Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Khảo sát hoạt tính kháng nấm gây hại cho cây ớt của một số dược liệu

TỔNG QUAN

Tổng quan về các chủng nấm thử nghiệm

2.1.1 Nấm gây héo rũ trên cây Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum thuộc họ Nectriaceae bộ Hypocreales là một mầm bệnh có sẵn trong đất F oxysporum có thể gây bệnh trên hơn 100 loại cây trồng khác nhau từ cà chua, chuối, ớt, bắp cải, khoai lang, thuốc lá, dưa hấu… đến các loại hoa như tulip, thủy tiên, cẩm chướng…và đứng thứ năm trong số mười mầm bệnh gây tử vong cao nhất ở thực vật [7] Các triệu chứng đặc trưng của bệnh bao gồm hiện tượng các mạch dẫn trong cây bị hóa nâu, lá bị héo, còi cọc, héo dần và rụng hay thậm chí có thể làm chết cây Do đó F oxysporum gây ra thiệt hại không nhỏ tới năng suất và chất lượng nông sản, đặc biệt là ở các vùng mang khí hậu nhiệt đới [8-12]

Nấm F oxysporum có thể sinh trưởng dễ dàng trên nhiều loại môi trường nhân tạo Trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) , nấm mọc nhanh (có thể kín đĩa đường kính 9 cm trong vòng 7 ngày), tản nấm thường có màu hồng, cam, đỏ, tía sau khi cấy

4 - 5 ngày [8, 9, 13] Nấm hình thành ba loại bào tử vô tính cả trên môi trường nhân tạo hoặc trên cây bị héo chết: một là bào tử phân sinh lớn dạng đa bào (3 - 5 vách ngăn), hình trăng khuyết; hai là bào tử phân sinh nhỏ dạng đơn bào, hình oval hoặc hình thành từ bọc giả; ba là bào tử hậu dạng đơn bào hoặc thành cặp, vách dày, sức chống chịu tốt, hình thành từ sợi nấm hoặc từ bào tử phân sinh lớn [13, 14]

Hình 2 1 Nấm Fusarium oxysporum sau 7 ngày nuôi cấy trên PDA a Mặt trên khuẩn lạc b Mặt dưới khuẩn lạc

2.1.2 Nấm gây bệnh thối gốc, cổ rễ Fusarium solani

Fusarium solani thuộc họ Nectriaceae bộ Hypocreales cũng là một mầm bệnh có sẵn trong đất Cùng với F oxysporum, F solani là một trong những loại bệnh gây hại nguy hiểm nhất đối với cây trồng Chúng ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng nông sản, gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho người nông dân F solani gây thối thân, cổ rễ cây thông qua các vết thương từ đó gây nên tình trạng héo rũ Trên cây non, nấm làm cho lá cây mất dần gân lá, héo rũ và rụng dần đến khi cây chết Ở cây trưởng thành, nấm gây héo rũ, còi cọc, hoa và quả kém phát triển [15-17]

Ngoài ra, F solani còn có khả năng gây hại cho nông sản sau khi thu hoạch thông qua các vết thương trên củ, quả trong quá trình thu hoạch và xử lý sau thu hoạch Nấm làm cho nông sản bị mất dần độ cứng, không giữ được nước, nhũn và cuối cùng bị sợi nấm bao phủ [17, 18]

Nấm F solani có thể sinh trưởng dễ dàng trên nhiều loại môi trường nhân tạo Trên môi trường PDA, nấm mọc nhanh (có thể kín đĩa 9 cm trong vòng 7 ngày), tản nấm có hình thể tơi xốp hoặc bằng phẳng trên môi trường nuôi cấy Mặt trên tản nấm có màu trắng, mặt dưới có màu kem Nấm hình thành ba loại bào tử vô tính cả trên môi trường nhân tạo hoặc trên cây bị héo chết: tiểu bào tử có dạng hình trụ hoặc hình trứng có thể có 1 vách ngăn hoặc không có vách ngăn, đại bào tử đa số có dạng hình liềm thường có 2 – 5 vách ngăn, bào tử áo đa số có dạng hình tròn [19, 20]

Hình 2 2 Nấm Fusarium solani sau 7 ngày nuôi cấy trên PDA a Mặt trên khuẩn lạc b Mặt dưới khuẩn lạc

2.1.3 Hình thức gây bệnh của Fusarium oxysporum và Fusarium solani trên cây

Fusarium oxysporum là mầm bệnh tồn tại trong đất, từ đó chúng xâm nhập vào cây thông qua các vết thương hở ở rễ, phần thân nằm gần mặt đất hoặc thông qua hạt giống bị nhiễm bệnh Điều kiện nhiệt độ từ 18 – 34 °C, ẩm độ cao thích hợp cho nấm phát triển Khi đã xâm nhập được vào vật chủ, nấm đi vào bó mạch và xâm chiếm các mô xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân Quá trình này gây nên các phản ứng trên cây, tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu Các hợp chất này làm cản trở quá trình vận chuyển nước từ rễ đến các bộ phận khác của cây Do đó gây ra các triệu chứng héo, hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn và thậm chí gây chết cây [21, 22] Sau khi F oxysporum xâm nhập vào vật chủ (cây), các triệu chứng ban đầu được gây ra bao gồm: hiện tượng mất vân lá, héo rũ, còi cọc trên lá non, dần dần làm cây yếu rồi chết Trên cây trưởng thành, nấm gây héo vàng, hiện tượng hoa, quả phát triển bất thường và biểu hiện rõ nhất ở giai đoạn ra hoa Đồng thời, khi nấm xâm nhập, các mạch dẫn trong cây sẽ bị chuyển sang màu nâu Đôi khi, hiện tượng này không thể nhìn thấy khi quan sát hình thái thông thường nhưng có thể thấy rõ khi quan sát mặt cắt ngang thân cây Tuy héo là triệu chứng chủ yếu của bệnh và có thể quan sát được trên cây nhưng đây thực sự chỉ là triệu chứng thứ cấp, là hệ lụy của việc rễ và các mạch dẫn trong cây bị tổn thương dẫn đến mất nước Triệu chứng chính của bệnh phải là hiện tượng thân cây, các mạch dẫn bị chuyển sang màu nâu, chỉ được phát hiện khi quan sát mặt cắt ngang thân cây như đã trình bày ở trên Trong một số trường hợp, F oxysporum còn có thể gây ra hiện tượng thối rễ, thối củ tại vị trí vết thương ban đầu khi chúng xâm nhập vào vật chủ [23]

Trên cây ớt, mầm bệnh có thể tác động lên cây ngay cả ở thời điểm cây còn non và khi cây đã trưởng thành, ra hoa Ở cây non, bệnh làm cho cây còi cọc, vàng lá, héo dần và cuối cùng là chết Nếu mầm bệnh tấn công cây trưởng thành, hoa và quả của cây không phát triển bình thường Triệu chứng đặc trưng của bệnh là các lá già phía dưới bị vàng trước sau đó lan lên các lá trên Triệu chứng héo rũ hoặc biến vàng có thể xuất hiện ở một vài cành trên cây hay cả cây Lá của các cây bị nhiễm bệnh sẽ bị vàng, héo và sau đó cây sẽ chết Các tế bào cắt ngang thân cây bị bệnh thường hóa nâu Triệu chứng điển hình thường thấy là phần thân sát mặt đất có vết nấm tạo thành mảng trên bề mặt làm phá hủy hệ thống mạch dẫn của cây làm cho cây héo và chết Chúng phát triển mạnh ở ngưỡng nhiệt 25 – 30 °C [12]

Hình 2 3 Biểu hiện bệnh Fusarium oxysporum trên cây ớt

Fusarium solani cũng là một mầm bệnh trong đất tương tự như F oxysporum

Chúng xâm nhập vào trong cây thông qua các vết thương hở do các nông cụ trong quá trình chăm sóc hoặc vết thương của tuyến trùng chích hút tạo ra Các vết thương này làm giảm khả năng miễn dịch của bộ rễ, từ đó tạo điều kiện cho nấm F solani xâm nhập gây hại Nấm có thể gây bệnh cho cây cả khi còn non và khi đã trưởng thành Biểu hiện trên lá: khi cây mới phát bệnh thì gân lá già có màu vàng nhạt, phiến lá ngả sang màu vàng cam, lúc đầu rải rác từng lá càng về sau càng nhiều Lá dễ rụng khi có gió hoặc lấy tay rung nhẹ thân cây Bệnh càng nặng lá vàng và rụng càng nhiều Bệnh có thể xuất hiện trên 1 – 2 cành hoặc toàn bộ cây Biểu hiện trên rễ: các rễ ngay dưới cành bị bệnh sẽ hóa nâu và thối, tuột vỏ, rễ nhỏ thối trước sau đó lan dần đến các rễ lớn, có thể xuất hiện tơ nấm trắng Ngoài ra bệnh có thể tấn công ngay phần cổ rễ sau đó gây ra các triệu chứng đặc trưng như rễ kém phát triển và đổi màu, từ đó cây không hấp thu chất dinh dưỡng làm lá bị héo và hóa vàng, cuối cùng gây chết Trên nông sản sau thu hoạch, nấm làm cho nông sản bị mất dần độ cứng, mô bị nhiễm bệnh chuyển sang màu nâu sẫm Bên trong củ, quả bị bệnh cho thấy các tổn thương có thể kéo dài vào trung tâm, do đó củ, quả không giữ được nước, nhũn và cuối cùng bị sợi nấm bao phủ [20]

Fusarium solani là loài gây thối quả điển hình trên cà chua sau thu hoạch, chiếm tới 34% tổng số bệnh do Fusarium gây ra Nấm F solani dễ dàng thâm nhập vào quả qua các vết thương, phát triển hệ sợi nấm sâu vào bên trong khiến quả mềm nhanh, mô quả mục, sũng nước và phủ đầy hệ sợi nấm màu trắng.

