Phân lập vi khuẩn xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (rosa spp ) và cây ớt (capsicum spp ) tại tỉnh đồng tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh

Đặtvấnđề

Ngày nay, sản xuất nông nghiệp phụ thuộc rất nhiềuv à o v i ệ c s ử d ụ n g t h u ố c b ả o vệ thực vật nhờ chúng đạt hiệu quả nhanh chóng Thực trạng biến đổi khí hậu ngày càngkhiến canh tác nông nghiệp gặp nhiều khó khăn như cây trồng sinh trưởng phát triểnkhônghiệuquả,dịch bệnhdễbùngphát,vàtìnhtrạng ônhiễmmôi trườngngàycà ngtrở nên trầm trọng Tại Đồng Tháp, gần đây đã xuất hiện nhiều dịch bệnh nghiêm trọng.Trong đó, bệnh đốm lá vi khuẩn do chiXanthomonasgây ra trên hai loài cây trồng chủlực của tỉnh là cây ớt và cây hoa hồng là đặc biệt nghiêm trọng Đối với các nông hộ thunhập chính từ hai loài cây này, nông dân đã tiến hành canhtácl i ê n t ụ c t r o n g n ă m đ ể tăngthu nhập, kết hợpvới việc mở rộngkhôngngừngvùngchuyênc a n h đ ã t ạ o đ i ề u kiện thuận lợi cho nhiều mầm bệnh phát triển và gây hại Bên cạnh đó, biện pháp chiếtnhánh cây hoa hồng để giữ giống hoặc sử dụng hạt giống ớt không kiểm soát nguồn gốcđã giúp bệnh lưu tồn và lây lan từ vụ này sang vụ khác Để đối phó với bệnh đốm lá vikhuẩn, khi bệnh mới phát nên nhổ bỏ ngay cây bệnh và hạn chế tưới nước, nên phunngay các loại thuốc hóa học đặc trị vi khuẩn (Cúc

& Thủy, 2014) Tuy nhiên, thuốckháng sinh và thuốc bảo vệ thực vật thường được sử dụng vượt ngưỡng cho phép, gâyngộ độc cho cây, sẽ rất tốn kém, có hại cho thiên địch và các vi sinh vật có lợi, gây ônhiễmmôitrường,ảnhhưởngđếnsứckhỏecộngđồng(Robisonetal.,2006;Adesemoyeet al.,

2009) và dễ làm mầm bệnh kháng thuốc Do đó, cần tập trung nghiêncứu phát triển các phương pháp mới giúp kiểm soát bệnh cây trồng một cách bền vững(Gerhardson,2002),tiếtkiệmchiphívàhạnchếsửdụngthuốcbảovệthựcvật.

Trong trường hợp này, kiểm soát sinh học (biological control) ứng dụng vi khuẩnkiểm soát bệnh (Biological control agent- BCA) là một chiến lược quan trọng trong việcquảnlýcanhtácmộtcáchbền vữngvàgiảmcácvấnđềvềmôitrường(Baleetal.,2008;Adesemoyeet al., 2009; Hungriaet al., 2010; 2013) Các chế phẩm vi sinh vật được sửdụng hiệu quả nhằm giảm bệnh hại trên lá hoặc sau thu hoạch ở các loại cây ngũ cốc,rau, cây ăn trái, cây hoa, cây cảnh (Cawoyet al., 2011) Chúng phân tán nhanh hơn vàomôi trường và thường ít độc hơn đối với các loài không phải mục tiêu Ngoài ra, vì sửdụng các phương thức tác động khác với thuốc bảo vệ thực vật thông thường nên chúngcó thể giúp ngăn chặn các mầm bệnh kháng thuốc (Bhattacharyyaet al.,2016; Marascoetal.,2012).

Trước đây, đa số các diện tích ẩm, lầy thấp ở Đồng Tháp được bao phủ bởi rừngrậm, và cây tràm được xem là đặc thù Hiện nay, tại Đồng Tháp rừng đặc dụng đượcphân bổ ở các khu vực được bảo tồn như Vườn Quốc Gia Tràm Chim, Khu di tíchXẻoQuýt, Khu du lịch sinh thái Gáo Giồng) Những khu vực này do được bảo tồn khỏi cáchoạtđộngcủaconngười, đặcbiệtlàhoạtđộngnôngnghiệpnênhệvisinhvật cóth ể còn rất đa dạng Bên cạnh vi khuẩn vùng rễ, đây là nguồn tài nguyên quý giá phục vụchocôngtác tuyểnchọncác dòngvisinhvậtkiểmsoátbệnhhiệuquả.

Xuất phát từ những hiện trạng trên, luận án “Phân lập vi khuẩnXanthomonasspp.gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosaspp.) và cây ớt

(Capsicumspp.) tại tỉnh đồngthápvàtuyểnchọnvikhuẩnđối khángphòngtrịbệnh”đãđượcthựchiện.

Mụctiêucủaluậnán

Phânlậpvàxác địnhđượccácdòngvikhuẩnXanthomonasspp.gâybệnhđốmlátrêncâyhoahồng(Rosaspp.)v àcâyớt(Capsicumspp.).

Nộidung nghiêncứu

Nộidung1:Phânlập,khảosátkhảnănggâyhạivàxácđịnhc á c dòngvikhuẩn gây bệnhđốmlávikhuẩntrêncâyhoahồnggiốnghồnglửavàcâyớt.

Nộidung2:Tuyểnc h ọ n vikhuẩncókhảnăngđốikhángvớiXanthomonas spp. đượcphânlậptừcơchấtvùngrễvàđấtvùngsinhtháibảnđịa.

Nộidung3:Khảos á t khảnăngkiểms o á t bệnhđốmlávikhuẩntrongđiềukiệnnh àlướicủa nhữngdòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọng

Tínhmớicủaluậnán

Nghiên cứu đã ghi nhậnXanthomonas euvesicatoriagây bệnh đốm lá trên cây hoahồng vàXanthomonasspp gây bệnh đốm lá trên cây ớt nhờ vào các kỹ thuật sinh hóa,MALDI-TOF-MSvàsinhhọcphântửnhưmultilocussequenceanalysis(MLSA).

Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhậnB velezensis(BR16),B subtilis(BR37,BP49, X61),Bacilluss p p ( B P 1 1 , X 3 2 ) ,Enterobacterspp (T11), Serratiaspp.

(X16)cókhảnăngđốikhángđángkể,đặcbiệt,nghiêncứuđãtuyểnchọnđượcB.amyloliquefaci ensBR88,B velezensisBP103,B subtilisG24 có khả năng kiểm soátbệnh đốm lá vi khuẩn hiệu quả nhất dựa trên các thí nghiệm sàng lọcin vitro, nhà lưới,ngoài đồng, và được xác định danh pháp bằng kỹ thật phân tích MALDI-TOF-MS vàSinh học phân tử.Các dòng vi khuẩn này có thể được sử dụng như tác nhân sinh họcphòngtrịbệnhđốmlátrêncâyhoahồngvàcâyớt.

Phạmvivàđốitượngnghiêncứu

Phạmvinghiêncứu

Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm khi phân lập vi khuẩngâybệnhvà tuyểnchọninvitrocác dòngvikhuẩnđốikháng.

Nghiêncứu đánh giákhả năng gây hại củac á c d ò n gXanthomonasspp và đánhgiáhi ệu qu ả kiểms o á t bệnhc ủa cá c dòngvi khuẩnđốikh án g đượct hự c hiệnở điềukiệnnhàlướivàngoàiđồng.

Đốitượngnghiêncứu

Giống cây hoa hồng giống hồng lửa và cây ớt chỉ thiên được sử dụng trong thínghiệm, đây là giống cây được người dân trồng phổ biến tại tỉnh Đồng Tháp và đượcngười dân đánh giá là giống có tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều nhất Bên cạnh đó, vi khuẩn gâybệnhvà vikhuẩnđốikhángđượcphân lậptừtỉnhĐồngTháp.

Ýnghĩakhoahọc vàthựctiễn

Ýnghĩakhoahọc

Dựa trên các kỹ thuật phânt í c h l i ê n q u a n đ ế n s i n h h ó a v à s i n h h ọ c p h â n t ử h i ệ n đại xác định được các dòng gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng cũng như trên cây ớt làmcơ sở cho các thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn đối kháng có khả năng kiểm soát bệnh.Đồng thời qua các kỹ thuật này cũng xác định được các dòng vi khuẩn đối kháng triểnvọng, góp phần vào chứng minh và khẳng định khả năng áp dụng vào thực tế sản xuấtcủacácdòngvikhuẩnđốikhángnày.

Việc phân tích khả năng gây hại của mầm bệnh và khả năng đối kháng của cácdòng vi khuẩn được phân lập trên cơ sở các kết quả đã được xử lý bằng các phân tíchkhoa học trên phần mềm đã được công nhận đã cung cấp một nguồn thông tin khoa học,tàiliệuthamkhảochocác nghiên cứutiếptheo.

Ýnghĩathựctiễn

Kếtquảnghiêncứucungcấpcơsởkhoahọchướngđếnsửdụngcácdòngvikhuẩnđốik h á n g t r i ể n v ọ n g t r o n g k i ể m s o á t bệnhđốml á trên c â y hoahồngv à câyớtt r o n g điềukiệnsản xuấtthựctế,phụcvụsựpháttriểnnôngnghiệptheohướngbềnvững.

Sơlược vềchiXanthomonasgâybệnhtrênthực vật

Tácnhângâybệnh

Bệnh do vi khuẩn gây ra là một trong những trở ngại khó kiểm soát và dễ tái phátnhấtđốivới cácvụmùatrênkhắpthếgiới.Nguyênnhânlàdosựtăngsinhnhanhchóng,sự khó khăntrong quảnl ý , c á c v ấ n đ ề p h á t s i n h k h i k i ể m s o á t b ằ n g t h u ố c h ó a h ọ c , v à sựthiệt hại nghiêmtrọngcủacác trangtrại bị nhiễmbệnh(Sundinet al.,2016).Xanthomonaslà một chi vi khuẩnl ớ n g â y b ệ n h t r ê n t h ự c v ậ t , c ó p h ả n ứ n g g r a m â m , hìnhquevàsắctốvàng.Chinàygâybệnhtrên 400loàivậtphânbốtrêntoànthếgiới và là tác nhân gây bệnh cho một số cây trồng quan trọng về kinh tế như: lúa (rice), camquýt(citrus),sắn(cassava),cà chua(tomato), mía đường (sugarcane),chanh dây(passionfruit),chuối(banana)(Ryane t a l ,2011; Rodriguezet al., 2012) Vi khuẩnthuộc chiXanthomonascó thể tương tác với cây chủ bằng nhiều phương thức, chúng cóthể tồn tại trong đất, hạt giống, tàn tích cây trồng, tương tác với côn trùng và đặc biệt làcó thể sống độc lập với cây chủ Những hình thức sinh tồn này tạo điều kiện cho sự pháttriểncủadịchbệnh(Marcuzzo,2009).

Một sốXanthomonasspp gây bệnh cho các loài cây thuộc họ Rosaceae đã đượcbáo cáo, nhưXanthomonas fragariaetrên dâu tây (Robertset al., 1997),X prunitrênđào (Wertet al., 2006) Tuy nhiên, rất ít báo cáo vềXanthomonasspp gây bệnh về hoahồng (Rosaspp.), một thành viên của họ Rosaceae, bước đầu ghi nhận dòng vi khuẩnnày trên cây hoa hồng thuộc loàiXanthomonas euvesicatoria(Huanget al 2013; Baraketal., 2016).

Trên họ Solanaceae, Joneset al (2004) đã ghi nhận rằng tất cả vi khuẩn thuộcXanthomonasgây bệnh đốm lá vi khuẩn (bacterial spotXanthomonas– BSX) được phânthành4loàilàX.euvesicatoria,X.vesicatoria,X.perforans,vàX.gardneri.Trongđó,

X euvesicatoriavàX vesicatoriagây bệnh trên cả ớt và cà chua (Joneset al., 2004).Trong khi, một số loàiXanthomonasspp chỉ gây bệnhtrênc à c h u a n h ưX perforansandX. gardneri Tuy nhiên, gần đây Potniset al (2015) lại ghi nhậnX perforansđãxuất hiện trên ớt Tại Hàn Quốc, Myunget al (2015) và Kyeonet al (2016) đã ghi nhậnXanthomonaseuvesicatoriagâybệnhtrênớt(Capsicumsp.).

Các vi khuẩn thuộc chiXanthomonaslây nhiễm và gây bệnh trên nhiều loài thựcvật nhờ vào các nhân tố lây nhiễm như các polysaccharide bề mặt, các chất có khả năngkết dính, các hệ thống tiết và phản ứng siêu nhạy cảm khác nhau, các chất độc, các chứcnăng liên quan làm mất tác dụng các hợp chất kháng khuẩn của cây trồng tiết ra, và khảnăngthunhậnchấtdinhdưỡng(Agrios,2005).

Triệuchứngbệnh

Nhữngtriệuchứngbệnhđiểnhìnhcủabệnhđốmlávikhuẩnnhư:dướidạngnhữngđốm nhỏ, ngấm nước, phát triển thành những đốm hoại tử bất thường và có góc cạnh,thường có đường kính từ 1,58 mm (1/16 inch) đến 6,35 mm (1/4 inch) Những đốm nàycó trung tâm màu xám nhạt và mép nâu tối, được bao quanh bởi các vòng màu vàng hẹp(Lowellet al., 1991; Agrios, 2005; Nguyễn Thị Thu Cúc và Trần Thị Thu Thủy, 2014).Mô ở trung tâm của đốm có thể khô và rụi đi, tạo ra một “lỗ hỏng” (shot–hole).

Trongđiềukiệnẩmướtvàmưaliêntục,cácvếtthươngsẽlanrấtnhanh,giữmàuxanhđậm, và bị ngấm nước Nhiều đốm có thể kết hợp lại và gây ra vết hoại tử lớn Cuối cùng, lábiếnmàuvàngvàrụngsớm(Myungetal.,2009;Huangetal.,2013).

Các dòng vi khuẩn này thường không lưu tồn trong đất nhưng có thể tồn tại trongmộtnămhoặclâuhơntrêntronghạt.Câyconcót h ể bịnhiễmbởigióhoặcnướcb ắnlêntừ cáccây bệnh lâncận.C á c c â y g h é p b ị n h i ễ m b ệ n h đ ư ợ c đ ư a v à o c á n h đ ồ n g c ó thể đóng vai trò như nguồn gốc ban đầu của bệnh Vi khuẩn này cũng có thể sống trêntàn dư cây ớt và cà chua từ vụ mùa trước hoặc tồn tại trên cỏ dại (Agrios, 2005; NguyễnThị Thu Cúc và Trần Thị Thu Thủy, 2014) Tưới phun một cách thường xuyên, trongđiều kiện ấm áp, hoặc mưa to và kéo dài sẽ gây ra sự bùng phát bệnh nghiêm trọng. Tấtcảcáctácnhânnhưgió,giọtmưarơi,hoặcnướctưới,sựchuyểnđộngcủathiếtbịxịt áp suất, và cả việc xử lý cây ướt đều hỗ trợ sự lây lan của vi khuẩn trên đồng ruộng Sựlan truyền bệnh trong một cánh đồng thường có thể tương quan với hướng gió thổi Sựlây nhiễmx ả y r a t h ô n g q u a c á c l ỗ t ự n h i ê n ( s t o m a t e s ) h o ặ c t h ô n g q u a c á c v ế t t h ư ơ n g trênlá và thânc â y d o c ô n t r ù n g g â y r a h o ặ c d o c ọ x á t( N g u y ễ n T h ị T h u C ú c v à T r ầ n Thị Thu Thủy, 2014) Bệnh phát triển mạnh khi ở điều kiện độ ẩm cao và kéo dài, nhiệtđộ cao dao động từ 20 0 C đến 35 0 C.Nhiệt độ ban đêm từ 24 0 C đến 28 0 C giúp phát triểnbệnh tật trong khi nhiệt độ ban đêm thấp (16 0 C) ngăn chặn sự phát triển của bệnh bất kểnhiệt độ ban ngày Nồng độ nitơ cao thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn trên cây Cácdòng khác nhau của vi khuẩn có thể được xác định dựa trên phạm vi và các triệu chứngcủa ký chủ.

Quảnlýbệnh

Bệnh doc á c l o à iXanthomonasspp thường bắt đầu với hạt giống bị nhiễm, mặcdùmầmbệnhcóthểđượctruyềnsangcâykhỏemạnhbằngcáchoạtđộngcanhtáctrong nông nghiệp như cắt tỉa và phun sương cho luống trồng, nước mưa, nhiễm trong đất vàcó thể do côn trùng (Ryanet al.,2011) Nhìn chung, việc kiểm soát sự lây nhiễm trùngdocácmầmbệnhkhác nhaucủachiXanthomonasđượcthựchiệnbằngcáchsử dụngcác loài hoặc giống ít nhiễm bệnh hơn, sử dụng các tấm chắn gió, khử trùng thiết bị vàdụng cụ canh tác, bổ sung các hóa chất gốc đồng và loại bỏ các cây bị nhiễm bệnh (Liuet al., 2016) Tuy nhiên, những biện pháp này là chưa thật sự hiệu quả, do sự tích tụ củachất hóa học trong môi trường, khả năng nhiễm bệnh của các giống được cho là khángbệnh và những tổn thất về diện tích cây trồng (Perneznyet al.,2012; Dewdney &Graham,2017).

Tại Đồng Tháp, khi vi khẩn gây bệnh đã xâm nhập được vào ruộng ớt hoặc hoahồng thì cực kỳ khó kiểm soát Do đó, việc ngăn ngừa lây nhiễm mầm bệnh từ các câyghép hoặc cây trung gian là rất quan trọng Khi mua cây con cần đảm bảo được nguồngốc và được kiểm tra, chứng nhận là không bị bệnh Luân canh với cây trồng khác họ.Tiêu hủy những tàn dư trước khi vào mùa vụ tiếp theo Kiểm soát cỏ dại bên trong vàxung quanh các cánh đồng Thiết lập và duy trì một chương trình sinh sản cân bằng đất(Burgesset al., 2009, Cúc & Thủy, 2014) Ngoài ra, tránh tình trạng sinh trưởng quámức, đặc biệt là trước khi ra quả, vì điều này có thể dẫn đến việc có quá nhiều lá và tăngmứcđộnghiêm trọngcủabệnh.Hạnchếtướiphun.Saukhitrồngcâycóthểsửdụn gcác hợp chất chứa đồng nhưd u n g d ị c h B o r d e a u x t r ư ớ c k h i x u ấ t h i ệ n b ệ n h T i ế p t ụ c phun lên lá theo lịch trình từ 7 đến 10 ngày Thuốc xịt áp dụng cho cây trồng trước khimưa hoặc tưới tiêu là có lợi nhất Ngoài ra còn có thể sử dụng các chế phẩm vi sinh vàoviệcquảnlý,cũng nhưquản lýdịch hạitổnghợp (Agrios,2005).

Sơlượcvềcâyhoahồngvàcâyớt

Câyhoahồng

Cây hoa hồng (Rosaspp.) thuộc họ Rosaceae Cây có xuất xứ từ ôn đới và bánnhiệt đới Ở nước ta, cây hoa hồng được trồng ở nhiều vùng trên cả nước Theo NguyễnXuân Linh (1998), hoa hồng gồm hơn 300 loài được phân bố ở khắp bán cầu Hoa hồngđược trồng đầu tiên ở Trung Quốc và sau đó du nhập qua Châu Âu, và chính nơi đây,chúngđượclaitạothànhcác giốnghoa hồngnhưngàynay.

Cây hoa hồng có rễ thuộc rễ chùm, chiều ngang tương đối rộng và khi bộ rễ lớn sẽphát sinh nhiều rễ phụ Thân cây thuộc nhóm cây thân gỗ, cây bụi thấp, thẳng, có nhiềucành và gai cong Cây ưa khí hậu ôn hòa, nhiệt độ sinh trưởng phát triển tốt là vàokhoảng 18 – 25 0 C Đất trồng loài cây này phải cao ráo, thoát nước tốt, pH từ 5,6 – 6,5(PhạmVănDuệ,2005;NguyễnXuânLinh,1998).Yêucầuẩm độđất khoảng60– 70%,độẩmkhôngkhí vàokhoảng80- 85%.

Tại Đồng Tháp, cây hoa hồng được trồng chủ yếu ở Làng hoa Sa Đéc với nhiềugiốngnhư hồngnhung,hồng lửa(hayhồngPháp), hồng tỉmuội,hồng tường vi,… Trong đó, hồng nhung và hồng lửa chiếm đa số và mang lại giá trị kinh tế cao cho người nôngdân Tuy nhiên, việc trồng hoa thâm canh và ngày càng mở rộng đã tạo điều kiện chonhiều loại sâu bệnh có cơ hội phát sinh, phát triển, lây lan và gây hại (Nguyễn ThịThuCúcvàTrầnThịThuThủy,2014).

Câyớt

Cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, bắt nguồn từ một sốloài hoang dại, được thuần hóa và trồng ở Châu Âu, Ấn Độ cách đây hơn 500 năm. Câyớt được chia hai nhóm phổ biến là ớt (Capsicum frutescensL.) và ớt ngọt (CapsicumannuumL.) (Glushenkova, 2012) Trong đó, cây ớt có dạng thân thảo, thân dưới hóa gỗ,cónhiềucành,nhẵn;lámọcsole,hìnhthuôndài,đầunhọn;hoamọcđơnđộcởkẽlá.Ở nước ta, cây ớt được trồng ở nhiều nơi, thuộc nhóm cây gia vị có tiềm năng phát triểnrất lớn ở nước ta Cây ớt phát triển tốt ở đất thịt nhẹ, đất pha cát dễ thoát nước Hạt ớtnảymầmở25-30 0 C. Đồng Tháp (ĐT) là một trong những tỉnh có diện tích trồng ớt lớn nhất đòng bằngSông Cửu Long Năm 2013, diện tích trồng ớt của Đồng Tháp là 2.766 ha (chiếm hơn50%diệntíchtrồngớtởĐBSCLvàsảnlượngđạt30.428tấn.ĐồngThápcóđiềukiệntự nhiên phù hợp cho cây ớt phát triển và chất lượng cao, nhất là đất cồn ở huyện ThanhBình, năng suất trung bình 11 tấn/ha (giảm 26,7% so với năm 2012) Tuy nhiên, gần đâydiện tích và sản lượng ớt bị giảm do tình hình thời tiết bất lợi (ảnh hưởng biến đổi khíhậu) dẫn đến dịch bệnh xuất hiện thường xuyên trên cây ớt, đặc biệt là bọ trĩ, bệnh thánthư, bệnh do virus, bệnh héo xanh, đốm lá vi khuẩn, Dịch bệnh gây thiệt hại lớn vềnăng suất và chất lượng ớt, đến nay chưa có một quy trình quản lý dịch bệnh trên ớt hiệuquả, nông dân sử dụng thuốc hóa học là giải pháp phổ biến Hơn nữa, do thâm canh liêntục nhiềuvụ, đất đai bị bạc màu trong khi nông dânk h ô n g c ó t ậ p q u á n s ử d ụ n g p h â n hữu cơ Điều này dẫn đến độ phì tự nhiên của đất giảm làm hạnc h ế n ă n g s u ấ t c ủ a ớ t (VõThị ThanhLộc,2015).

Ảnhhưởngcủavikhuẩntrongđấtđốivớihệsinhtháinôngnghiệp

Tươngtáccủavikhuẩntrongđấtđốivớihệsinhtháinông nghiệp

Một trong những thách thức chính trong thế kỷ XXI là làm sao canh tác cây trồngmột cách bền vững Những vi sinh vật liên quan đến cây trồng giữ chức năng sinh tháiquan trọng đối với đất và cây trồng Chức năng này bao gồm những ảnh hưởng củachúng lên sự sinh trưởng và sức sống; nâng cao được khả năng chịu đựng stress, hỗ trợkhả năng kháng bệnh; hỗ trợ sự hấp thu những dinh dưỡng có ích của cây trồng, và thúcđẩyđadạngsinhhọc(Maheshwari,2012).Hơn150nămqua,nhiềunghiêncứuđãchứngminhrằng vi khuẩnvànấmcómộtsựtươngtácmậtthiếtvớicâytrồng,có thểkíchthíchsựsinhtrưởng,vàngănchặnmầmbệnhchocâytrồng(Whipps,2001).

Trong đó, vi khuẩn là một trong những sinh vật thích nghi nhất Sự tiến hóa củachúng trong suốt thời gian dài, và khả năng thích nghi đa dạng cao và trước các môitrường bất lợi, kết hợp với chọn lọc tự nhiên đã làm cho những vi sinh vật này có thểphục hồi tốt nhất trong các dạng sống trên hành tinh này Vì vậy, vi khuẩn trong đất đãcónhữngđónggópthiếtyếutrongviệcduy trìsựcânbằngsinhthái.Mộttrongnhữngsự phát triển đáng chú ý nhất của vi sinh vật trong thế kỷ XX là phát hiện vi khuẩn kíchthích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB), chúng cung cấpmột loạt các đặc tính có lợi cho cây trồng, qua đó tạo thuận lợi cho việc tăng năng suấtcâytrồng mộtcáchbềnvững.

Cácloạiđấttựnhiêncósựhiệndiệncủanhữngquầnthểvisinhvậttrongtrạngthái cân bằng động Ước tính có khoảng 7,7 kg nấm và 18,1 kg vi khuẩn tồn tại trên mỗimẫu Anh (khoảng 0,4 hecta) Các vi sinh vật đất cạnh tranh với nhau về nguồn dinhdưỡng và không giansống (Maheshwari,

2012) Chúng đóng vai trò trung tâmt r o n g việc điều khiển cách thức mà các hệ sinh thái trên mặt đất phản ứng với sự thay đổi khíhậu toàn cầu Cây trồng thường đáp ứng với nồng độ CO2cao bằng cách tăng tạo rễ vàtiết dịch (Korner, 2000) Đa số các vi khuẩn có trong đất mang lại lợi ích cho cây trồngbằng các con đường như:(i)Liên kết trực tiếp với rễ (mycorrhizae, vi khuẩn hình thànhnốt);(ii)Phân hủy và giải phóng các chất khoáng từ các chất hữu cơ có trong đất làmtăng hàm lượng các chất sẳn có cho cây sử dụng;(iii)Ký sinh hoặc gây hại cho bệnhcây;(iv)Ức chế sự tăng trưởng, sinh sản, và hoạt động gây hại của bệnh hại nhờ vào cáctương tác ức chế hóa học của các vi sinh vật Các loại nấm và vi khuẩn này thường cótrongtấtcảcácloạiđấttựnhiên.

Tất cả các môi trường ảnh hưởng đến cây trồng ở mức vi mô, đặc biệt là vùng rễ(rhizosphere) đều hiện diện một lượng lớn vi sinh vật (Berget al., 2005) Khi kiểm tranhững dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường sống của cây trồng ghi nhận khoảng1% đến 35% dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng ức chế sự phát triển của các mầmbệnh (Berget al., 2002, 2006) Trong các dòng vi khuẩn được phân lập, tỷ lệ dòng vikhuẩnbiểuhiệnđặctínhkíchthíchsinhtrưởngthực vật(PGPB)caohơnnhiềuvàc óthể lên đến 2/3 quần thể (Furnkranzet al., 2009) Sự kích thích tăng trưởng thực vật cóthể đạt được bằng sự tương tác trực tiếp giữa các vi khuẩn có lợi và cây chủ và gián tiếpdohoạtđộngchốnglạimầmbệnhthựcvật.Phươngthứchoạtđộngvàkhảnăngsửdụng,tiềmnăng chocácứngdụngcôngnghệsinhhọcđượcthểhiệntronghình2.2.

Hình 2.2: Sự tương tác giữa cây trồng và vi sinh vật kích thích sự sinh trưởng và sứckhoẻcâytrồng(Berg &Smalla,2009)

Các vi khuẩn có lợi có thể được phân loại theo chức năng như:(i)kích thích sựtăng trưởng thực vật (plant–growth–promoting bacteria–PGPB);(ii)tác nhân kiểm soátsinh học (biological control agents – BCA) Tác động trực tiếp của PGPB hoặc PGPR(plant–growth–promoting rhizobacteria)là kícht h í c h t ă n g t r ư ở n g t h ự c v ậ t , t r o n g k h i ảnh hưởng trực tiếpc ủ a B C A l à đ ể k i ể m s o á t m ầ m b ệ n h , l ầ n l ư ợ t c ả i t h i ệ n n ă n g s u ấ t câytrồng.

Tuy nhiên, theo Aviset al (2008), PGPR và BCA có thể có tác dụng thứ cấp ở cáccây trồng có quan hệ gần Ví dụ nhưc h iSinorhizobium(PGPB) nổi tiếng nhất với vaitrò chính là cố định đạm, và vì thế cải thiệnsựs i n h t r ư ở n g c ủ a c â y t r ồ n g ; T u y n h i ê n , loàiSinorhizobiumcũng có liên quan đến sự ức chế bệnh bằng cách kích thích tăng tổnghợpcáchợpchấtbảovệthựcvật,dẫnđếnkiểmsoátmầmbệnhvàkíchkháng lưudẫn.

