Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Khảo sát hoạt tính kháng nấm gây hại cho cây ớt của một số dược liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM GÂY HẠI CHO CÂY ỚT CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 8520301

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2024PHAN THỊ TƯỜNG VY

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TS Lê Xuân Tiến

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 PGS TS Nguyễn Thị Phương Phong (Chủ tịch hội đồng)2 PGS TS Trần Văn Hiếu (Ủy viên Phản biện 1)

3 PGS TS Hà Cẩm Anh (Ủy viên Phản biện 2)4 TS Phan Thị Hoàng Anh (Ủy viên hội đồng)5 TS Phan Nguyễn Quỳnh Anh (Thư ký hội đồng)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS TS Nguyễn Thị Phương Phong PGS TS Nguyễn Quang Long

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: PHAN THỊ TƯỜNG VY MSHV: 2171048 Ngày, tháng, năm sinh: 21/01/1999 Nơi sinh: Bình Định Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 8520301 I TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát hoạt tính kháng nấm gây hại cho cây ớt của một số dược liệu (Antifungal activity of some medicinal plants on chili pepper plants)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Chuẩn bị và thu các cao chiết và tinh dầu từ các dược liệu: hương nhu trắng,cành lá hồi, mùi già, cành lá quế, lá trầu không

 Đánh giá GC – MS các tinh dầu để xác các thành phần tinh dầu.

 Đánh giá hoạt tính kháng hai chúng nấm Fusarium oxysporum và Fusarium

solani của các cao chiết và tinh dầu thông qua các thử nghiệm:

o Khảo sát hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.o Xác định giá trị MIC của mỗi cao chiết và và tinh dầu.

o Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm in vivo trên cây ớt hiểm.

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: (Ghi theo QĐ giao đề tài) 04/09/2023 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo QĐ giao đề tài) 18/12/2023 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS Lê Xuân Tiến

TS Lê Xuân Tiến PGS TS Lê Thị Hồng Nhan

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

PGS TS Nguyễn Quang Long

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập tại Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG HCM nói chung và quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp này nói riêng, em đã không ngừng nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và động viên từ những người xung quanh Tất cả những điều đó đã làm cho em có cơ hội học hỏi thêm nhiều kiến thức chuyên sâu và có nhiều trải nghiệm thực tiễn quý báu Vì vậy, thông qua đây em muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến những người đã luôn sát cánh bên mình

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP.HCM, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Bộ môn Kỹ thuật Hóa hữu cơ, Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em có thể hoàn thành luận văn này

Thứ hai, em muốn dành lời cảm ơn này cho TS Lê Xuân Tiến, ThS Nguyễn Kim Minh Tâm, những giảng viên đã luôn đồng hành và dõi theo em trong suốt quá trình thực hiện luận văn Cảm ơn thầy, cô vì tất cả những kiến thức và tình cảm thầy, cô đã dành cho chúng em Tất cả sự quan tâm của thầy, cô là động lực to lớn nhất để em hoàn thiện đề tài luận văn của mình

Thứ ba, em xin được cảm ơn những người bạn, anh, chị, em của mình trong suốt thời gian qua Cảm ơn các thành viên của lab 108 đã luôn bên cạnh và giúp đỡ nhau trong ngần ấy thời gian Cảm ơn các bạn, các em trong team Rùa đã hỗ trợ hết mực cho mình trong suốt thời gian qua

Đặc biệt hơn hết, em xin dành lời cảm ơn này cho gia đình mình Cảm ơn gia đình luôn tin tưởng và ủng hộ mọi quyết định của con Cảm ơn ba mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc về vật chất và tinh thần cho con có thể chuyên tâm học tập và làm việc

Lời cảm ơn cuối cùng, em xin được gửi đến chính mình Cảm ơn bản thân đã không bao giờ từ bỏ Cảm ơn vì đã không ngừng nỗ lực, cố gắng để hoàn thiện hơn Do thời gian và trình độ còn hạn chế, luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được chỉ bảo và đóng góp ý kiến từ quý thầy cô để bài báo cáo

của em được hoàn thiện hơn

Phan Thị Tường Vy

TÓM TẮT

Luận văn này được tiến hành để khảo sát khả năng kháng nấm gây hại cho cây trồng của một số dược liệu Các dược liệu được chọn để thử nghiệm bao gồm: cành lá hương nhu, cành lá đại hồi, mùi già, cành lá quế và cành lá trầu không Các dược liệu được chọn để thu cao chiết và tinh dầu sau đó tiến hành khảo sát và đánh giá hàm lượng các hoạt chất cũng như khả năng kháng nấm Luận văn tiến hành khảo sát hoạt

tính kháng nấm của các cao chiết và tinh dầu lên hai chủng nấm là Fusarium

oxysporum gây héo rũ và Fusarium solani gây thối gốc, héo rũ và thối nông sản sau

thu hoạch Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính và hàm lượng hoạt chất được tiến hành song song với nhau Các tinh dầu được tiến hành phân tích bằng phương pháp Sắc kí

khí ghép khối phổ (GC – MS) Các thử nghiệm in vitro được tiến hành để khảo sát hoạt tính kháng nấm và giá trị MIC của các cao chiết và tinh dầu Các thí nghiệm in

vivo được tiến hành trên cây ớt hiểm 30 ngày tuổi Kết quả xác định hàm lượng các

hoạt chất trong tinh dầu bằng GC – MS cho thấy thành phần chính trong các tinh dầu lần lượt là eugenol chiếm 36.59% trong tinh dầu hương nhu, anethole chiếm 75,08% tinh dầu cành lá hồi, linalool chiếm 16.42% tinh dầu mùi già, cinnamaldehyde chiếm từ 73.59% đến 87.73% tinh dầu cành lá quế và chavibetol chiếm 39.94% tinh dầu lá

trầu không Các cao chiết và tinh dầu cho thấy khả năng kháng lại F oxysporum và

F solani với các giá trị MIC nằm trong khoảng từ 0.004 đến 0.533 mg/mL Đồng

thời các thử nghiệm in vivo trên cây ớt cũng cho thấy khả năng ức chế F.oxysporum

của các cao chiết và tinh dầu Hiệu lực ức chế của cao trầu không tại 0.375 mg/mL là 97.90 ± 0.87 (%), tinh dầu hương nhu tại nồng độ 0.140 mg/mL là 46.13 ± 3.92 (%) và tinh dầu quế phân đoạn cinnamaldehyde nồng độ 0.035 mg/mL tương ứng là 95.74 ± 1.74 (%) sau 5 ngày xử lí với mẫu Từ các kết quả thu được có thể thấy tiềm năng ứng dụng của các cao chiết và tinh dầu từ năm loại dược liệu được chọn để tiến hành thử nghiệm đồng thời mở ra hướng ứng dụng các dược liệu này vào việc bào chế các chế phẩm bảo vệ thực vật có nguồn gốc tự nhiên

ABSTRACT

The purpose of this thesis was to examine the potential of certain medicinal herbs to combat detrimental plant resistance The following medicinal herbs were chosen for

testing: Ocimum gratissimum L, Illicium verum L, Coriandrum sativum L.,

Cinnamomum cassia L., Piper betle L Their essential oils and extracts were collected

to assess the potential active ingredients The antimicrobial properties of extracts and

essential oils against two fungal strains: Fusarium oxysporum, causing wilt, and

Fusarium solani, causing root rot and fruit rot were tested In vitro tests were

conducted to investigate the antifungal ring diameter and MIC values of the extracts

and essential oils In vivo experiments were conducted on 30-day-old Siamese pepper

plants GC-MS analysis showed that the principal constituent of essential oils from

Ocinum gratissimum L., Illicium verum L., Coriadrum sativum L., Cinnamomum cassia L and Piper betle L were eugenol (36.59 %) , anethole (75.08 %) , linalool

(16.42 %) , cinnamaldehyde (73.59 – 87.73% and chavibetol (39.94 %), respectively The range of MICs against Fusarium oxysporum was found between 0.009 (cinnamaldehyde and middle fragments) to 0.533 mg/mL (Ollicium verum essential oil) and the one against Fusarium solani was from 0.004 (all fragments of

Cinnamomum cassia essential oil except light fragment) to 0.375 mg/mL (Piper betle

extract) compared to the MIC of 0.188 mg/mL of Nystatin The antifungal activity against Fusarium oxysporum on chili plants of Piper betle L extract was 97.90 ± 0.87 (%), of Ocimum gratissimum L essential oil was 46.13 ± 3.92 (%), of

Cinnamomum cassia L was 95.74 ± 1.74 (%) after 5-treatment-day The results

indicated the potential applications of extracts and essential oils derived from the five chosen medicinal herbs to produce natural fungicide

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, có sự hỗ trợ từ Giảng viên hướng dẫn là TS Lê Xuân Tiến Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các thực nghiệm Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng

Học viên thực hiện

Phan Thị Tường Vy

1.1 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.2 Đối tượng nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 4

2.1 Tổng quan về các chủng nấm thử nghiệm 4

2.1.1 Nấm gây héo rũ trên cây Fusarium oxysporum 4

2.1.2 Nấm gây bệnh thối gốc, cổ rễ Fusarium solani 5

2.1.3 Hình thức gây bệnh của Fusarium oxysporum và Fusarium solani trên cây……… 6

2.2 Tổng quan về thuốc diệt nấm 9

2.2.1 Phân loại 10

2.2.2 Tác động của các hợp chất gây độc đối với nấm 12

2.2.3 Tình hình nghiên cứu về thuốc diệt nấm sinh học đối với nấm gây hại trên cây trồng 13

2.3 Tổng quan về các dược liệu 15

2.3.1 Hương nhu trắng 15

2.3.2 Đại hồi 18

2.3.3 Mùi già 20

2.3.4 Quế 22

3.2 Phương pháp nghiên cứu 27

3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng nấm in vitro bằng phương pháp hòa tan mẫu trong thạch 27