Hình 2 4 Biểu hiện của cây, quả bị nhiễm Fusarium solani

Nhìn chung, cả hai chủng nấm F oxysporum và F solani đều gây nên hiện tượng héo rũ thứ phát trên cây trồng, ảnh hưởng đến sự phát triển của hoa và quả, củ Từ đó, làm giảm năng suất và gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho người nông dân Nhiều khảo sát đã chỉ ra, các nấm thuộc chi Fusarium đặc biệt là F oxysporum và F solani là hai loài gây bệnh héo phổ biến nhất, làm giảm năng suất của cây trồng đặc biệt ở các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Pakistan, Ai Cập, Việt Nam, Thái Lan… Cụ thể, chúng gây thiệt hại khoảng 40% trên tổng sản lượng ớt ở Ấn Độ, gây bệnh trên 21.9% diện tích cây trồng ở Pakistan, 79% sản lượng ớt ở Thái Lan, 56% lượng nông sản ở Ai Cập và 3.25% diện tích chuối tại Khu liên hợp Nông nghiệp Snuol Campuchia – Việt Nam trong giai đoạn cuối năm 2020 đầu năm 2021…[25-29]

Tuy nhiên, các mầm bệnh của hai chủng nấm này có thể tồn tại lâu trong đất lên đến 7 năm và rất khó để loại bỏ triệt để Việc sử dụng các biện pháp trị thường tốn kém, còn sử dụng các chất hóa học trong thời gian dài sẽ gây tồn dư trên nông sản và gây ô nhiễm môi trường Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất, sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên, có khả năng ức chế, phòng, chống tốt F oxysporum và F solani có ý nghĩa vô cùng thiết thực trong nông nghiệp Điều này không chỉ góp phần trong công tác bảo vệ thực vật mà còn bảo quản tốt nông sản sau thu hoạch Từ đó có hiệu quả trong việc tránh thất thoát và suy giảm chất lượng nông sản Đồng thời cũng giúp bảo vệ môi trường và sức khỏe con người Đó cũng chính là một trong những mục tiêu của luận văn này.

Tổng quan về thuốc diệt nấm

Thuốc diệt nấm là những hóa chất được dùng để tiêu diệt hoặc cản trở sự phát triển của nấm ký sinh hoặc bào tử của chúng [30] Hiện nay có khoảng 150 chất diệt nấm, phần lớn là các chất hữu cơ được phát hiện và tổng hợp Các chất này có tác dụng bảo vệ cây khỏi sự nảy mầm và sự xâm nhập của nấm vào mô cây Trong quá khứ, các hợp chất lưu huỳnh, đồng, thủy ngân thường được sử dụng để trừ bệnh Tuy nhiên, các hợp chất lưu huỳnh và đồng làm một số cây nhạy cảm mọc chậm lại Do đó, các hợp chất hữu cơ được tổng hợp để thay thế, chúng có hiệu lực cao hơn và ít độc hơn Dựa vào đối tượng và phương thức tác động, thuốc diệt nấm được chia thành bốn nhóm chính: Polyene, Azole, Allylamine, Echinocandin Ngoài ra, còn có Griseofulvin và Flucytosine [31]

Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc diệt nấm hóa học lại gây ảnh hưởng nhất định đến cây trồng, môi trường và sức khỏe con người Thuốc diệt nấm có thể gián tiếp gây hại cho sức khỏe con người thông qua việc sử dụng lương thực, rau quả được trồng bằng loại thuốc này Các hóa chất trong thuốc diệt nấm có thể gây dị ứng, các triệu chứng hoặc bệnh không mong muốn trên cơ thể Đồng thời, thuốc diệt nấm cũng gây ô nhiễm môi trường nước, đất và làm tăng độc tính đối với các sinh vật sống Ngoài ra, sử dụng lâu dài hoặc kết hợp nhiều loại thuốc diệt nấm còn làm tăng nguy cơ kháng thuốc ở các loài nấm.

Ngày nay, cùng với sự phát triển của nông nghiệp bền vững, việc ứng dụng các hợp chất tự nhiên có hoạt tính mạnh trong việc kháng nấm vào bào chế nên các chế phấm thuốc diệt nấm ngày càng được quan tâm Do đó, việc phát triển các chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc tự nhiên sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho người sản xuất như: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu tư, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trường sinh thái, không ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và vật nuôi, góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả [35, 36]

Polyene là nhóm kháng nấm lâu đời, có cấu trúc đặc trưng bởi vòng macrolide đóng kín bằng ester nội phân tử hoặc vòng lactone Nhờ các liên kết đôi kị nước, Polyene gắn chọn lọc vào ergosterol trên màng tế bào nấm, gây thay đổi cấu trúc màng sinh chất Sự thay đổi này dẫn đến thoát đại phân tử và ion ra khỏi tế bào, làm phân giải tế bào nấm Các thuốc kháng nấm Polyene phổ biến như Amphotericin B, Nystatin, Natamycin có hiệu quả chống lại các chủng nấm Candida albicans, Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum.

Azole là nhóm thuốc kháng nấm được sử dụng phổ biến nhất [38] Chúng gắn lên enzyme cytochrome P450 và ức chế enzym 14--demethylase để ngăn tổng hợp ergosterol và các lipid khác của màng tế bào nấm, làm rối loạn chức năng màng và ức chế nấm tăng trưởng [39] Tùy theo số lượng phân tử nitơ trong cấu trúc vòng hữu cơ của chúng mà Azole chia thành các Imidazole (chứa 2 nguyên tử Nitơ như Clotrimazole, Miconazole, Ketoconazole, Econazole, Bifonazole, Isoconazole ) và Triazole (chứa 3 nguyên tử nitơ như Itraconazole, Voriconazole, Fluconazole, Terconazole, Posaconazole ) [40] Các Azole được sử dụng rộng rãi để chống lại các bệnh liên quan đến các chủng nấm Candida, Cryptococcus, Pityrosporum, Aspergillus, Sporotrichum, Histoplasma, Blastomyces…[40-43]

Thuốc kháng nấm nhóm Allylamine là thuốc làm ức chế quá trình sinh tổng hợp ergosterol bằng cách ức chế sự hình thành squalene epoxidase [44] Nhiều nghiên cứu cho thấy độ dung nạp và độ an toàn của thuốc cao Hai Allylamine được sử dụng nhiều nhất trong kháng nấm là Terbinafin và Naftifin để chống lại các chủng như

Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae…[45, 46] 2.2.1.4 Nhóm Echinocandin

Echinocandin là nhóm thuốc trị nấm mới, diệt nấm bằng cách ức chế enzyme

-1,3-D-glucan synthase tham gia tổng hợp -glucan trên thành tế bào của nấm [46]

Các thuốc nhóm azol được sử dụng để điều trị nhiễm nấm sâu do khả năng phá hủy tế bào nấm Chúng phổ tác dụng rộng, có hiệu quả với cả nấm men (trừ Cryptococcus neoformans), sợi nấm và nấm lưỡng dạng.

Echinocandin là: Anidulafungin, Caspofungin, Micafungin…[47]

2.2.1.5 Nhóm các thuốc diệt nấm Griseofulvin và Flucytosine

Các thuốc kháng nấm này có cơ chế tác động khác với các loại thuốc trên, chúng bao gồm hai nhóm thuốc thế hệ mới là Griseofulvin và Flucytosine Nhóm Griseofulvin gồm các thuốc kháng nấm được phân lập từ Penicillium griseofulvum [48] Chúng có tác dụng ngăn không cho tế bào nấm phân chia đồng thời làm rối loạn cấu trúc và chức năng của vi ống (microtubule) [49, 50] Tuy nhiên, chúng chỉ có tác dụng với các chủng Trichophyton, Microsporum và Epidermophyton [46] Nhóm

Flucytosine là một loại pyrimidine có chứa flo và dễ tan trong nước Thuốc kháng nấm này hoạt động bằng cách ức chế quá trình tạo ra các axit nucleic và protein của nấm, ngăn chặn sự phát triển của chúng Flucytosine đặc biệt hiệu quả trong điều trị các bệnh nhiễm nấm men do Candida và Cryptococcus gây ra Thuốc thường được kết hợp với Amphotericin B để tăng hiệu quả điều trị.

