sau khi qua sắc ký cột

Phõn đoạn IC 50 (àg/ml)

Dịch chiết ban đầu 1.89 ± 0.06 àg/ml