3.2.2 Xác định giá trị MIC của các cao chiết và tinh dầu 28

3.2.3 Xác định hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum in vivo trên cây ớt.29CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

4.1 Thành phần và hàm lượng các tinh dầu 31

4.2 Hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp hòa tan mẫu trong thạch 42

4.3 Giá trị MIC của các cao chiết và tinh dầu 52

4.4 Kết quả hoạt tính kháng Fusarium oxysporum trên cây ớt hiểm 61

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

5.1 Kết quả 67

5.2 Kiến nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC 87

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Quy trình chưng cất phân đoạn tinh dầu quế 2

Hình 2 1 Nấm Fusarium oxysporum sau 7 ngày nuôi cấy trên PDA………4

Hình 2 2 Nấm Fusarium solani sau 7 ngày nuôi cấy trên PDA 5

Hình 2 3 Biểu hiện bệnh Fusarium oxysporum trên cây ớt 7

Hình 2 4 Biểu hiện của cây, quả bị nhiễm Fusarium solani 8

Hình 2 5 Cây hương nhu trắng – eugenol 16

Hình 2 6 Lá, quả hồi – anethole – tannin 19

Hình 2 7 Mùi già – linalool 21

Hình 2 8 Cành lá quế - cinnamaldehyde 22

Hình 2 9 Lá trầu không – chavibetol 24

Hình 4 1 Các tinh dầu được sử dụng trong đề tài……… 32

Hình 4 2 Cơ chế chuyển đổi allylpyrocatechol diacetate thành chavibetol 40

Hình 4 3 Kích thước tảng nấm Fusarium oxysporum sau 120 giờ 44

Hình 4 4 Đồ thị biểu diễn hiệu lực ức chế của các mẫu thử lên Fusarium oxysporum theo thời gian 45

Hình 4 5 Kích thước các tảng nấm Fusarium solani sau 120 giờ 48

Hình 4 6 Đồ thị biểu diễn hiệu lực ức chế của các mẫu thử lên Fusarium solani theo thời gian 49

Hình 4 7 Hiệu quả kháng Fusarium oxysporum của các tinh dầu quế sau 72 giờ 55

Hình 4 8 Hiệu quả kháng Fusarium oxysporum của các cao và tinh dầu sau 72 giờ 55

Hình 4 9 Khả năng kháng nấm Fusarium solani của các tinh dầu quế sau 72 giờ 60 Hình 4 10 Hiệu quả kháng Fusarium solani của các cao và tinh dầu sau 72 giờ 60

Hình 4 11 Các biểu hiện bệnh của Fusarium oxysporum trên cây ớt 62

Hình 4 12 Các bào tử nấm trên mặt cắt thân & rễ cây nhiễm bệnh dưới kính hiển vi 63

Hình 4 13 Cây trên nghiệm thức đối chứng, không gây bệnh 63

Hình 4 14 Mặt cắt rễ, thân cây khỏe mạnh dưới kính hiển vi 63

Hình 4 15 Các nghiệm thức trên cây ớt sau 5 ngày phun mẫu 65 Hình 4 16 Một số yếu tố gây nhiễu kết quả hoạt tính kháng nấm 66

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Thông số quá trình chưng cất các phân đoạn tinh dầu quế………3

Bảng 2 1 Nồng độ mẫu thử kháng nấm in vitro ……….29

Bảng 4 1 Thành phần tinh dầu hương nhu……….33

Bảng 4 2 Thành phần tinh dầu cành lá hồi 34

Bảng 4 3 Thành phần tinh dầu mùi già 36

Bảng 4 4 Thành phần chính trong các tinh dầu quế 38

Bảng 4 5 Thành phần tinh dầu trầu không 40

Bảng 4 6 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum 43

Bảng 4 7 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm Fusarium solani 47

Bảng 4 8 Kết quả đường kính vòng ức chế Fusarium oxysporum của các mẫu thử 52

Bảng 4 9 Kết quả đường kính vòng ức chế nấm Fusarium solani 57

Bảng 4 10 Nồng độ các mẫu thử trên cây ớt 62

Bảng 4 11 Hoạt tính kháng nấm của mẫu thử trên cây ớt 64

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DMSO Dimethyl sulfoxide

ED50 Effective dose Liều có hiệu quả trên 50% sinh vật thử nghiệm

GC-MS Gas Chromatography Mass Spectometry Sắc kí khí ghép khối phổ

LC50 Median lethal concentration Nồng độ gây chết 50 % số động vật thử nghiệm

MFC Minimum fungicidal concentration Nồng độ kháng nấm tối thiểu

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

PDA Potato Dextrose Agar Môi trường thạch dùng để nuôi cấy nấm

PDB Potato Dextrose Broth Môi trường lỏng dùng để nuôi cấy nấm

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Việt Nam có vị trí địa lý nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, địa hình nhiều đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu rất đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng Những yếu tố trên đã tạo nên các hệ sinh thái, thảm thực vật nhiệt đới phong phú và phát triển với khoảng 12 000 loài, trong đó có các loài mang nhiều giá trị mà ta chưa biết đến [1] Việc tìm ra, nghiên cứu và ứng dụng chúng đang là một vấn đề mà các nhà khoa học rất quan tâm Trong đề tài này, các dược liệu bao gồm hương nhu trắng, đại hồi, mùi già, quế và trầu không được tiến hành nghiên cứu để làm rõ hoạt tính kháng nấm và khả năng ứng dụng của chúng, cụ thể như sau:

1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Fusarium là một trong những chi nấm gây hại phổ biến nhất trên nông sản Chúng

đứng thứ năm trong mười chi nấm gây tử vong nhiều nhất ở thực vật Trong đó, hai

chủng Fusarium oxysporum và Fusarium solani, là hai chủng gây hại nhiều nhất trên

nông sản trong cả quá trình phát triển và bảo quản sau thu hoạch Để có thể giải quyết

các vấn đề do Fusarium gây ra cần nhiều các hợp chất hóa học, thuốc thử hoặc thiết

bị đòi hỏi chi phí cao Thêm vào đó, các chất này thường ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như để lại dư lượng trên nông sản làm ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Vì vậy, việc phát triển một chế phẩm diệt nấm có khả năng kháng nấm tốt, có nguồn gốc tự nhiên, sinh học, đáp ứng được nhu cầu của xã hội và bắt kịp xu hướng mới, hướng tới tạo ra các loại nông sản an toàn, có năng suất và chất lượng cao là mối quan tâm hàng đầu Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các chiết xuất từ các dược liệu như hương nhu, đại hồi, mùi già, quế, trầu không có khả năng kháng nấm tốt [2-6]

Tuy nhiên, những nghiên cứu chuyên sâu về việc kháng Fusarium từ các chiết xuất

này ở Việt Nam vẫn còn hạn chế Do đó, với mong muốn cung cấp thêm nhiều bằng chứng về khả năng kháng nấm cũng như bước đầu đề xuất công thức kết hợp các dược liệu này với nhau, làm tiền đề cho một chế phẩm kháng nấm sinh học, luận văn

này đã tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm in vitro, in vivo hoạt tính kháng nấm của

các cao chiết và tinh dầu từ năm loại dược liệu kể trên

1.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận văn này là các dược liệu như bên dưới:  Cành lá hương nhu trắng

 Cành lá đại hồi  Mùi già

 Cành lá quế

 Cành lá trầu không

1.3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu như đã đề ra ở trên, cần thực hiện các nội dung sau:  Chuẩn bị, thu các cao chiết và tinh dầu từ các dược liệu:

o Các cao chiết và tinh dầu bao gồm cao chiết và tinh dầu từ hương nhu trắng, tinh dầu cành lá hồi, cao và tinh dầu mùi già, cao và tinh dầu lá trầu không là các mẫu thử nghiệm được chuẩn bị bởi nhóm nghiên cứu của TS Lê Xuân Tiến

o Các tinh dầu từ cành là quế (tinh dầu tổng, các phân đoạn) là sản phẩm của Công ty TNHH OXEYNS, được chưng cất theo quy trình như bên dưới

Hình 1 1 Quy trình chưng cất phân đoạn tinh dầu quế

Điều kiện để thu các phân đoạn tinh dầu quế được thể hiện như trong bảng:

Bảng 1 1 Thông số quá trình chưng cất các phân đoạn tinh dầu quế

Phân đoạn Nhiệt độ đáy tháp chưng cất (°C)

Nhiệt độ đỉnh tháp chưng cất (°C)

Áp suất

(kPa) Lưu ý

Light (Q2) 127 – 128 94 - 108 -99 Middle (Q4) 127 – 128 108 - 110 -99

Residue (QR) 133 -99 Thu ở đáy  Đánh giá GC – MS các tinh dầu để xác định sự ảnh hưởng của các thành phần tinh dầu lên hoạt tính kháng nấm