2.2.1.6 Nhóm các thuốc diệt nấm có nguồn gốc tự nhiên

Nhóm các thuốc diệt nấm có nguồn gốc tự nhiên thường sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên, sinh học để diệt trừ nấm hại Chúng thường được chia thành các dạng sau: các thuốc diệt nấm từ các chiết xuất động, thực vật (cao chiết, tinh dầu…), thuốc diệt nấm phân lập từ các hoạt chất trong chiết xuất thực vật và thuốc diệt nấm từ vi sinh vật…

Thuốc diệt nấm từ các chiết xuất động, thực vật: là các sản phẩm được tách chiết từ các động, thực vật, có đặc tính kháng nấm gây hại như dịch chiết, tinh dầu, chitosan… Một số ví dụ cho dạng thuốc diệt nấm này như dầu neem, chiết xuất tỏi, tinh dầu tràm trà, chitosan…[52-56]

Thuốc diệt nấm vi sinh: là các thuốc diệt nấm sử dụng các tác nhân như vi khuẩn, virus, nấm khác hoặc các sản phẩm chuyển hóa của chúng như enzyme chitinase, glucanase để kháng lại nấm bệnh Trong nhóm vi khuẩn, một số chủng như Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, và xạ khuẩn Streptomyces có khả năng tạo ra các hợp chất ức chế sự phát triển của nấm hoặc thúc đẩy tăng trưởng thực vật và tạo ra sức đề kháng toàn thân chống lại mầm bệnh nấm [57-60] Nhiều virus có khả năng tác động và tiêu diệt các tác nhân gây nấm hoặc nấm bệnh được sử dụng như một chất đối kháng để diệt nấm [61] Một số chủng nấm và sản phẩm chuyển hóa của chúng có thể hoạt động như thuốc diệt nấm sinh học bằng cách ký sinh hoặc cạnh tranh với nấm gây bệnh từ đó tiêu diệt nấm bệnh Một ví dụ cho dạng này là nấm

Trichoderma kí sinh ở vùng rễ có khả năng sản sinh enzyme chitinase, glucanase từ đó có khả năng kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium….[62]

2.2.1.7 Nhóm các chất diệt nấm khác

Ngoài các cách phân loại trên, khi thuốc diệt nấm tác động lên các nấm gây hại trên cây trồng, chúng còn được phân loại thành: thuốc diệt nấm tiếp xúc và hấp thụ Thuốc diệt nấm tiếp xúc giết chết nấm khi được phun trên bề mặt lá hoặc thân bị nhiễm nấm và thuốc không thấm vào mô Thuốc đóng vai trò như một lá chắn, bao phủ bên ngoài cả lá hoặc thân cây [63] Thuốc diệt nấm hấp thụ sẽ thấm qua lớp mô của cây và thuốc lưu thông trong cây để kiểm soát bệnh Thuốc diệt nấm hấp thụ có thể được sử dụng để ngăn chặn bệnh sau khi nó đã lây nhiễm cho cây [47]

2.2.2 Tác động của các hợp chất gây độc đối với nấm

2.2.2.1 Sự xâm nhập và di chuyển của các hoạt chất Đối với các nấm hại, khả năng gây độc của các chất dựa trên tương quan về độ tan, độ hấp phụ và độ khuếch tán của nó so với bề mặt chất nguyên sinh hoặc màng tế bào Chênh lệch càng cao, chất càng dễ đi qua màng tế bào để xâm nhập và phá hủy tế bào nấm [38, 40, 64-66]

2.2.2.2 Các hình thức tác động của chất độc

Tổng quan về các dược liệu

Hương nhu trắng có tên khoa học là Ocimum gratissimum L., thuộc chi Ocimum, họ Lamiaceae Hương nhu trắng là một loài cây thân cỏ, có mùi thơm, có thể cao tới hơn 1,5m Lá cây mọc đối, có cuống, phiến lá dài từ 5 đến 10 cm, hình trứng nhọn, phía cuống thon, mép khía tai béo hay có răng cưa thô, trên gân chính của lá thường có lông Hoa của hương nhu trắng thường nhỏ, mọc thành xim đơn 6 hoa, xếp thành từng chùm, thỉnh thoảng phía dưới có phân nhánh Hạch nhỏ hình cầu Hạt không nở và không có chất nhầy bao quanh khi cho vào nước Hương nhu trắng được tìm thấy ở cả châu Á, châu Phi và Nam Mỹ [75, 76], được trồng phổ biến ở các vùng nhiệt đới như Brazil, Ấn Độ, Việt Nam, Nigeria, Cameroon…và Nam Phi [2] Ở nước ta, hương nhu trắng mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi trên cả nước

Hương nhu trắng, đặc biệt là tinh dầu có chứa nhiều các hợp chất như eugenol (thành phần chính, chiếm khoảng 70 – 95%), linalool (khoảng 1 – 2%), thymol, citral, geraniol, camphor, -farnese, -bisabolene, -pinene…[2, 77, 78] Chính nhờ sự có mặt của những thành phần này giúp cho hương nhu trắng có nhiều công dụng trong việc điều trị các bệnh liên quan đến răng miệng, hô hấp, giun sán, đau dạ dày, thấp khớp hay kháng ung thư và đặc biệt có hiệu quả trong việc kháng khuẩn và kháng nấm…[79-84]

Hình 2 5 Cây hương nhu trắng – eugenol

Năm 2005, Lemos, Janine cùng các cộng sự tiến hành xác định hoạt tính kháng nấm của các dịch chiết ethanol, ethyl acetate, hexane, chloroform và tinh dầu hương nhu trắng lên chủng Cryptococcus neoformans Kết quả thử nghiệm cho thấy, tất cả các dịch chiết và tinh dầu đều có tác dụng ức chế Cryptococcus neoformans Trong đó, dịch chiết chloroform cho khả năng ức chế tốt nhất Cryptococcus neoformans với giá trị MIC đạt 62.5 g/mL [85]

Năm 2006, Okigbo và Ogbonnaya tiến hành thử nghiệm khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm Aspergillus niger, A flavus, Fusarium oxysporum, Rhizopus stolonifer, Botryodiplodia theobromae, Penicillium chrysogenum gây thối rữa ở khoai mỡ của các dịch chiết từ lá hương nhu trắng Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy dịch chiết ethanol và nước có hiệu quả ức chế lên các chủng Aspergillus niger,

Fusarium oxysporum và Botryodiplodia theobromae Trong đó, dịch chiết ethanol cho hiệu quả ức chế tốt hơn trên cả 3 chủng nấm Tỉ lệ ức chế của dịch chiết hương nhu trắng lên sự phát triển của tản nấm lần lượt là 66.6%, 70.1% và 72.1% [86] Năm 2012, Houinsou và các cộng sự tiến hành nghiên cứu khả năng kháng lại các chủng nấm Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium poae và

Phân tích GC - MS cho thấy tinh dầu lá hương nhu trắng chứa các thành phần chính là thymol (26,9%), γ-terpinene (20,0%) và p-cymene (17,6%) Sự hiện diện của các hợp chất này giúp tinh dầu hương nhu trắng có khả năng kháng nấm, với giá trị MFC đối với Fusarium oxysporum là 200 ± 0,00 ppm.

Fusarium graminearum (400 ± 0.00 ppm), Fusarium poae và Aspergillus niger tại nồng độ 1600 ± 0.00 ppm [87]

Trong năm 2017, nghiên cứu của Mohr, Lermen, Gazim và cộng sự đã tiến hành chiết xuất tinh dầu từ cây hương nhu trắng với mục tiêu xác định thành phần hợp chất có trong loại tinh dầu này Họ tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả năng kháng nấm của tinh dầu đối với 10 chủng nấm gây hại cây trồng được phân lập.

Fusarium oxysporum f sp tracheiphilum (CMM0033), F oxysporum f sp cubense

(CMM-0813 và CMM-2819), F oxysporum f sp lycopersici (CMM-1104), F solani (CMM-3828), Rhizoctonia solani (CMM-3274), Macrophomina phaseolina (CMM-

Tinh dầu hương nhu trắng chứa khoảng 30 hợp chất, với các thành phần chính là linalool (32,9%) và 1,8-cineole (21,9%) Tinh dầu này có hoạt tính kháng nấm đáng kể, ức chế các chủng nấm với giá trị MIC từ 31,25 đến 125 µg/mL Đặc biệt, tinh dầu hương nhu trắng có hiệu quả cao nhất đối với nấm F oxysporum f sp lycopersici và R solani, với giá trị MIC chỉ 31,25 µg/mL.

Năm 2023, Akpo và các cộng sự tiến hành thử nghiệm khả năng kháng Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides và Fusarium oxysporum của cao chiết và tinh dầu hương nhu trắng Kết quả cho thấy tinh dầu hương nhu trắng có khả năng ức chế sự phát triển của Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides tại nồng độ

500 ppm và Fusarium oxysporum tại 750 ppm Bên cạnh đó, cao chiết nước của hương nhu trắng có khả năng ức chế 90% sự phát triển của Fusarium oxysporum và ức chế 100% sự phát triển của Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides tại nồng độ 60% (v/v) [89]

2.3.2 Đại hồi Đại hồi có tên khoa học là Illicium verum, thuộc chi Illicium, họ Magnoliaceae, được trồng làm cây gia vị phổ biến ở Đông Á, Nam Á và Bắc Mỹ Trong đó, Việt Nam và Trung Quốc là 2 quốc gia sản xuất đại hồi chủ yếu Đại hồi là cây nhỡ thân gỗ, sống lâu năm, cao khoảng 6 – 10 m, cây nhân thành nhiều nhánh Cành đại hồi khi non có màu xanh lục, về già có màu nâu, vỏ nhẵn, giòn, dễ gãy Lá cây mọc so le, có mùi thơm, có dạng hình mũi mác, dài khoảng 5 – 15 cm, rộng 2 – 5 cm, phiến lá dày, cứng, nhẵn Hoa đại hồi mọc ở nách lá, là hoa lưỡng tính, có màu hồng đến đỏ sẫm, cuống hoa dài từ 1.5 – 4 cm, cánh hoa có hình elip rộng 7 – 12 cm Quả hồi là quả kép, mỗi quả gồm 6 – 8 đại (cánh), xếp thành hình ngôi sao hoặc bông hoa Khi còn non, quả màu xanh, lúc về già chuyển sang màu nâu, đầu quả có mũi nhọn Khi chín, ở đầu mỗi đại (cánh) sẽ nứt ra làm đôi, để lộ hạt màu nâu nhạt, bóng nhẵn bên trong Tại Việt Nam, đại hồi thường phân bố ở một khu vực tương đối nhỏ ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn Một số nơi khác cũng có trồng Bát giác hồi hương để làm gia vị và dược liệu như Tuyên Quang, Bắc Kạn, Hà Giang, Thái Nguyên… [3, 90]