Cộngđồngvikhuẩn trongđấtngậpnước

Các vùng đất ngập nước là một trong những hệ sinh thái quan trọng nhất trên tráiđất Hiện nay, sự đa dạng sinh học và khả năng sản xuất của hệ sinh thái này có giá trịlớn đối với cuộc sống trên hành tinh của chúng ta Tuy nhiên, tính đa dạng và chức năngcủa các cộng đồng vi sinh vật trong các hệ thống đất ngập nước rất ít được khảo sát sovớiđấttrêncạnvàcác hệsinhtháidướinước(Pauletal.,2013).

Sự phát triển quan trọng của vi sinh vật trong đất ngập nước ở thập kỷ đầu tiên củathế kỷ 21 đã được đánh giá bước đầu Trong đó, sự chuyển hóa của vi sinh vật ở vùngđất ngập nước được đánh giá bởi Lamerset al (2012), cho thấy tác động của các hoạtđộng vi sinh vật đối với sự sinhtrưởng và năng suất thực vật Nhiềuc h u y ể n h ó a s i n h học được xúc tác bởi các vi khuẩn có thể kiểm soát thành phần thực vật ở vùng đất ngậpnước, đặc biệt là chuyển đổi nitrogen, lưu huỳnh và chuyển hóa sắt, như tác nhân làmgiảm sulfate (Pesteret al., 2012), cố định nitrogen - diazotrophs (Lovell & Davis, 2012),Giảm khí methan

CH4(methanotrophs) và khử dinitrogen monoxide N2O - denitrifiers(KolbandHorn,2012).

Theo Pesteret al.(2012), mặc dù hình thành như một quầnt h ể n h ỏ , n h ữ n g t á c nhân khử sulfate trong vùng đất ngập nước ngọt có khả năng xúc tác giảm sulfate đángkể và tương tác đáng kể với các vi khuẩn trong các chu trình khác Nhìn chung, các khuđất ngập nước nội địa (nước ngọt) có một cộng đồng vi khuẩn rất đa dạng có khả nănggiảm thiểu sulfate Bên cạnh đó, vai trò quan trọng của các vi khuẩn cố định đạm trongmôi trường hạn chế dinh dưỡng được đánh giá bởi Lovell & Davis (2012), ghi nhận rằngcộngđồngvi khuẩnnàyrấtđadạngthậmchíkhácnhaugiữacácloàithựcvật.

Sự ngập nước thường xuyên hoặc định kỳ tạo ra một số đặc điểm đặc trưng về lý,hóa học và sinh học cho môi trường (Ponnamperuma, 1984) Sự phân tầng quan trọngnhất giữa nước và đất bị ngập là sự xâm nhập của oxy trong khí quyển Sự khuếch tánoxy trong nước chậm hơn 10.000 lần so với không khí Oxygen nhanh chóng cạn kiệt ởtầng trên của đất ngập do các quá trình oxy hóa hóa học và sinh học, dẫn đến một cấutrúcđấtởđósựhiệndiệncủaoxyđượcgiớihạnởcácmilimettrên(Frenzeletal.,1992).Các loài cây trong vùng đất ngập nước đã phát triển các cơ chế để có thể tồn tại và tăngtrưởng trong đất và trầm tíchbị thiếuoxygen.Còn được gọi là môkhôngk h í , c á c m ô này hiện diện trên chồi và rễ tạo điều kiện vận chuyển oxy từ khí quyển đến rễ, do đócungcấpnguồnoxygenchoquátrìnhhôhấp.

Câytrồngởvùngđấtngậpnướclànơigiaodiệng i ữ a hiệndiệnoxygenvàyếmk hí (thiếu oxygen), và do đó cung cấp môi trường sống cho cả vi khuẩn hiếu khí và kỵkhí, tạo điều kiệncho việc tái sản xuất chất dinh dưỡng (Hình 2.3) Bênc ạ n h o x y g e n , các loài thực vật tại đây thải ra các hợp chất cacbon hữu cơ cung cấp cho vi sinh vậttrong vùng rễ (rhizosphere) là nguồn năng lượng cần thiết giúp vi sinh vật thực hiện cácphảnứngsinhhọckhácnhau.

Hình2.3:Sơđồtrìnhbàysựtươngtácgiữasựphóngthíchoxygencủarễvàcácquátrìnhhiếuk hívàkỵkhíliênquanđếnsựtáisinhcácnguyêntố,cũngnhưsựphátthải methanetừđấtngậpnước(Pauletal., 2013).

Do yêu cầu phải thích ứng với môi trường vùng rễ của vùng đất ngập nước chothấy rằng có thể cósựh i ệ n d i ệ n đ a d ạ n g c á c l o à i v i k h u ẩ n S ự đ a d ạ n g v i k h u ẩ n n à y , đặc biệt là trong môi trường đất, thường đi kèm với sự đa dạng về chức năng, và đượcxemlàcóýnghĩaquantrọngtrongviệcduytrìcácchứcnăngđịasinhhọc(biogeochemical) dưới sự thay đổi môi trường Vùng rễ (rhizosphere) của các khu đấtngập nước là nơi cư ngụ của một nhóm các vi khuẩn sống tự do và đa dạng có khả năngcố định nitrogen. Cộng đồng vi khuẩn này được duy trì với sự đa dạng cao và ổn địnhtrước những biến đổi về môi trường(Paulet al., 2006).Ngoài ra, còncósự hiệnd i ệ n của các nhóm vi khuẩn chuyên biệt (vi khuẩn chuyển hóa sắt), chúng thường liên quanđến những phản ứng quan trọng về sinh học và môi trường Trong vùng rễ của khu đấtngập nước, nơi có sự giao nhau đặc trưng giữa hiện diện oxygen và yếm khí, những vikhuẩn hiếu khí và kỵ khí bắt buộc phải hoạt động gần nhau, qua đó tạo điều kiện cho sựtuầnhoànvậtchất.

Các vùng đất ngập nước nội địa như U Minh, Đồng Tháp Mười và các hệ thốngsông suối, hồ là những nơi chứa đựng nhiều loài động vật, thực vật đặc hữu hoặc nhữngloài có tầm quan trọng về đa dạng sinh học toàn cầu Tuy nhiên, hiện nay, các nghiêncứu về cộng đồng vi khuẩn trên các vùng đất ngập nước này chưa được ghi nhận nhiều,vàđặcbiệtlànhữngkhảnăngcóthểứngdụngcộngđồngnàyhiệncònchưađượcnghiêncứuvàkh aithác.Chínhvìvậy,việcnghiêncứunàycóthểsử dụngcộngđồng vikhuẩn nhằmphụcvụconngười,vàđồngthờinhằmbảotồnnguồngenquýhiếmlàvôcùng cầnthiết.

Mộtsốcơchếkiểmsoátbệnhthựcvậtcủacácdòngvikhuẩntừđất

Các dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng và kiểm soát bệnh có tiềm năng rất lớnvào việc phát triển các hệ thống nông nghiệp bền vững Chúng thực hiện theo ba cáchkhác nhau:(i)Tổng hợp các hợp chất đặc biệt cho cây trồng;(ii)Tạo thuận lợi cho việchấp thu một số chất dinh dưỡng từ đất;(iii)Ngăn ngừa bệnh cây (Kumar and Dubey,2012) Nhìn chung, cơ chế gián tiếp liên quan đến khả năng giảm các tác động có hại docácsinhvậtgâybệnhtrêncâytrồng.CácdòngBCAgiántiếpgiúpkíchthíchsinhtrưởngcây trồng thông qua sự ức chế các mầm bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau, chẳng hạnnhư khả năng tổng hợp siderophores cạnh tranh nguồn sắt với các tác nhân gây bệnh(Pandeyetal,2005),khảnăngtổng hợpcácchấtchuyểnhóachốngnấmvàvi kh uẩnnhưkhángsinh(Kangetal.,2004),sựbiểuhiệncủacácenzymephângiảitếbàonấmβ–1,3–glucanase,cellulase,chitinase,trêncảnấmvàvikhuẩnnhưProtease(Szekereset al., 2004) và khả năng tổng hợp hydro cynide (Senthilkumaret al., 2009), những chấtnày ức chế sự phát triển của các dòng vi sinh vật gây bệnh Do đó, các dòng BCA đãthành công trong việc cạnh tranh với các mầm bệnh về chất dinh dưỡng và không giansống.

Cácnghiêncứuvềvikhuẩngây bệnhđốmládoXanthomonassp trênhoa hồng(Rosaspp.)vàcâyớt

Vikhuẩngâybệnhđốmlátrêncâyhoahồng

Bệnh đốm vi khuẩn trên hoa hồng (Rosasp.) đã được ghi nhận ở các bang miềnnam Hoa Kỳ như Florida và Texas, trong đó các dòng thuộc chiXanthomonasđã đượcphân lập và cho thấy có khả năng gây bệnh Phân tích trình tự Multilocus và trình tựrRNA 16S cùng với cấu hình axit béo ghi nhận các dòng gây bệnh trên hoa hồng này rấtgiống vớiX alfalfaesubsp.citrumelonis Kết quả nghiên cứu này được Huanget al.

(2013) tiến hành Nhóm tác giả tiến hành khảo sát trên các cây hoa hồng tại Bang TexasvàFloridatrong khoảngthời giangiữa năm2004 đến 2010.Mười dòng vik h u ẩ n đ ạ i diện được thu thập và được sử dụng để xác định vị trí phân loại Các dòng này được lâybệnh nhân tạo, ghi nhận các tổn thương qua những vết ngấm nước, sau đó tiếp tục pháttriển thành những đốm hoại tử và vết cháy lá trên phần lớn các cây chủ Sự khác biệt vềkiểuhìnhnàycóthểđượcliênkếtvớitínhđadạngditruyền(Huangetal.,2013).

Nhóm tác giả đã sử dụng một số phương pháp như phân tích axit béo (Fatty acidmethyl ester analysis), trình tự gen rRNA trong việc định danh, phân loại các dòng vikhuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng Kết quả đã xác nhận rằng các dòng vi khuẩngây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng là thành viên của chiXanthomonas(Huanget al.,2013).

Ngoài ra, nhóm còn sử dụng kỹ thuật phân tích phát sinh loài dựa vào kết quả phântích và đánh dấu trìnht ự đ a l o c u s ( M L S A ) n h ằ m m ô t ả t h ê m c á c d ò n g v i k h u ẩ n g â y bệnhtrênhoahồng.TrìnhtựkhôngliêntụccủacácgenfusA,gapA,gltA,gyrB,lacF, vàlepAcủacácdòngvikhuẩnthuộcchiXanthomonasđãđượctảixuốngtừPAMDB.org

(Almeidaet al., 2010) được sử dụngchocác phântíchsosánhvớic á c trình tự của các dòng vi khuẩn gây bệnh trong nghiên cứu này Tiến hành phương phápMLSA (phương pháp phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự của các locus nhiễmsắcthểkhácnhaugiữacácsinhvậtcóquanhệgầngũi)dựatrêncácgenfusA(translationelongationf actorGgene),gap1(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseg e n e ) ,gltA (citrate synthase gene),gyrB (DNA gyrase subunit B gene),lacF (ABC transportersugar permease gene), vàlepA (GTP binding protein gene) Việc phân tích được thựchiện bằng cách sử dụng phần mềm Clustal X phiên bản 2.0.6 và điều chỉnh (bằng mắt)bằng cách sử dụng phiên bản Se-Al 2.0a10 Trước khi phân tích phát sinh loài, sự đadạngtrìnhtự,baogồmsốlượngcáckiểuhaplotype,sốlượngcácvịtrí đa hình(polymorphic) và đa dạng nucleotide (nuclear diversity) được xác định trong tất cả cácdòng gây bệnh trên hoa hồng thuộc chiXanthomonasbằng cách sử dụng phần mềmDnaSP phiên bản 5. Phân tích chi tiết cây phát sinh loài được tiến hành bằng phần mềmMEGA5.

Kết quả ghi nhận những dòng vi khuẩn này ít có sự biến đổi di truyền đáng kể,chỉcóhaihaplotype,vàrơivàoX.axonopodisphânnhóm9.2(hình2.5).Tácnhângâybệnhnàyđược đánhg i á làmộtmầmbệnhmới Cáchđặttênmầm bệnhro sa đượcđềxuất theo quyết định danh pháp được mô tả trước đây Các dòng vi khuẩn gây bệnh trên câyhoa hồng có ít đa dạng di truyềnv ì c h ú n g h i ệ n d i ệ n c h ỉ c ó h a i h a p l o t y p e v à h i ể n t h ị 2 5 vị trí đa hình (polymorphic) chỉ trong trình tựgapA 25 đột biến tronggapA có lẽ đượctạo ra được do sự tái tổ hợp từ dòng khác. Phân tích trên các dòng gây bệnh trên hoahồng trong loàiX axonopodisphân nhóm 9.2 (phân nhóm này bao gồm hơn 50 mầmbệnh) xác định cùng với X alfalfae,X. euvesicatoria, vàX perforansdựa trên các phátsinh loàigyrB Các thành viên của phân nhóm được xem là gây bệnh cho một loạt cácchi thực vật khác Trong đó, các mầm bệnh (rosa) trên cây hoa hồng này là loài gây hạinghiêm trọng trên hoa hồng Những phát hiện này cho thấy đặc điểm cây chủ cụ thể, hỗtrợcácchođặtdanhphápchocácmầm bệnhnày.

Trong 10 dòng vi khuẩn này, các dòng R07, R09, HDRA, X1808, X1811, X1847,X1850, Tx11 và Tx12 chia sẻ cùng kiểu haplotype, dòng HDRB là một mẫu haplotypeđộc nhất Hai haplotypes khác nhau bởi 25 nucleotide (nt) trong chuỗi 444- ntgapA, vớigiá trị về đa dạng nucleotide đạt 0.01126 Mười dòng vi khuẩn gây bệnh trên hoa hồngnày tạo thành hai nhánh nhỏ trong phân nhóm 9.2 dựa trên các kết quả phân tích“maximum parsimony”, nhưng kết quả phân tích xác suất sau Bayesian của 2 nhánh nàychưa ổn định Các giá trị khởi động đối với nhóm 9,2 là 55 và 65%, nhưng phân tích xácsuấtsauBayesianlà100%chophânlớp,giúpphânlớptrởnênđángtincậy.Cácdòngvi khuẩn này đã được phân tích phát sinh loài cho thấy có quan hệ gần vớiX alfalfaesubsp.citrumelonis,X. alfalfaesubsp.alfalfae, vàX perforanscủa phân lớp 9,2 hơn sovới các dòngXanthomonasspp khác Giá trị tương đồngt r o n g n ộ i b ộ d ò n g v i k h u ẩ n gây bệnh trên hoa hồng là 99,1% Các giá trị tương tự cho các dòng còn lại thuộc phânlớp 9,2 là 98,3 đến 99,7%, với giá trị thấp nhất giữa hoa hồng và HDRB vớiX alfalfaesubsp.alfalfae Nhìn chung, các dòng vi khuẩn gây bệnh trên hoa hồng này có giá trịtương đồng cao nhất (98,8 đến 99,7%) với phân họX. alfalfaesubsp.citrumelonis Nhìnchung, kết quả MLSA và lây bệnh nhân tạo cho thấy rằng đây là một mầm bệnh mới(Xanthomonassp pv.rosa) thuộcchiXanthomonaslà tác nhân gây đốml á v i k h u ẩ n trên hoa hồng Mặc dù mầm bệnh này có mức độ tương đồng cao về trình tự DNA vớicác thành viên khác củaX axonopodisphân nhóm 9.2, nó hiển thị một kiểu hình độckhác biệt với các mầm bệnh khác tương tự của các phân nhóm được sử dụng trongnghiêncứunày.

Hình2.5:Sựphátsinhloàicủacácdòngrosacủa chiXanthomonasdựatrêncácdữliệukết nốicủacácđoạngenfusA,gap-1,gltA,gyrB,lacF,vàlepA(Huangetal.,2013).

PhátsinhloàicủanhữngdònggâybệnhtrêncâyhoahồngcủaXanthomonasdựatrênbộdữliệu nốicácđoạncủacácgenfusA,gap-1,gltA,gyrB,lacF,vàlepA.CáctrìnhtựcácgennàythuộcXanthomonasđượctảivềtừ PAMDB Số trên các nốt (node) đại diện cho các giá trị hỗ trợ bootstrap cho độ phân cực tối đa – maximumparsimony (phía trước), khả năng tối đa – maximum likelihood (trung bình) và xác suất sau Bayesian trình bàynhư là tỷ lệ phần trăm – Bayesian posterior được trình bày dưới dạng phần trăm (điểm cuối) Các giá trị đượcbiểu thị bởi dấu hoa thị (*) dưới 50% bootstrap hoặc 90% đối với xác suất sau của Bayesian Các số từ 9,1 đến9,6làcác nhómdoRademakervà cộng sựmôtảtrongXanthomonas axonopodis(2005)

Trong một nghiên cứu gần đây, Baraket al.(2016) đã so sánh toàn bộ trình tự bộgen của dòng GEV-Rose-07, một trong những dòng gây bệnh trên hoa hồng, với cácdòngXanthomonascó liên quan chặt chẽ khác Dựa trên phân tích toàn bộ trình tự bộgen,GEV-Rose-07cóliênquanchặtchẽvớinhómphânloạiRademaker9.2,baogồm

X euvesicatoria(Xe) 85-10,X perforans(Xp) 91-118,X euvesicatoriapv allii

(Xea)CFBP 6369,X alfalfaesubsp.citrumelonis(Xac) F1, vàX dieffenbachiae(Xd)LMG12,749 (Rademakeret al., 2005) Với giá trị phân tích tương đồng nucleotide theo cặplớn hơn 97% (> 97%) vớiX euvesicatoria, dòng GEV-Rose-07 được đề xuất là mầmbệnhthuộcloàiX.euvesicatoria;vàthuộcphânloàirosavớitênđầyđủlàX.euvesicatoriap v.rosa(Xer) (Baraket al., 2016) TênX euvesicatoriapv.rosecũngđược công nhận và sử dụng để nghiên cứu về vi khuẩnXanthomonasgây bệnh hoa hồng(Fanetal., 2022).

Vikhuẩngâybệnhđốmlátrêncâyớt

Myunget al(2009) đã tiến hành ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh đốm lá trên cây ớt trongmộtnhàkính thương mạiởJinju,HànQuốcvàonăm2014,kếtquảchothấy cót ỷlệmắc bệnh đốm lá là 35%, với các triệu chứng đốm lá điển hình trên cây con đã được ghinhận trên giống ớt ngọt (Capsicum annuumL.) Cụ thể như sau: Các triệu chứng gâybệnh như: những đốm hoại tử tròn, bất thường, đen, với cạnh ngấm nước Các lá bị ảnhhưởng chuyển sang màu nâu sẫm và dễ dàng rụng đi Bảy dòng vi khuẩn được phân lập(BC3707 đếnBC3713)đã đượctái phânlậptrênmôitrường đậu nànhtrypticase(trypticase soy agar) từ các vị trí lá bệnh sau khi được khử trùng bề mặt trong cồn ethyl70%trong20giây. Đặc điểm hình thái đã được ghi nhận cho thấy các dòng vi khuẩn được phân lậpnày có Gram âm, roi chuyển động với một sợi cực duy nhất Trên môi trường peptonesucrose agar, khuẩn lạc có màu vàng và nhô lên với rìa mịn Đặc điểm sinh hóa đượckiểm tra dựa trên hướng dẫn phân biệt các loài thuộc chiXanthomonas(Schaadet al.,2001) và chiXanthomonasliên quan đến bệnh đốm vi khuẩn ở cà chua và ớt

(Jonesetal., 2004) Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn này cók ế t q u ả d ư ơ n g t í n h t r o n g p h ả n ứngcatalase,vàâmtínhđốivớioxidase.

Xác định tác nhân gây bệnh và khả năng gây bệnh được thực hiện bằng cách phunhuyền phù tế bào vi khuẩn chứa 10 7 CFU/ml lên cây ớt (C annuum) 3 tuần tuổi và câygiống cà chua 2 tuần tuổi (Solanum lycopersicun) trong nhà kính duy trì ở 27 ± 2 0 C. Cácdòng gây ra các triệu chứng tương tự như những biểu hiện bệnh ban đầu trên cây ớt(Capsicumspp cv Wangdaebak) và ớt chuông (C.spp var.angulosumcv.R e d ) , v à làml á ớ t v à l á c à c h u a r ụ n g s a u 1 t u ầ n c h ủ n g m ầ m b ệ n h K h ô n g c ó t r i ệ u c h ứ n g n à o đượcghinhậntrêncâyđốichứngvà câycàchuakhiphun bằngnướccấttiệttrùng.

Một nghiên cứu khác của Kyeonet al.(2016) với 72 mẫu bệnh trên cây ớt trênkhắp Hàn Quốc được sử dụng để xác định tác nhân gây bệnh 3 kiểu hình của các mầmbệnh trên ớt tại Hàn Quốc được so sánh với các dòng BSX (bacterial spot – causingXanthomonas) tham khảo để định danh chính xác Ba đặc điểm chính được sử dụng đểtách 4 loài BSX được dựa theo Joneset al (2004) Tất cả các mầm gây bệnh trên ớt ởHàn Quốc đều âm tính đối với hoạt tính pectolytic, và ngoại trừ 5 dòng, những dòng cònlại ghi nhận kết quả âm tính đối với hoạt tính amylolytic Những đặc điểm này giống hệtnhư củaX euvesicatoriavàX. gardneri Năm dòng được phân lập cho kết quả dươngtínhvới hoạttínhamylolytickhôngthuộccácdòngcủaX.euvesicatoriahoặcX.perforans.

A:Tổnthươngtrênlớpbiểubìmặttrêncủaláớt;B:Tổnthươngtrênlớpbiểubìmặtdướiláớt;C:Tổnthươngtrênlớpbiểubìmặttr êncủalácàchua;D:Tổnthươngtrênlớpbiểubìmặtdướicủalácàchua.

Gần đây, Stoyanovaet al (2014) lập luận rằng để tách thành phần loài của nhómBSXthìviệcsửdụngmộtsốđặcđiểmkiểusinhhóanhưhoạttínhamylolytic vàvi ệcsử dụngcis-aconitic acid là chưa đủ Bên cạnh đó, tất cả các mầm bệnh này trênớ t ở HànQuốccómộtprotein32kDa.ĐâylàloạiproteinchỉduynhấtcóởX.euvesicatoria.

Nhằm đảm bảo xác định chính xác danh pháp của các dòng gây bệnh trên ớt đượcthu thập, Kyeonet al.(2016) đã tiến hành phân tích một số đặc điểm kiểu hình và kiểugen đã được sử dụng như: khả năng phâng i ả i a m y l o ( a m y l o l y t i c a c t i v i t y ) , k h ả n ă n g phângiảipecto(pectolytic activity),sựhiệndiệnvếtproteinđộcnhấtkhiđi ệnditrên gelsodiumdodecylsulfatepolyacrylamide(SDS-

PAGE),PhântíchR e s t r i c t i o n fragment length polymorphism – RFLP dựa trên genrpoB, Phân tích phát sinh loài với16SrRNA và trìnhtự 3genhouskeeping.Cụ thểnhưsau:

Kết quả về phân tích 3 đặc điểmk i ể u h ì n h c h o t h ấ y t ấ t c ả c á c m ầ m b ệ n h t r ê n ớ t này ở Hàn Quốc đều làX euvesicatoria Kết quả của RFLP dựa trên genrpoBcho thấyrằng tấtcảcácmầmbệnhtrênớt này đềucóvạch(band) trùngvới mẫucủaX.euvesicatoriavàX perforans Một cây phát sinh dựa trên trình tự 16S rRNA cũng chothấyr ằ n g t ấ t cảcácmầmbệnhtrênớtở H à n Quốcđ ư ợ c n h ó m lạicùngvớiX euvesicatoriavàX.perforans.CáckếtquảnàychothấydựagenrpoBtheophương phápRFLP và chuỗi

16S RNA là chưa đủ để tách biệt 2 loài BSX (X euvesicatoriavàX.perforans) Những kết quả này cũng chỉ ra rằng loài thứ 2 có liên hệ chặt chẽ với loàicònlại.

Phương pháp MLSA cho nhiều thông tin chi tiết về kiểu gen hơn so với trình tự16S rRNA và RFLP Một số nghiên cứu trước đây về phương pháp MLSA đã phân biệtđược 4 loài BSX (Almeidaet al., 2010,Hamzaet al., 2012, Kebedeet al.,2014,Timilsniaet al., 2015) Cây phát sinh loài của 3 gene lưu trữ (housekeeping) làgapA,gyrB, vàlepAcho thấy tất cả các dòng gây bệnh trên ớt ở Hàn Quốc được phân thànhcùngnhómgiốngnhưX.euvesicatoria.

Cácnghiêncứusửdụngvikhuẩntrongviệckiểmsoátmầmbệnh doXanthomonasspp.gâyratrêncâytrồng

Cácn g h i ê n c ứ u s ử d ụ n g v i k h u ẩ n t r o n g v i ệ c k i ể m s o á t Xanthomonascampestrispv.campestristrêncây trồnghọcải

X campestrispv.campestris(Xcc)là nguyênnhângây ra bệnhthối đen( b l a c k rot), một bệnhlây lantrêntoàn thế giới và được đánhgiálà bệnhlýg â y h ạ i n ặ n g n ề nhất,vớithiệthạikinht ế đángk ể đốivớicácloạira uh ọ c ả i (Mo nt ei roe t al.,2005).

Mặc dù chủ yếu ảnh hưởng đến họ Brassica như: bắp cải (cabbage), bông cải xanh(broccoli), súp lơ trắng (cauliflower), cải xoăn (kale) và các loại cải khác (Qianet al.,2005), ngoài ra còn có một số trường hợp được ghi nhận trên cỏ dại (weeds) và cây cảnh(ornamental plants) Bệnh thối đen gây ra hiện tượng đen sạm ở các mô mạch và các tổnthương trên lá, từ úa lá đến hoại tử, dẫn đến thối rữa trên cây rau và không còn sử dụngđược (Alvarez,2000).

Vi khuẩn thuộc chiBacillusđược biết đến như một tác nhân kiểm soát sinh học(Firaet al., 2018) Các dòngB subtilisvàPseudomonas fluorescensđều được phân lậptừ các mẫu súp lơ (cauliflower), thể hiện đặc tính đối kháng vớiXcc(Singhet al.,2010).Cácdòngvikhuẩnđốikhángnàyđượcthửnghiệmriêngbiệtvàtronghỗnhợp(v ớitỷlệ 1:1) và với các mật số khác nhau Trong thử nghiệmin vitro, sự ức chế thay đổi tùytheo mật số mầm bệnh và vi khuẩn đối kháng, cả hai vi khuẩn đối kháng không thể hìnhthành quầng ức chế ở nồng độ thấp hơn 10 6 CFU/mL Các thử nghiệm sau đó được thựchiệntrêncâysúplơbằngcáchphunlêncâyvớinồngđộtươngtựnhưtrongốngnghiệm,chỉ thay đổi thời gian sử dụng chất đối kháng Kết quả ghi nhận rằng hỗn hợp của cả haivi khuẩnđượcphunxửlýmộttuầntrướckhixử lýXcclàm giảmtỷlệnhiễmbệnh xuốngthấp hơn so với nghiệm thức đối chứng xử lý bằng streptomycin Điều này cho thấy tiềmnăngcủacảhaidòngvikhuẩnnhưlà tácnhânbảovệtrongkiểmsoátsinhhọc.

Mishra&Arora(2012)đánhgiábốnmươidòngvikhuẩnđượcphânlậptừvùngrễ của loàiBrassica campestrisvề khả năng đối kháng vớiXcc Hai dòng KA19 và SEtương ứngP aeruginosavàB thuringiensisđược ghi nhận rất tiềm năng với quầng ứcchế rộng hơn 11 mm Sau đó, thử nghiệm riêng rẽ và kết hợp trong điều kiện nhà kínhcóthể kiểm soát bệnh thối đen bằng cách sử dụng kỹ thuật phun lá hoặc ngâm hạt và trộnđất.Kếtquảcàngkhả quanhơnkhiđượcsửdụngphốihợphai dòngnày.

Trong một nghiên cứu khác, Liuet al.(2016) đã thử nghiệm 23 dòng vi khuẩnvùng rễ (rhizobacteria) có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật nhằm đối kháng vớiXcc, với thử nghiệminv i t r ovàin vivo Thử nghiệmin vitrotrên đĩa ghi nhận 18 trongsố 23 dòng tạo ra quầng ức chế, tất cả chúng đều được xác định làB velezensis Támdòng này đã được chọn để thử nghiệm trong nhà kính phun trên cây bắp cải Tất cả cácdòng được thử nghiệm đều làm giảm bệnh tới 40% Bốn dòng đối kháng nhất đã đượcchọn để nghiên cứu dạng riêng lẻ, và dạng phối hợp chung 4 dòng với một hỗn hợp kháclà vi khuẩn kích thích sinh trưởng cây trồng Tất cả các phương pháp điều trị đạt kết quảkhả quan, đặc biệt dạng hỗn hợp có kết hợp với vi khuẩn kích thích sinh trưởng, là hỗnhợp hiệu quả nhất, làm giảm đáng kể các triệu chứng bệnh và thúc đẩy sự phát triển củacây.