 Đánh giá hoạt tính kháng hai chúng nấm Fusarium oxysporum và Fusarium

solani của các cao chiết và tinh dầu thông qua các thử nghiệm:

o Khảo sát hoạt tính kháng nấm in vitro bằng phương pháp khuếch tán trên

đĩa thạch

o Xác định giá trị MIC của mỗi cao chiết và tinh dầu

o Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm in vivo trên cây ớt hiểm

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về các chủng nấm thử nghiệm

2.1.1 Nấm gây héo rũ trên cây Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum thuộc họ Nectriaceae bộ Hypocreales là một mầm bệnh có

sẵn trong đất F oxysporum có thể gây bệnh trên hơn 100 loại cây trồng khác nhau

từ cà chua, chuối, ớt, bắp cải, khoai lang, thuốc lá, dưa hấu… đến các loại hoa như tulip, thủy tiên, cẩm chướng…và đứng thứ năm trong số mười mầm bệnh gây tử vong cao nhất ở thực vật [7] Các triệu chứng đặc trưng của bệnh bao gồm hiện tượng các mạch dẫn trong cây bị hóa nâu, lá bị héo, còi cọc, héo dần và rụng hay thậm chí có

thể làm chết cây Do đó F oxysporum gây ra thiệt hại không nhỏ tới năng suất và

chất lượng nông sản, đặc biệt là ở các vùng mang khí hậu nhiệt đới [8-12]

Nấm F oxysporum có thể sinh trưởng dễ dàng trên nhiều loại môi trường nhân tạo

Trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) , nấm mọc nhanh (có thể kín đĩa đường kính 9 cm trong vòng 7 ngày), tản nấm thường có màu hồng, cam, đỏ, tía sau khi cấy 4 - 5 ngày [8, 9, 13] Nấm hình thành ba loại bào tử vô tính cả trên môi trường nhân tạo hoặc trên cây bị héo chết: một là bào tử phân sinh lớn dạng đa bào (3 - 5 vách ngăn), hình trăng khuyết; hai là bào tử phân sinh nhỏ dạng đơn bào, hình oval hoặc hình thành từ bọc giả; ba là bào tử hậu dạng đơn bào hoặc thành cặp, vách dày, sức chống chịu tốt, hình thành từ sợi nấm hoặc từ bào tử phân sinh lớn [13, 14]

Hình 2 1 Nấm Fusarium oxysporum sau 7 ngày nuôi cấy trên PDA

a Mặt trên khuẩn lạc b Mặt dưới khuẩn lạc

2.1.2 Nấm gây bệnh thối gốc, cổ rễ Fusarium solani

Fusarium solani thuộc họ Nectriaceae bộ Hypocreales cũng là một mầm bệnh có

sẵn trong đất Cùng với F oxysporum, F solani là một trong những loại bệnh gây hại

nguy hiểm nhất đối với cây trồng Chúng ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng

nông sản, gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho người nông dân F solani gây

thối thân, cổ rễ cây thông qua các vết thương từ đó gây nên tình trạng héo rũ Trên cây non, nấm làm cho lá cây mất dần gân lá, héo rũ và rụng dần đến khi cây chết Ở cây trưởng thành, nấm gây héo rũ, còi cọc, hoa và quả kém phát triển [15-17]

Ngoài ra, F solani còn có khả năng gây hại cho nông sản sau khi thu hoạch thông

qua các vết thương trên củ, quả trong quá trình thu hoạch và xử lý sau thu hoạch Nấm làm cho nông sản bị mất dần độ cứng, không giữ được nước, nhũn và cuối cùng bị sợi nấm bao phủ [17, 18]

Nấm F solani có thể sinh trưởng dễ dàng trên nhiều loại môi trường nhân tạo

Trên môi trường PDA, nấm mọc nhanh (có thể kín đĩa 9 cm trong vòng 7 ngày), tản nấm có hình thể tơi xốp hoặc bằng phẳng trên môi trường nuôi cấy Mặt trên tản nấm có màu trắng, mặt dưới có màu kem Nấm hình thành ba loại bào tử vô tính cả trên môi trường nhân tạo hoặc trên cây bị héo chết: tiểu bào tử có dạng hình trụ hoặc hình trứng có thể có 1 vách ngăn hoặc không có vách ngăn, đại bào tử đa số có dạng hình liềm thường có 2 – 5 vách ngăn, bào tử áo đa số có dạng hình tròn [19, 20]

Hình 2 2 Nấm Fusarium solani sau 7 ngày nuôi cấy trên PDA

a Mặt trên khuẩn lạc b Mặt dưới khuẩn lạc

2.1.3 Hình thức gây bệnh của Fusarium oxysporum và Fusarium solani trên cây

Fusarium oxysporum là mầm bệnh tồn tại trong đất, từ đó chúng xâm nhập vào

cây thông qua các vết thương hở ở rễ, phần thân nằm gần mặt đất hoặc thông qua hạt giống bị nhiễm bệnh Điều kiện nhiệt độ từ 18 – 34 °C, ẩm độ cao thích hợp cho nấm phát triển Khi đã xâm nhập được vào vật chủ, nấm đi vào bó mạch và xâm chiếm các mô xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân Quá trình này gây nên các phản ứng trên cây, tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu Các hợp chất này làm cản trở quá trình vận chuyển nước từ rễ đến các bộ phận khác của cây Do đó gây ra các triệu chứng héo, hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn và thậm chí gây chết cây [21,

22] Sau khi F oxysporum xâm nhập vào vật chủ (cây), các triệu chứng ban đầu được

gây ra bao gồm: hiện tượng mất vân lá, héo rũ, còi cọc trên lá non, dần dần làm cây yếu rồi chết Trên cây trưởng thành, nấm gây héo vàng, hiện tượng hoa, quả phát triển bất thường và biểu hiện rõ nhất ở giai đoạn ra hoa Đồng thời, khi nấm xâm nhập, các mạch dẫn trong cây sẽ bị chuyển sang màu nâu Đôi khi, hiện tượng này không thể nhìn thấy khi quan sát hình thái thông thường nhưng có thể thấy rõ khi quan sát mặt cắt ngang thân cây Tuy héo là triệu chứng chủ yếu của bệnh và có thể quan sát được trên cây nhưng đây thực sự chỉ là triệu chứng thứ cấp, là hệ lụy của việc rễ và các mạch dẫn trong cây bị tổn thương dẫn đến mất nước Triệu chứng chính của bệnh phải là hiện tượng thân cây, các mạch dẫn bị chuyển sang màu nâu, chỉ được phát hiện khi quan sát mặt cắt ngang thân cây như đã trình bày ở trên Trong một số trường

hợp, F oxysporum còn có thể gây ra hiện tượng thối rễ, thối củ tại vị trí vết thương

ban đầu khi chúng xâm nhập vào vật chủ [23]

Trên cây ớt, mầm bệnh có thể tác động lên cây ngay cả ở thời điểm cây còn non và khi cây đã trưởng thành, ra hoa Ở cây non, bệnh làm cho cây còi cọc, vàng lá, héo dần và cuối cùng là chết Nếu mầm bệnh tấn công cây trưởng thành, hoa và quả của cây không phát triển bình thường Triệu chứng đặc trưng của bệnh là các lá già phía dưới bị vàng trước sau đó lan lên các lá trên Triệu chứng héo rũ hoặc biến vàng có thể xuất hiện ở một vài cành trên cây hay cả cây Lá của các cây bị nhiễm bệnh sẽ bị vàng, héo và sau đó cây sẽ chết Các tế bào cắt ngang thân cây bị bệnh thường hóa

nâu Triệu chứng điển hình thường thấy là phần thân sát mặt đất có vết nấm tạo thành mảng trên bề mặt làm phá hủy hệ thống mạch dẫn của cây làm cho cây héo và chết Chúng phát triển mạnh ở ngưỡng nhiệt 25 – 30 °C [12]

Hình 2 3 Biểu hiện bệnh Fusarium oxysporum trên cây ớt

Fusarium solani cũng là một mầm bệnh trong đất tương tự như F oxysporum

Chúng xâm nhập vào trong cây thông qua các vết thương hở do các nông cụ trong quá trình chăm sóc hoặc vết thương của tuyến trùng chích hút tạo ra Các vết thương

này làm giảm khả năng miễn dịch của bộ rễ, từ đó tạo điều kiện cho nấm F solani

xâm nhập gây hại Nấm có thể gây bệnh cho cây cả khi còn non và khi đã trưởng thành Biểu hiện trên lá: khi cây mới phát bệnh thì gân lá già có màu vàng nhạt, phiến lá ngả sang màu vàng cam, lúc đầu rải rác từng lá càng về sau càng nhiều Lá dễ rụng khi có gió hoặc lấy tay rung nhẹ thân cây Bệnh càng nặng lá vàng và rụng càng nhiều Bệnh có thể xuất hiện trên 1 – 2 cành hoặc toàn bộ cây Biểu hiện trên rễ: các rễ ngay dưới cành bị bệnh sẽ hóa nâu và thối, tuột vỏ, rễ nhỏ thối trước sau đó lan dần đến các rễ lớn, có thể xuất hiện tơ nấm trắng Ngoài ra bệnh có thể tấn công ngay phần cổ rễ sau đó gây ra các triệu chứng đặc trưng như rễ kém phát triển và đổi màu, từ đó cây không hấp thu chất dinh dưỡng làm lá bị héo và hóa vàng, cuối cùng gây chết Trên nông sản sau thu hoạch, nấm làm cho nông sản bị mất dần độ cứng, mô bị nhiễm bệnh chuyển sang màu nâu sẫm Bên trong củ, quả bị bệnh cho thấy các tổn thương có thể kéo dài vào trung tâm, do đó củ, quả không giữ được nước, nhũn và cuối cùng bị sợi nấm bao phủ [20]