Trong thành phần hóa học của hồi có chứa đa dạng các nhóm chất như alkaloid, tannin (9 - 10%), anethole (80 – 90% trong tinh dầu), limone, α-pinene, safrol, β-phellandrene, α-terpineol, farnesol…[91-93] Chính nhờ sự có mặt của các nhóm hợp chất này giúp cho hồi có khả năng kháng được nhiều chủng nấm, kháng sâu, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxy hóa… [3, 92, 94, 95]

Hình 2 6 Lá, quả hồi – anethole – tannin

Năm 2007, Park và các cộng sự tiến hành khảo sát khả năng kháng lại 2 chủng nấm Botrytis cinerea và Colletotrichum gloeosporioides của 25 loại tinh dầu Trong đó, tinh dầu đại hồi cho khả năng ức chế tốt nhất lên cả 2 chủng nấm thử nghiệm Tại nồng độ 10 μg trên mỗi đĩa thử nghiệm, tinh dầu hồi có khả năng ức chế 90% sự phát triển của các tảng nấm Bên cạnh đó, kết quả phân tích GC – MS thành phần tinh dầu đại hồi cũng chỉ ra thành phần chính trong tinh dầu là trans-anethole (87.4%) Chính sự có mặt của hoạt chất này mang lại khả năng kháng 2 chủng nấm thử nghiệm [96]

Năm 2009, Dzamic và các cộng sự chỉ ra trong tinh dầu hồi có chứa khoảng 16 hợp chất, trong đó cis và trans-anethole chiếm hàm lượng lớn nhất (khoảng 91% hàm lượng tinh dầu) có khả năng kháng lại 19 chủng nấm gây hại cho cây trồng như

Fusarium tricinctum, Fusarium sporotrichioides, … với MIC và MFC trong khoảng

Năm 2010, Huang và các cộng sự tiến hành phân tích hàm lượng các chất có trong tinh dầu hồi tỉnh Quảng Tây, Trung Quốc và thử nghiệm khả năng kháng nấm của chúng Nghiên cứu chỉ ra trong tinh dầu quả hồi có chứa 22 hợp chất, trong đó trans-anethole chiếm 89.5% là thành phần chính và cũng là thành phần có hoạt tính kháng lại 11 chủng nấm gây hại cho cây trồng như nấm gây héo Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum f sp cucumerinum, Fusarium oxysporum f sp lycopersici, Fusarium oxysporum f sp vasinfectum… với IC50 lần lượt là 0.08, 0.16, 0.14, 0.25 mg/mL [97]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Cành lá hương nhu trắng

Tất cả các hóa chất được sử dụng trong luận văn đều có độ tinh khiết từ 95% trở lên và được mua từ hãng Chemsol (Việt Nam) Potato Dextrose Broth (PDB), Potato Dextrose Agar (PDA) (Himedia, Ấn Độ) là môi trường nuôi cấy nấm Nystatin (Duchefa Biochemie, Hà Lan) là đối chứng dương cho thử nghiệm kháng nấm

Thiết bị quang phổ hấp thụ phân tử (UV – Vis) OPTIZEN POP, đèn tungsten halogen và deuterium dùng để xác định số lượng bào tử nấm

Sử dụng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để phân tích thành phần và hàm lượng các hợp chất có trong tinh dầu Phổ sắc ký khí GC được đo trên thiết bị Agilent G1530A (Agilent Technologies) kết hợp với cột mao quản HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) (Viện Kỹ thuật Công nghệ cao Nguyễn Tất Thành) Khối phổ MS được đo trên thiết bị Agilent 5973N (Agilent Technologies) (Viện Kỹ thuật Công nghệ cao Nguyễn Tất Thành) Các thông số vận hành cụ thể bao gồm nhiệt độ buồng hóa hơi 250 °C, thể tích tiêm 1 μL, khí mang Helium, tỷ lệ phân chia dòng 1/50 và chế độ quét từng giây Đối với điều kiện phân tích MS, tác nhân bắn phá ion là EI+, năng lượng electron 70 eV và nhiệt độ bộ nguồn được điều chỉnh theo yêu cầu phân tích.

230 °C, phạm vi quét khối lượng: 40 - 400 amu Khối phổ mẫu được so sánh với khối phổ chuẩn trong thư viện NIST Ver 2.0a

Các chủng nấm dùng trong luận văn là Fusarium oxysporum và Fusarium solani được phân lập và định danh tại phòng thí nghiệm Vi sinh, bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách Khoa – ĐHQG HCM Chúng được nuôi cấy trên môi trường PDA Một lít môi trường có chứa 4 g tinh bột khoai tây, 20 g glucose, 16 g agar và 250mL dịch thân, lá ớt, bổ sung nước cất vừa đủ

3.1.5 Các chủng sinh vật thử nghiệm

Cây ớt hiểm giống F1, 30 ngày tuổi được mua tại vườn ươm Thanh Tuyền (kiosquet số 06 Thành Thái, phường 14, quận 10, thành phố Hồ Chí Minh) Các cây ớt được chọn là cây khỏe mạnh, đồng đều về kích thước, không bị tổn thương cơ học hay nhiễm bệnh và chưa từng xử lý qua thuốc trừ sâu, thuốc diệt nấm hoặc bất kì chất hóa học nào.

Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng nấm in vitro bằng phương pháp hòa tan mẫu trong thạch

Khảo sát hoạt tính kháng nấm bước đầu được thực hiện để đánh giá sơ bộ khả năng kháng lại hai chủng nấm F oxysporum và F solani của các cao chiết và tinh dầu Các thí nghiệm được thực hiện dựa trên phương pháp của Do, Al-Hetar và Grover [56, 139, 140] với các thay đổi cho phù hợp Các cao chiết từ hương nhu, mùi già và trầu không được hòa tan trong DMSO và pha loãng với PDA đã được hấp tiệt trùng và để nguội đến 50 – 55 °C ở nồng độ 1.25 mg/mL Các tinh dầu hương nhu, đại hồi, mùi già, quế (gồm quế tổng và các phân đoạn Light, Middle, Cinnamaldehyde, Residue) và trầu không được hòa tan trong DMSO rồi pha loãng với môi trường PDA với nồng độ 0.22 mg/mL Chọn nồng độ 0.22 mg/mL cho các tinh dầu vì trong các đánh giá sơ bộ, tại nồng độ này các tản nấm mới bắt đầu phát triển để có thể theo dõi được hiệu lực ức chế Đối chứng dương Nystatin cũng được pha loãng tương tự với nồng độ 1.25 mg/mL để so sánh với khả năng kháng nấm của các mẫu thử Đối chứng âm là DMSO để đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi hòa tan mẫu lên khả năng kháng nấm của các mẫu thử Sau đó, 20 mL dịch đã hòa trộn với các mẫu cao, tinh dầu, đối chứng dương và đối chứng âm được đổ vào đĩa petri ỉ90 mm vụ trựng, để cho thạch nguội và đụng lại Cỏc đĩa chỉ chứa PDA được dựng để kiểm tra khả năng phát triển của các chủng nấm thử nghiệm trên môi trường nuôi cấy Các chủng nấm được nuôi cấy trước đó trên môi trường PDA đến 7 ngày tuổi Dựng dụng cụ đục lỗ kiểu nỳt chai lấy một tản nấm cú ỉ8 mm từ mộp rỡa của khuẩn lạc nấm sau đó đặt lên tâm các đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn, lặp lại 3 lần đối với mỗi nồng độ Các đĩa thí nghiệm được ủ ở nhiệt độ 28 °C, quan sát hình thái và đo đường kính tản nấm ở từng công thức thí nghiệm sau mỗi 24, 48, 72, 96 và 120 giờ Hiệu lực ức chế nấm được tính theo công thức Abbott [140]:

Trong đó: Dc là đường kính tản nấm trên đĩa đối chứng âm (mm); 8 là đường kính khoanh agar – nấm được cấy vào mỗi đĩa, Dt là đường kính tản nấm trên đĩa petri trộn mẫu thử (mm) tại thời điểm kiểm tra

3.2.2 Xác định giá trị MIC của các cao chiết và tinh dầu

Từ kết quả đánh giá sơ bộ khả năng kháng nấm của các cao chiết và tinh dầu bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, thí nghiệm xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các cao chiết và tinh dầu có khả năng kháng lại F oxysporum và

F solani được thực hiện Thí nghiệm xác định đường kính vòng ức chế được thực hiện trên cả hai chủng nấm Fusarium oxysporum và Fusarium solani dựa theo phương pháp của Yao và Tian [121] với một số điều chỉnh cho phù hợp

Nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 28 °C Sau 7 ngày nuôi cấy, nước muối sinh lý được sử dụng để thu bào tử và điều chỉnh độ đục tương ứng với 2x10 6 CFU/mL tại bước súng 530 nm 400 àL dịch bào tử được hũa trộn với 20 mL mụi trường PDA (ở 50-55 °C) Dịch đó hũa trộn được đổ vào đĩa petri ỉ90 mm vụ trựng, để cho thạch nguội và đông lại Các mẫu cao, tinh dầu và đối chứng dương được hòa tan trong DMSO theo các nồng độ như trong Bảng 2.1 Mỗi cao chiết và tinh dầu được hòa tan thành bốn nồng độ Các nồng độ này tương ứng với các kí hiệu a b c d trên từng lỗ trên đĩa thí nghiệm là sự giảm dần nồng độ Chứng âm là DMSO Khi mụi trường đụng lại, que sắt rỗng vụ trựng ỉ8 mm được sử dụng để đục lỗ trờn thạch, các lỗ không được quá gần nhau và gần mép đĩa Dùng micropipette cho vào mỗi lỗ thạch 75 àL dung dịch thử nghiệm ở những nồng độ đó chuẩn bị Khi đú, chất ức chế sẽ khuếch tán vào thạch và tạo thành các vòng ức chế Các đĩa thí nghiệm được ủ ở nhiệt độ 28 °C, theo dõi và đo đường kính vòng ức chế sau mỗi 48, 72 và 96 giờ

Bảng 2 1 Nồng độ mẫu thử kháng nấm in vitro

3.2.3 Xác định hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum in vivo trên cây ớt

Từ kết quả đánh giá in vitro khả năng kháng nấm của các cao chiết và tinh dầu bằng phương pháp khếch tán đĩa thạch và kết quả xác định giá trị MIC ở các thử nghiệm trên, nghiên cứu lựa chọn các cao chiết và tinh dầu cho hoạt tính kháng nấm tốt để tiến hành xác định hoạt tính kháng nấm in vivo trên thực tế cây ớt tại 30 ngày tuổi Các cây ớt chia ra thành các nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 cây, lặp lại 3 lần, đặt ở các khu vực khác nhau để tránh nhiễm chéo

Để tiến hành gây bệnh cho ớt, các cây khỏe mạnh, đồng đều ở tuổi 30 ngày được chọn Bào tử nấm Fusarium oxysporum với nồng độ 2x107 CFU/mL được sử dụng để gây bệnh, ủ trong 24 giờ trước khi phun Phương pháp gây bệnh theo Koch được áp dụng, kim tiêm vô trùng được dùng để tạo vết thương ở thân và rễ cây, sau đó dịch bào tử được đổ trực tiếp vào vết thương Các cây đối chứng không bị gây bệnh Quá trình phát bệnh được theo dõi và so sánh với cây đối chứng để đánh giá hiệu quả gây bệnh.

Cao chiết được pha chế với dung môi Tween 80 theo tỷ lệ nhất định rồi hòa tan trong nước đạt nồng độ kháng nấm đã xác định trước đó Sau đó, hỗn hợp được khuấy đều để tạo thành hệ nhũ tương ổn định Nước cất pha Tween 80 và Nystatin lần lượt là đối chứng âm và đối chứng dương Mỗi cây trong thí nghiệm được phun 10 mL dung dịch mẫu thử, sau đó quan sát, đánh giá hình thái và mức độ bệnh.

10, 15 ngày sau khi xử lí với dịch cao và tinh dầu Tỉ lệ bệnh trên cây ớt được đánh giá bằng phầm trăm diện tích lá bị héo rũ, ngả màu vàng, nâu như biểu hiện của bệnh [142] Hiệu lực ức chế của các mẫu thử được tính theo công thức Abbott [140]:

Trong đó: C là tỉ lệ bệnh trung bình ở lô đối chứng và T là tỉ lệ bệnh trung bình ở các nghiệm thức mẫu thử.

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Luận văn này được thực hiện nhằm mục đích đánh giá hoạt tính kháng nấm của một số dược liệu Việt Nam là hương nhu trắng, đại hồi, mùi già, quế và trầu không Chi nấm được chọn để thử nghiệm là Fusarium – chi nấm đứng thứ năm trong mười loại nấm gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với cây trồng Hai chủng nấm tiêu biểu trong chi Fusarium bao gồm Fusarium oxysporum gây héo rũ và Fusarium solani gây thối rễ và nông sản sau thu hoạch được chọn để tiến hành thử nghiệm khả năng kháng nấm của các cao chiết và tinh dầu Đầu tiên, các cao chiết và tinh dầu từ cành lá hương nhu, tinh dầu cành lá hồi, cao chiết và tinh dầu mùi già, tinh dầu cành lá quế, cao chiết và tinh dầu lá trầu không được thu thập và chuẩn bị cho các thử nghiệm Để có thể xác định hoạt tính kháng nấm của các cao chiết và tinh dầu từ năm loại dược liệu kể trên, luận văn này đã tiến hành các bước như sau:

 Đánh giá GC – MS các tinh dầu để xác định sự ảnh hưởng của thành phần các tinh dầu lên hoạt tính kháng nấm

Các nghiên cứu in vitro bao gồm khảo sát hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và xác định giá trị MIC của các cao chiết và tinh dầu thông đối với chủng nấm Fusarium oxysporum và Fusarium solani Ngoài ra, hoạt tính kháng nấm in vivo được đánh giá thông qua thử nghiệm trên cây ớt hiểm để kiểm tra khả năng bảo vệ cây trồng khỏi bệnh héo rũ do nấm gây ra.

Kết quả của các thử nghiệm này được trình bày cụ thể như các mục bên dưới.

Thành phần và hàm lượng các tinh dầu

Các mẫu cao chiết và tinh dầu từ hương nhu, cành lá hồi, mùi già và lá trầu không được chuẩn bị bởi nhóm nghiêm cứu của TS Lê Xuân Tiến Riêng các mẫu tinh dầu từ cành lá quế là sản phẩm của Công ty TNHH OXEYNS Các mẫu cao chiết và tinh dầu sau khi thu về được tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu hóa lý như độ ẩm, màu sắc, mùi… Các cao chiết từ hương nhu, mùi già, trầu không có màu đen, đặc sánh, có độ ẩm tương ứng là 18.56%, 15.23%, 14.86% và có mùi thơm nhẹ đặc trưng của từng loại nguyên liệu Các tinh dầu là tinh dầu tổng thu được từ quá trình chưng cất lôi cuốn hơi nước cành lá hương nhu, cành lá hồi, mùi già, cành lá quế và lá trầu không Các tinh dầu thu được đa số trong suốt, có màu vàng từ nhạt đến đậm dần trừ tinh dầu quế phân đoạn Residue có màu nâu đỏ và tinh dầu quế phân đoạn Light có màu vàng cam Tất cả các tinh dầu đều có mùi thơm đặc trưng và mùi đậm hơn khi so sánh với cao chiết cùng loại Màu của các tinh dầu được thể hiện trong Hình 4.1 bên dưới Các tinh dầu theo thứ tự từ trái sang phải lần lượt là tinh dầu trầu không, tinh dầu quế phân đoạn cinnamaldehyde, tinh dầu quế phân đoạn Residue, tinh dầu quế phân đoạn Middle (Q4), tinh dầu quế phân Light (Q2), tinh dầu quế tổng, tinh dầu mùi già, tinh dầu hồi và tinh dầu hương nhu

Hình 4 1 Các tinh dầu được sử dụng trong đề tài

(a) – Tinh dầu trầu không (b) – Tinh dầu quế phân đoạn cinnamaldehyde (c) – Tinh dầu quế phân đoạn Residue (d) – Tinh dầu quế phân đoạn Q4

(e) – Tinh dầu quế phân đoạn Q2 (f) – Tinh dầu quế tổng

(g) – Tinh dầu mùi già (h) – Tinh dầu hồi

Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ GC – MS được sử dụng để xác định hàm lượng các chất có trong các mẫu tinh dầu từ đó có thể đưa ra mối liên hệ giữa thành phần các chất có trong từng mẫu tinh dầu và hoạt tính kháng nấm của chúng Các thành phần trong mỗi tinh dầu được trình bày chi tiết trong các bảng bên dưới

Trong tinh dầu hương nhu trắng đã xác định được 36 hợp chất, đạt 96.231% tổng hàm lượng tinh dầu Trong đó, 4 thành phần chính là eugenol (36.59%) thuộc nhóm phenylpropene có hàm lượng lớn nhất, β-ocimene (17.59%), β-copaene (13.69%), và caryophyllene (6.66%) thuộc nhóm sesquiterpene có hàm lượng thấp hơn lần lượt Các chất còn lại chiếm tỉ lệ không đáng kể, dao động từ 0.04 – 2.54% So với các nghiên cứu trước đây, hàm lượng eugenol (36.59%) trong nghiên cứu này thấp hơn

Tỷ lệ eugenol trong tinh dầu hương nhu trắng ở phía nam Western Ghats và Belgaum của Ấn Độ chiếm 54.42% [143] và 75.1% [144], ở Uganda (Trung Phi) hàm lượng này là 56.4% [145] ở Ceará (Brazil) là 72.26% [146], còn ở Đắk Lắk và Thái Bình (Việt Nam) lần lượt là 65.135% [147] và 59.448% [148] Nguyên nhân của sự khác nhau này có thể là do nguồn gen, vị trí địa lý, thời gian và bộ phận thu hái, cây trồng hay hoang dại Hàm lượng eugenol trong tinh dầu là một trong những yếu tố quan trọng quyết định khả năng kháng nấm của nó Do đó, quan tâm đến hàm lượng eugenol để có thể tiến hành những so sánh về khả năng kháng nấm của các tinh dầu với nhau

Bảng 4 1 Thành phần tinh dầu hương nhu

Thời gian lưu Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

Thời gian lưu Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

27.713 (1R,2S,6S,7S,8S)-8-Isopropyl-1-methyl-3- methylenetricyclo[4.4.0.02,7]decane-rel- 1.693

Phân tích tinh dầu từ cành lá hồi xác định được 32 hợp chất, trong đó anethole chiếm thành phần chính với tỷ lệ 75,08% Anethole có khả năng kháng nấm Các hợp chất còn lại chiếm tỷ lệ nhỏ, dao động từ 0,11 – 4,77% Hàm lượng anethole thấp hơn so với tinh dầu quả hồi ở Quảng Tây và Thập Yển, Trung Quốc Sự khác biệt này có thể do nguồn gen, vị trí địa lý, thời gian thu hái, bộ phận thu hái và phương pháp chiết xuất tinh dầu.