Ghazalibiglaret al.(2015) đã sàng lọc và ghi nhận 14 dòng có khả năng đối khángchống lại 6 dòngXcctrongs ố 2 4 d ò n gPaenibacillus Trong đó, bảy dòng được chọncho thửnghiệmtrongchậu,trongđó dòngP16 làmgiảmtỷlệbệnhthốiđendohaidòng

Xccđượcsửdụngtrongthínghiệminvivo.Ngoàira,dòngP16cóthểkíchkhángởcây bắpcải(Ghazalibiglaret al.,2016).

Cácn g h i ê n c ứ u s ử d ụ n g v i k h u ẩ n t r o n g v i ệ c k i ể m s o á t Xanthomonascampestrispv.campestristrêncâycàchuavàớt

Cây cà chua và ớt là loại cây trồng rất quan trọng đối với nềnk i n h t ế t h ế g i ớ i , v ì thế bệnh đốm lá vi khuẩn (BLS- Bacterial leaf spot) trên hai loại cây này đã gây ra thiệthại đáng kể (Abbasi & Weselowski, 2015) Các mầm bệnh đã biết gây ra hiện tượng nàylàX.vesicatoria,X.euvesicatoria,X. perforansvàX.gardneri(Jonesetal.,2004;Potniset al., 2015) Việc sử dụng các giống kháng và ứng dụng các hợp chất hóa học làm thuốcdiệt vi khuẩn là các phương pháp kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn thông thường (Peitletal.,2017) Tuy nhiên, những kỹ thuật này đã được chứng minh là không thể kiểm soátcăn bệnh này (Perneznyet al.,2012) Do đó, nhiều nghiên cứu liên quan đến kiểm soátsinh học đối với bệnh đốm vi khuẩn trên cây cà chua và ớt đã được phát triển (El-Hendawyet al., 2005; Obradovicet al., 2005; Jiet al., 2008;) Trong đó, vi khuẩn thuộcchiBacillusđã thể hiện tiềm năng như một tác nhân kiểm soát sinh học ức chế một sốloàiXanthomonasspp gây ra (Miriket al., 2008; Lanna Filhoet al., 2010) Nghiên cứuđược thực hiện bởi Miriket al.(2008) đã tìm thấy ba dòngBacillusspp., được phân lậptừ vùng rễ cây ớt, có tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩnX vesicatoria Kết quảtrong các thí nghiệm trong nhà kính và trồng cây trên cây ớt cho thấy bệnh đốm lá do vikhuẩngiảmkhiđượcxử lýbadòngnàydạngđơnlẻhoặckếthợp.

Trongmộtnghiêncứukhác(LannaFilhoetal.,2010),BacilluspumilusvàPaenibacillus macerans, từ cây cà chua khỏe mạnh, đã ức chế sự phát triển của

X.vesicatoriatrongthửnghiệmkhángkhuẩnvàbảovệcây càchuachốnglạicácphytopathogens này Gần đây hơn, cùng các tác giả đã chứng minh rằng các phân đoạnprotein từBacillus amyloliquefaciensvàBacillus pumilus, được phân lập từ thân càchua, có khả năng thúc đẩy sự cảm ứng của cây cà chua kháng lạiX. vesicatoria(LannaFilhoet al.,2013).Pseudomonasspp được coi là một trong những tác nhân kiểm soátsinh học quan trọng, đã được ghi nhận là có vai trò kiểm soát nhiều bệnh thực vật do vikhuẩn, nấm và tuyến trùng gây ra (Obradovicet al., 2004) Một số nghiên cứu cũng đãchứng minh tác dụng của những vi khuẩn này chống lạiX vesicatoria(Abo-Elyousr &El-Hendaw, 2008; Príncipeet al.,2018) Trong nghiên cứu của Abo-Elyousr &El-Hendaw (2008),Pseudomonas fuorescensđược phân lập từ vùng rễ của cây cà chua đãhạn chế sự phát triển củaX vesicatoria in vitro, trên hạt cà chua, trong điều kiện phòngthí nghiệm, chúng đã cải thiện khả năng nảy mầm của hạt và sức sống của cây con vàtrong điều kiện nhà kính và ngoài đồng làm giảm đáng kể chỉ số bệnh của bệnh đốm vikhuẩntrêncàchua.

Liuet al.(2018) đã chứng minh trong các thí nghiệm trên cây cà chua trong nhàkínhrằnghỗnhợpcủahaidòngPGPRriênglẻ(B.velezensisAP197+AP298)và(B

altitudinisAP69+B.velezensisAP199)thể hiệnkhả năng kiểmsoátsinhhọcchốnglại mầmbệnhvikhuẩnlá(X.axonopodispv.vesicatoria)tốthơncácdòngriêng lẻ.

Cácnghiênc ứ u s ử dụngv i khuẩntrongviệck i ể m soátc á c l o à i Xanthomonasspp.khác

Giống như các loàiXanhomonasspp đã nêu ở trên,cácloàikhác thuộc chiXanthomonasnày cũng rất quan trọng trong nông nghiệp và khó kiểm soát Tuy nhiên,có rất ít nghiên cứu kiểm soát sinh học đối với các loài này DòngX. axonopodispv.manihotis(Xam) là tác nhân gây bệnh bạc lá vi khuẩn trên cây sắn (CBB-

Cassavabacterialblight).ỞIndonesia,mộtnghiêncứuđãphânlập20vikhuẩnnộisinh(endoph ytic) từ thân cây sắn, được xác định đều làPseudomonassp Một nghiên cứuđược thực hiện vào năm 2015 (Halfeld-Vieiraet al.,2015) ghi nhận có sự giảm chỉ sốbệnh bạc lá vi khuẩn trên cây chanh dây (passionfruit bacterial blight) do ba dòngX.axonopodispv.passiflorae(Xap) gây rakhi sử dụng chín dòngv i k h u ẩ n t ừ b ề m ặ t l á cây chanhleo bản địa (thuộc cácchi:Arthrobacter,Curtobacterium,Enterobacter,Microbacterium,PseudomonasvàSte notrophomonas), sự cạnh tranh đối với các hợpchất sắt và nitrogenate trên lá giải thích khả năng kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩnkiểmsoátbệnh này.

Gần đây, Ribeiroet al.(2017) ghi nhận sự xâm nhiễm của một dòngPseudomonassp. có chứa pyoverdine ức chếX axonopodispv.passiforae, và giảm chỉ số bệnh bạc lávi khuẩn chanh dây Dịch chiết chứa pyoverdine làm giảm số lượng tế bào củaX.axonopodispv.passiforae in vitrovà làm giảm đáng kể chỉ số bệnh của bệnh bạc lá vikhuẩninvivo.

Bệnhc h á y b ì a l á d o v i k h u ẩ nXanthomonas oryzaepv.oryzaegây ra là bệnh hạilúa trên toàn thế giới Jiet al(2008) ghi nhận một dòngLysobacter antibioticus, đượcphân lập từ vùng rễ cây lúa, đã ức chế đáng kể sự phát triển mầm bệnh này trong các thínghiệm nhà kính và ngoài đồng Chithrashreeet al.(2011) cũng ghi nhận vi khuẩn vùngrễ kíchthích sinh trưởng thực vật thuộcBacillusspp cóthể làmg i ả m t ỷ l ệ b ệ n h c h á y bìalálúa,chiềudàivếtbệnhvàhéocây.

Sự canh tác cây Hồng môn (Anthurium) trên toàn thế giới đã bị ảnh hưởng bởibệnh bạc lá doX axonopodispv.dieffenbachiae.DòngBacillus amyloliquefaciensB014, được phân lập từ cây khỏe mạnh đã được ghi nhận có khả năng ức chế bệnh này(Lietal., 2012).

Xanthomonas campestrispv.cucurbitaegây bệnh đốm vi khuẩn trên dưa chuột,bầubí(gourds),bíđỏ(pumpkins)vàbíđao(squash).HaidòngBacillussubtilis(UMAF6

614vàUMAF6639) đượcZeriouhetal.(2011)ghi nhậnkhả năngk h á n g khuẩn cao đối với mầm bệnh nàyin vitrovà trong lá dưa (melon) Khả năng kiểm soátsinhhọc nàycóthểliênquanđếnchấtiturinlipopeptides.

Một số vi khuẩn đã thể hiện khả năng chống lại các loàiXanthomonasspp. trongđiều kiệnin vitrovàin vivovà cải thiện sức khỏe cây trồng thông qua nhiều cơ chế. Mộtsố vi sinh vật này có các gen sinh tổng hợp cụ thể liên quan đến việc sản xuất các nhómkháng sinh Vi khuẩn vùng rễ đối kháng, kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR), vikhuẩn nội sinh đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc chống lạiXanthomonasspp Đặc biệt vi khuẩn thuộc chiBacillusvàPseudomonascó thể được đánh dấu là tácnhânkiểmsoátsinhhọctiềmnăngđốivớicácmầmbệnhkhácnhauthuộcchiXanthomonas.

Sự kết hợp của một số dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh cũng là một sự thaythế rất hiệu quả và đáng tin cậy Nhìn chung, chúng ta có thể nói rằng các vi sinh vật cótiềm năng lớn để kiểm soátXanthomonasspp và chúng đã được quan tâm nhiều để ứngdụng thương mại Một số chế phẩm phòng trừ sinh học đối vớiXanthomonassp có sẵntrên thị trường như Serenade® OPTI (BAYER) chứa một dòngBacillus subtilis(dòngQST 713) duy nhất có thể được sử dụng để chống lạiXanthomonassp gây ra đốm vikhuẩn trên cà chua, ớt, cà tím và khoai tây và vi khuẩnXanthomonas arboricolagây racácbệnhchính trêncâyăn quảcóhạt.

KỹthuậtMALDI-TOF- MS(MatrixAssistedLaserDesractionIonizationTime-Of- Flightmassspectrometry)vàMLSA(Multilocussequenceanalysis)tr ongnghiêncứuđịnhdanhvi khuẩn

Việcpháthiệnvàxácđịnhcácloàivikhuẩn mộtcáchnhanhchóngvà đángtinc ậy là vô cùng cần thiết nhằm chẩn đoán và điều trị hiệu quả Trong thời gian qua, việcxác định vi khuẩn trong các phòng thí nghiệm lâm sàng thường chủ yếu dựa vào các kỹthuậtxác định trìnhtựgen, hìnhthái, sinh hóa.Việcxác định chính xác vi khuẩn rấtquan trọng trong trường hợp bùng phát các bệnh truyềnn h i ễ m v à đ ó n g v a i t r ò q u a n trọng trong việc chẩn đoán và điều trị hiệu quả Tuy nhiên, việc xác định vi khuẩn kỵkhí, vi khuẩn khó nuôi cấy, vi khuẩn sinh trưởng chậm bằng các phương pháp thôngthường rất tốn thời gian, tốn kém và phức tạp Gần đây, các nhà nghiên cứu đã tập trungsự chú ý vào việc sử dụng khối phổ (mass spectrometry - MS) để xác định vi khuẩn, đặcbiệt là phương pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và nănglượng laser theo thời gian bay(MALDI-TOF) Trong kỹ thuật MALDI-TOF-MS, vikhuẩn được xác định bằng cách sử dụng tế bào nguyên vẹn hoặc chiết xuất tế bào Việcxác định vi sinh vật được thực hiện bằng cách so sánh dấu vân tay khối lượng peptide(peptide mass fingerprint – PMF) của sinh vật chưa biết với PMF có trong cơ sở dữ liệuhoặc bằng cách so sánh khối lượng dấu ấn sinh học của sinh vật chưa biết với cơ sở dữliệu proteome Quá trình này diễn ra nhanh chóng, chính xác và tiết kiệm cả về công laođộng và chi phí liên quan Công nghệ này đã được các nhà vi sinh vật học sử dụng chomột số mục đích như: xác định vi sinh vật, nghiên cứu dịch tễ học, phát hiện tác nhângâychiếntranhsinhhọc,pháthiệnmầmbệnhtruyềnquanướcvàthựcphẩm,pháthiện sự kháng kháng sinhvà phát hiệnc á c m ầ m b ệ n h t r o n g m á u v à đ ư ờ n g t i ế t n i ệ u ( N e e l j aet al., 2015) Việc sử dụng MALDI-TOF-MS có thể xác định thành công các nhóm vikhuẩn khó nuôi cấy Đây là một phương pháp xác định vi khuẩn nhanh chóng, chính xácvà tiết kiệm chi phí so với các kỹ thuật hình thái thông thường hoặc sinh học phân tử, làmột công nghệ mới để xác định thường quy vi khuẩn trong các phòng thí nghiệm vi sinhlâm sàng. Định danh vi sinh vật bằng khối phổ, trong đó kỹ thuật MALDI-TOF làphươngphápđượcnghiêncứu,ứng dụngvàgiảiquyếtcáchạnchếtrên.MALDI-TOFít tốn kém, thời gian trả kết quả ngắn chỉ mất một vài phút cho một kết quả đáng tin cậy.Năng suất của phương pháp này khá cao với khả năng xác định đến hàng trăm mẫu trênmỗi lần chạy Hiệu năng định danh của MALDI-TOF cao, cho kết quả đủ thông tin vàgiao diện dễ đọc đồng thời hỗ trợ truy xuất nguồn gốc và có phần mềm thân thiện vớingười dùng Tất cả các công đoạn của phương pháp này từ chuẩn bị mẫu đến đo và xemxét kết quả đều được máy móc đảm nhiệm tự động khép kín Chính vì thế, không chỉgiảmsứ c l a o động,tiết k iệ m n h â n l ự c , MA LD I-

T OF cònc ho k ế t quảchínhx á c , t h ờ i gianrakếtquảnhanh,bảoquảnkếtquảdễdàngvàtiệnl ợi.

Máy phân tích khối phổ MALDI-TOF dựa trên kỹ thuật ion hóa bằng cách giải hấphợp chất ra khỏi chất mang bằng tia laser Các ion khác nhau sẽ được phân tách nhờ sựkhác nhau về thời gian bay (TOF-time of flight) Cụ thể,c á c i o n đ ơ n đ ư ợ c t ạ o r a b ằ n g kỹ thuật MALDI sẽ có sự khác biệt về khối lượng Vì vậy, những ion có khối lượng lớnhơn sẽ có tốc lực nhỏ hơn, nên mất nhiều thời gian hơn để bay qua cùng một khoảngđường dài Các ion sau khi được tăng tốc, bay ngang qua một vùng trường tĩnh điện, nơiđây chúng sẽ được tách riêng nhau ra tùy theo giá trị khối lượng trên điện tích (m/z) củachúng, vàđượctậptrungtạibộphậnthunhậntínhiệu.

Mẫu để phân tích bằng MALDI-TOF-MS được chuẩn bị bằng cách trộn hoặc phủvới dung dịch của một hợp chất hữu cơ, hấp thụ năng lượng được gọi là chất nền.Khichất nền kết tinh khi làm khô, mẫu được bao bọc trong chất nền cũng đồng thời kết tinh.Mẫu trong chất nền được ion hóa tự động bằng chùm tia lazer Quá trình khử hấp thụ vàion hóa bằng chùm tia laser tạo ra các ion đơn lẻ được proton hóa từ chất phân tích trongmẫu Các ion proton hóa sau đó được tăng tốc ở một thế cố định, tại đó các ion này táchkhỏinhaudựatrêntỷlệ khốilượngtrênđiệntíchcủachúng(m/z).Sauđó,cácchấtphântích tích điện được phát hiệnvà đo bằng cách sử dụng loại máy phântíchk h ố i l ư ợ n g như máy phân tích thời gian bay(TOF) Trong quá trình phân tích MALDI-TOF, tỷ lệm/z của một ion được đo bằng cách xác định thời gian cần thiết để nó di chuyển theochiều dài của ống bay Một số máy phân tích TOF tích hợp một gương ion ở cuối phíasau của ống bay, có nhiệm vụ phản xạ ngược các ion qua ống bay tới một máy dò.DựatrênthôngtinTOF,mộtphổđặctrưngđượcgọilàdấuvântaykhốilượngpeptide(PMF)đượctạor achocác chấtphântíchtrongmẫu(Hình2.7).

Trongcácnghiêncứutrướcđây,việcphânloạicácloàivikhuẩnnhưXanthomonasspp đã được thực hiện dựa trên sự lai DNA-DNA (DNA - DNA hybridization, DDH)(Vauterinetal.,1995),lặplạitrìnhtựchuỗi dựavàopolymerasechuỗi phản ứng(polymerase chain reaction, rep-PCR) (Rademakeret al., 2005), Phân tích và ghi dấutrìnhtựmultilocushay

MLSA là một kỹ thuật thay thế nhằm phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tựcủacáclocuskhácnhautrênnhiễmsắcthể giữacácsinhvậtcóquanhệgầngũi(Maidenet al.,

1998) Quan trọng hơn, MLSA cung cấp một cách thức tương đối đơn giản vànhanh chóng để xác định các dòng vi khuẩn thành các loài đã biết hoặc nhóm chúngthành các loài mới (Almeidaet al., 2010) Nhằm đạt được độ phân giải cao hơn về cácmối quan hệ phát sinh loài của các loài thuộc một chi hoặc thuộc các chi trong một họ,phân tích trình tự đa locus (Multilocus sequence analysis - MLSA) hiện đang là một kỹthuật được sử dụng rộng rãi Trong kỹ thuật MLSA, trình tự một phần của các gen mãhóa cho các protein có chức năng được bảo tồn (gene giữ nhà-housekeeping) được sửdụng để xây dựng cây phát sinh loài tiến đến phânt í c h p h á t s i n h l o à i M L S A c ó t h ể được thực hiện khác nhau tùy vào việc lựa chọn gene, số lượng gene và phương phápphântíchđượcsửdụngkhisosánhcáctrìnhtựthu được.Sốlượnggenecóthểđư ợclựachọnítnhấtlà2đến6genehoặcnhiềuhơn.Cácgenthườngđượcphântíchlànhữnggen mã hóa chocác tiểu đơnvị của các enzym phổ biến, chẳng hạn như tiểu đơnv ị P của DNA gyrase (gyrB), tiểu đơn vị P của RNA polymerase (rpoB), yếu tố sigma 70(sigma D) của RNA polymerase ( rpoD), tái tổ hợp A (recA), tiểu đơn vị P của ATPsynthase F0F1(atpD), yếu tố khởi đầu dịch mã IF-2 (infB), sửa đổi tRNA GTPaseThdFhoặcTrmE(thdF)hoặc chaperoninGroEL (groEL).

Một cơ sở dữ liệu MLSA và trang web đã được phát triển gần đây dành cho cácdòng vi khuẩn liên quan đếnt h ự c v ậ t , đ ư ợ c g ọ i l à P A M D B o r g , p h ụ c v ụ v i ệ c x á c đ ị n h và so sánh dòng vi khuẩn Dữ liệu MLSA của PAMDB có thể chỉ định các dòng vikhuẩnthuộcXanthomonaschưa biếtvề bất kỳ nhóm phátsinh loài nào, nhưngn ó c h ỉ có khả năng giới hạnđối với sự phân biệt các dòng thuộc cùng một pathovar hoặc phânloài(Almeidaetal.,2010).Việcsắpxếptoànbộgenvànhữngthôngtinbổsungvềvịtrí gencủaMLSAcóthểcungcấpphươngtiệnđểtiếptụcxácđịnhcácdòngXanthomonasvà phân tích sự tiến hóa của chúng Nhìn chung, MLSA là phương phápđược lựa chọn hiện nay có thể giúp giải quyết các mối quan hệ phát sinh loài một cáchhiệuquảởcấpđộchivàloài.

Vậtliệu

Thờigianvàđịa điểm

Các thí nghiệmin vitrođược xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh và các dòng vikhuẩn đốikhángtriểnvọngđượcthựchiện từ tháng1 năm2016 đếntháng12 năm2017,tạiViệnNghiêncứu vàPháttriển

CôngnghệSinhhọc,ĐạihọcCầnthơ;ViệnLúaĐồngbằngSôngCửuLong;TrườngĐạihọcĐồng Tháp.

Các thí nghiệm ở điều kiện nhà lưới từ tháng 6 năm 2017 đến tháng 10 năm 2018tạiTrườngĐạihọcĐồngTháp.Trongđó,thínghiệmkhảosátkhảnănggây bệnhcủavi khuẩn được phân lập từ mẫu bệnh được thực hiện từ tháng 6 đến tháng 10 năm 2017;Các thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng ở điều kiện nhà lưới được thức hiện từtháng01năm2018đếntháng10năm2018.

Các thí nghiệm ngoài đồng từ tháng 11 năm 2018 đến tháng 12 năm 2019 tại Lànghoa Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp (trên cây hoa hồng giống hồng lửa), và tại vườn nông dântạihuyệnChâu Thànhtỉnh ĐồngTháp. Địađiểm thumẫu

Nhằm phục vụ việc phân lập và tuyển chọn vi sinh vật đối kháng, các mẫu đất đãđược thu thập tại các khu vực được bảo tồn sinh thái hoặc rừng đặc dụng tại tỉnh ĐồngTháp(VườnQuốc GiaTràmChim,KhudulịchsinhtháiGáoGiồng,Khuditíchl ịchsử văn hóa Xẻo Quýt); Mẫu cơ chất chứa vi sinh vật vùng rễ đã được thu thập từ cácvườntrồng cây hoahồng giống hồng lửa (cơchấtvùng rễ); Đấtvùngrễcây ớtc ũ n g được thu mẫu phụcvụcho việctuyểnchọnvikhuẩnđối kháng.

Mẫu bệnh được thu thập trên cây hoa hồng giống “hồng lửa” tại Làng hoa Sa Đéc,Thành phố Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp, và trên cây ớt tại các vườn trồng ớt trong tỉnh ĐồngTháp.

Dụngcụ,thiếtbịvàMôitrườngnuôicấy

Lame, Lamelle, đĩa petri, ống nghiệm, ống falcon, bình tam giác, đũa khuấy,eppendorf,micropipette,…

Tủcấyđèncựctím,máyđopH,Vortex,máylytâm,máylắcngang,waterbath, tủhút,tủúm,tủlạnhtrữmẫu,kínhhiểnvi,tủthanhtrùngkhô,autoclave,cânđiệntử,…

Môi trường King’ B: Peptone (20 g),Glycerol (10 mL),

K2HPO4(1,5g),MgSO4(1,5g),Agar(15g),Nướccất(1000mL),pH(7,2±0,2);

MôitrườngNutrientagar:Yeastextract(3g),Pepton(10g),NaCl(5g),Agar(20g),

Môit r ư ờ n g Nutrient B r o t h : Y e a s te x t r a c t ( 3 g ) , Peptone( 1 0 g ) , N a C l (5g), N ư ớ c cất(1000mL),pH7,0±0,2.

Mẫubệnhcây

Vậtliệuthínghiệm

Nhằm phục vụ việc đánh giá khả năng lây nhiễm của các dòng vi khuẩn gây bệnhvà các đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn đối kháng, giống hoa hồng giống hồnglửa (Rosaspp.) tại Đồng Tháp, và cây ớt giống chỉ thiên(Capsicumspp.) Trang

Cây hoa hồngthuộcgiống hồnglửa được trồngtrong chậunhựa, trêng i á t h ể l à rơm oai mục đã được hấp tiệt trùng, trồng trong nhà lưới, sau 45 ngày trồng và được cắtcànhvào7ngàytrướckhithínghiệm(để cóđọtvàlánon).

Cây ớt được trồng từ hạt Hạt được diệt khuẩn bằng cách nhúng vào dung dịchethylic 70% trong 1 phút, sau đó rửa kỹ 3 lần bằng nước vô trùng Các hạt này được ủvàokhaychứagiáthểvôtrùnggồmđất,xơdừaoaimục,trođãđượcrữaqua3lầnnước,phân mùn với tỷ lệ 2:4:4, có bổ sung phân hữu cơ dạng lỏng Agro Dream C Sau đó, đặtkhay đã gieo hạt trong môi trường ẩm

(từ 70 – 90%), nhiệt độ từ 25– 30 0 C Khi cây conđạt 2 tuần tuổi được chuyển vào chậu nhựa chứa giá thể vô trùng gồm đất, xơ dừa, trấu(đã được xả nước, ủ mục và phơi khô), phân mùn với tỷ lệ 5:3:2 chuẩn bị cho các khảosát về khả năng lây nhiễm, hiệu quả đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng triểnvọng.Xửlýcácthínghiệmtrênlá củacâyconđạt4tuầntuổi.

Mẫuđấttừvùngsinhtháibảnđịa(đượcsửdụngtrongphân lậpvikhuẩn)đượcth u từ 18 điểm từ Vườn Quốc Gia Tràm Chim, 9 điểm từ Khu du lịch sinh thái GáoGiồng,và

Mẫucơchấtrơmoaimục(câyhoahồnggiốnghồnglửa) đượcnôngdântrồnghoa tạithành phốSaĐécsửdụng;Đấtvùngrễtrồng(câyớt)thutừcácvườntrồng ớtcó diện tích trên 1000 m 2 , tại những cây có dấu hiệu sinh trưởng vượt trội, không có triệuchứngbệnh.

Mẫu đất được sử dụng từ đất thịt sản xuất nông nghiệp tại huyện Châu Thành, tỉnhĐồng Tháp được sử dụng cho các thí nghiệm nhà lưới và ngoài đồng;Đ ố i v ớ i ớ t s ử dụng hỗn hợp gồm đất thịt, phân rơm oai mục, trấu, phân mùn theo tỷ lệ4:1:4:1 Riêngvớicâyhoahồngchỉsửdụnggiáthểlàphânrơmphatrấuvớitỷ lệ4:1;PhânbónhữucơdạnghỗnhợpN–P–K(20:20:15).

Phươngpháp

Nộidu ng 1 : Phânl ậ p v à x á c địnhc á c dòngv i k h u ẩ n g â y bệnh đốmlá vikhuẩntrêncâyhoa hồngvàcâyớt

3.2.1.1 Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng chuyên canh cây hoa hồng và cây ớtđãđượcchọntạitỉnhĐồngTháp.

Mục tiêu:Thu nhận được nguồn mẫu bệnh đại diện trên hai loại cây trồng thếmạnhcủa tỉnhĐồngTháplàmnguồnvikhuẩnchocácthínghiệmsau.

Dự kiến thu mẫu bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt (20 vườn) và cây hoa hồnggiống hồng lửa (20 vườn) Thu mẫu đại diện các khu vực trồng phổ biến tại tỉnh ĐồngTháp.

Mẫu bệnh (Hình 3.2) được thu thập phải tươi, vết bệnh còn mới, phần tiếp giápgiữamôbệnhvàmôkhôngbệnhphảirõ ràngtrêncâyhoahồnggiốnghồnglửađượ cthuthập từ Làng hoa Sa Đéc tỉnh Đồng Tháp(Huanget al., 2013; Cúc&Thủy,2 0 1 4 ) , và mẫu bệnh trên cây ớt từ các vườn trồng ớt trong tỉnh Đồng Tháp (Lowellet al., 1991;Joneset al., 2004; Agrios, 2006; Kyoneet al., 2016) Thu lá bệnh ở nhiều mức độ khácnhau, mỗi mức độ 10 lá Giữ mẫu trong túi giấy vô trùng đã chuẩn bị sẳn ở phòng thínghiệm, được giữ ẩm bằng cách xịt nước cất vô trùng, sau đó đặt trong các túi nylon cólỗ thông khí (dùng kim côn trùng số 2 châm vào 1/3 phía trên của túi ni– lông khoảng 5lỗ/cm 2 ) và để ở điều kiện nhiệt độ phòng theo tiêu chuẩn Việt Nam – TCVN 5297:1995.Ghi vào túi chứa mẫu các thông tin như: ngày và giờ lấy mẫu, tên mẫu, địa điểm lấymẫu,mứcđộbệnh(Burgessetal.,2009).

3.2.1.2 Phân lập,táchròngvikhuẩn Xanthomonasspp từcácmẫubệnh

Mục tiêu: Phân lập được những dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây hoa hồng giốnghồng lửa và cây ớt phục vụ cho các thí nghiệm khảo sát khả năng lây nhiễm, định danhvàđốikhángvềsau.

Cắt một miếng lá mang triệu chứng bệnh dài khoảng 2 – 3 cm, kiểm tra có sự tiếtdịchkhuẩn.Khửtrùng bề mặt môlá này bằngcáchdùng bông đã nhúng

33 cồne t h y l i c 70%t hấ m mặtl á , r ử a l ạ i t ro ng nướcv ô tr ùn g D ù n g dụngc ụ đ ã k h ử t r ùn gcắtt h à n h những miếng cấy nhỏ (khoảng 2×2 mm) từ phầnr a n h g i ớ i g i ữ a m ô k h ỏ e v à m ô b ệ n h cho vào một ống nghiệm chứa 10mL dung dịch MgSO40,01M vô trùng

(Araújo et al.,2012),đểyêncho đếnkhidịchvikhuẩnứaralàm nướcvẩnđục(Hình3.3).Sauđó dùngque cấy khuẩn đã khử trùng nhúng vào dịch khuẩn và cấy lên đĩa petri chứa môi trườngKing's B theo phương pháp hộp ria (Thước, 2007) Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25 –30 0 Ctrong3–

Hình 3.3: Hình dạng tiết dịch khuẩn gây bệnh từ vết cắt ngang mẫu bệnh đốm lá vi khuẩn trêncâyhoahồng(A),kỹthuậthộpria(Burgessetal.2009)(B).