Trên quả cà chua sau thu hoạch, F solani được ghi nhận là loài gây thối quả điển hình, chiếm 34% tỉ lệ gây bệnh trên tổng các loài thuộc chi Fusarium [24] Các sợi nấm F solani có thể dễ dàng thâm nhập sâu vào bên trong trái thông qua các vết

thương Hệ sợi nấm mở rộng vào trung tâm của quả, làm giảm nhanh độ cứng, các mô bị mục nát, sũng ướt và bị bao phủ bởi hệ sợi nấm màu trắng [18]

Hình 2 4 Biểu hiện của cây, quả bị nhiễm Fusarium solani

Nhìn chung, cả hai chủng nấm F oxysporum và F solani đều gây nên hiện tượng

héo rũ thứ phát trên cây trồng, ảnh hưởng đến sự phát triển của hoa và quả, củ Từ đó, làm giảm năng suất và gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho người nông dân

Nhiều khảo sát đã chỉ ra, các nấm thuộc chi Fusarium đặc biệt là F oxysporum và F

solani là hai loài gây bệnh héo phổ biến nhất, làm giảm năng suất của cây trồng đặc

biệt ở các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Pakistan, Ai Cập, Việt Nam, Thái Lan… Cụ thể, chúng gây thiệt hại khoảng 40% trên tổng sản lượng ớt ở Ấn Độ, gây bệnh trên 21.9% diện tích cây trồng ở Pakistan, 79% sản lượng ớt ở Thái Lan, 56% lượng nông sản ở Ai Cập và 3.25% diện tích chuối tại Khu liên hợp Nông nghiệp Snuol Campuchia – Việt Nam trong giai đoạn cuối năm 2020 đầu năm 2021…[25-29]

Tuy nhiên, các mầm bệnh của hai chủng nấm này có thể tồn tại lâu trong đất lên đến 7 năm và rất khó để loại bỏ triệt để Việc sử dụng các biện pháp trị thường tốn kém, còn sử dụng các chất hóa học trong thời gian dài sẽ gây tồn dư trên nông sản và gây ô nhiễm môi trường Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất, sản phẩm

có nguồn gốc từ tự nhiên, có khả năng ức chế, phòng, chống tốt F oxysporum và F

solani có ý nghĩa vô cùng thiết thực trong nông nghiệp Điều này không chỉ góp phần

trong công tác bảo vệ thực vật mà còn bảo quản tốt nông sản sau thu hoạch Từ đó có hiệu quả trong việc tránh thất thoát và suy giảm chất lượng nông sản Đồng thời cũng giúp bảo vệ môi trường và sức khỏe con người Đó cũng chính là một trong những mục tiêu của luận văn này

2.2 Tổng quan về thuốc diệt nấm

Thuốc diệt nấm là những hóa chất được dùng để tiêu diệt hoặc cản trở sự phát triển của nấm ký sinh hoặc bào tử của chúng [30] Hiện nay có khoảng 150 chất diệt nấm, phần lớn là các chất hữu cơ được phát hiện và tổng hợp Các chất này có tác dụng bảo vệ cây khỏi sự nảy mầm và sự xâm nhập của nấm vào mô cây Trong quá khứ, các hợp chất lưu huỳnh, đồng, thủy ngân thường được sử dụng để trừ bệnh Tuy nhiên, các hợp chất lưu huỳnh và đồng làm một số cây nhạy cảm mọc chậm lại Do đó, các hợp chất hữu cơ được tổng hợp để thay thế, chúng có hiệu lực cao hơn và ít độc hơn Dựa vào đối tượng và phương thức tác động, thuốc diệt nấm được chia thành bốn nhóm chính: Polyene, Azole, Allylamine, Echinocandin Ngoài ra, còn có Griseofulvin và Flucytosine [31]

Tuy nhiên, các thuốc diệt nấm hóa học phần nào ảnh hưởng đến cây trồng, môi trường và sức khỏe con người Thuốc diệt nấm có thể gián tiếp có hại cho sức khỏe con người do các loại lương thực, rau quả thu hoạch từ các loại cây trồng có sử dụng thuốc diệt nấm Từ đó, các hóa chất này có thể gây ra dị ứng, các triệu chứng hoặc bệnh không mong muốn trên cơ thể Chúng cũng có thể là hiểm họa tiềm tàng cho các hệ sinh thái do nó có thể bị rửa trôi và gây ô nhiễm môi trường nước, đất cũng như tích lũy sinh học và làm gia tăng độc tính đối với các sinh vật sống trong hệ sinh thái [32, 33] Đồng thời, chúng cũng gây ra nguy cơ kháng thuốc diệt nấm từ quá trình sử dụng lâu dài hoặc kết hợp nhiều loại thuốc [34]

Ngày nay, cùng với sự phát triển của nông nghiệp bền vững, việc ứng dụng các hợp chất tự nhiên có hoạt tính mạnh trong việc kháng nấm vào bào chế nên các chế phấm thuốc diệt nấm ngày càng được quan tâm Do đó, việc phát triển các chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc tự nhiên sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho người sản xuất như: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu tư, làm đất không

bị bạc màu, thân thiện với môi trường sinh thái, không ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và vật nuôi, góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả [35, 36]

2.2.1 Phân loại

2.2.1.1 Nhóm Polyene

Polyene là nhóm thuốc kháng nấm lâu đời nhất, đặc trưng bởi một vòng macrolide được đóng kín bằng một ester nội phân tử hoặc một vòng lactone [37] Nhờ trong công thức phân tử có chứa các liên kết đôi kị nước, các Polyene có khả năng gắn chọn lọc vào ergosterol trên màng tế bào nấm Từ đó làm cho cấu trúc màng sinh chất thay đổi, các đại phân tử và ion trong tế bào thoát ra ngoài khiến tế bào nấm bị phân giải Các loại thuốc kháng nấm Polyene được sử dụng phổ biến là Amphotericin B,

Nystatin, Natamycin… chống lại các chủng nấm như Candida albicans,

Aspergillusspp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum…[38] 2.2.1.2 Nhóm Azole

Azole là nhóm thuốc kháng nấm được sử dụng phổ biến nhất [38] Chúng gắn lên

enzyme cytochrome P450 và ức chế enzym 14--demethylase để ngăn tổng hợp

ergosterol và các lipid khác của màng tế bào nấm, làm rối loạn chức năng màng và ức chế nấm tăng trưởng [39] Tùy theo số lượng phân tử nitơ trong cấu trúc vòng hữu cơ của chúng mà Azole chia thành các Imidazole (chứa 2 nguyên tử Nitơ như Clotrimazole, Miconazole, Ketoconazole, Econazole, Bifonazole, Isoconazole ) và Triazole (chứa 3 nguyên tử nitơ như Itraconazole, Voriconazole, Fluconazole, Terconazole, Posaconazole ) [40] Các Azole được sử dụng rộng rãi để chống lại

các bệnh liên quan đến các chủng nấm Candida, Cryptococcus, Pityrosporum,

Aspergillus, Sporotrichum, Histoplasma, Blastomyces…[40-43] 2.2.1.3 Nhóm Allylamine

Thuốc kháng nấm nhóm Allylamine là thuốc làm ức chế quá trình sinh tổng hợp ergosterol bằng cách ức chế sự hình thành squalene epoxidase [44] Nhiều nghiên cứu cho thấy độ dung nạp và độ an toàn của thuốc cao Hai Allylamine được sử dụng

nhiều nhất trong kháng nấm là Terbinafin và Naftifin để chống lại các chủng như

Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae…[45, 46] 2.2.1.4 Nhóm Echinocandin

Echinocandin là nhóm thuốc trị nấm mới, diệt nấm bằng cách ức chế enzyme

-1,3-D-glucan synthase tham gia tổng hợp -glucan trên thành tế bào của nấm [46] Do đó chúng có khả năng phá vỡ tế bào nấm Thuốc có phổ tác dụng rộng, cả nấm

men (trừ C neoformans), nấm sợi và nấm lưỡng dạng Một số loại thuốc nhóm

Echinocandin là: Anidulafungin, Caspofungin, Micafungin…[47]

2.2.1.5 Nhóm các thuốc diệt nấm Griseofulvin và Flucytosine

Các thuốc kháng nấm này có cơ chế tác động khác với các loại thuốc trên, chúng bao gồm hai nhóm thuốc thế hệ mới là Griseofulvin và Flucytosine Nhóm

Griseofulvin gồm các thuốc kháng nấm được phân lập từ Penicillium griseofulvum

[48] Chúng có tác dụng ngăn không cho tế bào nấm phân chia đồng thời làm rối loạn cấu trúc và chức năng của vi ống (microtubule) [49, 50] Tuy nhiên, chúng chỉ có tác

dụng với các chủng Trichophyton, Microsporum và Epidermophyton [46] Nhóm

Flucytosine là một pyrimidine có fluor, tan trong nước Chúng chống nấm bằng cách ngăn tế bào nấm tạo ra nucleic acid và protein khiến nấm không phát triển được

Flucytosine được dùng trong chống lại các loại nấm men như Candida, Cryptococcus

và thường được dùng kết hợp với Amphotericin B [46, 51]