Bảng 4 2 Thành phần tinh dầu cành lá hồi

Thời gian lưu Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

Thời gian lưu Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

19.437 1,6,10-Dodecatrien-3-ol, 3,7,11-trimethyl- 0.119 19.694 1-(4-Methoxyphenyl)propane-1,2-diol 0.309 22.029 1-(3-Methyl-2-butenoxy)-4-(1-propenyl)benzene 0.479

Trong tinh dầu mùi già, xác định được 36 chất chiếm 91.82% tổng hàm lượng tinh dầu Tinh dầu mùi già là sự góp mặt của nhiều andehyde, alcohol và terpenoid Trong đó, chiếm hàm lượng cao nhất là linalool với 16.42%, tiếp đến là các chất thuộc nhóm andehyde với 2-decenal, (E)- (15.83%) chiếm tỉ lệ cao nhất, 2-dodecenal (11.63%), decanal (9.75%) và (E)-tetradec-2-enal (6.24%) thấp dần lần lượt Trong khi đó, hợp chất 2-decen-1-ol (2.47%) chiếm thành phần chính trong nhóm các alcohol Khi so sánh với các nghiên cứu tiền đề, các thành phần chính như linalool, 2-decenal, (E)- đều thể hiện thành phần cao hơn Khi so sánh với tinh dầu mùi già ở Kenya, linalool chỉ chiếm 0.32% và 2-decenal, (E)- chiếm tỉ lệ tương ứng là 15.9% [150], trong khi đó tinh dầu mùi già ở Phú Thọ, Việt Nam biểu diễn hàm lượng linalool (15.30%) và 2-decenal, (E)- (12.92%) tương ứng [151], còn tinh dầu mùi già ở Lubin, Ba Lan linalool chỉ chiếm 0.3 – 1.1% và andehyde chiếm tỉ lệ cao nhất là E-2-dodecanol (16.67 – 17.8%) [152] Sự khác biệt này có thể là do nguồn gen, vị trí địa lý, thời gian và bộ phận thu hái cũng như phương pháp tách chiết và thu nhận tinh dầu tạo nên Chính điều này là cơ sở để có thể tiến hành so sánh và bàn luận về khả năng kháng nấm của các tinh dầu này với nhau

Bảng 4 3 Thành phần tinh dầu mùi già

Thời gian lưu Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

Thời gian lưu Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

Trong tinh dầu quế tổng, tinh dầu quế phân đoạn Middle và phân đoạn cinnamaldehyde, thành phần chiếm tỉ lệ nhiều nhất là cinnamaldehyde Đối với tinh dầu quế phân đoạn Light, (Z)-3-phenylacrylaldehyde chiếm tỉ lệ cao nhất và trong phân đoạn Residue, acetic acid- cinnamyl ester chiếm tỉ lệ cao nhất Cụ thể như trình bày trong bảng 3.5 bên dưới Trong tinh dầu quế tổng, xác định được 25 hoạt chất, chiếm 96.19% tổng hàm lượng tinh dầu và cinnamaldehyde chiếm hàm lượng cao nhất với 73.59% Trong phân đoạn Light, xác định được 27 chất, chiếm 97.27% tổng hàm lượng tinh dầu và (Z)-3-phenylacrylaldehyde chiếm hàm lượng cao nhất (60.05%) Trong phân đoạn Middle, xác định được có 15 hoạt chất, chiếm 98.84% tổng hàm lượng tinh dầu và (Z)-cinnamaldehyde với 87.73% là chất chiếm hàm lượng cao nhất Trong phân đoạn Residue, xác định được có 15 hoạt chất, chiếm 92.59% tổng hàm lượng tinh dầu và acetic acid, cinnamyl ester với 33.41% là thành phần chiếm hàm lượng cao nhất Trong phân đoạn cinnamaldehyde, xác định được 10 hoạt chất, chiếm 97.78% tổng hàm lượng tinh dầu và (Z)-cinnamaldehyde với tỉ lệ 86.97% là thành phần chính trong phân đoạn này Khi tiến hành so sánh với các tinh dầu quế trong các nghiên cứu khác, có thể thấy hàm lượng cinnamaldehyde của đa số tinh dầu cành lá quế ở các phân đoạn trong luận văn này cao hơn đáng kể Tinh dầu vỏ cành quế ở Đài Bắc, Đài Loan chứa 42.37% [153], các tinh dầu từ vỏ thân quế nhiều độ tuổi ở Quảng Đông, Trung Quốc cho hàm lượng cinnamaldehyde giao động từ 33.95% đến 76.4% [154], tinh dầu lá quế thu hái vào tháng 9, năm 2011 ở Yên Bái, Việt Nam chứa 90.08% là cinnamaldehyde [155] Sự khác biệt về hàm lượng aldehyde này trong tinh dầu có thể lí giải do đang tiến hành so sánh giữa các tinh dầu quế từ các bộ phận khác nhau của cây quế, thời gian, độ tuổi cây, vị trí địa lí cũng như cách thu thập tinh dầu quế khác nhau Tuy nhiên, từ các nghiên cứu này cũng như thành phần tinh dầu từ luận văn có thể thấy tinh dầu từ cành, lá, các cành lá ở vị trí thấp thường cho hàm lượng cinnamaldehyde cao hơn là tinh dầu từ vỏ quế

Bảng 4 4 Thành phần chính trong các tinh dầu quế

Phân đoạn Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

Tinh dầu quế tổng Cinnamaldehyde, (E)- 73.591

Phân đoạn Tên hoạt chất Diện tích peak (%) trans-13-Octadecenoic acid 1.622

(Z)-Cinnamaldehyde cis-Calamenene trans-13-Octadecenoic acid

(Z)-Cinnamaldehyde trans-13-Octadecenoic acid n-Hexadecanoic acid

Một nghiên cứu phân tích thành phần tinh dầu trầu không đã xác định được 42 hoạt chất chiếm 97,75% tổng hàm lượng tinh dầu Trong đó, các chất thuộc nhóm phenolic, phenolate và terpene chiếm tỷ trọng lớn Chavibetol là phenolic chính với hàm lượng cao nhất (31,94%), tiếp theo là allylpyrocatechol diacetate thuộc nhóm phenolate (8,33%), các terpene γ-muurolene và caryophyllene có hàm lượng thấp hơn lần lượt là 4,94% và 5,57% Tuy nhiên, thành phần tinh dầu lá trầu không tại Hậu Giang, Việt Nam có sự khác biệt nhất định với tinh dầu được đề cập trong nghiên cứu này, mặc dù các hoạt chất thuộc nhóm terpene, phenol và dẫn xuất phenol vẫn có mặt Allylpyrocatechol diacetate có tỷ lệ cao nhất (34,55%) trong tinh dầu Hậu Giang, tiếp theo là các terpene như 4-terpineol, γ-muurolene, δ-cadinene, (+)-taumuurolol và α-cadinol Ngoài ra, các dẫn xuất phenol như phenol, 2-methoxy-3-(2-propenyl) và acetyleugenol cũng có mặt trong tinh dầu này.

Lý và Trần Thị Hồng Vân (2010) về thành phần của tinh dầu trầu không vùng Nam

Bộ, allylpyrocatechol diacetate chiếm tỉ lệ cao nhất với 43.21%, phenol,2- methoxy- 4-(1-prophenyl)- với 19.28% và các terpene khác [157] Sự khác biệt về tỉ lệ thành phần này có thể lí giải là do tinh dầu được thu từ các khu vực địa lí, thổ nhưỡng khác nhau, thời gian thu hái nguyên liệu, phương pháp chưng cất tinh dầu riêng Bên cạnh đó, mức độ sự chuyển đổi của allylpyrocatechol diacetate thành chavibetol dưới tác dụng của enzyme có trong mỗi loại lá trầu không cũng khiến cho thành phần của dẫn xuất phenol này và chavibetol khác nhau giữa các tinh dầu được so sánh [158]

Hình 4 2 Cơ chế chuyển đổi allylpyrocatechol diacetate thành chavibetol

Trong đó: 1 – Chavibetol 2 – Chavibetol acetate

3 – Allylpyrocatechol diacetate 4 – Allylpyrocatechol a, b là 2 cơ chế thủy phân dưới tác dụng của enzyme Catechol-O-methyl transferase (COMT)

Bảng 4 5 Thành phần tinh dầu trầu không

Thời gian lưu Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

Thời gian lưu Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

12.308 1-(1-Ethyl-2,3-dimethyl-cyclopent-2- enyl)-ethanone 0.312

Thời gian lưu Tên hoạt chất Diện tích peak (%)

Hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp hòa tan mẫu trong thạch

Với mục đích xác định hoạt tính kháng nấm của các cao chiết và tinh dầu từ hương nhu, mùi già, trầu không và tinh dầu cành lá hồi, tinh dầu quế (tinh dầu tổng, tinh dầu các phân đoạn) lên các chủng nấm Fusarium oxysporum, Fusarium solani bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, các thí nghiệm được bố trí như mô tả ở mục 2 Cứ sau mỗi 24, 48, 72, 96 và 120 giờ, tiến hành đo đường kính tản nấm và xác định hiệu lực ức chế Kết quả được trình bày trong Bảng 4.6 và Bảng 4.7 Nhìn chung, kết quả sơ bộ cho thấy tất cả các cao chiết tại nồng độ 1.25 mg/mL và tinh dầu tại nồng độ 0.22 mg/mL đều có khả năng kháng lại F.oxysporum và F solani Trong đó, 1.25 mg/mL là nồng độ bão hòa của các cao chiết Tại nồng độ 0.22 mg/mL của các tinh dầu, mới bắt đầu có sự phát triển của các tản nấm để có thể theo dõi được hiệu lực ức chế (HLUC) Dựa trên kết quả thu được, cao chiết và tinh dầu mùi già hầu như không kháng được hai chủng nấm thử nghiệm Đồng thời các mẫu thạch đối chứng, đối chứng âm với DMSO không biểu hiện sự kháng nấm, chứng dương Nystatin tại nồng độ 1.25 mg/mL kháng nấm tốt là cơ sở để so sánh và bàn luận

Bảng 4 6 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum của các cao chiết và tinh dầu

Mẫu thử Đường kính tản nấm (mm) HLUC (%) sau 120 giờ 24h 48h 72h 96h 120h Đối chứng âm 13.8 27.3 40.8 52.0 60.7 0.00 ± 3.21 Đối chứng dương 9.4 13.1 15.8 18.7 21.4 74.52 ± 0.81

Cao hương nhu 13.5 23.5 35.8 45.8 56.0 8.48 ± 1.92 Cao mùi già 13.4 25.7 39.0 50.2 60.0 0.86 ± 1.71

Tinh dầu hồi 9.9 21.4 33.0 44.2 55.2 9.95 ± 0.40 Tinh dầu mùi già 10.6 23.5 35.7 46.5 58.0 4.67 ± 2.18 Tinh dầu quế tổng 8.0 19.6 28.8 39.3 49.9 20.18 ± 0.65 Tinh dầu quế Q2 9.7 20.7 30.9 41.3 50.4 19.16 ± 0.83 Tinh dầu quế Q4 8.8 19.1 28.7 39.2 50.4 19.16 ± 2.33

Tinh dầu quế Residue 9.8 19.6 30.3 39.2 48.1 23.55 ± 1.85 Tinh dầu trầu không 9.2 18.7 28.8 36.5 49.0 21.83 ± 2.13 Đối với F oxysporum, đa số các cao chiết và tinh dầu đều thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của tảng nấm sau 120 giờ, ngoại trừ cao chiết và tinh dầu mùi già hiệu quả ức chế là không đáng kể Trong khi đó, ở công thức đối chứng âm, sợi nấm phát triển đồng đều, xốp mịn và lan rộng và có màu đỏ tím đặc trưng, đạt đến đường kính 60.7 mm sau 120 giờ Thêm vào đó, có thể thấy trong 24 giờ đầu tiên, không có sự phát triển của các tản nấm trong các đĩa petri có phối trộn cao trầu không, tinh dầu hương nhu và các tinh dầu quế tổng

Hình 4 3 Kích thước tảng nấm Fusarium oxysporum sau 120 giờ

Trong số các cao chiết ở nồng độ 1,25 mg/mL, cao chiết lá trầu không có khả năng ức chế mạnh nhất đối với chủng nấm Fusarium oxysporum Hiệu lực ức chế sau 120 giờ lên đến 87,29 ± 3,50%, cao hơn 12,77% so với thuốc kháng nấm phổ rộng Nystatin (74,52 ± 0,81%) Ngược lại, các cao chiết hương nhu và mùi già ở nồng độ 1,25 mg/mL không cho thấy khả năng ức chế đáng kể sau 120 giờ.

Tinh dầu hương nhu có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm tản lá tốt nhất, tiếp theo là tinh dầu quế Tinh dầu trầu không, hồi và mùi già có hiệu quả ức chế không đáng kể So với chất chứng dương Nystatin, các loại tinh dầu đều có khả năng ức chế nấm F oxysporum thấp hơn Trong nhóm tinh dầu quế, tinh dầu cinnamaldehyde có tác dụng ức chế tốt nhất.

Hình 4 4 Đồ thị biểu diễn hiệu lực ức chế của các mẫu thử lên

Fusarium oxysporum theo thời gian

Nếu chỉ xét xu hướng thay đổi của hiệu lực ức chế lên F oxysporum, đồ thị ở

Hình 4.4 biểu diễn hiệu lực ức chế của các cao chiết và tinh dầu giảm dần theo thời gian ở hầu hết các mẫu thử Hiệu lực ức chế nhìn chung cao nhất là sau 24 giờ và giảm dần đến khi đạt 120 giờ Ở tất cả các mẫu cao chiết và tinh dầu, hiệu lực ức chế giảm mạnh từ 24 giờ sang 48 giờ Sau 48 giờ, xu hướng giảm hiệu lực ức chậm lại và hiệu lực ức chế bắt đầu ổn định hơn Điều này có thể lý giải là do sau 48 giờ, tốc độ phát triển của các tản nấm mới bắt đầu ổn định Dựa vào độ dốc của đường biểu diễn, có thể thấy hiệu lực ức chế của các cao chiết ổn định qua thời gian hơn là các tinh dầu Có thể lý giải trường hợp này là do khi hòa trộn các mẫu cao và tinh dầu vào trong môi trường nuôi cấy, các cao chiết có thể khuếch tán được vào môi trường một cách đồng đều Còn đối với các tinh dầu, chúng chứa các cấu tử dễ bay hơi, do đó, thời gian đầu, có thể tinh dầu đã bị bay hơi một phần trước khi kịp khuếch tán hoàn toàn vào môi trường (lưu ý nhiệt độ của Potato Dextrose Agar (PDA) khi phối trộn với tinh dầu là 50 – 55 °C, đĩa thạch cần mở nắp cho khô trước khi cấy tảng nấm 8 mm lên) Sau 48 giờ, khi này các thành phần kháng nấm đã phần nào ổn định trong môi trường và bắt đầu phát huy tác dụng Do đó, bấy giờ hiệu lực ức chế bắt đầu ổn định hơn Thêm vào đó, có thể thấy được sự thay đổi hiệu lực ức chế của các tinh dầu quế là khá tương đồng, các đường biểu diễn nằm gần nhau và có hình thái tương tự nhau trên biểu đồ Đối với Fusarium solani, hiệu lực ức chế của các cao chiết và tinh dầu cũng có xu hướng tương tự Tất cả các cao chiết và tinh dầu thử nghiệm đều cho khả năng ức chế sự phát triển của tản nấm sau 120 giờ ở nồng độ của cao chiết và tinh dầu thử nghiệm, trừ cao mùi già kháng với hiệu lực ức chế không đáng kể ( tinh dầu quế phân đoạn Middle > tinh dầu quế phân đoạn Light > tinh dầu quế tổng > tinh dầu hương nhu > tinh dầu trầu không > đối chứng dương Nystatin > cao trầu không > tinh dầu hồi Kết quả này hoàn toàn trùng khớp với thử nghiệm về khả năng ức chế sự phát triển tảng nấm trong thử nghiệm ở mục 4.2

Từ kết quả, hầu như tất cả các tinh dầu đều có khả năng kháng nấm F oxysporum tốt hơn đối chứng dương, trừ tinh dầu hồi và tinh dầu mùi già Các tinh dầu quế cho khả năng kháng F oxysporum cao nhất trong các tinh dầu là do sự có mặt của cinnamaldehyde và các dẫn xuất của nó Bên cạnh đó, tinh dầu hương nhu, cao chiết trầu không chứa nhiều eugenol và các terpene có khả năng kháng nấm như linalool, 1,8-cineole… Tinh dầu trầu không chứa nhiều chavibetol cùng dẫn xuất phenolate của nó cũng thể hiện hoạt tính kháng nấm tốt Sự chênh lệch về hàm lượng các chất này trong mỗi cao chiết và tinh dầu đã tạo nên khả năng kháng nấm khác nhau của mỗi mẫu thử Khi so sánh với các nghiên cứu khác, tinh dầu hương nhu sử dụng trong luận văn này có giá trị MIC lên chủng F oxysporum (0.07 mg/mL) cao hơn so với tinh dầu hương nhu ở Brazil trong nghiên cứu của Mohr và các cộng sự năm 2017, khi MIC của tinh dầu này là 0.0625 mg/mL [88] Điều này có thể lý giải là do sự chênh lệch về tỉ lệ và thành phần các chất trong hai tinh dầu hương nhu Trong khi tinh dầu hương nhu trong luận văn này có thành phần cao nhất là eugenol, các thành phần terpene chiếm tỉ lệ thấp hơn và không đáng kể, còn trong tinh dầu Brazil lại chứa chủ yếu là các terpene như linalool, 1,8-cineole được đánh giá là có khả năng kháng nấm mạnh [88] Từ sự khác biệt về thành phần cũng như sự tương tác giữa các chất trong tinh dầu đã ảnh hưởng đến khả năng ức chế F oxysporum của hai tinh dầu hương nhu Khi so sánh với tinh dầu trầu không trong nghiên cứu của Nguyễn và các cộng sự năm 2016, khả năng kháng F oxysporum của tinh dầu trầu không trong luận văn này có giá trị MIC thấp hơn (0.131 mg/mL) tương ứng với khả năng kháng nấm tốt hơn tinh dầu trầu không ở Hậu Giang trong nghiên cứu (MIC = 0.2 mg/mL) [156]