Những khuẩn lạc đơn nhỏ trên các vết vạch lần thứ tư có hình thái tương tự chiXanthomonas Dùng que cấy khuẩn đã khử trùng lấy một khuẩn lạc nhỏ và cấy lên môitrườngKing'sB,đểtrong48giờ(Burgessetal.,2009;Điệp&Hiệp,2011),tiếnhàn htrữ giống tạm thời trên ống thạch nghiêng chứa môi trường King’s B, và trữ dài hạn ở điềukiệnlạnhsâu (–

Mục tiêu:Đánh giá được khả năng lây nhiễm lên cây chủ của các dòng vi khuẩngâybệnhtươngứng.Chọnlọcđượcdòngvikhuẩncókhảnănggâybệnhcaonhất,trungbình và thấp nhất, làm cơ sở cho việc khảo sát khả năng đối kháng kiểm soát bệnh củanhữngdòngvikhuẩnphânlậpđược.

Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm trên 2 đối tượng cây chủ là cây hoa hồng giốnghồng lửa và cây ớt với các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá tương ứng Nội dung nàyđược bố trí thành 2 thí nghiệm, với các vi khuẩnXanthomonasspp gây bệnh trên câychủtươngứngnhưBảng3.1.

Thíngh iệm Đối tượngcâyc hủ

Trênmỗithí nghiệm,bốtríngẫu nhiên,3lầnlặplại,vớimỗilầnlặplạitrên4cây

(đốivớicâychủlàcâyhoahồng)vàtrên10cây (đốivớicâychủlàcâyớt).Baogồm:

- NT2đến21:Xửlýlâynhiễmvikhuẩngâybệnhđược phânlậpriênglẻtừdòng1 đếndòng20.

Chuẩn bị vi khuẩn:Pha loãng dung dịch huyền phù vi khuẩn trong nước cất thanhtrùngkếthợpkhuẩnlạccủadòngvikhuẩngâybệnhsau3ngàynuôicấytrênmôitrườngKing’sB ,đạtmậtsố10 8 CFU/mL(Lietal.,2006).

Cây hoa hồngthuộcgiống hồnglửa được trồngtrong chậunhựa, trêng i á t h ể l à rơm oai mục đã được hấp tiệt trùng, trồng trong nhà lưới, sau 45 ngày trồng và được cắtcành vào 7 ngày trước khi thí nghiệm để có đọt non, có bổ sung phân hữu cơ dạng lỏngAgroDreamC(HoaKỳ).

Cây ớt được trồng từ hạt Hạt được diệt khuẩn bằng cách nhúng vào dung dịchethylic 70% trong 2 phút, sau đó rửa kỹ 3 lần bằng nước vô trùng Các hạt này được ủvàokhaychứagiáthểvôtrùnggồmđất,xơ dừaoaimục,trođãđượcrữaqua3lầnnước,phân mùn với tỷ lệ 2:4:4, có bổ sung phân hữu cơ dạng lỏng Agro Dream C Sau đó, đặtkhay đã gieo hạt trong môi trường ẩm (từ 70 – 90%), nhiệt độ từ 25– 30 0 C Khi cây conđạt 2 tuần tuổi được chuyển vào chậu nhựa chứa giá thể vô trùng gồm đất, xơ dừa, trấu(đã được xả nước, ủ mục và phơi khô), phân mùn với tỷ lệ 5:3:2 chuẩn bị cho các khảosáttiếptheo.Xửlý cácthínghiệmtrênlácủacâyconđạt4tuầntuổi.

Lây nhiễm bệnh:Phun huyền phù dòng vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị lên cây chủ(câyhoahồng)hoặc(câyớt)vớimậtsố10 8 CFU/mLvới5mL/cây.Câyđốichứngđượcphun bằng dung dịch nước cất vô trùng Các cây này được đặt trong nhà lưới có độ ẩmcaotừ70- 90%,phunẩm4lầnvàobanngày(Kyeonetal.,2016).

Chỉtiêughinhận:Ghinhậnvàsosánhcáctriệuchứngcủanhữngdònggâybệnh đượcphânl ậ p s o v ớ i nhữngbiểuh i ệ n b ệ n h điển h ì n h t r ê n c â y hoah ồ n g h o ặ c c â y ớt được thu mẫu Đánh giá mức độ bệnh qua 16 ngày sau lây nhiễm theo QCVN 01– 38:2010/BNNPTNT (phụ lục 2, mục I, bệnh trên lá) Cụ thể theo hai công thức sau (IRRI,2002;Sharma,2004):

Nnlàlábịbệnhởcấpn.Nlà tổngsốláđiềutra. nlàcấpbệnhcaonhất(cấp9).

5đến25%diệntíchlábịhại.Cấp7: >25 đến50% diệntíchlábịhại.Cấp9:

(iii)Tíchlũy bệnhtheothờigianAUDPC(AreaUnderDiseaseP r o g r e s s i v e Curve) AUDPC được tính theo công thức của Jeger &Viljanen-Rollinson (2001) nhưsau:

3.2.1.4 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp dựa vào hình thái vàphươngphápsinhhóa

Mục tiêu:Ba dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá với khả năng lây nhiễm cao, trungbình và yếu (trên cây ớt) được định danh thuộc chiXanthomonastheo các xét nghiệmsinhhóa(Schaadetal.,2001;Kyeonetal., 2016).

Bố trí thí nghiệm:Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Nutrient agar để quansát khuẩn lạc Tiến hành các xét nghiệm chỉ tiêu sinh hóa của các dòng vi khuẩn mầmbệnhnhư:PhảnứngGram,hoạttínhcatalase.

Chỉ tiêu ghi nhận:Ghi nhận màu sắc của khuẩn lạc, kết quả các phản ứng, lựachọn những dòng vi khuẩn cho các thí nghiệm sau dựa kết quả như khuẩn lạc có màuvàng;phảnứngGram(–)âmtính;Chohoạttínhcatalase(+)dươngtính.

3.2.1.5 Xácđịnhdanhphápvikhuẩn Xanthomonasspp theophươngphápMALDI- TOF-MS

Nguyên lý:MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desraction Ionization Time-

Nộidung2:Tuyểnchọnvikhuẩncónguồngốctừcơchấtvùng rễv à đ ấ t v ù n g s i n h t h á i b ả n đ ị a cók h ả n ă n g đ ố i k h á n g v ớ i Xanthomonasspp.gâybệnhđãđượcphânlập

Nhằm phân lập được các dòng vi khuẩn từ vùng bảo tồn sinh thái hoặc rừng đặcdụng của tỉnh Đồng Tháp (Vườn Quốc Gia Tràm Chim, Khu du lịch sinh thái GáoGiồng)vàđấtvùngrễ.Sử dụngcácphươngphápsau: a) Phươngpháplấymẫuđất

Lấy mẫu đất từ khu vực bảo tồn sinh thái hoặc rừng đặc dụng: Dự kiến thu mẫu từ3 khu vực là Vườn Quốc Gia Tràm Chim, Khu du lịch sinh thái Gáo Giồng, Khu di tíchlịch sử văn hóa Xẻo Quýt Chọn mẫu từ nhiều điểm thuộc khu vực thu mẫu Lấy mẫuđơn Thời điểmlấy mẫu vào buổisáng khi trời không mưa Số lượng mẫuthut ạ i c á c khu hệ sinh thái (Hình 3.4) theo phương pháp trích dẫn TCVN 5297:1995: đối với VườnQuốcgiaTràmChimlà18mẫu(SơđồA),cáckhuvựckhácthu9mẫu.

Lấy mẫu đất, cơ chất từ vùng rễ: Mỗi vườn chọn 1 mẫu hỗn hợp gồm 3 mẫu đơn.Mỗimẫuđơnthutừvùngrễ củanhữngcâycósựsinht r ư ở n g tốtvượttrội, không códấuhiệubệnh.

Giữ mẫu trong túi nylon kiếng được hấp tiệt trùng đã chuẩn bị sẳn ở phòng thínghiệm Ghi vào túi chứa mẫu các thông tin như: ngày và giờ lấy mẫu, tên người lấymẫu, nguồn và địa điểm lấy mẫu, các giá trị thông số phân tích tại hiện trường như pH,nhiệtđộ Vậnchuyểnmẫugiữởkhoảng4 0 C. b) Phânlậpvikhuẩntừnguồnmẫuđấtthuthậpđược

Mục tiêu: Chọn lọc được những dòng vi khuẩn thuần từ các mẫu đất thu được từvùngsinhtháiđược bảotồnvàđấtvùng rễ.

Cân 5 g mẫu đất và chuyển vào dụng cụ chứa 50 mL dung dịch saline peptone vôtrùng,s a u đó đ ặ t t r ê n m á y lắcv ớ i v ậ n t ố c 2 0 0 r p m t r o n g k h o ả n g 15p h ú t Phal o ã n g

Sàng lọc sơ bộ trên môi trường đĩa thạch

Những dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng nhất với vi khuẩn gây bệnh

Xác định mật độ tối thiểu có khả năng đối kháng ức chế vi khuẩn gây bệnh dung dịch đất này ở cỏc độ pha loóng phự hợp Hỳt 50 àL dung dịch đất tại cỏc độ phaloãng trải vào đĩa petri chứa môi trường Nutrient agar (NA) ủ ở 28 0 C trong 48 giờ. Tạiđộ pha loãng xuất hiện khuẩn lạc riêng biệt và rõ nhất, mỗi khuẩn lạc được tiếp tục làmròng bằng phương pháp hộp ria (Thước, 2007; Điệp & Hiệp, 2011) Những khuẩn lạcđơn, nhỏđ ư ợ c t r ữ g i ố n g t ạ m t h ờ i t r ê n ố n g t h ạ c h n g h i ê n g c h ứ a m ô i t r ư ờ n g N A , v à t r ữ dài hạn ở điều kiện lạnh sâu (–20 0 C) trong môi trường NB kết hợp glycerol vô trùng30%.

3.2.2.2 Khảosátkhảnăn g đốikh án g invitro đ ố i v ớ i cácdòng X a n t h o m o n a s spp đượcchọncủanhữngdòngvikhuẩnphânlậpđượctừmẫuđất

Mụctiêu:Lựa chọn đượcnhữngdòngvikhuẩnphânlậptừđấtcótriểnvọng trong đặctínhđốikhángtrướcdòngXanthomonasspp.gâybệnhđãthuthậpđược.

Cáchtiếnhành:Thửnghiệmđượctiếnhànhquahaithí nghiệm. a) Thínghiệm1:Sànglọcsơbộtrênmôitrườngthạchđĩa

Bố trí thí nghiệm:Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên, bố trí 3 lần lặp lại, với mỗinghiệmthứclàmộttrongnhữngdòngvikhuẩnđượcphânlậptừmẫuđấtcủamôitrườngnghiêncứ u.

Cỏch tiến hành:Lắc 100 àL huyền phự vi khuẩnXanthomonasspp được chọnchứa

108CFU/mL đã được chuẩn bị trong MgSO40,01 M từ dòng vi khuẩn đạt 3 ngàynuôi cấy trong đĩa petri chứa môi trường King’s B (15 mL/đĩa) Chuyển vi khuẩn phânlập được (OD 600 0,3) từ mẫu đất sang đĩa petri này (qua khoanh giấy thấm vô trùng-5mm),ủtrong24giờở28 0 C(Lietal.,2006;2008).

Nhữngdòngvikhuẩncóvùngứcchếcaonhấtđượcchọnchokhảosáttiếptheo. b) Thínghiệm 2:Khảosátmật sốđốikhángcủa cácdòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọng đốivớiXanthomonasspp.XP17vàXR13

Mục tiêu:Xác định được mật số vi khuẩn đối kháng tối thiểu có khả năng đốikháng với vi khuẩn gây bệnh, có triển vọng trong việc kiểm soát bệnh trong điều kiệnnhàlưới,ngoàiđồng.

Bố trí thí nghiệm:Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên, bố trí 3 lần lặp lại, với mỗinghiệm thức là một mật độ được pha loãng của các dòng vi khuẩn được chọn ở thínghiệm1cókhảnăngđốikhángcaovớivikhuẩngâybệnh.Cụthể:

Các dòng vi khuẩn đối kháng BR16, BR37, BR88, G24, X61, T265 được thửnghiệm đối kháng trên bốn mật độ pha loãng (10, 100, 1000 và 10000 lần) của dòngXanthomonasspp.XR13.

TrongkhiBP11,BP49,BP103,G24,T11,T188đượcthửnghiệmđốikhángtrên bốnmậtđộphaloãng(10,100, 1000và10000lần)củadòngXanthomonasspp.XP17.

Cácd ò n gXanthomonasspp được chọn là dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnhcaonhất trêntừngcâychủ.(XR13trêncâyhoahồng,XP17trêncâyớt)

Chuẩn bị đĩa petri chứa vi khuẩn gây bệnh:Dung dịch nước muối vô trùng

(NaCl0,85%) được chuyển vào các đĩa petri có chứaXanthomonasspp được chọn đạt 48 giờnuôicấytrênKing’sBvàvikhuẩnđốikhángtriểnvọngđạt24giờnuôicấytrênnutrientagar Các khuẩn lạc được chà bằng que trải thủy tinh và vortex các huyền phù thu đượctrong 5 phút (Balouiri, 2016) Huyền phù ban đầu củaXanthomonasspp là 2,7 x10 13 CFU/mL (đối với XR13) và 4,4 x10 13 CFU/mL (đối với XP17) được pha loãng thànhdãy 10, 100, 1000 và 10000 lần Tạo đĩa chứa vi khuẩn bằng cỏch hỳt 100 àL củaXanthomonasspp cho vào cỏc đĩa petri chứa 10 mL môi trường King’s B ở 50 o C riêngbiệt cho mỗi độ pha loãng với dòng XP17 tương ứng tạo dãy mật số 4,4 x 10 11 ; 4,4 x

Chuẩn bị vi khuẩn đối kháng:Huyền phù ban đầu của các vi khuẩn đối kháng triểnvọng đạt 24 giờ nuôi với mật số ban đầu khoảng 10 9 CFU/mL (bảng 3.3) và tiếp tụcđượcpha loãng10, 100,1000và10000lần.

Thử đối khỏng:Hỳt 5 àL và nhỏ thành giọt huyền phự vi khuẩn đối khỏng vào đĩapetri đã chứaXanthomonasspp ở các độ pha loãng khác nhau như đã đề cậpở t r ê n , phơi khôtrongtủcấyvôtrùng.Cácđĩapetri đượcgiữở28± 2 o Ctrong36giờ.

Chỉ tiêu ghi nhận:Đường kính vùng ức chế hình thành bởi vi khuẩn đối khángchống lạiXanthomonasspp Đánh giá và lựa chọn mật số vi khuẩn đối kháng tối thiểucókhảnăngức chếcác dòngXanthomonasspp này.

Bảng3.3:Mậtsốvikhuẩnđốikhángbanđầu(CFU/mL)trướckhiđược phaloãng.

3.2.2.3 Địnhdanhmộtsốdòngvikhuẩnđối khángtriểnvọng a) XácđịnhdanhphápvikhuẩnđốikhángtheophươngphápMALDI-TOF-MS

Mụctiêu:Cácdòngvi khuẩnđốikhángtriển vọngđượcđịnhdanhđếnmứcđộ chihoặcloàitheokỹthuậtMALDI-TOF.

Bốtríthínghiệm: SửdụngkỹthuậtMALDI-TOF phântíchcác dòngvikhuẩn đốikhángtriểnvọngđượclựachọnđịnhdanhqua,với hailầnlặplại.

Chỉtiêughinhận:Ghinhậnkếtquảđượcđánhgiáquahệthốngtựđộng.Sosánh vớihướngdẫncủahệthốngvàphântíchkếtquảđếnmứcđộchihoặcloài. b) Danhphápvikhuẩnđượcxácđịnhcácdòngvikhuẩnđượcchọnbằngsinhhọcphân tử

Bốtríthínghiệm:Mỗidòngvikhuẩntriểnvọngđượcchọn(invitro)triểnvọngchưa xácđịnhđượcbằngMALDI-TOFsẽđượctáchchiếtDNA vàgửigiảitrìnhtự.

Cáchtiếnhành ĐểthựchiệnchiếtxuấtDNAvikhuẩn,eppendorf1,5mLchứahuyềnphùtếbàovi khuẩn được đun sôi trong 20 phút, sau đó làm lạnh trong nước đá và ly tâm ở tốc độ13200 vòng/phút trong 5 phút Sau đó, phần chất lỏng là mẫu DNA của vi khuẩn đượcbảoquản ở-20 o Cchođếnkhisửdụng.

Khuếch đại gen 16S rRNA của các mẫu DNA của phân lập bằng cách sử dụng cácđoạnmồichung27F/1492R(Weisburg,1991),cótrìnhtựsau:27F:5’-

Hỗn hợp phản ứng PCR (50 μL dung dịch nền axit α-cyano-4-L) chứa các thành phần sau: 37,5 μL dung dịch nền axit α-cyano-4-L BiH20, 5 μL dung dịch nền axit α-cyano-4-L Buffer10X, 0,5 μL dung dịch nền axit α-cyano-4-L dNTP 10 mM, 2 μL dung dịch nền axit α-cyano-4-L primer 27F 10 μL dung dịch nền axit α-cyano-4-M, 2 μL dung dịch nền axit α-cyano-4-L primer 1492R, 1 μL dung dịch nền axit α-cyano-4-L Taqpolymerase 5000U/mL, 2 μL dung dịch nền axit α-cyano-4-L mẫu DNA của vi khuẩn Chương trình PCR bao gồm biếntínhbanđầuở 95 o Ctrong5phút,tiếptheolà35 chukỳở95 o Ctrong30giây,58 o Ctrong30 giây và

72 o C trong 1:45 phút, sau đó ở 72 o C trong 5 phút và lần gia hạn cuối cùng ở25 o C trong 2 phút trong máy quay vòng nhiệt T100 (BioRad) Sản phẩm PCR được điệndi trên gel agarose 1% ở 50V trong 40 phút Buffer TAE 1X được sử dụng để chuẩn bịgelcũngnhưđiệndi.Sauđó,gelđượcnhuộmvới0,5μL dung dịch nền axit α-cyano-4-g/mLethidiumbromide tron g15phút vàđược hiểnthịdưới máyUV-transilluminator.

Các mẫu được giải trình tự qua BigDye Terminator Cycle Sequencing Chemistryand ABI 3730 XL Sequencer (Applied Biosystems) Các chuỗi được căn chỉnh bằngBioEdit phiênbản 7.2.5.

Trình tự của các mẫu PCR vi khuẩn được so sánh với cơ sở dữ liệu của ngân hànggen (NCBI) bằng công cụBLAST-N.D ự a t r ê n m ứ c đ ộ t ư ơ n g đ ồ n g c ủ a d ò n g p h â n l ậ p có cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen, xác định tên của vi khuẩn và đăng ký số hiệu gianhập“accessionnumber”trongngânhànggen (NCBI).

Nộidung3:Khảosátkhảnăngkiểmsoátbệnhđốmlávikhuẩn trongđiềukiệnnhàlướicủanhữngdòngvikhuẩntriểnvọng

Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm trên 2 đối tượng cây chủ là cây hoa hồng giốnghồng lửa và cây ớt với mỗi dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được chọn Nội dung 3được bố trí thành 4 thí nghiệm, tương ứng cho nhóm vi khuẩn đối kháng và vi khuẩnXanthomonasspp.gâybệnhtrêncâychủtươngứngnhưBảng3.4.

Bảng3.4:Cácthínghiệm khảo sátkhảnăngkiểmsoátbệnhtrongđiều kiệnnhàlưới

Thíngh iệm Đối tượngcâyc hủ

BP11, BP49, Badòngvikhuẩn đốikhángtriển bệnh Badòng

BR88 BP103 vọngtừvùngsinh tháibảnđịa trênc â y hoahồng trênc â y ớt

Trên mỗi thí nghiệm, bố trí ngẫu nhiên, gồm 7 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, với mỗilầnlặplại trên4cây(đốivớicâychủlàcâyhoahồng),và10cây(đốivớicâychủlà câ yớt).Cụthể mỗithínghiệmđượcbốtrínhưsau:

– NT2,3,4:Láđượcphunnướccất,khôngxửlývikhuẩnđốikhángvàcólây bệnhnhântạovớimộttrong badòngXanthomonasspp.đượcchọn.

– NT 5, 6, 7: Lá được phun lần lượt với một trong ba dòng vi khuẩnđối khángtriển vọng được chọn với mật số 10 7 CFU/mL (kết quả thí nghiệm 2 mục 3.2.2.2, b),được phun trước 48 giờ lây bệnh nhân tạo với một trong ba dòngXanthomonasspp.đượcchọn tươngứng vớiđốitượng câychủ.

Chuẩn bị vi khuẩn: Được nuôi trong 3 ngày ở 30 o C trên môi trường King’s B, badòngXanthomonasspp gây bệnh(dòng có khả năng gây hạicao nhất,t r u n g b ì n h v à thấp nhất) được thu khuẩn lạc và pha thành huyền phù trong MgSO 4 0,01M theo mật số10 8 CFU/mL Các dòng vi khuẩn đối kháng được nuôi trên môi trường NA đạt 24 giờ,được pha huyền phù trong NaCl 0,85% theo nồng độ 10 7 CFU/mL Tất cả huyền phù vikhuẩnđược đượcchủnglêncâychủtheophươngphápphun.

Cây hoa hồngthuộcgiống hồnglửa được trồngtrong chậunhựa, trêng i á t h ể l à rơm oai mục đã được hấp tiệt trùng, trồng trong nhà lưới, sau 45 ngày trồng và được cắtcànhvào 7 ngày trước khi thí nghiệm, có bổs u n g p h â n h ữ u c ơ d ạ n g l ỏ n g A g r o D r e a m C(HoaKỳ).

Cây ớt được trồng từ hạt Hạt được diệt khuẩn bằng cách nhúng vào dung dịchethylic 70% trong 1 phút, sau đó rửa kỹ 3 lần bằng nước vô trùng Các hạt này được ủvàokhaychứagiáthểvôtrùnggồmđất,xơ dừaoaimục,trođãđượcrữaqua3lầnnước,phân mùn với tỷ lệ 2:4:4, có bổ sung phân hữu cơ dạng lỏng Agro Dream C Sau đó, đặtkhay đã gieo hạt trong môi trường ẩm(từ 70 – 90%), nhiệt độ từ 25– 30 0 C Khi cây conđạt2tuầntuổiđượcchuyểnvàochậunhựachứagiáthểvôtrùnggồmđất,xơdừa,trấu i=1

(đãđượcxảnước,ủmụcvàphơikhô),phânmùnvớitỷlệ5:3:2chuẩnbịchocáckhảosáttiếpth eo.Xửlý cácthínghiệmtrênlácủacâyconđạt4tuầntuổi.

Vi khuẩn đối kháng triển vọng được phun lên lá trên mỗi cây chủ theo mật số

10 7 CFU/mL với 5mL/cây Các dòng vi khuẩn gây bệnh với mật số 10 8 CFU/mL lênc â y chủ với 5mL/cây Thời gian phun vi khuẩn được tiến hành vào chiều tối sau 17 giờ Cáccây đượckhảosátđặtở28 0 Cvàđộẩmtươngđốikhoảng70–90%(Lietal., 2008).

Chỉ tiêu ghi nhận:Ghi nhận và so sánh các triệu chứng của các nghiệm thức.Đánh giá mức độ bệnh qua 16 ngày sau lây nhiễm theo QCVN 01– 38: 2010/BNNPTNT(phụ lục

2, mục I, bệnh trên lá) Tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh, chỉ số tích lũy bệnh theo thờigian (AUDPC), hiệu quả giảm bệnh cụ thể theo các công thức sau (IRRI, 2002; Sharma,2004):

Nnlàlábịbệnhởcấpn.Nlà tổngsốláđiềutra. nlàcấpbệnhcaonhất(cấp9).

5đến25%diệntíchlábịhại.Cấp7: >25 đến50% diệntíchlábịhại.Cấp9:

(iii) Tíchlũyb ệ n h theothờig i a n AUDPC(AreaUnderDiseaseP r o g r e s s i v e Curve).AUDPCđượctínhtheocôngthứccủaJeger&Viljanen-Rollinson(2001)

Trong đó: C là tỷ lệ bệnh ở nghiệm thức chỉ lây nhiễm bệnh dòngXanthomonasspp.; T là tỷ lệ bệnh ở nghiệm thức thí nghiệm có xử lý khuẩn đối kháng và lây nhiễmbệnhdòngXanthomonasspp.tươngứng.

Nộidung4 : Đánhg i á hiệu quảcủanhững dòngv i k hu ẩn k i ể m soátbệnh(BCA)ởđiềukiệnngoàiđồng

Mụctiêu:Đánhgiáđược hiệuquảkiểmsoátbệnhđốmlávikhuẩncủacácdòng đốikhángtriểnvọng(BCA)ởđiềukiệnngoàiđồng.

Bố trí thí nghiệm:Thí nghiệm trên 2 đối tượng cây chủ là cây hoa hồng giốnghồng lửa và cây ớt với mỗi dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được chọn Nội dung 3được bố trí thành 4 thí nghiệm, tương ứng cho nhóm vi khuẩn đối kháng và vi khuẩnXanthomonasspp.gâybệnhtrêncâychủtươngứngnhưsaubảng3.5.

Xử lý vi khuẩn đối kháng Xử lý lây nhiễm bệnh

Thíngh iệm Đối tượngcâyc hủ

Badòngvikhuẩnđ ối kháng triểnvọngtừvùngsi nh

Trên mỗi thí nghiệm, bố trí ngẫu nhiên, gồm 7 nghiệm thức (NT), 3 lần lặp lại, vớimỗi lần lặp lại trên 4c â y ( đ ố i v ớ i c â y c h ủ l à c â y h o a h ồ n g ) , v à 1 0 c â y ( đ ố i v ớ i c â y c h ủ làcâyớt).Cụthể mỗithínghiệmđược bốtrí nhưsau: – NT1:Khôngxửlývikhuẩnđốikhánghoặclây bệnhnhântạo.

– NT2,3,4:Láđượcphunnướccất,khôngxửlývikhuẩnđốikhángvàcólây bệnhnhântạovớimộttrong badòngXanthomonasspp.đượcchọn.

– NT 5, 6, 7: Lá được phun lần lượt với một trong ba dòng vi khuẩnđối khángtriển vọng được phun với mật số 10 7 CFU/mL, trước 48 giờ lây bệnh nhân tạo với mộttrongbadòngXanthomonasspp.đượcchọntươngứngvớiđốitượngcâychủ.

Câyhoahồngt h u ộ c g i ố n g hồngl ử a được trồngt r o n g chậun h ự a , trêng i á th ể là rơmoaimụcnhưnôngdânsửdụng,trồngtrongvườn,sau45ngàytrồngvàđượccắt tháibảnđịa hoahồng

4 Câyớt - - + - + cànhvào7ngàytrướckhithínghiệm,cóbổsungphânhữucơdạnglỏngAgroDreamC(Ho aKỳ).

Cây ớt được trồng từ hạt Hạt được diệt khuẩn bằng cách nhúng vào dung dịchethylic 70% trong 1 phút, sau đó rửa kỹ 3 lần bằng nước vô trùng Các hạt này được ủvào khay chứa giá thể gồm đất, xơ dừa oai mục, tro đã được xả qua 3 lần nước, phânmùn với tỷ lệ 2:4:4, có bổ sung phân hữu cơ dạng lỏng Agro Dream C Sau đó, đặt khayđã gieo hạt trong môi trường ẩm (từ 70 – 90%), nhiệt độ từ 25– 30 0 C Khi cây con đạt 2tuần tuổi được chuyển vào chậu nhựa chứa giá thể gồm đất, xơ dừa, trấu (đã được xảnước, ủ mục và phơi khô), phân mùn với tỷ lệ 5:3:2 chuẩn bị cho các khảo sát tiếp theo.Xửlýcácthínghiệmtrênlácủa câyconđạt4tuầntuổi.

Vi khuẩn đối kháng triển vọng được phun lên lá trên mỗi cây chủ theo mật số

10 7 CFU/mL (kết quả thí nghiệm 2, mục 3.2.2.2, b) với 5 mL/cây Các dòng vi khuẩn gâybệnh với mật số 10 8 CFU/mL lên cây chủ với 5mL/cây Thời gian phun vi khuẩn đượctiến hànhvàochiềutốisau17 giờ.