2.2.1.6 Nhóm các thuốc diệt nấm có nguồn gốc tự nhiên

Nhóm các thuốc diệt nấm có nguồn gốc tự nhiên thường sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên, sinh học để diệt trừ nấm hại Chúng thường được chia thành các dạng sau: các thuốc diệt nấm từ các chiết xuất động, thực vật (cao chiết, tinh dầu…), thuốc diệt nấm phân lập từ các hoạt chất trong chiết xuất thực vật và thuốc diệt nấm từ vi sinh vật…

Thuốc diệt nấm từ các chiết xuất động, thực vật: là các sản phẩm được tách chiết từ các động, thực vật, có đặc tính kháng nấm gây hại như dịch chiết, tinh dầu,

chitosan… Một số ví dụ cho dạng thuốc diệt nấm này như dầu neem, chiết xuất tỏi, tinh dầu tràm trà, chitosan…[52-56]

Thuốc diệt nấm vi sinh: là các thuốc diệt nấm sử dụng các tác nhân như vi khuẩn,

virus, nấm khác hoặc các sản phẩm chuyển hóa của chúng như enzyme chitinase,

glucanase để kháng lại nấm bệnh Trong nhóm vi khuẩn, một số chủng như Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, và xạ khuẩn Streptomyces có khả năng tạo ra các

hợp chất ức chế sự phát triển của nấm hoặc thúc đẩy tăng trưởng thực vật và tạo ra sức đề kháng toàn thân chống lại mầm bệnh nấm [57-60] Nhiều virus có khả năng tác động và tiêu diệt các tác nhân gây nấm hoặc nấm bệnh được sử dụng như một chất đối kháng để diệt nấm [61] Một số chủng nấm và sản phẩm chuyển hóa của chúng có thể hoạt động như thuốc diệt nấm sinh học bằng cách ký sinh hoặc cạnh tranh với nấm gây bệnh từ đó tiêu diệt nấm bệnh Một ví dụ cho dạng này là nấm

Trichoderma kí sinh ở vùng rễ có khả năng sản sinh enzyme chitinase, glucanase từ

đó có khả năng kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium….[62]

2.2.1.7 Nhóm các chất diệt nấm khác

Ngoài các cách phân loại trên, khi thuốc diệt nấm tác động lên các nấm gây hại trên cây trồng, chúng còn được phân loại thành: thuốc diệt nấm tiếp xúc và hấp thụ Thuốc diệt nấm tiếp xúc giết chết nấm khi được phun trên bề mặt lá hoặc thân bị nhiễm nấm và thuốc không thấm vào mô Thuốc đóng vai trò như một lá chắn, bao phủ bên ngoài cả lá hoặc thân cây [63] Thuốc diệt nấm hấp thụ sẽ thấm qua lớp mô của cây và thuốc lưu thông trong cây để kiểm soát bệnh Thuốc diệt nấm hấp thụ có thể được sử dụng để ngăn chặn bệnh sau khi nó đã lây nhiễm cho cây [47]

2.2.2 Tác động của các hợp chất gây độc đối với nấm

2.2.2.1 Sự xâm nhập và di chuyển của các hoạt chất

Đối với các nấm hại, khả năng gây độc của các chất dựa trên tương quan về độ tan, độ hấp phụ và độ khuếch tán của nó so với bề mặt chất nguyên sinh hoặc màng

tế bào Chênh lệch càng cao, chất càng dễ đi qua màng tế bào để xâm nhập và phá hủy tế bào nấm [38, 40, 64-66]

2.2.2.2 Các hình thức tác động của chất độc

Sau khi đi vào bên trong tế bào nấm hại, các chất độc có bốn hình thức tác động lên chúng, bao gồm: tác động cục bộ hoặc toàn bộ, tác động tích lũy, tác động liên hợp và tác động đối kháng [67] Tác động cục bộ xảy ra khi chất độc chỉ gây ra những biến đổi tại những mô mà chất độc trực tiếp tiếp xúc Tác động toàn bộ khi chất độc xâm nhập vào bào tử và loang ra khắp cơ thể, tác động đến cả những cơ quan ở xa Tác động tích lũy xảy ra khi nấm tiếp xúc với chất độc nhiều lần làm cho quá trình hấp thu nhanh hơn quá trình bài tiết Tác động liên hợp xảy ra khi hai hay nhiều chất kết hợp với nhau, làm cho hiệu lực của chúng tăng Tác động liên hợp gồm hai dạng là gia cộng (hiệu ứng của hỗn hợp bằng tổng các tác động riêng lẻ) và nâng cao tiềm thế (hiệu ứng của hỗn hợp vượt quá tổng hiệu ứng riêng của từng chất cộng lại) Tác động đối kháng xảy ra khi kết hợp các chất độc lại với nhau, chất độc này sẽ làm giảm độ độc của chất độc kia [67]

2.2.3 Tình hình nghiên cứu về thuốc diệt nấm sinh học đối với nấm gây hại trên cây trồng

Năm 1997, Chris và Ian đã nghiên cứu khả năng chống lại 15 mầm bệnh phổ biến

trên cây trồng của tinh dầu Monarda citriodora và Melaleuca alternifolia Cả 2 tinh dầu thử nghiệm đều cho kết quả kháng nấm cao, trong đó tinh dầu Monarda

citriodora cho tác động mạnh hơn [68]

Năm 2009, Halit Aladag và cộng sự nghiên cứu khả năng kháng các chủng nấm

Candida albicans, Candida glabrata, Candida kruseii, Candida parapsilosis và Candida dubliensis của dịch chiết từ lá trà xanh (Camellia sinensis L.) Kết quả chỉ

ra rằng dịch chiết methanol cho khả năng kháng tốt đối với tất cả các chủng Candida thử nghiệm Trong đó, kháng tốt nhất chủng Candida albicans với đường kính vùng

ức chế lớn hơn 17 mm [69]

Năm 2010, Charoenporn và các cộng sự tiến hành đánh giá hoạt tính kháng nấm

Fusarium gây héo trên cà chua ở Thái Lan của các công thức thuốc diệt nấm sinh học

từ các chủng nấm đối kháng với Fusarium Các chủng nấm đối kháng được sử dụng để chống lại Fusarium bao gồm Chaetomium globosum N0802, Chaetomium

lucknowense CLT và Trichoderma harzianum PC01 Các chủng nấm đối kháng được

chiết với hexan, ethyl acetate và methanol sau đó thử khả năng ức chế sự sản sinh bào

tử của Fusarium oxysporum f sp lycopersici Trong đó, Chaetomium globosum

N0802 chiết bằng hexan cho hiệu quả ức chế tốt nhất với giá trị ED50 là 157 µg/mL,

tiếp theo là Chaetomiumlucknowense CLT chiết bằng hexane và Trichoderma

harzianum PC01 chiết với methanol với giá trị ED50 lần lượt là 188 và 192 µg/mL Các chủng nấm đối kháng tiếp tục được điều chế dưới dạng công thức huyền phù

trong alginate và calcium gluconate 0.1 M để thử khả năng ức chế Fusarium trên cây

cà chua Các công thức đều thể hiện khả năng giảm tỉ lệ héo rũ trên cà chua một các

đáng kể Trong đó, công thức với Chaetomium globosum N0802 kháng tốt nhất, giảm được 44.68% bệnh và tiếp theo lần lượt là Trichoderma harzianum PC01 (41.01%),

Chaetomium lucknowense CLT (36.28%) khi so sánh với đối chứng dương là thuốc

diệt nấm prochoraz (21.95%)

Năm 2012, Javed và cộng sự thử nghiệm hoạt tính kháng lại các chủng nấm

Aspergillus flavus Link ex Grey, Aspergillus fumigatus Fres., Aspergillus nidulans Eidam ex Win và Aspergillus terreus Thom của các dịch chiết (nước, methanol,

chloroform) và tinh dầu lá Eucalyptus citriodora Hook Kết quả cho thấy khả năng

ức chế sự phát triển nấm của chiết xuất methanol (14.5%) là tốt nhất, tiếp theo là tinh dầu (12.9%), chiết xuất chloroform (10.15%) và chiết xuất nước (10.0%) [70]

Năm 2012, Euloge và cộng sự tiến hành đánh giá khả năng ức chế Aspergillus

flavus và Aspergillus parasiticus được phân lập từ cây đậu phộng của tinh dầu chiết

xuất từ lá Ocimum canum Giá trị MIC của tinh dầu đối với các độc tố từ Aspergillus

flavus và Aspergillus parasiticus lần lượt là 1.5 và 2.0 g/mL Giá trị MFC trên các

chủng này lần lượt là 2.0 và 2.5 g/mL [71]

Năm 2012, Ghassan và các cộng sự đánh giá khả năng kháng nấm Penicillium

digitatum của các chiết xuất từ lá neem (Azadirachta indica L.), ớt (Capsicum frutescence L.), lá mướp sát (Cerbera odollam L.), sả chanh (Cymbopogon nardus

L.) và gừng (Zingiber ocinale L.) với mục đích tìm ra chiết xuất có thể thay thế các

loại thuốc diệt nấm tổng hợp Kết quả cho thấy chiết xuất từ neem, ớt và mướp sát có

vùng ức chế hoàn toàn Penicillium digitatum ở nồng độ 3000 ppm Trong điều kiện

bảo quản quả sau thu hoạch, neem, ớt, mướp sát cho khả năng ngăn chặn sự phát triển của sợi nấm ở các nồng độ 4000 và 5000 ppm Từ đó Ghassan và các cộng sự kết luận các chiết xuất này tiềm năng lớn trong việc phát triển thành các sản phẩm sinh học bảo vệ nông sản, thay thế cho các thuốc diệt nấm tổng hợp [72]