Bảng 4 9 Kết quả đường kính vòng ức chế nấm Fusarium solani của các cao chiết và tinh dầu

Mẫu thử Nồng độ (mg/mL) Đường kính vòng ức chế (mm)

Cao hương nhu Tất cả nồng độ - - -

Tinh dầu và cao mùi già Tất cả nồng độ - - -

Mẫu thử Nồng độ (mg/mL) Đường kính vòng ức chế (mm)

Mẫu thử Nồng độ (mg/mL) Đường kính vòng ức chế (mm)

0.131 14.3 8.6 - Đối chứng DMSO (-) 99.9 (%) - - - Đối chứng Nystatin (+) 1.50 23.6 19.7 19.7

Lưu ý, sau 24 giờ, chưa có sự phát triển của nấm trên môi trường PDA nên không được biểu diễn Kí hiệu “-” biểu thị cao chiết hoặc tinh dầu không có khả năng tạo vòng ức chế lên nấm tại nồng độ thử nghiệm

Hình 4 9 Khả năng kháng nấm Fusarium solani của các tinh dầu quế sau 72 giờ

Hình 4 10 Hiệu quả kháng Fusarium solani của các cao và tinh dầu sau 72 giờ

Theo thứ tự giảm dần nồng độ, các cao chiết và tinh dầu trong bảng 4.9 được sắp xếp theo thứ tự chữ cái abcd, tương ứng từ a là nồng độ cao nhất đến d là nồng độ thấp nhất.

Từ kết quả Bảng 4.9, hoạt tính kháng nấm của các cao chiết và tinh dầu lên nấm F solani lần lượt như sau: Cao trầu không có MIC 0,375 mg/mL sau 72 giờ; Tinh dầu hương nhu có MIC 0,07 mg/mL sau 48 giờ; Tinh dầu hồi có MIC là 0,133 mg/mL sau 48 giờ; Tinh dầu quế tổng hợp và phân đoạn Middle có MIC giống nhau, bằng 0,004 mg/mL sau 96 giờ; Phân đoạn cinnamaldehyde có MIC 0,004 mg/mL sau 48 giờ; Phân đoạn Residue có MIC 0,004 mg/mL sau 72 giờ; Phân đoạn Light có MIC 0,018 mg/mL sau 96 giờ; Tinh dầu trầu không có MIC 0,131 mg/mL sau 72 giờ; Trong khi đó, chứng dương Nystatin cho MIC 0,188 mg/mL sau 96 giờ Sắp xếp thứ tự khả năng kháng nấm F solani của các cao chiết và tinh dầu từ cao đến thấp như sau: Tinh dầu quế tổng > Tinh dầu quế phân đoạn Middle > Tinh dầu quế phân đoạn Residue > Tinh dầu quế phân đoạn Cinnamaldehyde > Tinh dầu quế phân đoạn Light > Tinh dầu hương nhu > Tinh dầu trầu không > Đối chứng dương Nystatin > Cao trầu không > Tinh dầu hồi.

Kết quả hoạt tính kháng Fusarium oxysporum trên cây ớt hiểm

Từ các kết quả thử nghiệm in vitro, luận văn tiến hành chọn cây ớt hiểm 30 ngày tuổi có kích thước đồng đều, phát triển tốt, không bị sâu bệnh hại để tiến hành gây bệnh để tiếp tục các thử nghiệm in vivo Trong thử nghiệm này, vì hạn chế về mặt thời gian và các thử nghiệm về độc lực của Fusarium solani không đáp ứng được khả năng gây bệnh trên cây, tiến hành chọn chủng nấm Fusarium oxysporum để tiến hành gây bệnh Từ các kết quả in vivo ở trên, tiến hành chọn cao chiết lá trầu không, tinh dầu hương nhu và tinh dầu quế phân đoạn cinnamaldehyde là các cao chiết và tinh dầu cho hoạt tính kháng mạnh cùng hiệu quả kinh tế cao để tiến hành phun lên cây Chứng dương là Nystatin Các cao chiết, tinh dầu, đối chứng âm, đối chứng dương được pha với Tween 80 theo tỉ lệ 1:2 và thêm nước đến khi đạt được nồng độ như trong Bảng 4.10 trước khi phun lên cây 10 mL các dung dịch mẫu thử được tiến hành phun lên mỗi cây Các dung dịch mẫu thử được phun lên cây sau khi gây bệnh 24 giờ [139, 140, 167]

Bảng 4 10 Nồng độ các mẫu thử trên cây ớt

Mẫu thử Nồng độ (mg/mL)

Tinh dầu quế phân đoạn cinnamaldehyde 0.035

Sau khi phun các dịch thử nghiệm 5, 10 và 15 ngày, tiến hành ghi nhận tỉ lệ bệnh và tính toán hiệu quả kháng nấm của từng mẫu thử Dấu hiệu bệnh được biểu hiện là lá cây bị héo rũ, chuyển vàng, mất vân lá, lá rụng hoặc thân cây bị hóa nâu có thể quan sát được bằng mắt thường hoặc khi quan sát mặt cắt ngang thân cây Để chắc chắn các dấu hiệu bệnh trên là do F oxysporum được gây bệnh nhân tạo trên cây gây nên, các mẫu thân, rễ cây được mang đi nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi quang học để làm đối chứng

Hình 4 11 Các biểu hiện bệnh của Fusarium oxysporum trên cây ớt a, b – Lá cây bị héo rũ c – Bề mặt thân cây khi bị hóa nâu d –Thân cây & mặt cắt thân bị hóa nâu (bên trái) khi so với cây khỏe mạnh (bên phải)

Hình 4 12 Các bào tử nấm trên mặt cắt thân & rễ cây nhiễm bệnh dưới kính hiển vi

Ngược lại, cây được đánh giá không bệnh khi so sánh với các cây trên các nghiệm thức đối chứng (không gây bệnh), cây phát triển bình thường, không xuất hiện các lá héo rũ, thân hóa nâu, cây bắt đầu ra hoa và kết trái và không thấy sự xuất hiện của tế bào nấm trong mặt cắt thân, rễ cây duới kính hiển vi

Hình 4 13 Cây trên nghiệm thức đối chứng, không gây bệnh

Hình 4 14 Mặt cắt rễ, thân cây khỏe mạnh dưới kính hiển vi

Kết quả cho thấy các cây bị nhiễm Fusarium oxysporum đều xuất hiện tình trạng héo rũ, thân nâu Cây đối chứng âm kém phát triển, thậm chí chết Ngược lại, cây đối chứng dương và được phun mẫu thử, đặc biệt là cao trầu không và tinh dầu quế, có tỷ lệ bệnh thấp và phát triển ổn định Các bảng dưới đây trình bày chi tiết hoạt tính kháng Fusarium oxysporum của các cao chiết và tinh dầu đã thử nghiệm, với ký hiệu "-" biểu thị mẫu thử không ức chế được nấm ở nồng độ thử nghiệm.

Bảng 4 11 Hoạt tính kháng nấm của mẫu thử trên cây ớt

5 ngày 10 ngày 15 ngày Đối chứng âm - - - - Đối chứng dương 0.375 24.97 ±1.43 27.87 ± 2.50 22.20 ± 2.50

Cao trầu không 0.375 97.90 ± 0.87 97.01 ± 1.42 83.73 ± 1.42 Tinh dầu hương nhu 0.140 46.13 ± 3.92 50.16 ± 3.92 42.04 ± 3.92

Tinh dầu quế phân đoạn cinnamaldehyde 0.035 95.74 ± 1.74 96.65 ± 1.97 83.40 ± 1.97

Cao chiết trầu không và tinh dầu quế cho hiệu lực ức chế tốt nấm mốc trên cây với tỷ lệ ức chế lần lượt là 97,90% và 95,74% tại nồng độ 0,375 mg/mL và 0,035 mg/mL Hiệu lực ức chế của cả hai mẫu giảm dần sau 5 ngày phun Tinh dầu hương nhu có hiệu lực ức chế thấp nhất (46,13%) tại nồng độ 0,140 mg/mL và giảm dần sau 15 ngày Tuy nhiên, nồng độ cao của tinh dầu hương nhu gây kích ứng trên cây, dẫn đến cháy lá và thu hút rệp sáp, ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.

Hình 4 15 Các nghiệm thức trên cây ớt sau 5 ngày phun mẫu a – Đối chứng (không gây bệnh) b – Đối chứng âm c – Đối chứng dương d – Tinh dầu quế phân đoạn cinnamaldehyde e – Tinh dầu hương nhu f – Cao chiết trầu không

Hình 4 16 Một số yếu tố gây nhiễu kết quả hoạt tính kháng nấm a – Hiện tượng cháy các lá ở ngọn khi nâng nồng độ tinh dầu hương nhu b – Rệp sáp gây héo vàng lá cây ớt