Chỉ tiêu ghi nhận:Ghi nhận và so sánh các triệu chứng của các nghiệm thức.Đánh giá mức độ bệnh qua 16 ngày sau lây nhiễm theo QCVN 01– 38: 2010/BNNPTNT(phụ lục

2, mục I, bệnh trên lá) Tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh, chỉ số tích lũy bệnh theo thờigian(AUDPC),hiệuquảgiảmbệnh(nhưthínghiệmnhàlướimục3.2.3).

Phươngpháplâynhiễmbệnh

Vi khuẩnXanthomonasspp gây bệnh đốm lá trên hai loại cây trồng (cây hoa hồngvà cây ớt) đã được phân lập phục vụ các thí nghiệm khảo sát khả năng gây bệnh trên câytrồng, các thí nghiệm ở nhà lưới và ngoài đồng được nuôi cấy trên môi trường King’ B.Khi đạt 3 ngày nuôi cấy, sinh khối vi khuẩn này được thu thập bằng que trải vô trùng,được pha loãng trong nước cất vô trùng cho đến khi huyền phù đạt mật số 10 8 CFU/mL(Liet al., 2006) Việc lây nhiễm bệnh được thực hiện bằng cách phun trực tiếp huyềnphù vi khuẩn gây bệnh lên tán lá với mật số 10 8 CFU/mL (với 5mL/ cây) Việc lây nhiễmbệnh đối với tán lá cây hoa hồng khi cây đạt 45 ngày trồng và được cắt cành vào 7 ngàytrước khi thí nghiệm để có đọt non; Trong khi đối với cây ớt, việc lây nhiễm bệnh trêntánlákhicâyconđạt4tuầntuổi.

Sốliệuđược xử lýbằngphầnmềmMicrosoftExcel;phân tíchthốngkêbằng phần mềmMinitab16.1vớiphépthửTukey’sởmứcýnghĩa5%.

Phương phápxửlýsốliệu

20 dòng vi khuẩn gây bệnh được thu thập và phân lập từ các vườn trồng hoa hồng củaLàng hoa Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp với các triệu chứng điển hình của bệnh đốm lá do vikhuẩn (Hình 4.1) Tất cả các dòng phân lập này khi còn non đều có khuẩn lạc trơn láng(smooth), tròn (round), rìa lồi đều (entire) và sệt như bơ (butyrous), hơi vàng (Hình 4.1,mục D, E) Sau một thời gian phát triển (khoảng 3 ngày), khuẩn lạc có màu vàng. Sựphát sinh các chất nhầy (mucoid), sệt giống bơ (butyrous) của khuẩn lạc là một đặc điểmthuộcXanthomonasgây bệnh (Ryanet al., 2011) Các dòng vi khuẩn này được đặt tênlầnlượttừXR1đếnXR20.

A:Triệuchứngtựnhiên;B:Vikhuẩnrỉ ratừvịtrícắtngangcủalábị nhiễmbệnh;C:Khuẩnlạccủamầmbệnh bằngkỹthuậtriatrênmôitrườngKing’sB;D:Khuẩnlạcở36giờnuôicấy; E:Khuẩnlạcsau3ngàynuôicấy.

Kết quả đánh giá khả năng gây hại trên cây hoa hồng (Bảng 4.1) ghi nhận tất cả 20 dòngXanthomonasspp đều có khả năng gây hại và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đốichứng không lây nhiễm bệnh Trong đó, bệnh có thể được ghi nhận rõ ở thời điểm4ngày sau khi lây nhiễm (NSKLN) ở tất cả các nghiệm thức có lây bệnh trừ nghiệm

Nộidung1:Phânlậpcácdòngvikhuẩngâybệnhđốmlávikhuẩn

Phânlậpvàxácđịnhdanhphápdòngvikhuẩngâybệnhtrêncây

20 dòng vi khuẩn gây bệnh được thu thập và phân lập từ các vườn trồng hoa hồng củaLàng hoa Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp với các triệu chứng điển hình của bệnh đốm lá do vikhuẩn (Hình 4.1) Tất cả các dòng phân lập này khi còn non đều có khuẩn lạc trơn láng(smooth), tròn (round), rìa lồi đều (entire) và sệt như bơ (butyrous), hơi vàng (Hình 4.1,mục D, E) Sau một thời gian phát triển (khoảng 3 ngày), khuẩn lạc có màu vàng. Sựphát sinh các chất nhầy (mucoid), sệt giống bơ (butyrous) của khuẩn lạc là một đặc điểmthuộcXanthomonasgây bệnh (Ryanet al., 2011) Các dòng vi khuẩn này được đặt tênlầnlượttừXR1đếnXR20.

A:Triệuchứngtựnhiên;B:Vikhuẩnrỉ ratừvịtrícắtngangcủalábị nhiễmbệnh;C:Khuẩnlạccủamầmbệnh bằngkỹthuậtriatrênmôitrườngKing’sB;D:Khuẩnlạcở36giờnuôicấy; E:Khuẩnlạcsau3ngàynuôicấy.

Kết quả đánh giá khả năng gây hại trên cây hoa hồng (Bảng 4.1) ghi nhận tất cả 20 dòngXanthomonasspp đều có khả năng gây hại và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đốichứng không lây nhiễm bệnh Trong đó, bệnh có thể được ghi nhận rõ ở thời điểm4ngày sau khi lây nhiễm (NSKLN) ở tất cả các nghiệm thức có lây bệnh trừ nghiệm thứcđốichứngvớitrungbìnhtỷlệbệnhchiếm20,3%,bệnhtiếp tụctiếntriểntăngdầnlê n đến thời điểm 8 NSKLN với tỷ lệ bệnh trung bình chiếm 24,7% Tuy nhiên, ở thời điểm12 NSKLN, tỷ lệ bệnh trung bình (28%) khác biệt nhưng không có ý nghĩa thống kê sovới thời điểm 8 NSKLN và 16 NSKLN (30,3%), cho thấy triệu chứng bệnh có sự tiếntriểnchậmlại (Hình 4.2).

Bảng4.1:Tỷlệbệnh(DI)đốmlávikhuẩntheocácthờiđiểmkhảosátgâyrabởi20dòng

25,2 ghij 30,0 ghi 35,2 bc 36,0 cd XR3 18,8 fgh 22,6 efgh 24,8 ghij 31,7 efg 35,5 cde 27,5 hijk 28,8 ghij 25,8 jkl 26,6 ijkl

XR9 20,8 ef 29,8 bc 35,0 cd 34,9 def

XR10 24,6 cd 31,6 ab 35,6 bc 37,0 bcd

XR12 21,8 de 24,5 def 27,5 fgh 27,8 hijk

XR14 24,6 cd 27,7 cd 31,5 de 31,1 fgh

XR15 24,6 cd 30,0 bc 34,3 cd 38,7 bc

XR20 24,6 cd 25,5 de 28,2 efg 30,1 ghi ĐC 0,0 k 0,0 j 0,0 k 0,0 m

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột hoặc hàng (TB) được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau inthườnghoặcinhoathì khôngkhác biệtcó ýnghĩathốngkêởmức ýnghĩa 5%bằng phépthửTukey’s

*khácbiệtởmứcýnghĩa5% ĐC:Đối chứng khônglâybệnh; TB: Trung bình

Tại thời điểm 16 NSKLN, tỷ lệ bệnh đốm lá trên cây hoa hồng của các nghiệm thức đềukhác biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng Trong đó, nghiệm thức lâynhiễmXR13 có tỷ lệ bệnh cao nhất với 43,6% và khác biệt có ý nghĩat h ố n g k ê v ớ i t ấ t cảcácnghiệm thứclâynhiễmcácdòngcònlại.Tỷlệbệnhthấpnhấtthuộcvềcácnghiệmthức có sự lây nhiễm một trong các dòng XR8, XR7, XR11, XR16 hoặc XR18 với tỷ lệbệnh tương tự nhau về ý nghĩa thống kê dao động từ 23,2% đến 26,6%, thấp hơn từ 1,6đến 1,8 lần so với lây nhiễm dòng XR13 Bên cạnh đó, các nghiệm thức lây nhiễm mộttrongcácdòngXR3,XR9,XR14,XR20cótỷlệbệnhởmứcđộtrungbìnhgầnvớitrungbình tỷ lệ bệnh của các nghiệm thức, thấp hơn từ 1,3 đến 1,4 lần so với lây nhiễm dòngXR13 Điều này chứng tỏ XR13 là dòng vi khuẩn có khả năng thích nghi, nhân mật sốtốt trong điều kiện môi trường, có độc lực cao nhất, trong khi nhóm có tỷ lệ bệnh thấpnhấtcóđộc lựcthấpnhưngvẫncókhảnănggâybệnh(Hình4.4).

XR1 XR2 XR3 XR4 XR5

XR6XR7 XR8 XR9 XR10 XR11

XR12XR13 XR14 XR15 XR16 XR17

Hình4.2:Tỷlệbệnh(DI)đốmlávikhuẩntheocácthờiđiểmkhảosátgâyrabởi20dòng

Kết quả phân tích chỉ số bệnh (Bảng 4.2) qua 16 NSKLN ghi nhận tất cả cácnghiệmthứcđềux u ấ t hiệnvùngbịnhiễmbệnh (hay vếtbệnh) ngoạitrừ nghiệmt hức đốichứng Trongđó,ởthờiđiểm4NSKLN, mứcđộbệnhđãđượcghi nhậnrõ vớitrung bình chỉ số bệnh chiếm 6,8% Sau đó, bệnh tiếp tục tiến triển đến thời điểm 12 NSKLNvới trung bình chỉ số bệnh chiếm 14,2%, khác biệt có ý nghĩa với trung bình chỉ số bệnhtại các thời điểm 4 và 8 NSKLN, nhưng lại tương đồng có ý nghĩa thống kê với trungbình chỉ số bệnh tại thời điểm 16 NSKLN Điều này thể hiện sự phát triển của bệnh sau12NSKLNcódấuhiệuchậmlại(Hình4.3).

Bảng4.2:Chỉsốbệnh(SI)đốmlávikhuẩntheocácthờiđiểmkhảosátgâyrabởi20dòng

4NSKLN 8NSKLN 12NSKLN 16NSKLN AUDPC

XR4 5,8 ef 10,6 hi 13,3 fg 17,5 defg 142,3 GH

XR8 6,4 def 11,2 fghi 13,6 fg 14,4 ij 140,9 GH

XR9 7 d 12,7 ef 17,2 cd 18 cdef 169,4 DE

XR10 8,9 bc 15,2 bc 18,3 bc 19,4 bc 190,9 BC

XR11 7 de 10,2 i 10,7 ij 12,5 kl 122,7 IJ

XR12 6,9 de 12 efgh 14,6 ef 15,5 hi 151,2 FG

XR14 6,3 def 12,3 efg 16,1 de 16,8 efgh 160 EF

XR20 9,5 bc 15 cd 16,2 d 18,2 cde 180,3 CD ĐC 0 i 0 k 0 l 0 m 0 L

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột hoặc hàng (TB) được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau inthườnghoặcinhoathìkhôngkhácbiệtýnghĩathốngkêởmứcýnghĩa5%bằngphépthửTukey’s.ĐC:Đốichứngkhônglâybệ nh;TB:Trungbình;AUDPC:chỉsốtíchlũybệnhtheothờigian

1 2 N G À Y 16 NG ÀY Đồng thời, tại thời điểm 16 NSKLN, chỉ số bệnh của nghiệm thức lây bệnh dòngXR13( 25 ,2 %) lu ôn ca o hơnhẳnvà khácbiệtcóýng hĩ a thốngkê so vớ i cácngh iệmthức lây bệnh với một trong các dòngXanthomonasspp còn lại với chỉ số bệnh cao hơngấp 1,6 so với trung bình chỉ số bệnh của các nghiệm thức Bênc ạ n h đ ó , n g h i ệ m t h ứ c lây bệnh với dòng XR18 lại có chỉ số bệnh thấp nhất với chỉ số bệnh (11,6%) thấp hơn1,4lầnsovớitrungbìnhchỉsốbệnhcủacácnghiệmthức,thấphơn2,2lầnsovớinghiệmthức lây bệnh dòng XR13, và thấp hơn 1,5 lần chỉ số bệnh do dòng XR9 gây ra Kết quảnày lại tiếp tục ghi nhận dòng XR13 là dòng có độc lực cao nhất và dòng XR18 là dòngcóđộc lực thấpnhất,trong khidòngXR9thuộcdòngcóđộclựctrungbình(Hình4.4).

Hình4.3:Chỉsốbệnh(SI)đốmlávikhuẩntheocácthờiđiểmkhảosátgâyrabởi20dòng

Ngoài ra, phân tích chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC) ghi nhận chỉ sốAUDPC của nghiệm thức lây nhiễm XR13 (250,2) cao nhất và khác biệt có ý nghĩathống kê với các nghiệm thức lây nhiễm bệnh các dòngXanthomonasspp còn lại. Cácnghiệm thức lây nhiễm một trong các dòng XR5, XR6, hoặc XR18 có chỉ số AUDPCtương đương nhau dao động từ 94,2 đến 103,95, thấp hơn từ 2,4 đến 2,7 lần so vớinghiệm thức lây nhiễm dòng XR13 và thấp hơntừ 1,7 đến 1,8lầns o v ớ i n g h i ệ m t h ứ c lâynhiễmdòngXR9(Hình4.4).

Hình4.4:Biểuđồthểhiệntỷlệbệnh(A),chỉsốbệnh(B),chỉsốAUDPC(C)từcácdòngXanthomon asspp.gâybệnhđốmlátrêncâyhoahồngtrongđiềukiệnnhàlướitại16NSKLN.

Nhìn chung, ở điều kiện nhà lưới, các dòngXanthomonasspp đều có khả năngbệnh trên cây hoa hồng với triệu chứng bệnh được ghi nhận rõ sau 4 NSKLN Bệnh phát triển trong giai đoạn 4 đến 8 NSKLN, sau đó, tiến triển chậm lại Tại 16NSKLN, dựatrên tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh và chỉ sốAUDPC, dòng XR13 có khả năng gây hại cao nhất,trong khi dòng XR18 có khả năng gây hại thấp nhất so với tất cả các dòng gây bệnh, vàdòng XR9 có khả năng gây hại ở mức độ trung bình Từ kết quả ghi nhận được, dòngXR13, XR18 cùng với XR9 được lựa chọn phục vụ cho việc tuyển chọn vi khuẩn đốikhángtrongđiềukiệninvitro,nhàlướivàngoàiđồng(Hình4.5).

Hình4.5:Khảnănggâybệnhcủabadòngvikhuẩn(XR9,XR13,XR18)gâybệnhđốmlátrêncâyh oahồngtrongđiềukiệnnhà lưới.

A:Nghiệmthức(NT)đốichứng khônglâybệnh;B: NTlâybệnhdòngXR9;C:NTlâybệnh dòngXR13; D:NTlâybệnh dòngXR18 .

Từ kết quả khảo sát khả năng gây hại của các dòngXanthomonasspp trên cây hoahồng, ba dòng XR9, XR13 và XR18 được lựa chọn phục vụ việc xác định mầm bệnhbằngphươngphápMALDIT- OF-MS.Kếtquảphântích(Bảng4.3)ghinhậnchothấysự trùng khớp với các loài thuộc chiXanthomonas, giá trị điểm số của XR9 đạt từ 2,03đến 2,12 cho các dòng vi sinh vật phù hợp, trong khi XR13 đạt từ 1,94 đến 2,04 DòngXR18 với giá trị điểm 1,99 đến 2,00 Nhìn chung, cả ba dòng XR9, XR13, XR18 đềugiống nhau về chi qua cả 2 lần thử và cả ba dòng đều có sự trùng khớp với cùng chi vớigiá trị điểm của chúng đều cao hơn2,00 và nhỏ hơn 2,3, đều là chiXanthomonas, vàchưacósựchắc chắnvề loài.

(XR9,XR13,XR18)dựavàokỹthuậtMALDI-TOF-MS

Dòng Dòngvisinhvật Giátrị Dòngvisinhvật Giátrị

C10(++ )(A) XR13 Xanthomonas 2.042 Xanthomonas 1.942 axonopodis perforans

C12(++ )(B) XR9 Xanthomonas 2.12 Xanthomonas 2.037 axonopodis perforans

(+): Ký hiệu thể hiện giá trị điểm từ 1,700 đến 1,999 tương ứng có thể xác định đến chi, (++): Ký hiệu thể hiệngiátrịđiểmtừ2,000đến2,299,tươngứngxácđịnhchínhxácchivàcóthểxácđịnhđếnloài.A:thểhiệnkết quảđầu tiên (hay phù hợp nhất) có cùng loài với kết quả thứ hai (có SV >2), hoặc ít nhất cùng chi (có SV >1,7);

B:thểhiệnđầutiên(kếtquảphùhợpnhất)đạtítnhấtcùngmộtchivớikếtquảthứhai(cóSV>1,7).SV:giátrịđiểm(Scorevalue)

4.1.1.4 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo kỹ thuật

TrìnhtựsáugencủaXanthomonassp XR13(Hình4.6) được giải trìnht ự , x á c định khung đọc mã và được đăng ký “accession number” trên hệ thống Banklt thuộcGenbank (NCBI) lần lượt là

OK044140 (fusA), OK044141 (gap1), OK044142 (glta),OK044143 (gyrb), OK044144

(lacf), OK044145 (lepA) Khi so sánh dữ liệu trên hệthống Genbank (NCBI) qua công cụ BLASTN, từng gen riêng biệt được kiểm tra độtương đồng với gen tương ứng của các loài trên cơ sở dữ liệu Kết quả (Bảng 4.4) ghinhậnđốivớigenfusA,dòngXR13tươngđồngvớiX.euvesicatoriapv.alfalfaeCP072268

(100%),X euvesicatoriapv.rosaR07 (100%),X. euvesicatoriaCP018467,MK478772,KY680672đếnKY680675(99,83%),X.axonopodisp v.citrumeloCP002914 (99,83%). Đối với gengap1, dòng XR13 tương đồng vớiX. axonopodispv.commiforeaeCP031059 (99,77%),X perforansCP019725, CP018475

(99,77%),X euvesicatoriapv.alfalfaeCP072268(99,55%),X. axonopodispv.citrumeloCP002914(99,55%). Đối với gengltA, dòng XR13 tương đồng vớiX perforansCP019725

(99,28%),CP018475(99,28%),X.axonopodispv.commiforeaeCP031059(99,10%),X.euve sicatoriaCP018467(99,10%),X.axonopodispv.citrumeloCP002914(99,10%). ĐốivớigengyrB,dòngXR13tươngđồngvớiX.euvesicatoriapv.alfalfaeCP072268(99,

EU015308,EU015321,EU015335(99,42%). Đốiv ớ i g e nl a cF,d ò n g X R 1 3 t ư ơ n g đ ồ n g v ớ iX a x o n o p o d i s p v c o m m i f o r e a e

8,52%),K X 8 7 8 9 9 5 , KX878996,878998,878999(98,49%),X.euvesicatoriapv.alfalfaeCP072268(99,33%),X.a xonopodispv.citrumeloCP002914(98,33%),X e u v e s i c a t o r i a CP018467

(98,15%). Đối với genlepA, dòng XR13 tương đồng vớiX perforansCP019725, CP018475(100%),X.axonopodispv.citrumeloCP002914(99,74%),X.axonopodispv.com miforeaeCP031059(99,23%),X.euvesicatoriapv.alfalfaeCP072268(99,23%).

Bảng4.4:KếtquảBLASTNtrìnhtựsáugen housekeeping(fus A, gap 1, glt A, gyr B, lac F, lep A)củadò ng Xanthomonassp XR13gâybệnhtrêncâyhoahồng

X.euvesicatoria CP018467 98,15 lepA X.perforans CP019725 100

X.perforansCP019725,CP018475,X.axonopodispv.citrumeloCP002914,X.axonopodispv

.commiforeaeCP031059,X. euvesicatoriapv.alfalfaeCP072268,X.euvesicatoriapv.rosaR07 có sự tương đồng cao với dòng XR13 ở các gen được sosánh number đồng(%) fusA Xanthomonaseuvesicatoriapv.alfalfae CP072268 100

Xanthomonasaxonopodispv.c i t r u m e l o CP002914 99,83 gap1 X.axonopodispv.commiforeae CP031059 99,77

X.axonopodispv.citrumelo CP002914 99,55 gltA X.perforans CP019725 99,28

X.axonopodispv.citrumelo CP002914 99,10 gyrB X.euvesicatoriapv.alfalfae CP072268 99,42

X.perforans CP019725 99,42 khảosát.Bêncạnhđó,nhữnggencósựtươngđồngcaogiữacácloàinàylàfusA(daođộngtừ 99,83%đến 100%),lacA(daođộngtừ99,23%đến100%),gap1(daođộngtừ99,55%đến 99,77%),gyrB (99,42%), tiếp theo là gltA (dao động từ 99,10% đến 99,28%), vàthấp nhất làlacF (dao động từ 98,15% đến 98,70%) Như vậy, so với năm gen còn lại,genlacFcủadòngXR13cósựsaikhácnhấtcóđộbảot ồ n thấphơnsovớicácdòngt rên ngânhànggen đượcsosánh.

Hình4.6:Kếtquảđiệnditrìnhtựsáugen housekeepingcủadòngXanthomonassp.XR13gây bệnhtrêncâyhoahồngCácvạchđạidiệntươngứngcủa6genlà1fusA,1gap-1,1gltA,1gyrB,1lacFvà1lepA;M:Thangchuẩn(100bp,Bioline).

Kỹ thuật MLSA được sử dụng để tiếp tục xác định dòng XR13 gây bệnh trên câyhoa hồng dựa vào phân tích phát sinh loài của dòng XR13 từ trình tự nối với 2.692 bpcho sáu gen được giải trình tự gồm các genefusA (591 bp),gap1 (444 bp),gltA (501bp),gyrB (411 bp),lacF (408 bp) vàlepA (390 bp), với kết quả phân tích phát sinh loàithu được từ kỹ thuật neighbor-joining tree, Maximum Composite Likelihood (ML) trênchương trình MEGA X Kết quả phân tích phát sinh loài ghi nhận dòng XR13 gây bệnhtrêncâyhoahồngcóphátsinhloàicùng nhánh,gần gũivới cácloàiX.eu ve si ca t or ia pv.rosaR07 có nguồn gốc từ Hoa Kỳ (Huanget al., 2013; Baraket al.,

1053,X axonopodispv.manihotisL M G 7 8 4t ừ h ệ t h ố n g PAMDB.org(Almeidaetal.,2010).

Hình 4.7: Phát sinh loài của dòngXanthomonassp XR13 gây bệnh trên cây hoa hồng dựatrêntrình tựnối củacácgenfusA,gap-1,gltA,gyrB,lacFvàlepA.

Phát sinh loài được tính bằng phương pháp Neighbor-Joining trong MEGA X Các trình tự của sáu genhousekeepingcủacácdòngvikhuẩnthuộcchiXanthomonasđượctảixuốngtừhệthốngPAMDB.org,trongkhinhánh ngoạiStenotrophomonas maltophiliaR551 và dòngX euvesicatoriapv.rosaR07 được tải xuống từ hệthốngGenbank(NCBI)đểsắpxếpvớitrìnhtựcủadòngXR13trongnghiêncứunày.Cácsốtrêncácnútđạidiệnchocácgiátrịhỗtr ợbootstrapvớiphântích MaximumCompositeLikelihood(1000lầnlặplại).

Khiphântíchgiátrịtươngđồng(similaritymatrix)dựavàokỹthuậtDistance/ computepairwisedistancestrênchươngtrìnhMEGAX ghinhậnnhánhtrêncó giá trị tương đồng trong nhóm dao động từ 93,5% đến 98,6% (Bảng 4.5) Trong đó,dòngXanthomonassp XR13 có sự tương đồng cao nhất vớiX. euvesicatoriapv.rosaR07với 98,6%, tiếptheo làX euvesicatoriaICPB10461(97,9%)vàX. perforansICMP16690(97,6%).KếtquảphântíchMLSAcủatrìnhtựnốicủasáugenhousekeep ingtiếp tục ghi nhận dòng XR13 thuộc về chiXanthomonasvà có sự tươngđồng cao nhất với dòngX euvesicatoriapv.rosaR07 (có nguồn gốc từ Hoa Kỳ), cùngvới kết quả phân tích MALDI-TOF-MS càng khẳng định dòng XR13 gây bệnh đốm látrêncâyhoahồngtạiLànghoaSaĐéctỉnhĐồngTháplàloàiXanthomonaseuvesicatoria.

Bảng4.5:Giátrịmatrậntươngđồng(Similaritymatrixvalues-%)giữadòngXanthomonas sp.XR13vàcácdòngXanthomonasspp.trongcùngnhánhphátsinhloài.

Phânlậpvàxácđịnhdanhphápdòngvikhuẩngâybệnhtrêncây ớt(Capsicumspp.)tạitỉnhĐồngTháp

20 dòng vi khuẩn gây bệnh được thu thập và phân lập từ các vườn trồng cây ớttrong tỉnh Đồng Tháp với các triệu chứng điển hình của bệnh đốm lá do vi khuẩn (Hình4.8).Tấ t cảcácdòngp hâ nl ập nàykhicò nn on đ ề u có k h u ẩ n l ạ c t rơ nl án g( sm oo th ), tròn (round), rìa lồi đều (entire) và sệt như bơ (butyrous), hơi vàng (Hình 4.8) Sau mộtthời gian phát triển (khoảng

36 giờ), khuẩn lạc có màu vàng Sau 4-5 ngày nuôi cấy, trênbề mặt xuất hiệnc á c v â n ( v ò n g n h ẫ n ) S ự p h á t s i n h c á c c h ấ t n h ầ y ( m u c o i d ) , s ệ t g i ố n g bơ (butyrous) của khuẩn lạc là một đặc điểm thuộcXanthomonasgây bệnh(Ryanet al.,2011).CácdòngvikhuẩnnàyđượcđặttênlầnlượttừXP1đếnXP20.

4.1.2.2 Khảosát khả n ă n g gâybệnhtr ên cây ớ t c ủa cácd òng X a n t h o m o n as spp đượcphânlập

Kết quả đánh giá khả năng gây hại trên cây ớt (Bảng 4.6) ghi nhận tất cả 20 dòngXanthomonasspp đều có khả năng gây hại và khác biệt có ý nghĩa thống kê so vớinghiệm thức đối chứng không lây nhiễm bệnh Trong đó, triệu chứng bệnh có thể đượcghi nhận rõ ở thời điểm 4 ngày sau khi lây nhiễm (NSKLN) ở tất cả các nghiệm thức cólây bệnh trừ nghiệm thức đối chứng với trung bình tỷ lệ bệnh chiếm 21,7%, triệu chứngbệnh tiếp tục tiến triển tăng dần lên đến thời điểm 8 NSKLN với tỷ lệ bệnh trung bìnhchiếm 26,3% Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh tại thời điểm 8 NSKLN lại tương tự nhau về ý nghĩathống kê so với tỷ lệ bệnh tại 12 NSKLN (27,4%) và 16 NSKLN (28,4%), cho thấy triệuchứngbệnhcủacácnghiệmthứcnhìnchungcósựtiếntriểnchậmlại(Hình4.9).

Bảng4.6: Tỷlệbệnh(DI)đốmlávikhuẩngâyrabởi20dòngXanthomonasspp.trêncâyớt.

Nghiệmthức 4NSKLN 8NSKLN 12NSKLN 16NSKLN

XP7 28,0 cd 33,1 bcd 34,3 bc 33,9 bc

25 ef 28,2 cdef 26,2 cdef 29,6 cdef 38,4 ab 3 3,9 bc 30 cde 44,

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột hoặc hàng (TB) được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau inthườnghoặcinhoa thìkhôngkhácbiệtýnghĩathốngkêởmứcýnghĩa5%bằngphépthửTukey’s.*k h á c biệtởmứcýnghĩa 5%.ĐC:Đối chứng khônglây bệnh;TB:Trungbình

Tại thời điểm 16 NSKLN, tỷ lệ bệnh đốm lá trên cây ớt của các nghiệm thức đềukhác biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng Trong đó, nghiệm thức lâynhiễmXP17cótỷlệbệnhcaonhấtvới44,3%vàkhácbiệtcóýnghĩathốngkêvớitấtcả các nghiệm thức lây nhiễm một trong các dòng vi khuẩn gây bệnh còn lại Tỷ lệ bệnhthấp nhất thuộc về nghiệm thức có

XP20 20,3 f 28,4 cde 29,2 cd ĐC 0 h 0 g 0 f sự lây nhiễm dòng XP1 với tỷ lệ bệnh chiếm 21,5%,thấphơnkhoảng2,1lầnsovớitỷlệbệnhcủa nghiệmthứclâynhiễmdòngXP17,thấp hơn 1,5 lần so với tỷ lệ bệnh (33,9%) do dòng XP7 gây ra Điều này chứng tỏ XP17 làdòng vi khuẩn có khả năng thích nghi, nhân mật số tốt trong điều kiện môi trường và cóđộc lực cao nhất, trong khi dòng XP1 lại có khả năng gây bệnh với độc lực thấp nhất vàdòngXP7cókhảnănggâybệnhtrungbình(Hình4.11).