Năm 2015, Zaida và cộng sự phát hiện ra tinh dầu chiết xuất từ 2 loài Agastache

mexicana ssp Xolocotziana và Porophyllum linaria có khả năng chống lại 11 chủng

nấm phân lập từ lúa mì Kết quả cho thấy, các tinh dầu từ A mexicana cho giá trị MIC trong khoảng 0.3 đến 30 g/mL và P linaria là 0.0069 đến 0.92 g/mL trên

các chủng nấm thử nghiệm [73]

Năm 2016, Dawa và cộng sự nghiên cứu về khả năng kháng Colletotrichum

musae (thán thư) hại chuối của dịch chiết từ 42 loại thực vật tự nhiên Kết quả cho

thấy, -curcumene và zingerone có trong dịch chiết củ gừng (Zingiber officinale

Roscoe) là nguyên nhân giúp cho hoạt tính kháng nấm của loài này tốt nhất trong các

và không có chất nhầy bao quanh khi cho vào nước Hương nhu trắng được tìm thấy ở cả châu Á, châu Phi và Nam Mỹ [75, 76], được trồng phổ biến ở các vùng nhiệt đới như Brazil, Ấn Độ, Việt Nam, Nigeria, Cameroon…và Nam Phi [2] Ở nước ta, hương nhu trắng mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi trên cả nước

Hương nhu trắng, đặc biệt là tinh dầu có chứa nhiều các hợp chất như eugenol (thành phần chính, chiếm khoảng 70 – 95%), linalool (khoảng 1 – 2%), thymol, citral, geraniol, camphor, -farnese, -bisabolene, -pinene…[2, 77, 78] Chính nhờ sự có mặt của những thành phần này giúp cho hương nhu trắng có nhiều công dụng trong việc điều trị các bệnh liên quan đến răng miệng, hô hấp, giun sán, đau dạ dày, thấp khớp hay kháng ung thư và đặc biệt có hiệu quả trong việc kháng khuẩn và kháng nấm…[79-84]

Hình 2 5 Cây hương nhu trắng – eugenol

Năm 2005, Lemos, Janine cùng các cộng sự tiến hành xác định hoạt tính kháng nấm của các dịch chiết ethanol, ethyl acetate, hexane, chloroform và tinh dầu hương

nhu trắng lên chủng Cryptococcus neoformans Kết quả thử nghiệm cho thấy, tất cả các dịch chiết và tinh dầu đều có tác dụng ức chế Cryptococcus neoformans Trong đó, dịch chiết chloroform cho khả năng ức chế tốt nhất Cryptococcus neoformans với

giá trị MIC đạt 62.5 g/mL [85]

Năm 2006, Okigbo và Ogbonnaya tiến hành thử nghiệm khả năng ức chế sự nảy

mầm của bào tử nấm Aspergillus niger, A flavus, Fusarium oxysporum, Rhizopus

stolonifer, Botryodiplodia theobromae, Penicillium chrysogenum gây thối rữa ở

khoai mỡ của các dịch chiết từ lá hương nhu trắng Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy dịch chiết ethanol và nước có hiệu quả ức chế lên các chủng Aspergillus niger,

Fusarium oxysporum và Botryodiplodia theobromae Trong đó, dịch chiết ethanol

cho hiệu quả ức chế tốt hơn trên cả 3 chủng nấm Tỉ lệ ức chế của dịch chiết hương nhu trắng lên sự phát triển của tản nấm lần lượt là 66.6%, 70.1% và 72.1% [86]

Năm 2012, Houinsou và các cộng sự tiến hành nghiên cứu khả năng kháng lại

các chủng nấm Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium poae và

Aspergillus niger gây hại trên cà chua của tinh dầu lá hương nhu trắng Kết quả phân

tích GC – MS chỉ ra trong tinh dầu lá hương nhu trắng có chứa các thành phần chính là thymol (26.9%), γ-terpinene (20.0%) và p-cymene (17.6%) Với sự có mặt của các hợp chất này, tinh dầu hương nhu trắng thể hiện khả năng kháng lại các chủng nấm

thử nghiệm tại giá trị MFC lần lượt là Fusarium oxysporum (200 ± 0.00 ppm),

Fusarium graminearum (400 ± 0.00 ppm), Fusarium poae và Aspergillus niger tại

nồng độ 1600 ± 0.00 ppm [87]

Năm 2017, Mohr, Lermen, Gazim và các cộng sự đã tiến hành chiết tinh dầu hương nhu trắng để xác định thành phần hợp chất có trong nó cũng như thử nghiệm

khả năng kháng nấm trên 10 chủng nấm gây hại cây trồng được phân lập bao gồm

Fusarium oxysporum f sp tracheiphilum (CMM0033), F oxysporum f sp cubense

(CMM-0813 và CMM-2819), F oxysporum f sp lycopersici (CMM-1104), F solani (CMM-3828), Rhizoctonia solani (CMM-3274), Macrophomina phaseolina (CMM-2715, CMM-3875, CMM-3615 và CMM-3650) Kết quả phân tích GC-MS cho thấy

có khoảng 30 hợp chất tồn tại trong tinh dầu hương nhu trắng Trong đó, linalool và 1,8-cineole chiếm hàm lượng cao nhất với tỉ lệ lần lượt là 32.9% và 21.9% Về kết quả thử hoạt tính kháng nấm, tinh dầu hương nhu trắng thể hiện tiềm năng ức chế nấm tốt với giá trị MIC lên tất cả các chủng nấm từ 31.25 đến 125 g/mL Trong đó,

tinh dầu hương nhu trắng cho thấy khả năng ức chế tốt nhất 2 chủng F oxysporum f sp lycopersici và R solani với giá trị MIC đều là 31.25 g/mL [88]

Năm 2023, Akpo và các cộng sự tiến hành thử nghiệm khả năng kháng Botrytis

cinerea, Colletotrichum gloeosporioides và Fusarium oxysporum của cao chiết và

tinh dầu hương nhu trắng Kết quả cho thấy tinh dầu hương nhu trắng có khả năng ức

chế sự phát triển của Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides tại nồng độ 500 ppm và Fusarium oxysporum tại 750 ppm Bên cạnh đó, cao chiết nước của hương nhu trắng có khả năng ức chế 90% sự phát triển của Fusarium oxysporum và ức chế 100% sự phát triển của Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides tại

nồng độ 60% (v/v) [89]

2.3.2 Đại hồi

Đại hồi có tên khoa học là Illicium verum, thuộc chi Illicium, họ Magnoliaceae,

được trồng làm cây gia vị phổ biến ở Đông Á, Nam Á và Bắc Mỹ Trong đó, Việt Nam và Trung Quốc là 2 quốc gia sản xuất đại hồi chủ yếu Đại hồi là cây nhỡ thân gỗ, sống lâu năm, cao khoảng 6 – 10 m, cây nhân thành nhiều nhánh Cành đại hồi khi non có màu xanh lục, về già có màu nâu, vỏ nhẵn, giòn, dễ gãy Lá cây mọc so le, có mùi thơm, có dạng hình mũi mác, dài khoảng 5 – 15 cm, rộng 2 – 5 cm, phiến lá dày, cứng, nhẵn Hoa đại hồi mọc ở nách lá, là hoa lưỡng tính, có màu hồng đến đỏ sẫm, cuống hoa dài từ 1.5 – 4 cm, cánh hoa có hình elip rộng 7 – 12 cm Quả hồi là quả kép, mỗi quả gồm 6 – 8 đại (cánh), xếp thành hình ngôi sao hoặc bông hoa Khi còn non, quả màu xanh, lúc về già chuyển sang màu nâu, đầu quả có mũi nhọn Khi chín, ở đầu mỗi đại (cánh) sẽ nứt ra làm đôi, để lộ hạt màu nâu nhạt, bóng nhẵn bên trong Tại Việt Nam, đại hồi thường phân bố ở một khu vực tương đối nhỏ ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn Một số nơi khác cũng có trồng Bát giác hồi hương để làm gia vị và dược liệu như Tuyên Quang, Bắc Kạn, Hà Giang, Thái Nguyên… [3, 90]

Trong thành phần hóa học của hồi có chứa đa dạng các nhóm chất như alkaloid, tannin (9 - 10%), anethole (80 – 90% trong tinh dầu), limone, α-pinene, safrol, β-phellandrene, α-terpineol, farnesol…[91-93] Chính nhờ sự có mặt của các nhóm

hợp chất này giúp cho hồi có khả năng kháng được nhiều chủng nấm, kháng sâu, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxy hóa… [3, 92, 94, 95]

Hình 2 6 Lá, quả hồi – anethole – tannin

Năm 2007, Park và các cộng sự tiến hành khảo sát khả năng kháng lại 2 chủng

nấm Botrytis cinerea và Colletotrichum gloeosporioides của 25 loại tinh dầu Trong

đó, tinh dầu đại hồi cho khả năng ức chế tốt nhất lên cả 2 chủng nấm thử nghiệm Tại nồng độ 10 μg trên mỗi đĩa thử nghiệm, tinh dầu hồi có khả năng ức chế 90% sự phát triển của các tảng nấm Bên cạnh đó, kết quả phân tích GC – MS thành phần tinh dầu

đại hồi cũng chỉ ra thành phần chính trong tinh dầu là trans-anethole (87.4%) Chính

sự có mặt của hoạt chất này mang lại khả năng kháng 2 chủng nấm thử nghiệm [96] Năm 2009, Dzamic và các cộng sự chỉ ra trong tinh dầu hồi có chứa khoảng 16

hợp chất, trong đó cis và trans-anethole chiếm hàm lượng lớn nhất (khoảng 91% hàm

lượng tinh dầu) có khả năng kháng lại 19 chủng nấm gây hại cho cây trồng như

Fusarium tricinctum, Fusarium sporotrichioides, … với MIC và MFC trong khoảng

2.5 – 25 μL/mL [92]

Năm 2010, Huang và các cộng sự tiến hành phân tích hàm lượng các chất có trong tinh dầu hồi tỉnh Quảng Tây, Trung Quốc và thử nghiệm khả năng kháng nấm của chúng Nghiên cứu chỉ ra trong tinh dầu quả hồi có chứa 22 hợp chất, trong đó

trans-anethole chiếm 89.5% là thành phần chính và cũng là thành phần có hoạt tính

kháng lại 11 chủng nấm gây hại cho cây trồng như nấm gây héo Fusarium

graminearum, Fusarium oxysporum f sp cucumerinum, Fusarium oxysporum f sp

lycopersici, Fusarium oxysporum f sp vasinfectum… với IC50 lần lượt là 0.08, 0.16, 0.14, 0.25 mg/mL [97]

2.3.3 Mùi già

Mùi già có tên khoa học là Coriandrum sativum L thuộc chi Coriandrum, họ

Apiaceae, có nguồn gốc từ Đông Địa Trung Hải và được trồng làm cây gia vị phổ

biến ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nga, Trung Âu và Maroc từ xa xưa [98] Mùi già là cây thân thảo nhỏ, có thể cao đến 1 -2 m Thân cây tròn xốp, có nhiều đốt, ở mỗi đốt mang lá và cành Tán rộng 20 – 40cm Vỏ thân màu xanh, hơi tím Phần gốc có màu sậm hơn phần ngọn, ruột thân màu trắng xốp Quả mùi già có hình cầu, khi còn non màu xanh nhạt, bóng láng, khó ngửi Khi chín màu vàng rơm hay nâu sáng và có mùi thơm, với một đầu hơi nhỏ còn đầu kia bằng phẳng Lá mùi già màu xanh, mọc ra từ gốc, có cuống dài Các lá ở dưới khía thành phiến hình trái xoan, có răng, các lá ở trên xẻ tua Hoa mùi nhỏ, hình tán, có 3 – 5 hoa nhỏ, màu hồng hơi tím, xanh nhạt hay trắng tùy giống Hoa có 5 cánh, không đều nhau, có 5 tiểu nhị, 5 lá dài và 2 vòi nhị, còn những tán hoa sau chỉ có hoa đực[99, 100] Ở nước ta, mùi già được trồng phổ biến như một loại gia vị và vị thuốc dân gian [101]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong tinh dầu chiết xuất từ hạt và lá mùi già có chứa các thành phần như linalool (chiếm tỉ lệ nhiều nhất >50%), α-pinene, 2,6-octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-, acetate, (E), geraniol, 3-cyclohexene-1-methanol, α,α,4-trimethyl, hexadecanoic acid, tetradecanoic acid, 2-α-pinene, citronellyl acetate, một số acid và vitamin [102-104] Thành phần chính trong dịch chiết từ lá và hạt mùi già chủ yếu là các flavonoids (như caffeic acid, chlorogenic, quercetin, rutin…), phenol… [105, 106] Nhờ sự có mặt của các hợp chất này, mùi già có nhiều hoạt tính nổi trội như kháng khuẩn, kháng nấm gây hại cây trồng, kháng oxy hóa, kháng côn trùng… [4, 104, 107-112]

Hình 2 7 Mùi già – linalool

Năm 2019, Galina và các cộng sự tiến hành xác định thành phần hóa học của tinh dầu hạt mùi già được sản xuất dưới quy mô công nghiệp và khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của nó Kết quả GC – MS chỉ ra rằng tinh dầu hạt mùi già có chứa khoảng 32 hợp chất thuộc các nhóm terpenes (26.43%), aliphatic (71.91%) và heterocycles (0.99%), chiếm 99.32% tổng lượng tinh dầu Tinh dầu hạt mùi già có khả năng kháng

tốt các chủng vi khuẩn thử nghiệm bao gồm Bacillus subtilis, Pseudomonas

fluorescens, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, E amylovora tại nồng độ

từ 0.0035 – 0.007% Bên cạnh đó, tinh dầu mùi già cũng thể hiện khả năng kháng các

chủng nấm Fusarium oxysporum, F sporotrichiella, Drechslera sorokiniana tại các

nồng độ 0.002, 0.01 và 0.05% Khả năng ức chế các chủng nấm được thể hiện rõ rệt nhất ở nồng độ 0.05% thông qua hiệu quả ức chế sự phát triển cả về màu sắc và kích thước khuẩn lạc của nấm [113]

Năm 2020, Mohamed và các cộng sự tiến hành khảo sát hoạt tính kháng lại 3

chủng nấm Fusarium oxysporum, Aspergillus sp và Penicillium spp của các dịch

chiết từ mùi già Cả 3 loại dịch chiết (ethanol, acetone và nước) từ mùi già đều thể hiện khả năng ức chế sự phát triển lên 3 chủng nấm thử nghiệm Tỉ lệ ức chế nằm trong khoảng 78.33 – 83.16 (%), trong đó dịch chiết ethanol cho hiệu quả ức chế tốt nhất lên cả 3 chủng nấm Tại nồng độ 20 μL/L, khả năng ức chế sự phát triển nấm của các dịch chiết là tốt nhất [114]

Năm 2021, Lina và các cộng sự tiến hành thử nghiệm khả năng kháng hai chủng

nấm Fusarium oxysporum và Fusarium culmorum của dịch chiết CO2 và tinh dầu từ

hạt mùi già Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng tinh dầu có khả năng kháng hai chủng nấm tốt hơn so với dịch chiết (dịch chiết gần như không kháng) Bên cạnh đó, tinh

dầu hạt mùi già cho khả năng kháng F oxysporum tốt hơn F culmorum và kháng tốt

nhất ở nồng độ 1000 L/L sau 7 ngày [115]

2.3.4 Quế

Quế có tên khoa học là Cinnamomum cassia L., thuộc chi Cinnamomum, họ

Lauraceae, được trồng phổ biến ở Ấn Độ, Trung Quốc, Uganda, Việt Nam,

Bangladesh và Pakistan [5] Quế là cây thân gỗ, cao 10 – 20 m Lá mọc so le, phiến lá dày cứng, hình mác, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt trên nhẵn, màu lục sẫm bóng, mặt dưới màu xám tro, có 3 gân hình cung, gân phụ nhiều, song song Cụm hoa hình chùm xim mọc ở kẽ lá gần đầu cành Bao hoa gồm 6 phiến gần bằng nhau, màu trắng, mặt ngoài có lông nhỏ Quả hạch hình trứng nằm trong đài tồn tại, khi chín màu nâu tím Toàn cây có mùi thơm [116]

Trong cây quế, đặc biệt là tinh dầu quế (chiết từ cành lá) có chứa nhiều hoạt chất khác nhau như cinnamaldehyde (75-90%), coumarin, eugenol, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, cinnamyl alcohol…[117] Với sự có mặt của các hợp chất kể trên, quế có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm… tốt [117-119]

Hình 2 8 Cành lá quế - cinnamaldehyde

Năm 2006, Ooi và các cộng sự tiến hành so sánh khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của dầu quế và cinnamaldehyde Kết quả nghiên cứu cho thấy cả tinh dầu quế

và cinamaldehyde có khả năng kháng lại vi khuẩn (7 vi khuẩn Gram âm và 1 vi khuẩn Gram dương) với MIC trong khoảng 75 µg/mL tới 600 µg/mL; kháng được nấm men,

nấm da và kháng được nấm mốc Fusarium solani với MIC lần lượt là 138 µg/mL

(cinnamaldehyde), 150 µg/mL (dầu quế) Từ kết quả đó, Ooi kết luận khả năng kháng nấm của dầu quế là nhờ vào sự có mặt của hợp chất chính cinnamaldehyde [120]

Năm 2017, Xie và các cộng sự đánh giá khả năng kháng lại 2 chủng nấm gây hại

cây trồng phổ biến là Rhizoctonia solani và Fusarium oxysporum của tinh dầu vỏ quế

và tinh dầu nụ đinh hương Thành phần chính của tinh dầu vỏ quế là cinnamaldehyde (49.75%) và tinh dầu nụ đinh hương là eugenol (89.17%) Tinh dầu quế có chỉ số kháng 2 chủng nấm kể trên là 54.8% và 28.5% tại nồng độ 400 µg/mL Giá trị LC50

của cinnamaldehyde lên R solani và F oxysporum lần lượt là 75.4 µg/mL và 156.9

µg/mL Trong khi đó, tinh dầu nụ đinh hương và eugenol cho khả năng kháng tốt hơn

trên 2 chủng nấm thử nghiệm Chỉ số kháng nấm của tinh dầu đinh hương lên R

solani và F oxysporum lần lượt là 100% và 83.7% tại nồng độ 300 µg/mL Giá trị

LC50 của eugenol lên R solani và F oxysporum là 58.9 và 52.9 µg/mL [121]