Hình4.9:Tỷlệbệnh(DI)đốmlávikhuẩntheocácthờiđiểmkhảosátgâyrabởi20dòng

Kết quả (Bảng 4.7) ghi nhận các nghiệm thức có lây bệnh đều xuất hiện vùng bịnhiễm bệnh (hay vết bệnh) ngoại trừ nghiệm thức đối chứng Trong đó, ở thời điểm 4NSKLN,mứcđộbệnhđ ã đượcghinhậnrõ vớ i trung bìnhchỉ sốbệnhch iế m 13,5% Tuynhiên,trungbìnhchỉsốbệnhtạithờiđiểm8NSKLN(15,1%)khôngkhácbiệtcóý nghĩa với trung bình chỉ số bệnh với thời điểm 4 NSKLN, 12 NSKLN (16,5%), 16NSKLN (16,9%) Điều này thể hiện sự phát triển của bệnh sau 8 NSKLN chậm lại (Hình4.10).

Bảng4.7:Chỉsốbệnh(SI)đốmlávikhuẩntheocácthờiđiểmkhảosátgâyrabởi20dòng

XP11 12,2 ef 13,6 fg 15,3 efg 16 efg

172F GH XP12 12 ef 13 fg 14,8 fg 15,6 efg

XP13 11,8 ef 13,5 fg 15,5 efg 16,3 efg 172,6 FG

XP18 13 e 13,4 fg 14,3 fg 15,1 fg 167,1 FGH

XP19 12,5 ef 14 fg 15,6 efg 16,3 efg

176,3 FG XP20 10,2 efg 12,5 fg 14,3 fg 15,4 fg

Ghichú:Cácsốtrungbìnhtrongmộtcộthoặchàng(TB(B))đượctheosaubởimộthoặcnhữngchữgiốngnhauinthườnghoặci n hoathìkhông khácbiệt ýnghĩa thống kêởmứcýnghĩa 5%bằng phépthửTukey’s

*khácbiệtởmứcýnghĩa5%.ĐC:Đốichứngkhônglâybệnh;TB:Trungbình;AUDPC:chỉsốtíchlũybệnhtheothờigian Đồng thời, tại thời điểm 16 NSKLN (Bảng 4.7), chỉ số bệnh của nghiệm thức lâybệnh dòng XP17 (32,3%) luôn cao hơn hẳn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với cácnghiệm thức lây bệnh với một trong các dòngXanthomonasspp còn lại với chỉ số thức 4NSKLN 8NSKLN 12NSKLN 16NSKLN

XP3 20,1 c 22 cd 22,2 cd 21 cd 259 CD

XP5 12,3 ef 13,1 fg 14 efg 15,7 efg 168,2 FGH

XP6 12,8 ef 16,5 ef 17,7 ef 18,2 def 198,4 EF

XP8 12,1 ef 13 fg 14,8 fg 15,6 efg 166,5 FGH

XP9 11,9 ef 12,9 fg 14,5 fg 15,3 fg 164,1 FGH

XP10 10,9 efg 12,1 g 14f g 14,8 fg 155,6 GH bệnhcao hơn gấp 1,9 so với trung bình chỉ số bệnh của các nghiệm thức Đồng thời,nghiệmthứclâybệnhvớidòngXP1l ại cóchỉsốbệnhthấpnhấtvớichỉsốbệnh(13,2%)th ấp hơn 1,3 lần so với trung bình chỉ số bệnh của các nghiệm thức, thấp hơn 2,4 lần so vớinghiệm thức lây bệnh dòng XP17, và thấp hơn 1,7 lần so với dòng XP7 Bên cạnh đó,dòngXP7gâybệnhvớichỉsốbệnhthấphơn1,4lầnsovới dòngXP17vàtrungbìnhc hỉ số bệnh của các nghiệm thức (Hình 4.11) Kết quả này tiếp tục ghi nhận dòng XP17là dòng có mức độ bệnh cao nhất và dòng XP1 có mức độ bệnh thấp nhất, và XP7 cómứcđộbệnhtrungbìnhgiữahaidòngXP17vàXP1.

XP1 XP2 XP3 XP4 XP5 XP6

XP7XP8 XP9 XP10 XP11 XP12 XP13

XP14XP15 XP16 XP17 XP18 XP19 XP20 ĐC

Hình4.10:Chỉsốbệnh(SI)đốmlá vikhuẩntheocácthờiđiểmkhảosátgâyrabởi20dòng

Ngoài ra, kết quả phân tích chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC) ghi nhậnnghiệm thức lây nhiễm XP17( B ả n g 4 7 ) c ó c h ỉ s ố A U D P C

( 3 8 8 , 4 ) c a o n h ấ t v à k h á c biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức lây nhiễm bệnh các dòngXanthomonasspp.cònlại.DòngXP1 gâybệnhvớichỉsốAUDPC(130,3),thấpnhấtsovớicácnghiệmthức có lây bệnh, thấp hơn 3 lần so với nghiệm thức lây nhiễm dòng XP17, và thấp hơn2,1lầnsovớinghiệmthứclâynhiễmdòngXP7(279,1)(Hình4.11).

Hình4.11:Biểuđ ồ t h ể hiệntỷlệbệnh(A),c h ỉ sốbệ nh (B),chỉsốAUDP C (C)từcácdòng

Nhìn chung, ở điều kiện nhà lưới, các dòngXanthomonasspp đều có khả năngbệnh trên cây ớt với triệu chứng bệnh được ghi nhận rõ sau 4 NSKLN Bệnh phát triểntrong giai đoạn 4 đến 8 NSKLN, sau đó, tiến triển chậm lại Tại 16 NSKLN, dựa trên tỷlệ bệnh, chỉ số bệnh và chỉ số AUDPC, dòng XP17 có khả năng gây hại cao nhất, trongkhi dòng XP1 có khả năng gây hại thấp nhất và dòng XP7c ó k h ả n ă n g g â y h ạ i ở m ứ c độ trung bình so với tất cả các dòng gây bệnh (Hình 4.12) Từ kết quả ghi nhận được,dòng XP1, XP7, XP17 được lựa chọn phục vụ cho việc tuyển chọn vi khuẩn đối khángtrongđiềukiệninvitro,nhàlướivàngoàiđồng.

Hình4.12:Khảnănggâybệnhcủabadòngvikhuẩn(XP1,XP7,XP17)gâybệnhđốmlátrêncâyớttr ongđiềukiệnnhàlưới.

A:Nghiệmthứcđốichứngkhônglâynhiễmbệnh;B:NTlâynhiễmdòngXP1;C:NTlâynhiễmdòngXP7;D:NTlâyn hiễmdòngXP17;CácnghiệmthứcB,C,Dlábịrụngnhiều, đặcbiệtnghiệmthứcD.

Ba dòng XP1, XP7, và XP17 có triệu chứng bệnh điển hình khi lây bệnh nhân tạonhư tạo các đốm nhỏ, ngấm nước, (Hình 4.13, mục D, E) phát triển thành những đốmhoại tử bất thường, thường có đường kính từ 2 mm đến 6,35 mm Những đốm này cótrung tâm màu xám nhạt và mép nâu tối, sau khoảng 8 ngày sau khi lây nhiễm, các vếtbệnh được bao quanh bởi các vòng màu vàng hẹp, thường bị rụng đi khi lá đạt bệnh cấp5 trở lên Mô ở trung tâm của đốm có thể khô và rụi đi, tạo ra một “lỗ hỏng” Trong điềukiện ẩm ướt và mưa liên tục, các vết bệnh sẽ lan rất nhanh, giữ màu xanh đậm, và bịngấmnước.Nhiềuđốmcóthểkếthợplạivàgâyravếthoạitửlớn(hình4.13,mụcD,

F) Cuối cùng, lá biến màu vàng và rụng sớm các đặc điểm này tương tự với các triệuchứngđượcghinhậntrên đồng ruộng.

Các dòng vi khuẩn gây bệnh XP1, XP7, XP17 này được kiểm tra qua phản ứngGram và màu sắc khuẩn lạc trên môi trường nutrient agar, và phản ứng catalase. Kết quảghi nhận các dòng vi khuẩn này cho phản ứng Gram âm (–); màu vàng trên môi trườngnutrient agar, và cho phản ứng có hoạt tính catalase dương tính (+) Kết quả này thể hiệncác dòng vi khuẩn này thuộc chiXanthomonastheo phản ứng sinh hóa được (Schaad,2001).

B:GramâmcủaXP7;C:GramâmcủaXP17;D,E:Cácđốmbệnhsau4ngàysaukhilâynhiễm;F:Vếtbệnhbịngấmnướcvàrụngđi sau8 ngàysaukhi lâynhiễm.

Nộid u n g 2 : T u y ể n c h ọ n v i k h u ẩ n c ó k h ả n ă n g đ ố i k h á n g v ớ i Xanthomonasspp.đượcphânl ậ p t ừ c ơ c h ấ t v ù n g r ễ vàđ ất v ù n g sinhtháibảnđịa

Phânlậpvikhuẩn

Từ 20 mẫu cơ chất vùng rễ cây hoa hồng từ những chậu hoa hồng có cây sinhtrưởngk h ỏ e mạnhv à khôngbịnhiễmb ệ n h t h u ộ c 2 0 v ư ờ n h o a hồngtạiL à n g ho aS a Đéc tỉnh Đồng Tháp được thu thập và phân lập Kết quả phân lập được 203 dòng vikhuẩnvà đượcđánhsốthứtựtừBR1đếnBR203.

Bên cạnh đó, từ 20 mẫu đất vùng rễ trồng cây ớt với cây sinh trưởng khỏe mạnh,không bị nhiễm bệnh thuộc 20 vườn trồng ớt phân bố trên 7 huyện của tỉnh ĐồngTháp(gồm Châu Thành, Lai Vung, Lấp Vò, Cao Lãnh, Tam Nông, Thanh Bình, HồngNgự),253dòngvikhuẩnvùngrễđã đượcphânlập,đượcđánhsốkýhiệutừBP1đếnBP253.

Từ tháng 11 năm 2016 đến tháng 10 năm 2017, tiến hành thu thập 36 mẫu đất tại bavùng sinh thái bản địa tỉnh Đồng Tháp là Vườn Quốc gia Tràm Chim, Khu du lịch sinhthái Gáo Giồng, Khu di tích lịch sử văn hóa Xẻo Quýt, dựa trên các đặc điểm khác biệtvề hình thái như màu sắc, hình dạng và kích thước khuẩn lạc, tổng số 543 dòng vi khuẩnđã được phân lập Trong đó, bao gồm 303 dòng vi khuẩn từ TràmC h i m ( đ ư ợ c đ ặ t t ê n từT1đếnT303)từ18mẫuđất,138dòngvikhuẩntừGáoGiồng(từG1đếnG138)từ9 mẫuđấtvà102dòngvikhuẩntừXẻoQuýt(X1-X102) từ9mẫuđấtcònlại.

Các dòng vi khuẩn được phân lập sẽ tiếp tục được tuyển chọn khả năng đối khángvới các dòngXanthomonasspp gây bệnh trên cây trồng tương ứng Riêng các dòng vikhuẩnphânlậptừvùngsinhtháibảnđịađượckhảosáttrêncả2loại câytrồng.

Tuyểnc h ọ n v i khuẩn đốikhángc á c dòngXanthomonas spp g â y bệnhđốmlávikhuẩntrêncâyhoahồngtrongđiềukiệninvitro

4.2.2.1 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên câyhoahồngcủavikhuẩnphânlậptừcơchấtvùngrễ

Sàng lọc khả năng đối khángcủa 203 dòngvikhuẩn được phânlậptừ cơc h ấ t vùng rễ cây hoa hồng đối với ba dòngXanthomonasspp (XR9, XR13, XR18) ghi nhận54 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế ít nhất một dòng vi khuẩn gây bệnh qua đườngkính vùng ức chế xung quanh khuẩn lạc đối kháng trên đĩa thạch King’B Trong đó, 14dòng vi khuẩn thể hiện sự đối kháng triển vọng với cả ba dòng gây bệnh (Bảng 4.8), vớiba trong số các dòng này có khả năng đối kháng cao nhất, có tiềm năng như tác nhânkiểm soát sinh học Qua phân tích trung bình đường kính vùng ức chế của tất cả cácnghiệm thức đối với từng dòngXanthomonasspp ghi nhận khả năng đối kháng của cácnghiệm thức ức chế dòng XR13 với trung bình đường kính vùng ức chế (đạt 17,3 mm)thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với ức chế dòng XR18 (đạt 20 mm) Tuynhiên, khả năng đối kháng đối với dòng XR9 (19,1 mm) lại không khác biệt với 2 dòngXR13vàXR18.

Bảng 4.8: Khả năng đối khángin vitrocủa 14 dòng vi khuẩn đối với ba dòngXanthomonasspp.gâybệnhđốmlátrêncâyhoahồng(Rosaspp.)

Nghiệmt h ứ c Đường kính vùngức chế (mm)

BR59 15,5 fg 16,7 cde 17,8 cde 16,7 CD

BR73 17,5 cde 18,3 bcd 18,5 bcd 18,1 CD

BR118 15,2 fg 16,3 de 16,8 de 16,1 CD

BR173 16,8 cdef 17,5 bcde 16,5 de 16,9 CD

BR191 16,3 cdef 17 bcde 17 cde 16,8 CD

BR203 15,7 efg 16,3 de 16,7 de 16,2 CD ĐC 20,2 a 23,8 a 25,7 a 28,5 A

Ghichú:Cácsốtrungbìnhtrongmộtcộthoặchàng(TB(B))đượctheosaubởimộthoặcnhữngchữgiốngnhauinthườnghoặci nhoathìkhôngkhácbiệtýnghĩathốngkêởmứcýnghĩa5%bằngphépthửTukey’s.*k h á c biệtởmứcýnghĩa5%.ĐC:Đ ốichứngvớigiấythấmdungdịchoxolinicacid20%thaychovikhuẩnđốikháng;TB(A):Trung bình đường kính vùng ức chế của từng dòng vi khuẩn đối kháng đối với cả ba dòng

Xanthomonasspp.;TB(B):TrungbìnhđườngkínhvùngứcchếcủatấtcảcácnghiệmthứcđốivớitừngdòngXanthomonasspp Đối với khả năng đối kháng của từng dòng vi khuẩn vùng rễ đối kháng đối với cảba dòngXanthomonasspp được khảo sát ghi nhận nghiệm thức đối chứng (sử dụngoxolinic acid 20%) có đường kính vùng ức chế cao nhất và khác biệt với các nghiệmthức sử dụng vi khuẩn đối kháng Bên cạnh đó, các nghiệm thức với một trong ba dòngBR16, BR37 và BR88 có trung bình đường kính vùng ức chế tương đương nhau và caohơn,khácbiệtsovớicácdòngvikhuẩnđốikhángcònlại.

Cụ thể, khả năng đối kháng từ mười bốn dòng vi khuẩn đối kháng (bảng 4.8) cóđường kính vùng ức chế đối với từng dòngXanthomonasspp dao động từ 14,2 mm đến25,2 mm Trong đó, các dòng BR16, BR37 và BR88 cho thấy tiềm năng đối kháng caonhất so với các dòng vi khuẩn còn lại với đường kính vùng ức chế từ 19,5 mm đến 25,2mm đối với từng dòng gây bệnh (Hình 4.14) Các dòng vi khuẩn có khả năng đối khángkhuẩn thấp nhất thuộc về các dòng BR59, BR91, BR118, BR203, có vùng ức chế daođộng từ 14,2 đến 17,2 mm Trong nông nghiệp bền vững, một số mầm bệnh liên quanđến thực vật có thể được quản lý bằng các tác nhân kiểm soát sinh học Do đó, nhữngdòng vi khuẩn đối kháng được phân lập này có tiềm năng đáng kể trong việc sử dụngnhưtácnhânkiểmsoátbệnhsinhhọc.

Hình4.15:Hiệuquảcủacácdòngvikhuẩnđốikháng(BR16,BR37,BR88)đốivớibadòng

A:ĐốikhángđốivớidòngXR13;B:ĐốikhángđốivớidòngXR9;C:ĐốikhángđốivớidòngXR18; a: Đối chứng với giấy thấm dung dịchoxolinic acid20%; b: Đối chứng sử dụng môi trường nutrient broth đượckhử trùng; c: Giấy thấm huyền phù dòng BR16; d: Giấy thấm huyền phù dòng BR37; e: Giấy thấm huyền phùdòngBR88;f:Giấythấmhuyền phùdòngBR51.

4.2.2.2 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên câyhoahồngcủavikhuẩnphânlậptừđấtvùngsinh thái bảnđịatỉnhĐồngTháp

Qua quá trình sàng lọc khả năng đối khángin vitrocủa 543 dòng vi khuẩn đượcphân lập từ các vùng sinh thái này đối với ba dòngXanthomonasspp (XR9, XR13,XR18)gây bệnh đốmlá trêncây hoa hồng Sau 24giờ nuôi cấy,131d ò n g v i k h u ẩ n được ghi nhận có khả năng ức chế ít nhất một dòngXanthomonasspp dựa trên đườngkínhvùngứcchếcủakhuẩnlạcvikhuẩntrênđĩathạchchứamôitrườngKing’sBvà mầm bệnh Trong đó, 93 dòng vi khuẩn từ Tràm Chim (chiếm 70,99%), 15 dòng vikhuẩn từ Gáo Giồng (chiếm 11,45%) và 23 dòng vi khuẩn từ Xẻo Quýt (chiếm 17,56%).Bảng4.9:Đườngkínhvùngứcchếcủa17dòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọngđốivới3dòn g

Xanthomonasspp (XR13, XR9, XR18)gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng.

X84 16,3 fg 19,3 hi 18,2 fg 17,9 HI ĐC 22,3 c 29,0 cd 34,2 a 28,5 B

Ghichú:Cácsốtrungbìnhtrongmộtcộthoặchàng(TB(B))đượctheosaubởimộthoặcnhữngchữgiốngnhauinthườnghoặci n hoathìkhông khácbiệt ýnghĩa thống kêởmứcýnghĩa 5%bằng phépthửTukey’s

*khácbiệtởmứcýnghĩa5%.ĐC:Đốichứngvớigiấythấmdungdịchoxolinicacid20%thaychovikhuẩnđốikháng;TB(A):T rung bình đường kính vùng ức chế của từng dòng vi khuẩn đối kháng đối với cả ba dòng Xanthomonasspp.;TB(B):TrungbìnhđườngkínhvùngứcchếcủatấtcảcácnghiệmthứcđốivớitừngdòngXanthomonasspp Đốik h á n g v ớ i c ả 3d ò n gX a n t h o m o n a s s p p t r ê n , k ế t q u ả g h i n h ậ n 4 6 d ò n g v i khuẩncókhảnăngđốikhángvớisốlượngdòngvikhuẩntừ3vùngTràmChim,Gá o

Giồngvà XẻoQuýt lầnlượt là 26(chiếm56,52%), 12(chiếm 26,09%), 8(chiếm17,39%). Trong đó, 17 dòng vi khuẩn thể hiện khả năng đối kháng tích cực (Bảng 4.9,cộtTB(A))vớiD>15mmbaogồm dòngvikhuẩncónguồnphânlậptừTràmChi m(đạt 7 dòng – 41,18%), Gáo Giồng (đạt 6 dòng – 35,29%), Xẻo Quýt (đạt 4 dòng -23,53%) Khi xétkhả năng phânl ậ p c á c d ò n g v i k h u ẩ n đ ố i k h á n g t í c h c ự c s o v ớ i t ổ n g số dòng vi khuẩn được phân lập của từng vùng, Gáo Giồng cho tỷ lệ đạt cao nhất tươngứng 4,3% (với 6/138 dòng), sauđ ó l à X ẻ o Q u ý t đ ạ t 3 , 9 2 % ( v ớ i

4 / 1 0 2 d ò n g ) v à c u ố i cùng là Tràm Chim đạt 2,31% (với 7/303 dòng) Kết quả ghi nhận (Hình 4.15) cácnghiệm thức của 17 dòng vi khuẩn đều cho thấy khả năng ức chế 3 dòng vi khuẩnXanthomonasspp qua trung bình đường kính vùng ức chế từ 16,5 đến 31,7 mm Trongđó, có 3 dòng vi khuẩn thu thập lần lượt từ Tràm Chim (dòng

(dòngG24),XẻoQuýt(dòngX61)cótrungbìnhđườngkínhvùngứcchếcaonhấtdaođộ ngtừ 26,6 đến 31,7 mm, khác biệt so với các dòng vi khuẩn còn lại, và khác biệt với đốichứngdươngsửdụngthuốctrừbệnhhoạtchấtoxolinicacid20%(đạt28,5mm).

Hình 4.16: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn vùng sinh thái bản địađối vớibadòngXanthomonasspp.gâybệnhđốmlátrêncâyhoahồng. Đồng thời, kết quả cũng ghi nhận sự nhạy cảm của 3 dòngXanthomonasspp. gâybệnh qua trung bình đường kính vùng ức chế từ 18,7 đến 22,6 mm (Bảng 4.9, hàngTB(B)) Trong đó, hai dòng XR9 và XR18 có sự nhạy cảm và bị ức chế tương đươngnhau (dao động từ 22,4 đến 22,6 mm), khác biệt và cao hơn dòng XR13 (trung bình 18,7mm) Nhìn chung, ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng T265, X61, G24 đã được ghinhậnvà tuyểnc h ọ n

N h ữ n g d ò n g v i k h u ẩ n n à y c ó t i ề m n ă n g t r o n g v i ệ c ứ n g d ụ n g n h ư tác nhân kiểm soát sinh học, tiếp tục được xác định danh pháp nhờ vào phương phápMALDI-TOF-MS.

A:NghiệmthứclâynhiễmXR18;NghiệmthứclâynhiễmB:XR9;C:NghiệmthứclâynhiễmXR13;a:Đốichứng dươngápdụnghoạtchấtoxolinicacid20%,b:đốichứngâmsửdụngmôitrườngnutrientbrothđượckhửtrùng.

Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu về phân lập vi khuẩn từ đất có khả năngđối kháng mầm bệnh doXanthomonasspp gây ra Trong đó, 15 dòngB velezensisđãđược phân lập từ các vùng sinh thái Hoàng Liên, Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sinvà Côn Đảo, được ghi nhận có khả năng kháng nhiều loại nấm hại cây trồng và vi khuẩngây bệnhbạc lá lúaX oryzae, với kíchthước vòng đối kháng ức chếX. oryzaetrungbình là 20,8 mm Ngoài khả năng đối kháng, các dòng này còn có khả năng kích thíchsinh trưởng cây trồng (Trungvà ctv, 2017) Một nghiên cứu khác nhằm phát huy tiềmnăng của trực khuẩn bản địa ởĐ à i L o a n t r o n g v i ệ c k i ể m s o á t b ệ n h t h ố i n h ũ n t r ê n c â y có múi doX axonopodispv.citri, các loài thuộc chiBacilluscó phổ đối kháng rộng vớicác mầm bệnhtrênlá (phytopathogens) khác nhauđã được phânl ậ p t ừ t h ự c v ậ t n g o à i tựnhiên,từđấtvàpháttriểnthànhthuốctrừbệnhsinhhọc(Huangetal.,2012).

TuyểnchọnvikhuẩnđốikhángcácdòngXanthomonasspp.gây bệnhđốmlá vikhuẩntrêncâyớttrongđiềukiệninvitro

4.2.3.1 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây ớtcủavi khuẩnphânlậptừđấtvùngrễ

Sàng lọc khả năng đối kháng của 253 dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễtrồng cây ớt tại tỉnh Đồng Tháp đối với ba dòngXanthomonasspp (XP17, XP7, XP1)ghi nhận 45 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế ít nhất một dòng vi khuẩn gây bệnh quađường kính vùng ức chế từ giấy thấm huyền phù vi khuẩn đối kháng trên đĩa thạchKing’B Trong đó, có 14 dòng vi khuẩn thể hiện sự đối kháng triển vọng với cả ba dònggây bệnh (Bảng 4.10), với ba trong số các dòng này thể hiện khả năng đối kháng caonhất, cótiềmnăng nhưtácnhân kiểmsoátsinhhọc.

Kết quả phân tích trung bình đường kính vùng ức chế của tất cả các nghiệm thứcđối với từng dòngXanthomonasspp (Bảng 4.10, hàng TB(B)) ghi nhận khả năng đốikháng của các dòng vi khuẩn vùng rễ ức chế dòng XP17 với trung bình đường kính đạt20,5 mm, thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với dòng XP7 (23,6 mm) và XP1(đạt 23,9 mm) Tuy nhiên, khả năng đối kháng ức chế dòng XP7 và XP1 của các nghiệmthứclạitươngđươngnhau,khôngkhácbiệtcóýnghĩathốngkê.

Xanthomonasspp.(XP17,XP7,XP1)gâybệnhđốmlátrêncâyớt.

Nghiệmthức (Vikhuẩn) Đường kính vùng ức chế (mm)

BP2 16,3 b 18,3 f 19 de 17,9 FG BP5 19,7 b 24 de 23,7 bcde 22,4 CDEF

BP249 19 b 20 ef 21 de 20 FG ĐC 15,7 b 30,7 bc 30,3 abc 25,6 CDE

Ghichú:Cácsốtrungbìnhtrongmộtcộthoặchàng(TB(B))đượctheosaubởimộthoặcnhữngchữgiốngnhauinthườnghoặci nhoathìkhôngkhácbiệtýnghĩathốngkêởmứcýnghĩa5%bằngphépthửTukey’s.*k h á c biệtởmứcýnghĩa5%.ĐC:Đ ốichứngvớigiấythấmdungdịchoxolinicacid20%thaychovikhuẩnđốikháng;TB(A):Trung bình đường kính vùng ức chế của từng dòng vi khuẩn đối kháng đối với cả ba dòng

Xanthomonasspp.;TB(B):TrungbìnhđườngkínhvùngứcchếcủatấtcảcácnghiệmthứcđốivớitừngdòngXanthomonasspp Đối với khả năng đối kháng của từng dòng vi khuẩn vùng rễ đối kháng đối với cảba dòngXanthomonasspp (Bảng 4.10, cột TB(A)) được khảo sát ghi nhận nghiệm thứcsử dụng dòng BP103 có đường kính vùng ức chế cao nhất (34,1 mm) và khác biệt vớicác nghiệm thức sử dụng vi khuẩn đối kháng Bên cạnh đó, các nghiệm thức với mộttrong ba dòng BP11 (32,1 mm), BP49 (26,9 mm) có trung bình đường kính vùng ức chếtương đương nhau và cao hơn, khác biệt so với các dòng vi khuẩn đối kháng còn lại(Hình4.19).

Hình 4.18: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn vùng rễ đối với badòngXanthomonasspp.gâybệnhđốmlátrêncâyhoahồng.

Cụthể, c á c nghiệm t h ứ c từmườibốnd ò n g v i k h u ẩ n đốik h á n g ( B ả n g 4.10)t h ể hiện khả năng ức chế đối với từng dòngXanthomonasspp với đường kính dao động từ15,3 mm đến 34,3 mm Trong đó, các dòng BP103, BP11 và BP49 cho thấy tiềm năngđối kháng cao nhất so với các dòng vi khuẩn còn lại với đường kính vùng ức chế từ 25,7mm đến 34,3 mm đối với từng dòng gây bệnh (Hình 4.18) Các dòng vi khuẩn có khảnăng đối kháng khuẩn thấp nhất thuộc về các dòng BP2, BP6, BP18, BP178, BP249, cóvùng ức chế dao động từ 15,3 đến 21 mm. Trong nông nghiệp bền vững, một số mầmbệnh liên quan đến thực vật có thể được quản lý bằng các tác nhân kiểm soát sinh học.Do đó, những dòng vi khuẩn đối kháng được phân lập này có tiềm năng đáng kể trongviệcsửdụngnhưtácnhânkiểmsoátbệnhsinhhọc.

Hình4.19:Hiệuquảđốikhángcủavikhuẩnvùngrễtriểnvọng(BP11,BP49,BP103)đốivớibadò ngXanthomonasspp.gâybệnhđốmlátrêncâyớt.

XP17,XP7,XP1:Nghiệmthứclây nhiễmdòngXanthomonasspp.tươngứng;a:Đốichứngápdụnghoạtchấtoxolinicacid 20%; b:

4.2.3.2 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây ớtcủavikhuẩnphânlậptừđấtvùngsinhtháibảnđịa

Qua quá trình sàng lọc khả năng đối khángin vitrocủa 543 dòng vi khuẩn đượcphânlậptừcácvùngsinhtháinàyđốivớibadòngXanthomonasspp.

Từ kết quả thu được ghi nhận tại thời điểm 24 giờ sau khi thử nghiệm (Hình 4.21),cácnghiệmthứccủa13dòngvikhuẩnđềughinhậnkhảnăngđốikhángcaoứcchếcả

3 dòng vi khuẩnXanthomonasspp qua trung bình đường kính vùng ức chế (Bảng 4.11,mục TB(A)) dao động từ 18,6 đến 34,4 mm Trong đó, có 3 dòng vi khuẩn thu thập lầnlượt từ Tràm Chim với dòng T11 (đạt 32,2 mm), T188 (đạt 31,9 mm), Gáo Giồng vớidòngG24 (34,4 mm) đạt giá trị cao nhất, khác biệt so với các dòng vi khuẩn còn lại, vàkhác biệt với đối chứng sử dụng thuốc trừ bệnh hoạt chất oxolinic acid 20% (đạt 28,5mm).

Bảng4.11:Đườngkínhvùngứcchếcủa13dòngvikhuẩnvùngsinhtháibảnđịađốivới3dòngXanth omonasspp.(XP17,XP7,XP1)gâybệnhđốmlátrêncâyớt.

Nghiệmthức Đường kính vùng ức chế (mm)

X61 20,3 b 29,7 ab 35,7 a 28,6 ABC ĐC 14,7 d 30 ab 32 abc 25,6 BCDE

Ghichú:Cácsốtrungbìnhtrongmộtcộthoặchàng(TB(B))đượctheosaubởimộthoặcnhữngchữgiốngnhauinthườnghoặci n hoathìkhông khácbiệt ýnghĩa thống kêởmứcýnghĩa 5%bằng phépthửTukey’s

*khácbiệtởmứcýnghĩa5%.ĐC:Đốichứngvớigiấythấmdungdịchoxolinicacid20%thaychovikhuẩnđốikháng;TB(A):T rung bình đường kính vùng ức chế của từng dòng vi khuẩn đối kháng đối với cả ba dòng Xanthomonasspp.;TB(B):TrungbìnhđườngkínhvùngứcchếcủatấtcảcácnghiệmthứcđốivớitừngdòngXanthomonasspp Đồng Thời, kết quả cũng ghi nhận sự nhạy cảm của 3 dòngXanthomonasspp. gâybệnh qua trung bình đường kính vùng ức chế (Bảng 4.11, hàng TB(B)) từ 20 đến 28,2mm Trong đó, hai dòng XP7 và XP1 có sự nhạy cảm và bị ức chế tương đương nhau(dao động từ 26,6 đến 28,2 mm), khác biệt và cao hơn dòng XP17 (trung bình 20 mm).Nhìn chung, ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng T11, T188 và G24 đã được ghi nhậnvàtuyểnchọn Những dòngvi khuẩnnày cótiềmnăng trongviệc ứng dụng nhưt á c nhânkiểmsoát sinhhọc.

Hình 4.21: Hiệu quả đối kháng của vi khuẩn vùng sinh thái bản địa triển vọng (G24, T11,T188)đốivớibadòng Xanthomonasspp (XP17,XP7,XP1)gâybệnhđốmlátrêncâyớt

XP17, XP7, XP1: Nghiệm thức lây nhiễm dòngXanthomonasspp tương ứng; a: Đối chứng áp dụng hoạt chấtoxolinicacid20%,b:nghiệmthứcchỉsửdụngmôitrườngnutrientbrothđượckhửtrùng;khoanhgiấythấmnằmởtrungtâm giữđĩalàchỉthấmmôitrườngnutrientbrothđượckhửtrùng

Xácđịnhcácdòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọng

Sau khi sàng lọc khả năng đối khángin vitrocủa các dòng vi khuẩn được phân lập,các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng triển vọng được xác định danh pháp qua kỹthuậtMALDI-TOF-MS,là một phương phápnhanhvà chínhxác đượcápd ụ n g h i ệ n nay Sự khác biệt trong MALDI-TOF-MS được sử dụng để xác định ba nhóm vi khuẩnđối kháng (Bảng 4.12) là: (i) Các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được phân lập từcơ chất vùng rễ cây hoa hồng (BR16, BR37 và BR88); (ii) Các dòng vi khuẩn đối khángtriển vọng được phân lập từ đất vùng rễ trồng cây ớt (BP11, BP49 và BP103); (iii) Cácdòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được phân lập từ đất vùng sinh thái bản địa (T11,T265, X32, X61, X16 và G24) Các dòng vi khuẩn được phân tích với hai lần thử vàkiểm tra sự phù hợp với các dòng vi khuẩn trênt h ư v i ệ n c ủ a h ệ t h ố n g ( D a n h p h á p t r ê n hệ thống của kỹ thuật này đã được so sánh với danh pháp (ID) dựa trên các phương phápkiểu hìnhsinhhóavà/hoặcgiảitrìnhtự 16SrRNA.

Phântíchcácdòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọngđượcphânlậptừcơchấtvùngrễ cây hoa hồng (BR16, BR37 và BR88) ghi nhận sự trùng khớp với chiBacillus, giá trịđiểm của BR16 là từ 1,733 đến 1,775 cho hai lần thử, trong khi BR37 là từ 1,733 đến1,775.Mức thấp nhất trong sốcác dòng này là BR88 với giá trị điểm 1,7 chol ầ n t h ử phù hợp nhất, và không xác định được dòng phù hợp cho lần thử còn lại Các dòng vikhuẩn này ít nhất thuộc về cùng chi, nhưng chưa xác định được loài Nhìn chung, cả badòng vi khuẩn đối kháng này đều thuộc chiBacillusvới giá trị điểm từ 1,7 đến 1,775,nhưng chưa xácđịnhđượcloài. Đồng thời, khi phân tích các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được phân lập từđấtvùngrễtrồngcâyớt(BP11,BP49vàBP103)ghinhậnsựtrùngkhớpvớichiBacillus,giá trị điểm của BP11 lớn hơn 1,7 (hay >1,7) đạt từ 1,984 đến 1,988 cho hai lần thử,trong khi BP49 đạt từ 1,988 đến 2,054, với lần thử phù hợp nhấtl ớ n h ơ n 2 ( > 2 ) , p h ù hợp với dòngBacillus subtilis Giá trị điểmthấp nhất trong ba dòng này là BP103v ớ i giá trị điểm 1,73 cho lần thử phù hợp nhất và không xác địnhđ ư ợ c d ò n g p h ù h ợ p c h o lần thử còn lại Hai dòng vi khuẩn này ít nhất thuộc về cùng chi làBacillus, nhưng chưaxácđịnhđượcloài,ngoại trừdòngBP49thuộcloàiBacillussubtilis.

Bên cạnh đó, một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được phân lập từ vùngsinh thái bản địa tiếp tục được xác định danh pháp, đặc biệt là trên 3 dòng vi khuẩn đốikháng triển vọng (T265, G24, X61) Kết quả phân tích (Bảng 4.12) ghi nhận dòng T11phù hợp nhất với chiEnterobactervới giá trị điểm (score value) lớn hơn 1,7 (hay >1,7),đạt 1,726, nhưng với lần thử 2 lại chưa xác định được dòng phù hợp.V ớ i g i á t r ị đ i ể m của dòng X32 >1,7 (đạt từ 1,899 đến 1,774) cho 2 lần phân tích cho thấy dòng này phùhợp nhất với chiBacillus Đồng thời, dòng G24 cũng được ghi nhận phù hợp nhấtv ớ i chiBacillusvới giá trị điểm >1,7 (đạt từ 1,892 đến 1,874) Trong khi đó, dòng X61 lạiđược xác định phù hợp nhất đến loàiBacillus subtilisvới giá trị điểm >2

(đạt 2,012) vàphùhợpđếnchiBacilluscholầnphântíchthứhaivớigiátrịđiểm>1,7(đạt1,948).Với cả hai lần phântích đều đạt giá trị điểm >2(lầnl ư ợ t l à 2 , 2 3 6 ; 2 , 1 7 6 ) , d ò n g X 1 6 đ ư ợ c ghi nhận phù hợp nhất với loàiSerratia marcescens Tuy nhiên, kết quả phân tích lạichưa xác định được danh pháp đối với dòng T265 với giá trị điểm

2),hoặcítnhấtcùngchi(cóSV>1,7);B: thể hiện đầu tiên (kết quả phù hợp nhất) đạt ít nhất cùng một chi với kết quả thứ hai (có SV >1,7) SV: giá trịđiểm(Scorevalue)

Nhìn chung, đa số các dòng vi khuẩn đối kháng đều xác định được chi như: cácdòng BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24 đều thuộc chiBacillus,dòng T11 thuộc về chiEnterobacter,dòng X16 thuộc chiSerratia Trong đó, các dòngBP49, X61 được xác định đến loài làB subtilis.Ngoài ra, dòng T265 chưa được xácđịnh được chi Một số dòng có khả năng đối kháng triển vọng có thể được tiếp tục điểm (SV)

BR16 D6(+)(B) Bacillusvallismortis 1,775 Bacillussubtilis 1,733 BR37 B4(+)(B) Bacillusvallismortis 1,713 Bacillusmojavensis 1,71 BP11 D2(+)(B) Bacillussubtilis 1,988 Bacillussubtilis 1,984 BP49 D4(++)(A) Bacillussubtilis 2,054 Bacillussubtilis 1,988 BP103 A2(+)(B) Bacillusatrophaeus 1,73 Khôngxácđịnh 1,626

T265 D9 (+) (B) Khôngxácđịnh 1,681 Khôngxácđịnh 1,669X32 D10 (+) (B) Bacillussubtilis 1,899 Bacillussubtilis 1,774X61 D11 (++) (A) Bacillussubtilis 2,012 Bacillussubtilis 1,948X16 D12(++)(A) Serratiamarcescens 2,236 Serratiamarcescens 2,176G24 E10 (+) (B) Bacillussubtilis 1,892 Bacillussubtilis 1,874 danhphápnhư dòngBR16, BR37,BR88, T265,G24, BP103 bằng kỹ thuật phânt í c h s i n h họcphântử.

4.2.4.2 Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng dựa vào kỹ thuật phân tích Sinh họcphântử

Một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng chưa được xác định bởi MALDI- TOFđược tiếp tục xác định thêm khi phân tích trình tự gen 16S rRNA như các dòng BR16,BR37, BR88, T265, G24, BP103 Theo kết quả phân tích (Bảng 4.13 , Hình 4.22), trìnhtự gen 16S rRNA cho dòng BR16 cho thấy độ tương đồng cao nhất là 99,11% với cácdòngBacillus velezensiscó số gia nhập trên Ngân hàng gen(accession number) làMN160320 và MH458893 Trong khi đó, dòng BR37 thể hiện 99,11% tương đồng vớidòngBacillus subtilisMN493770 và EU250309 Bên cạnh đó, dòng BR88 có sự tươngđồng 99,41% vớiBacillus amyloliquefaciensKX871898 Theo phân tích trình tự ở trêncủa ba dòng phân lập đối kháng tiềm năng, các trình tự gen 16S rRNA này đã được đăngký lên hệ thống GenBank (NCBI) Số hiệu của BR16 là MW677565 Chuỗi BR37 đãđược gửi vào GenBank dưới số hiệu gia nhập MW828613, trong khi trình tự BR88 làMW828656 Trên cơ sở phân tích qua kỹ thuật MALDI-TOF và phân tích sinh học phântử, dòng BR16 được đề nghị làB. velezensisMW677565, trong khi dòng BR37 làB.subtilisMW828613vàdòngBR88tươngứnglàB.amyloliquefaciensMW828656.

(50kDa,Bioline);B:VạchcủadòngBP103(dòngsố8)trên gel; C:Vạch củadòngG24 vớithang chuẩn M(50kDa, DL2000).

Bên cạnh đó, dòng BP103 qua phân tích trình tự 16S rRNA được ghi nhận tươngđồng 99,08% với dòngBacillus velezensisOK189547 Trình tự gen này được đăng kýtrên genbank với số hiệu gia nhập là OM017175 Do đó, dòng BP103 được đề xuất làBacillusvelezensisOM017175.

Trong khi đó, ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được tuyển chọn, dòng X61đã được định danh làBacillus subtilisdựa vào kỹ thuật MALDI-TOF-MS, hai dòng cònlại là T265 và G24 được xác định thêm dựa vào phân tích trình tự gen 16S rRNA (Hình4.22) Kết quả phân tích ghi nhận dòng vi khuẩn T265 cho thấy độ tương đồng cao nhấtlà98,50%,đốivớicácdòngPaenibacilluselgiiKT862890và98,49%vớiPaenibacilluselgiiHQ

236085 Trong khi đó, dòng vi khuẩn G24 thể hiện sự tương đồng 99,49% vớiBacillus subtilisMK859998 và EF530208.2 Các trình tự gen 16S rRNA của dòng vikhuẩnT 2 6 5 v à G 2 4 đ ã đ ư ợ c đ ă n g k ý l ê n G e n B a n k l ầ n l ư ợ t v ớ i s ố h i ệ u g i a n h ậ p l ầ n lượt là MZ841643,MZ841644 Nhìn chung, qua phân tích trình tự gen 16S rRNA, dòngT265 được chỉ định làPaenibacillus elgiiMZ841643, trong khi dòng G24 làB subtilisMZ841644.

Loàitươngđồng Accession Giátrịtương sosánh number đồng(%)

Do tác động bất lợi của thuốc trừ bệnh hoạt chất hóa học, kiểm soát sinh học đangtrởthành p h ư ơ n g p h á p đượcưa c h u ộ n g đểquảnl ý bệnhh ạ i câytrồng.T r o n g n ghiêncứu này, các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được tiếp tục xác định qua kỹ thuậtphântíchsinhhọcphântửnhưB.velezensisMW677565(BR16),B.subtilisMW828613(BR37),B. amyloliquefaciensMW828656(BR88),BacillusvelezensisOM017175(BP103),Paenibacil lus elgiiMZ841643 (T265),B subtilisMZ841644 (G24) Qua kỹthuật MALDI-TOF-MS, một số dòng được xác định đến loài như các dòngB. subtilislàBP49,X61,cácdòngvikhuẩnđốikhángđượcxácđịnhđếnchinhưBR16,BR37,BR88,BP

11, BP49, BP103,X32, X61,G24(thuộc chiBacillus), dòng T11 thuộc về chiEnterobacter,dòng X16 thuộc chiSerratia Các dòng này có khả năng ức chế sự pháttriểncủaXanthomonasspp.gâybệnhtrêncâytrồngcụthểlàcâyhoa hồng,câyớt.

Những khả năng này phù hợp với kết quả của nhiều nghiên cứu trên thế giới nhưBacillus velezensis,B subtilis,B amyloliquefacienstrong việc kiểms o á t m ầ m b ệ n h thực vật do vi khuẩn (Miriket al., 2008, Firaet al., 2018) Bên cạnh đó, dòngBacillusvelezensiskiểm soátXanthomonas campestrispv.campestrisgây bệnh thối đen trên cácloạicâyraunhưdưachuộtthuộchọbầubí,ớtthuộchọcà(Liuetal.,2016),bệnhđốmlávikh uẩntrêncàchuavàcây ớt(Liuetal.,2018).HailoàiB.subtilisvàB.amyloliquefaciensgiảmsự phát triểncủa bệnhloéttrêncây cóm ú i d oXanthomonascitrisubsp.citrigây ra (Huanget al., 2012).B.amyloliquefaciensn h ư m ộ t t á c n h â nkiểm soát sinh học (Yoshidaet al., 2001), (Liet al., 2008), kiểm soátX. axonopodispv.diefenbachiaegâybệnhbạclávikhuẩntrêncâyhồngmôn(Lietal.,2012),h oặcbệnh đốm lá doX vesicatoriatrên cà chua và cây ớt (Lanna-Filhoet al., 2013) Mặt khác,Bacillus subtiliskiểm soátXanthomonas campestrispv.cucurbitaegây bệnh đốm lá vikhuẩn trên dưa chuột (Zeriouhet al., 2011) Theo Ghazalibiglaret al.(2015), vi khuẩnthuộc chiPaenibacilluscó thể kiểm soátXanthomonas campestrispv.campestris(Xcc)trên cây bắp cải Bên cạnh đó, Leet al.(2020) đã ghi nhậnPaenibacillus elgiivới môitrường lên men có khả năng chống lại mầm bệnh héo rũ do vi khuẩn trên cây cà chua,bệnh thối mềm trên cây cải thảo (Kim Chi) và bệnh đốm lá do vi khuẩn trên cây ớt Dođó, các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng trong nghiên cứu này có thể kiểm soát bệnhđốmládovikhuẩntrêncâyhoahồnghoặccâyớtlàhoàntoànkhảthi.

4.2.5 Khảo sát mật số đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọngđ ố i với Xanthomonas spp.XP17vàXR13

Vi khuẩn đối kháng đóng vai trò quan trọng trong quản lý bệnh do vi khuẩn. Quầnthể vi khuẩn đối kháng và mầm bệnhc ũ n g ả n h h ư ở n g đ ế n h i ệ u q u ả s i n h h ọ c c ủ a t á c nhân đối kháng Vi khuẩnXanthomonasspp các dòng XP17, và XR13 được pha loãngđểđạtmậtsốvikhuẩntrongđĩapetritươngứngdòngXP17làtheodãy4,4x10 11 ,4,4x1

2,7x 10 9 ,2,7x 10 8 CFU/mL;V i khuẩnđ ố i khángđượcphaloãngtheo 4m ậ t độ1 0, 100,1000,10000sovớimậtsốbanđầu(khoảng10 9 CFU/mL). Ở mật độ pha loãng 10 lần củaXanthomonasspp XP17 tương ứng 4,4 x 10 11 (CFU/ mL), các dòng vi khuẩn đối kháng ở các độ pha loãng đều không có khả năng tạođượcvùngứcchếmầmbệnh(Hình4.23).

Khảosátmậtđộđốikhángcủacácdòngvikhuẩnđốikhángtriển vọngđốivớiXanthomonasspp.XP17vàXR13

10 10 CFU/mL),P.fluorescensPF -1 với mật số 4,3 × 10 10 CFU/mL tạo đường kính vùng ức chế chỉ

6,3mm.KhigiảmmậtsốXccđếnmứcphaloãng10000(2,4×10 6 CFU/mL),khiápdụng

P fluorescensPF-1 cùng mật số trên lại tạo vùng ức chế với đường kính 24 mm.

Tươngtự,B subtilisBS- 7 với mật số 6,4 × 10 10 CFU/mL đã hìnht h à n h v ù n g ứ c c h ế m ầ m bệnh có đường kính 4,3 mm khiXccở mật độ ban đầu (2,4 × 10 10 CFU/mL). Khi giảmmật sốXccđến 1000 lần (2,4 × 10 6 CFU/mL) thìB subtilisBS- 7 cùng mật số trên đãtạo được vùng ức chế với đường kính 30 mm Vùng ức chế của cả hai vi khuẩn đốikháng đối kháng được tăng lên khi số lượngXccgiảm dần Bên cạnh đó, cả hai dòng vikhuẩn đối kháng dòngP.fluorescensPF -1 vàB subtilisBS- 7k h i ở m ậ t s ố n h ỏ h ơ n 10 6 CFU/mLđềukhôngthểhìnhthànhvùngứcchếchốnglạivikhuẩngâybệnh.

Nộidung3: K h ả o s á t k h ả n ă n g kiểm s o á t b ệ n h đ ố m l á vikhuẩn trongđiềukiệnnhàlướicủanhữngdòngvikhuẩntriểnvọng

Đánhgiáhiệuquảkiểmsoát bệnhđốmlávikhuẩntrên cây hoa hồngtrongđiềukiệnnhàlưới

4.3.1.1 Đánhgiáhiệu quảkiểmsoát bệnhđốmlávi khuẩn trêncâyhoahồngtrong điềukiệnnhàlướicủabadòngvikhuẩnđối khángtriểnvọngtừcơchấtvùngrễ

Phân tích kếtquảkhảo sáthiệuquảkiểm soátbệnh củabadòngvi khuẩnđốikhángtriển vọng gồm BR16 (B velezensisMW677565), BR37 (B subtilisMW828613) vàBR88 (B. amyloliquefaciensMW828656) đối với ba dòngXanthomonasspp. XR13,XR9vàXR18nhằmtìmradòngvikhuẩnđốikhángcóhiệuquảcaonhất,ghinhậncả ba dòng vi khuẩn đối kháng này đều đạt hiệu quả kiểm soát bệnh Trong đó, dòng BR88đạt hiệu quả ức chế cao nhất đối với cả ba dòng vi khuẩn gây bệnh dựa trên tỷ lệ bệnh,hiệu quả giảm bệnh (HQGB), chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC), và chỉ sốbệnhsau16ngàysaukhi lâynhiễm(NSKLN). Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh của ba dòng BR16, BR37, BR88 lần lượt đượcthử nghiệmt r ê n 3 d ò n gXanthomonasspp., kết quả (Bảng 4.15) ghi nhận tại thời điểm16 ngày sau khi lây nhiễm (NSKLN), trừ nghiệm thức đối chứng, các nghiệm thức cònlại đều có sự xuất hiện triệu chứng bệnh Trong đó, các nghiệm thức có xử lý vi khuẩnđối kháng kết hợp lây nhiễm dòngXanthomonasspp có tỷ lệ bệnh khác biệt có ý nghĩathống kê, và có tỷ lệ bệnh thấp hơn so với các nghiệm thức chỉ lây nhiễm vi khuẩn gâybệnh(LNB).

Trong đó, khi lây nhiễm bệnh dòng XR9 và XR18, các nghiệm thức có xử lý dòngBR16 có tỷ lệ bệnh (tương ứng 11,6%; 8,7%) không khác biệt có ý nghĩa thống kê vớihai nghiệm thức có xử lý dòng BR37 (tương ứng 16,1%; 11,8%), hoặc dòng BR88(tương ứng 9,1%; 6,7%), trong khi nghiệm thức xử lý với dòng BR88 có tỷ lệ bệnh thấpnhất và khác biệt với dòng BR37 Bên cạnh đó, khi lây nhiễm dòng XR13, hai nghiệmthức có xử lý BR16 (14,2%) và BR88 (12,2%) có tỷ lệ bệnh tương tự nhau về ý nghĩathống kê, và thấp hơn nghiệm thức có xử lý dòng BR37 (19,3%) Kết quả này cho thấyviệc xử lý các dòng vi khuẩn đối kháng có khả năng giúp giảm triệu chứng bệnh khi lâynhiễm bệnh nhân tạo, và giảm nhất khi áp dụng dòng BR88 kiểm soát đối với ba dòngXanthomonasspp được thử nghiệm(hình4.26). Đồngthời,khiphântíchhiệuquảgiảmbệnh(HQGB),kếtquảghinhậncảbadòngBR16, BR37 và BR88 đều có khả năng hạn chế sự gây hại từ cả ba dòngXanthomonasspp XR13, XR9, XR18 (Bảng 4.15).

Trong đó, khi lây nhiễm XR18, kết quả phân tíchHQGB ghi nhận hai nghiệm thức có xử lý BR16, hoặc BR37 có HQGB tương tự nhau(dao động từ 53,7 - 64.5%) và thấphơntừ 1,1 –1,4lầnsovới nghiệmthức cóx ử l ý dòng BR88 có HQGB cao nhất (tương ứng 70,1%;73,3%) Với lây nhiễm dòng XR13,nghiệm thức xử lý BR16 khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với BR37 hoặc BR88,trong khi xử lý BR88 có HQGB cao hơn BR37 Tuy nhiên, khi lây nhiễm dòng XR9,HQGB từ nghiệm thức có xử lý dòng BR16 hoặc BR88 tương tự nhau (tương ứng65,3%; 72,4%), khác biệt có ý nghĩa thống kê và cao hơn so vớiHQGB từ nghiệm thứccó xử lý dòng BR37 (đạt 50,3%) Nhìn chung, Hiệu quả giảm bệnh do xử lý dòng BR88tạo ra cao nhất so với xử lý dòng BR37, và cao hơn BR16 trong trường hợp lây nhiễmdòngXR13,hoặcXR18.

Bảng4.15:Tỷlệbệnhvàhiệuquảgiảmbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyhoahồngcủavikhuẩn đốikhángtriểnvọng(BR16,BR37,BR88)sau16NSKLNtrongđiềukiệnnhàlưới.

Nghiệmthức Lây nhiễm XR13 Lâynhiễm XR9 Lâynhiễm XR18

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s *khác biệt ở mức ý nghĩa5%.ĐC:Đốichứngkhôngxửlývikhuẩnđốikhángvàkhônglâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;HQGB:Hiệu quảgiảmbệnh

Kết quả phân tích chỉ số bệnh (Bảng 4.16) cho thấy khác biệt với nghiệm thức đốichứng không không lây nhiễm bệnh, các nghiệm thức còn lại đều xuất hiện vùng bịnhiễmbệnh.Trong đó,chỉsốbệnhcủa cácnghiệmthứccólâynhiễmbệnhriêngbiệ tvới các dòng XR13, XR9, XR18 (24,7%; 18,4%; 12,4%) luôn cao hơn hẳn và khác biệtcó ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng, điều này chứngtỏ cả ba dòng vi khuẩn đối kháng đều có khả năng khống chế vi khuẩnXanthomonasspp., làm giảm mức độ bệnh trên cây hoa hồng Bên cạnh đó, nghiệm thức được xử lýBR16 hoặc BR88 có chỉ số bệnh tương tự nhau về ý nghĩa thống kê dao động từ 5-5,3%(khi lây nhiễm XR13), 3,8 - 4,8% (khi lây nhiễm XR9), 2,1 - 3,2% (khi lây nhiễmXR18), thấp hơn nghiệm thức xử lý BR37 (tương ứng 7,7%; 6,6%; 4,7%), chứng tỏ haidòng BR16 và BR18 đều có khả năng kiểm soát bệnh tương đương nhau Kết quả nàychứng tỏ dòng BR16, BR88 có khả năng ức chế mầm bệnh hiệu quả nhất khi tiến hànhlây nhiễmbệnhnhântạotrongđiềukiệnnhàlưới. Đồng thời, phân tích chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC) ghi nhận cácnghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng có chỉ số AUDPC khác biệt ý nghĩa và đềuthấphơntừ2,3đến4,9lầnsovớicácnghiệmthứcchỉlâynhiễmbệnh.Trongđó,khi lây nhiễm dòng XR13 hoặc XR9, các nghiệm thức có xử lý dòng BR16 hoặc BR88 cóchỉ số AUDPC tương đương nhau tương ứng 54,1; 59,8 (khi lây nhiễm XR13), 43,7;53,9 (khi lây nhiễm XR9), và thấp hơn so từ 1,3 đến 1,6 so với xử lý dòng BR37 (tươngứng 82,6; 73,1).Tuy nhiên, khi lây nhiễm dòng XR18, nghiệmt h ứ c x ử l ý d ò n g B R 8 8 đạt chỉ số AUDPC thấp nhất (21,1), thấp hơn từ 1,3 đến 2,1 lần so với BR16(33,1),BR37(46),vàthấphơn4,9lầnsovớinghiệmthứclâynhiễmbệnh.Kếtquảnàychứng tỏ ở điều kiện nhà lưới, để kiểm soát bệnh đốm lá doXanthomonasspp có thể sử dụngba dòng vi khuẩn đối kháng BR16,BR37, BR88v ì c h ú n g c ó k h ả n ă n g k i ể m s o á t m ứ c độ bệnh, sự phát triển triệu chứng bệnh khi có sự xuất hiện của mầm bệnh, và đặc biệthiệuquảkhiápdụngdòng BR88.

Bảng4.16:ChỉsốbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyhoahồngvàAUDPCkhixửlývớivikhuẩn đốikhángtriểnvọng(BR16,BR37,BR88)sau16NSKLNtrongđiềukiệnnhàlưới.

Lây nhiễm XR13 LâynhiễmXR9 Lâynhiễm XR18

Nghiệmthức Chỉsố bệnh(%) AUDPC Chỉ sốbệnh(%

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s *khác biệt ở mức ý nghĩa5% ĐC: Đối chứng không xử lý vi khuẩn đối kháng hoặc lây nhiễm bệnh; LNB: Chỉ lây nhiễm bệnh; AUDPC:Chỉ sốtíchlũybệnhtheothờigian

Nhìn chung, qua phân tích tỷ lệ bệnh, hiệu quả giảm bệnh, chỉ số bệnh và chỉ sốAUDPC ghi nhận khi có lây nhiễm bệnh, cả ba dòng vi khuẩn đối kháng đều đạt hiệuquả kiểm soát bệnh, giúp giảm bệnh rất nhiều so với các nghiệm thức không được xử lývi khuẩn đối kháng Riêng dòng BR88 có khả năng kiểm soát bệnh cao hơn so với haidòng vi khuẩn đối kháng BR16, BR37, đặc biệt khi lây nhiễm dòng XR18 Vì thế,badòngnàyđượclựa chọnxửlýtiếptụcthửnghiệmngoàiđồng.

Hình 4.26: Hiệu quả kiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR88) đốivớibệnhđốmlávikhuẩntrêncâyhoahồngsau16NSKLN.

A: Nghiệm thức lây nhiễm dòng XR13; B: NT lây nhiễm dòng XR9; C: NT lây nhiễm dòng XR18; D: NT xử lýdòngBR88trướckhilâynhiễmdòngXR13;E:NTxửlýdòngBR88trướckhilâynhiễmdòngXR9;F:NTxửlýdòngBR88trướckhi lâynhiễmdòngXR18 CácnghiệmthứcA,B,vàCnhiễmbệnhvớimứcđộbệnhcaohơn,thểhiện quatánlábịnhiễmbệnhvàrụngđinhiều.Trongkhi,cácnghiệmthứcD,E,Fcóxửlývikhuẩnđốikh áng,cócóhiệuquảgiảmbệnhcaothểhiệnquatánlápháttriểntốt.