Năm 2019, Ma và các cộng sự tiến hành khảo sát khả năng kháng các chủng nấm

gây bệnh trên Panax notoginseng của tinh dầu lá và vỏ quế Kết quả phân tích cho thấy trong thành phần chính trong tinh dầu quế là trans-cinnamaldehyde (75.65%) Tinh dầu quế cho khả năng ức chế 100% sự phát triển của Fusarium oxysporum,

Cylindrocarpon destructans, Pythium aphanidermatum, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides và ức chế 66.59% sự phát triển của Fusarium solani tại nồng độ 50 mg/mL Giá trị MIC tương ứng của tinh dầu quế lên

từng chủng nấm là 138.44 μg/mL trên F oxysporum, 147.50 μg/mL trên F solani, 138.44 μg/mL trên C destructans, 494.06 μg/mL trên P aphanidermatum, 146.88 μg/mL trên B cinerea và 548.44 μg/mL trên C gloeosporioides [122]

2.3.5 Trầu không

Trầu không có tên khoa học là Piper betle L., thuộc chi Piper, họ Piperaceae có

nguồn gốc từ Đông Nam Á [123], được trồng phổ biến tại các vùng nhiệt đới ở châu Á như Đông Nam Á, Ấn Độ… [124, 125] Trầu không là một loại cây leo bám, cành

cây hình trụ, bề mặt nhẵn và có khía dọc, các mấu cây là nơi bén rễ Lá cây có hình tim tròn, mọc so le, gốc đôi khi hơi lệch, hai mặt lá nhẵn và có phần đầu nhọn, cuống lá có bẹ kéo dài Mặt trên của lá có màu sẫm bóng còn mặt dưới nổi rõ gân Hoa mọc thành cụm ở kẽ lá, mỗi bông ngắn, lá bắc có hình trái xoan hoặc hình tròn Quả tròn, mọng và có lông ở đỉnh Toàn cây chứa một loại tinh dầu cay và thơm Từ tháng 5 đến tháng 8 là mùa cây ra hoa và quả Loài cây này có đặc điểm là ưa ánh sáng, ẩm thấp và hơi chịu bóng, cây phát triển mạnh mẽ nhất vào mùa mưa ẩm Trầu không là loài cây leo bám, vì vậy khi trồng loài cây này phải có giàn đỡ hoặc giá thể (tường nhà, cây cau, thân cây gỗ…) [126] Ở Việt Nam, trầu không được trồng ở nhiều nơi để lấy lá ăn và sử dụng trong phong tục thờ cúng [127]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng lá trầu không có chứa nhiều vitamin, khoáng chất, tinh bột, enzyme, tannin, alkaloid, terpenoid (như 1,8-cineole, cadinene, camphene, caryophyllene, limonene, pinene, chavicol, chavibetol, allypyrocatecho, carvacrol, safrole, eugenol…) [128-132] do đó có khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm… hiệu quả [133-135]

Hình 2 9 Lá trầu không – chavibetol

Năm 2011, Irom và các cộng sự đã tiến hành đánh giá hiệu quả của dịch chiết chloroform từ lá trầu không trong việc kiểm soát bệnh héo rũ trên cây cà chua gây ra

bởi Fusarium oxysporum Nghiên cứu chỉ ra rằng dịch chiết chloroform trầu không 1% khối lượng có khả năng giảm lượng Fusarium trong đất tốt hơn so với thuốc diệt

nấm carbendazime Đồng thời, đất được xử lí với dịch chiết trầu không 1% cũng có thể làm giảm các triệu chứng và sự phát triển của bệnh sau 28 ngày [136]

Năm 2017, Pawar và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính kháng một số chủng nấm gây hại trên cây của các dịch chiết ethanol-methanol, hexane, ethyl acetate từ lá trầu

không Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy phần lớn các dịch chiết từ lá trầu không có khả năng kháng lại 3 chủng nấm Aspergillus niger, Aspergillus sp và Rhizopus

sp Trong đó, dịch chiết ethyl acetate cho khả năng kháng vượt trội hơn cả lên cả 3

chủng nấm kể trên (với đường kính vòng ức chế lần lượt là 28, 28, 23 mm trong khi chứng dương tương ứng là 6, 7, 0 mm) Đồng thời ghi nhận dịch chiết ethanol-methanol hầu như không có khả năng tạo vòng ức chế đối với 3 chủng nấm này [137]

Năm 2021, Nayaka và các cộng sự tiến hành thử nghiệm khả năng kháng nấm của các cao chiết và tinh dầu lá trầu không Trong khoảng 300 chủng nấm được thử, tinh dầu và cao chiết từ lá trầu không thể hiện khả năng ức chế các chủng gây hại cho

cây trồng như Fusarium oxysporum, Penicillium italicum, Culcularia lunata, Mycelia

sterilia, Nugrospora sp với các giá trị MIC tương ứng với mỗi chủng nấm kể trên là

0.5, 0.4, 0.5, 0.3, 0.53 L/mL [138]

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu

3.1.1 Nguyên liệu

Cành lá hương nhu trắng Cành lá đại hồi.

Mùi già Cành lá quế Lá trầu không

3.1.2 Hóa chất

Tất cả các hóa chất được sử dụng trong luận văn đều có độ tinh khiết từ 95% trở lên và được mua từ hãng Chemsol (Việt Nam) Potato Dextrose Broth (PDB), Potato Dextrose Agar (PDA) (Himedia, Ấn Độ) là môi trường nuôi cấy nấm Nystatin (Duchefa Biochemie, Hà Lan) là đối chứng dương cho thử nghiệm kháng nấm

3.1.3 Thiết bị

Thiết bị quang phổ hấp thụ phân tử (UV – Vis) OPTIZEN POP, đèn tungsten halogen và deuterium dùng để xác định số lượng bào tử nấm

Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC – MS) dùng để xác định thành phần và hàm lượng các chất có trong tinh dầu Phổ sắc ký khí GC được đo trên máy Agilent G1530A (Agilent Technologies) kết hợp với cột mao quản HP – 5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) (viện Kỹ thuật công nghệ cao Nguyễn Tất Thành) Khối phổ MS được đo trên máy Agilent 5973N (Agilent Technologies) (viện Kỹ thuật công nghệ cao Nguyễn Tất Thành) Nhiệt độ buồng hóa hơi: 250 °C, thể tích tiêm: 1 μL, khí mang: Helium, tỷ lệ phân chia dòng: 1/50, chế độ quét: từng giây Điều kiện phân tích MS: tác nhân bắn phá ion: EI+, năng lượng electron 70 eV, nhiệt độ bộ nguồn: 230 °C, phạm vi quét khối lượng: 40 - 400 amu Khối phổ mẫu được so sánh với khối phổ chuẩn trong thư viện NIST Ver 2.0a

3.1.4 Các chủng nấm

Các chủng nấm dùng trong luận văn là Fusarium oxysporum và Fusarium solani

được phân lập và định danh tại phòng thí nghiệm Vi sinh, bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách Khoa – ĐHQG HCM Chúng được nuôi cấy trên môi trường PDA Một lít môi trường có chứa 4 g tinh bột khoai tây, 20 g glucose, 16 g agar và 250mL dịch thân, lá ớt, bổ sung nước cất vừa đủ

3.1.5 Các chủng sinh vật thử nghiệm

Cây ớt hiểm giống F1, 30 ngày tuổi được mua tại vườn ươm Thanh Tuyền (kiosquet số 06 Thành Thái, phường 14, quận 10, thành phố Hồ Chí Minh) Các cây ớt được chọn là cây khỏe mạnh, đồng đều về kích thước, không bị tổn thương cơ học hay nhiễm bệnh và chưa từng xử lý qua thuốc trừ sâu, thuốc diệt nấm hoặc bất kì chất hóa học nào

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng nấm in vitro bằng phương pháp hòa tan mẫu

trong thạch

Khảo sát hoạt tính kháng nấm bước đầu được thực hiện để đánh giá sơ bộ khả

năng kháng lại hai chủng nấm F oxysporum và F solani của các cao chiết và tinh

dầu Các thí nghiệm được thực hiện dựa trên phương pháp của Do, Al-Hetar và Grover [56, 139, 140] với các thay đổi cho phù hợp Các cao chiết từ hương nhu, mùi già và trầu không được hòa tan trong DMSO và pha loãng với PDA đã được hấp tiệt trùng và để nguội đến 50 – 55 °C ở nồng độ 1.25 mg/mL Các tinh dầu hương nhu, đại hồi, mùi già, quế (gồm quế tổng và các phân đoạn Light, Middle, Cinnamaldehyde, Residue) và trầu không được hòa tan trong DMSO rồi pha loãng với môi trường PDA với nồng độ 0.22 mg/mL Chọn nồng độ 0.22 mg/mL cho các tinh dầu vì trong các đánh giá sơ bộ, tại nồng độ này các tản nấm mới bắt đầu phát triển để có thể theo dõi được hiệu lực ức chế Đối chứng dương Nystatin cũng được pha loãng tương tự với nồng độ 1.25 mg/mL để so sánh với khả năng kháng nấm của các mẫu thử Đối chứng âm là DMSO để đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi hòa