Trong nghiên cứu này,Bacillus velezensisMW677565,B. subtilisMW828613,B.amyloliquefaciensMW828656 ức chế sự phát triển củaXanthomonasspp Những loàinày cũng được ghi nhận trong nhiều kết quả nghiên cứu trên thế giới nhưBacillusvelezensisquảnlýXanthomonas campestrispv.campestrisgâybệnhth ốiđent r ê n các loại rau họ cải Với 8 dòngB velezensisđã được chọn thử nghiệm trong nhà kính bằngbiệnphápphuntrêncâybắpcải.Tấtcảcácdòngđượcthửnghiệmđềulàmgiảmbệnh tới40%(Liuetal.,2016).Trongnghiêncứukhác,Liuetal.(2018)đã chứngminhtrongcác thí nghiệmt r ê n c â y c à c h u a t r o n g n h à k í n h r ằ n g h ỗ n h ợ p c ủ a h a i d ò n g P G P R r i ê n g lẻ (B velezensisAP197 + AP298) và (B. altitudinisAP69 +B velezensisAP199) thểhiệnkhản ă n g k i ể m s o á t s i n h h ọ c c h ố n g l ạ i m ầ m b ệ n h v i k h u ẩ n l á (X.axonopodispv.vesicatoria) tốt hơn các dòng riêng lẻ, đã được chứng minhB. velezensis(AP197, AP199 và AP298) là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật và là tácnhân kiểm soát sinh học chống lạiX axonopodispv.vesicatoriagây bệnh đốm lá vikhuẩn trên cà chua và ớt (Liuet al., 2018) Bên cạnh đó, nhằm giảm sự phát triển củabệnh loét trên cây có múi doXanthomonas citrisubsp.citri,huyền phù của dòng TKS1-1 (B subtilis) và WG6-14 (B amyloliquefaciens) đã được thử nghiệm để kiểm tra sựphát triển các triệu chứng của bệnh trên cây cam quýt, kết quả ghi nhận sự phát triển cáctriệu chứng giảm xuống, có thể do có sự giảm xâm nhập của mầm bệnh và sự hình thànhmàng sinh học của các tế bào vi khuẩn Việc áp dụng công thức nội bào tử từB. subtiliscũnggiúptỷlệbệnhtrênbềmặtlágiảm(Huangetal.,2012).Trongkhi,B.amyloliquefaci enscòn được ghi nhận như tác nhân kiểm soát sinh học như kiểm soátX.axonopodispv.diefenbachiaegây ra bệnh bạc lá vi khuẩn trên cây hồng môn (Liet al.,2012), hoặc bệnh đốm lá doX vesicatoriatrên cà chua và ớt (Lanna-Filhoet al.,

2013).Mặtkhác,Bacillussubtilis(UMAF6614vàUMAF6639)kiểmsoáthiệuquảXanthomon as campestrispv.cucurbitaegây bệnh đốm lá do vi khuẩn trên dưa chuột -(Zeriouhet al.,

2011) Nhìn chung, hoạt tính kháng khuẩn của một số dòng nhưBacillusvelezensis,B. subtilis,B amyloliquefacienstrong việc kiểm soát mầm bệnh vi khuẩnthực vật đã được ghi nhận (Miriket al., 2008, Firaet al., 2018) Do đó, các dòng đốikháng triển vọng trong nghiên cứu này có thể khả thi trong việc kiểm soát bệnh đốm ládovikhuẩnRosaspp

4.3.1.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trongđiều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọngt ừ v ù n g s i n h t h á i bảnđịa

Nhằmtìmradòngvikhuẩnđốikhángcóhiệuquảcaonhất,cókhảnăngứcchếcác dòngXanthomonasspp.gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng, khảo sát đánh giá hiệuquảkiểmsoát bệnhcủa badòngvi khuẩn đốikhángtriểnvọng đối với ba dòngXanthomonasspp.XR13,XR9vàXR18đãđượctiếnhành.Kếtquảghinhậncảbadòngvi khuẩn đối kháng đều đạt hiệu quả kiểm soát bệnh Trong đó, dòngB subtilisG24 đạthiệu quả ức chế cao nhất đối với cả ba dòng vi khuẩn gây bệnh dựa trên tỷ lệ bệnh, hiệuquả giảm bệnh (HQGB), chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC), và chỉ số bệnhsau16ngàysaukhilâynhiễm(NSKLN). Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng lần lượt đượcthử nghiệmt r ê n 3 d ò n gXanthomonasspp., kết quả (Bảng 4.17) ghi nhận tại thời điểm16 ngày sau khi lây nhiễm (NSKLN), trừ nghiệm thức đối chứng, các nghiệm thức cònlại đều có sự xuất hiện triệu chứng bệnh Trong đó, các nghiệm thức có xử lý vi khuẩnđối kháng (G24, X61, T265) kết hợp lây nhiễm dòngXanthomonasspp có tỷ lệ bệnhkhác biệt có ý nghĩa thống kê, và có tỷ lệ bệnh thấp hơn so với các nghiệm thức chỉ lâynhiễmvi khuẩngây bệnh(LNB) Trong đó, khi lây nhiễm bệnhd ò n g X R 9 v à

X R 1 8 , các nghiệm thức có xử lý dòng X61 hoặc T265 có tỷ lệ bệnh giống nhau về ý nghĩathống kê, dao động từ 11,4% đến 12,2% (đối với lây nhiễm dòng XR9), và 8,7% đến8,9% (đối với lây nhiễm dòng XR18) Bên cạnh đó, khi lây nhiễm dòng XR13, hainghiệm thức có xử lý X61( 1 6 , 3 % ) v à T 2 6 5 ( 1 4 , 9 % ) đ ề u k h á c n h a u v ề ý n g h ĩ a t h ố n g kê, trong đó, tỷ lệ bệnh của nghiệm thức có xử lý dòng T265 cao hơn dòng X61 Với tỷlệ bệnh thấp nhất, nghiệmt h ứ c c ó x ử l ý d ò n g G 2 4 c ó t ỷ l ệ b ệ n h ( l ầ n l ư ợ t l à

1 0 , 3 % , 8,7%,và3,6%tươngứnglâynhiễmriêngbiệtcácdòngXR13,XR9,XR18)k hácbiệtcóý nghĩat h ố n g k ê vàthấphơnt ỷ lệb ện h c ủ a cácnghiệmthứccóx ử lý d ò n g

X 6 1 , hoặc T265 Kết quả này cho thấy việc xử lý các dòng vi khuẩn đối kháng có khả nănggiúp giảm triệu chứng bệnh khi lây nhiễm bệnh nhân tạo, và giảm nhất khi áp dụng dòngG24kiểmsoátđốivới badòngXanthomonasspp.đượcthửnghiệm(hình4.27). Đồng thời, khi phân tích hiệu quả giảm bệnh, kết quả ghi nhận cả ba dòng G24,X61, T265 đều có khả năng hạn chế sự gây hại từ cả ba dòngXanthomonasspp.

XR13,XR9,XR18.Trongđó,kếtquảphântíchhiệu quảgiảmbệnhcủacácnghiệmth ứccóxử lý dòng X61 hoặc T265 ghi nhận các dòng này có hiệu quả tương đương nhau về ýnghĩa thống kê tương ứng từ63,5% đến 66,1% (khi lây nhiễm dòng XR9), và khi lâynhiễm dòng XR18 thì hiệu quả giảm bệnh dao động từ 65,3% đến 65,9% (Bảng 4.17).Tuy nhiên, khi lây nhiễm dòngXR13 (Bảng 4.17), HQGB từ nghiệm thức có xử lý dòngT265(đạt63,5%)khác biệtcóýnghĩa thốngkêvàcaohơnsovớiHQGBtừnghiệ mthức có xử lý dòng X61 (đạt 60,1%) Bên cạnh đó, nghiệm thức có xử lý dòng G24 thểhiện hiệu quả giảm bệnh cao nhất lần lượt đạt 74,8% khi lây nhiễm dòng XR13, 74,1%khi lây nhiễm dòng XR9, và85,8% khi lây nhiễm dòng XR18, khác biệt có ý nghĩathốngkêvàcaohơnsovớihiệuquảgiảmbệnhtừviệcxửlýhaidòngvikhuẩncònlại.

Bảng4.17:Tỷlệbệnhvàhiệuquảgiảmbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyhoahồngcủavikhuẩn đốikhángtriểnvọng(X61,T265,G24)sau16NSKLNtrongđiềukiệnnhàlưới.

Nghiệmthức Lây nhiễm XR13 Lâynhiễm XR9 LâynhiễmXR18

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s *khác biệt ở mức ý nghĩa5%.ĐC:Đốichứngkhôngxửlývikhuẩnđốikhángvàkhônglâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;HQGB:Hiệu quảgiảmbệnh

Đánhg i á hiệuq u ả k i ể m s o á t b ệ n h đ ố m l á v i k h u ẩ n t r ê n câyớt trongđiềukiệnnhàlưới

4.3.2.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điềukiệnnhàlướicủabadòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọngtừcơchấtvùngrễ

Phân tích kếtquảkhảo sáthiệuquảkiểm soátbệnh củabadòngvi khuẩnđốikhángtriểnvọnggồmBP11(Bacillussp.),BP49(B.subtilis),BP103(Xanthomonasvel ezensis) đối với ba dòngXanthomonasspp XP17, XP7 và XP1 nhằm tìm ra dòng vikhuẩn đối kháng có hiệu quả cao nhất, ghi nhận cả ba dòng vi khuẩn đối kháng này đềuđạthiệuquảkiểmsoátbệnh.Trongđó,dòngBP103đạthiệuquảứcchếcaonhấtđ ốivới cả ba dòng vi khuẩn gây bệnh dựa trên tỷ lệ bệnh, hiệu quả giảm bệnh (HQGB), chỉsố tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC), và chỉ số bệnh sau 16 ngày sau khi lây nhiễm(NSKLN).

Kết quả (Bảng 4.19) ghi nhận tại thời điểm 16 ngày sau khi lây nhiễm (NSKLN),trừ nghiệm thức đối chứng không lây nhiễm bệnh, các nghiệm thức còn lại đều có sựxuất hiện triệu chứng bệnh Trong đó, các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng kếthợplây nhiễmdòngXanthomonasspp.cótỷlệbệnhkhácbiệtcóýnghĩathốngkê,vàcó tỷ lệ bệnh thấp hơn so với các nghiệm thức chỉ lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh (LNB).Dòng BP11 và BP49 khi được xử lý có kết hợp lây nhiễm dòng XP7, hoặc XP1 ghi nhậncó tỷ lệ bệnh tương đương nhau dao động từ 13,5-14,1% (LNB XP7), và 10,1-9,9%(LNB XP1), thấp hơn 2,3 đến 2,6 lần so với nghiệm thức có lây nhiễm bệnh, và cao hơn1,3đến1,7lầnso vớitỷlệbệnh khixử lý

BP103(tươngứng6,1%,8,6%).KhilâynhiễmbệnhdòngXP17,dòngBP11cótỷlệbệnh(17,7%)tươ ngđươngvớidòngBP49(17,9%)và không khác biệt dòng BP103 (13,5%) Kết quả này cho thấy việc xử lý các dòng vikhuẩn đối kháng có khả năng giúp giảm triệu chứng bệnh khi lây nhiễm bệnh nhân tạo,vàgiảmcaonhấtkhiápdụngdòngBP103kiểmsoátbệnh(hình4.28). Đồngthời,khiphântíchhiệuquảgiảmbệnh(HQGB),kếtquảghinhậncảbadòngBR16, BR37 và BR88 đều có khả năng hạn chế sự gây hại từ cả ba dòngXanthomonasspp (Bảng 4.19) Trong đó, các dòng

BP11 và BP49 ghi nhận HQGB tương tự nhau daođộngtừ60,4-60,8%(LNBXP17),54,3-

56,3%(LNBXP7),50,7-51,8%(LNBXP1), vàkhác biệt có ýnghĩa thống kê và thấp hơn so với HQGBtừnghiệmthức có xửlýdòngBP103 (đạt tương ứng lần lượt 70,1%; 72,3%; 70,3%) Nhìn chung, Hiệu quả giảmbệnhdoxửlýdòngBP103tạoracaonhất.

Bảng4.19:Tỷlệbệnhvàhiệuquảgiảmbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyớtcủavikhuẩn đốikhángtriểnvọng(BP11,BP49,BP103)sau16NSKLNtrongđiềukiệnnhàlưới.

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s *khác biệt ở mức ý nghĩa5%.ĐC:Đốichứngkhôngxửlývikhuẩnđốikhángvàkhônglâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;HQGB:Hiệu quảgiảmbệnh

Kết quả phân tích chỉ số bệnh (Bảng 4.20) cho thấy khác biệt với nghiệm thức đốichứng không lây nhiễm bệnh, các nghiệmt h ứ c c ò n l ạ i đ ề u x u ấ t h i ệ n v ù n g b ị n h i ễ m bệnh Trong đó, chỉ số bệnh của các nghiệm thức có lây nhiễm bệnh riêng biệt với cácdòng XP17, XP7, XP1 (tương ứng 32,4%; 20,6%; 12,6%) luôn cao hơn hẳn và khác biệtcó ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng, điều này chứngtỏ cả ba dòng vi khuẩn đối kháng đều có khả năng khống chế vi khuẩnXanthomonasspp., làm giảm mức độ bệnh trên cây ớt.

Bên cạnh đó, nghiệm thức được xử lý BP11hoặc BP49 có chỉ số bệnh tương đương nhau về ý nghĩa thống kê tương ứng 10,6%,11,3% (LNB XP17),9,9%,10% (LNBXP7),7,8%,7,4%(LNBXP1),thấphơnnghiệm thức xử lý BP103 (tương ứng 7,7%; 6,9%; 5,4%) Kết quả này chứng tỏ dòng BP103 cókhả năng ức chế mầm bệnh hiệu quả nhất khi tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo trongđiềukiệnnhàlưới. Đồng thời, phân tích chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC) ghi nhận cácnghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng có chỉ số AUDPC khác biệt có ý nghĩa thốngkê so với các nghiệm thức chỉ lây nhiễm bệnh, và thấp hơn từ 1,9 đến 5,3 lần. Trong đó,khi lây nhiễm bệnh, các nghiệm thức có xử lý dòng BP11 hoặc BP49 có chỉ số AUDPCtương đương nhau tương ứng 118,5; 109,8 (LNB XP17), 95,7; 84,3 (LNB XP7), 67,2;66,4 (XP1) và cao hơn từ so từ 1,3 đến 1,6 so với xử lý dòng BP103 (tương ứng 70,5;65,5; 40,1) Tuy nhiên,k h i l â y n h i ễ m d ò n g X P 7 , n g h i ệ m t h ứ c x ử l ý d ò n g B P 1 1 c ó c h ỉ sốAUDPClạikhôngkhác biệtsovớinghiệmthứccóxửlýBP103.Kếtquảnàychứng

CV% 80,78 8,51 78,36 15,50 74,31 16,74 tỏ ở điều kiện nhà lưới, để kiểm soát bệnh đốm lá doXanthomonasspp có thể sử dụngba dòng vi khuẩn đối kháng BP11, BP49, BP103v ì c h ú n g c ó k h ả n ă n g k i ể m s o á t m ứ c độ bệnh, sự phát triển triệu chứng bệnh khi có sự xuất hiện của mầm bệnh, và đặc biệthiệuquảkhiápdụngdòngBP103.

Bảng4.20:ChỉsốbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyớtvàAUDPCkhixửlývớivikhuẩn đốikhángtriểnvọng(BP11,BP49,BP103)sau16NSKLNtrongđiềukiệnnhàlưới.

Nghiệmthức bệnh(%) Chỉsố AUDPC bệnh(%) Chỉsố AUDPC

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s *khác biệt ở mức ý nghĩa5% ĐC: Đối chứng không xử lý vi khuẩn đối kháng hoặc lây nhiễm bệnh; LNB: Chỉ lây nhiễm bệnh; AUDPC:Chỉ sốtíchlũybệnhtheothờigian

Nhìn chung, qua phân tích tỷ lệ bệnh, hiệu quả giảm bệnh, chỉ số bệnh và chỉ sốAUDPC ghi nhận khi có lây nhiễm bệnh, cả ba dòng vi khuẩn đối kháng đều đạt hiệuquả kiểm soát bệnh, giúp giảm bệnh rất nhiều so với các nghiệm thức không được xử lývi khuẩn đối kháng Riêng dòng BP103 có khả năng kiểm soát bệnh cao hơn so với haidòngvikhuẩn đốikhángBP11,BP49,đặcbiệtkhilâynhiễmdòngXP17hoặcXP1.

Hình4.28:Hiệuquảkiểmsoátbệnhcủavikhuẩnđốikhángtriểnvọng(BP103)đốivới bệnhđốmlávikhuẩntrêncâyớtsau16NSKLN.

A: Nghiệm thức lây nhiễm dòng XP17; B: NT lây nhiễm dòng XP7; C: NT lây nhiễm dòng XP1; D: NT xử lýdòngBP103trướckhilâynhiễmdòngXP17;E:NTxửlýdòngBP103trướckhilâynhiễmdòngXP7;F:NTxửlýdòngBP103t rướckhilâynhiễmdòng XP1.Các nghiệmthức A,B, và Cnhiễmbệnh vớimứcđộbệnh caohơn.Trong khi, các nghiệm thức D, E, F có xử lý vi khuẩn đối kháng, có hiệu quả giảm bệnh cao thể hiện qua tán lápháttriểntốt.

4.3.2.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điềukiệnnhàlướicủabadòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọngtừvùngsinhtháibảnđịa

Nhằmtìmradòngvikhuẩnđốikhángcóhiệuquảcaonhất,cókhảnăngứcchếcác dòngXanthomonasspp.gây bệnh đốm lá trên cây ớt, khảo sát đánh giá hiệu quảkiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng (G24, T11, T188) đối với badòngXanthomonasspp XP17, XP7, XP1 đã được tiến hành Kết quả ghi nhận cả badòng vi khuẩn đối kháng đều đạt hiệu quả kiểm soát bệnh Trong đó, dòng G24(B.subtilis)đạthiệuquảứcchếcaonhấtđốivớicảbadòngvikhuẩngâybệnhdựatrêntỷ lệ bệnh, hiệu quả giảm bệnh (HQGB), chỉ số tích lũy bệnh( A U D P C ) , v à c h ỉ s ố b ệ n h sau16ngàysaukhilâynhiễm(NSKLN).

Kếtquả(Bảng4.21)ghinhậntạithờiđiểm16NSKLN,trừnghiệmthứcđốichứng,các nghiệm thức còn lại đều có sự xuất hiện triệu chứng bệnh Trong đó, các nghiệmthứccóxửlývikhuẩnđốikháng(G24,T11,T188)kếthợplâynhiễmdòngXanthomonassp p có tỷ lệ bệnh khác biệt có ý nghĩa thống kê, và có tỷ lệ bệnh thấp hơntừ 2,4 đến 3 lần so với các nghiệm thức chỉ lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh (LNB). Trongđó,cácnghiệmthứccóxửlýdòngT11hoặcT188cótỷlệbệnhtươngđươngnhauvềý nghĩa thống kê, dao động từ 15% đến 16% (LNB XP17), và 12,4% đến 12,9% (LNBXP7), 7,2% đến 7,4% (LNB XP1), và cao hơn nghiệm thức có xử lý dòng G24 có tỷ lệbệnh tương ứng là 9%; 9,4%, 5,2% Kết quả này cho thấy việc xử lý các dòng vi khuẩnđốikhángcókhảnănggiúpgiảm triệuchứngbệnhkhilâynhiễm bệnhnhântạo,vàgiảmnhấtkhi ápdụng dòngG24(hình 4.29). Đồng thời, khi phân tích hiệu quả giảm bệnh, kết quả ghi nhận cả ba dòng G24,T11, T188 đều có khả năng hạn chế sự gây hại từ cả ba dòngXanthomonasspp Trongđó, kết quả phân tích hiệu quả giảm bệnh của các nghiệm thức có xử lý dòng T11 hoặcT188 ghi nhận có hiệu quả tương đương nhau về ý nghĩa thống kê tương ứng từ 64,5%,66,7% (LNB XP17), và khi lây nhiễm dòng XP7 thì hiệu quả giảm bệnh dao động từ59,9%, 58,3%, và từ 65% đến 64,2% (LNB XP1) (Bảng 4.21) Tuy nhiên, HQGB từ haidòng này lại thấp hơn so với HQGB từ nghiệm thức có xử lý dòng G24 (đạt tương ứng80%;69,7%;74,8%).

Bảng4.21:Tỷlệbệnhvàhiệuquảgiảmbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyớtcủavikhuẩn đốikhángtriểnvọng(G24,T11,T188)sau16NSKLNtrongđiềukiệnnhàlưới.

Nghiệmthức Lây nhiễm XP17 Lây nhiễm XP7 Lâynhiễm XP1

Tỷlệ HQGB Tỷlệ HQGB Tỷlệ HQGB bệnh(%) (%) bệnh(%) (%) bệnh(%) (%) ĐC 0 d - 0 d - 0 d -

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s *khác biệt ở mức ý nghĩa5%.ĐC:Đốichứngkhôngxửlývikhuẩnđốikhángvàkhônglâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;HQGB:Hiệu quảgiảmbệnh

Kết quả phân tích chỉ số bệnh (Bảng 4.22) ở 16 NSKLN cho thấy khác biệt vớinghiệm thức đối chứng không lây nhiễm bệnh, các nghiệm thức còn lại đều xuất hiệnvùngbịnhiễmbệnh.Trongđó,chỉsốbệnhcủacácnghiệmthứccólâynhiễmbệnhriêngbiệt với các dòng XP17, XP7, XP1 (32,4%; 20,6%; 12,6%) luôn cao hơn hẳn và khácbiệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng, điều nàychứngtỏcảbadòngvikhuẩnđốikhángđềucókhảnăngkhốngchếvikhuẩnXanthomonasspp , làm giảm mức độ bệnh trên cây hoa hồng Nghiệm thức được xử lýT11 hoặc T188 lại có sự tương đương về ý nghĩa thống kê, tương ứng hai dòng này đềucó khả năng kiểm soát bệnh tương đương nhau trong điềi kiện nhà lưới Trong khi đó,nghiệm thức có xử lý dòng G24 có chỉ số bệnh (lần lượt là 7%; 5,9%; 3,3% tương ứngkhi lây nhiễm với dòng XP17, XP7, XP1) khác biệt có ý nghĩa thống kê và thấp hơn hẳnso với xử lý dòng T11 hoặc T188 Kết quả này chứng tỏ dòng G24 có khả năng ức chếmầm bệnh hiệu quả nhất khi tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo trong điều kiện nhà lưới(hình 4.29).

Bảng4.22:ChỉsốbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyớtvàAUDPCkhixửlývớivikhuẩn đốikhángtriểnvọng(G24,T11,T188)sau16NSKLNtrongđiềukiệnnhàlưới.

LâynhiễmXP17 Lâynhiễm XP7 Lây nhiễm XP1 Nghiệmthức bệnh(%) Chỉsố AUDPC bệnh(%) Chỉsố AUDPC

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s *khác biệt ở mức ý nghĩa5% ĐC: Đối chứng không xử lý vi khuẩn đối kháng hoặc lây nhiễm bệnh; LNB: Chỉ lây nhiễm bệnh; AUDPC:Chỉ sốtíchlũybệnhtheothờigian

Nộidung4:Đánhgiáhiệuquảkiểm soátbệnh đốmlávikhuẩntrên câyhoahồngvàcâyớtởđiềukiệnngoàiđồng

Đánhgiáhiệuquảkiểmsoát bệnhđốmlávikhuẩntrên cây hoa hồngởđiềukiệnngoàiđồng

4.4.1.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng ở điềukiệnngoàiđồngcủabadòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọngtừcơchấtvùngrễ Ở điều kiện ngoài đồng, ba dòng BR16 (B velezensisMW677565), BR37 (B.subtilisMW828613) và BR88 (B amyloliquefaciensMW828656)được thửkhả năng ứcchế các dòngXanthomonasspp (XR13, XR9 và XR18) gây bệnh đốm lá trên cây hoahồng, kết quả ghi nhận cả ba dòng vi khuẩn đối kháng đều đạt hiệu quả kiểm soát bệnh.Trong đó, dòng BR88 đạt hiệuquả ức chế caonhất đối với cả ba dòngv i k h u ẩ n g â y bệnh dựa trên tỷ lệ bệnh, hiệu quả giảm bệnh (HQGB), chỉ số tích lũy bệnh theo thờigian(AUDPC),vàchỉsốbệnhsau16ngàysaukhilâynhiễm(NSKLN). Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng lần lượt đượcthử nghiệmt r ê n 3 d ò n gXanthomonasspp., kết quả (Bảng 4.23) ghi nhận tại thời điểm16NSKLN,cácnghiệmthứcđềucósựxuấthiệntriệuchứngbệnhkểcảnghiệmth ứcđốichứngkhônglâynhiễmbệnh.Điều nàychứngtỏ,tạiruộngtrồngcâyhoahồngđã cóá p l ự c v ề n g u ồ n b ệ n h Đ ồ n g t h ờ i , k ế t q u ả c ò n g h i n h ậ n t ỷ l ệ b ệ n h c ủ a n g h i ệ m t h ứ c đốichứngtạiđồngruộngtươngđươngvớikhilâynhiễmdòngXR18tươngứng dòngvi khuẩn có khả năng gây bệnh tháp nhất trong số các mầm bệnh được phân lập Bêncạnh đó, các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng (BR16, BR37, BR88) có tỷ lệbệnh khác biệt có ý nghĩa thống kê, và thấp hơn so với các nghiệm thức chỉ lây nhiễmbệnh (LNB) Trong đó, các nghiệm thức có xử lý dòng BR16 hoặc BR88 có tỷ lệ bệnhtương đương nhau về ý nghĩa thống kê, tương ứng 6,3%; 7,9% (khi lây nhiễm XR13),4,3%; 6,1% (khi lây nhiễm XR9), và 3,7%; 4,7% (khi lây nhiễm dòng XR18), thấp hơntừ 1,3 đến 1,8 lần so với nghiệmt h ứ c x ử l ý B R 3 7 ( t ư ơ n g ứ n g 2 2 , 9 % ; 1 8 , 5 % ;

1 4 , 8 % ) , và từ 2 đến 3,7 lần so với nghiệm thức chỉ lây nhiễm bệnh (tương ứng 49%; 38,7%;29,9%) Kết quả này cho thấy việc xử lý các dòng vi khuẩn đối kháng có khả năng giúpgiảmtriệuchứngbệnhkhilâynhiễmbệnhnhântạo(hình4.30). Đồng thời, khi phân tích hiệu quả giảm bệnh, kết quả ghi nhận cả BR16, BR37,BR88 đều có khả năng hạn chế sự gây hại từ cả ba dòngXanthomonasspp XR13, XR9,XR18 Trong đó, khi lây nhiễm dòng XR13 và XR18, kết quả (Bảng 4.23) ghi nhận cácnghiệm thức có xử lý dòng BR16 hoặc BR88 đạt HQGB tương đương nhau về ý nghĩathống kê tương ứng đạt 67%; 73,2% (khi lây nhiễm XR9), và 66,2%; 71,9% (khi lâynhiễmX R 1 8 ) , v à c a o h ơ n 1 , 2 đ ế n 1 , 4 l ầ n s o v ớ i n g h i ệ m t h ứ c x ử l ý

B R 3 7 T u y n h i ê n , khilâynhiễmdòngXR9,HQGBtừnghiệmthứccóxửlýdòngBR16(đạt65,2%)không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với HQGB từ nghiệm thức có xử lý dòng BR37 (đạt52,3%), hoặc BR88 (72,1%) Như vậy, xử lý dòng BR88 vẫn đạt hiệu quả giảm bệnhtươngđươngvớidòngBR16,vàcaohơndòngBR37.

Bảng4.23:Tỷlệbệnhvàhiệuquảgiảmbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyhoahồngcủavikhuẩn đốikhángtriểnvọng(BR16,BR37,BR88)ở16NSKLNởđiềukiệnngoàiđồng

Lâ y nhiễm XR13 LâynhiễmXR9 Lây nhiễm XR18

Ghichú:Cácsốtrungbìnhtrongmộtcộtđượctheosaubởimộthoặcnhữngchữgiốngnhauinthườnghoặcinhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s *khác biệt ở mức ý nghĩa5%.ĐC:Đốichứngkhôngxửlývikhuẩnđốikhángvàkhônglâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;HQGB:Hiệu quảgiảmbệnh

Kết quảphântíchchỉsốbệnh (Bảng4.24)ở16NSKLNcho thấytất cả cácnghiệmthức đều xuất hiện vùng bị nhiễm bệnh (hay vết bệnh) Trong đó, nghiệm thức có lâynhiễm bệnh XR18 có chỉ số bệnh tương đương với nghiệm thức đối chứng không lâynhiễm bệnh Trong khi đó, chỉ số bệnh của các nghiệm thức cól â y n h i ễ m b ệ n h r i ê n g biệtvớicácdòngXR13,XR9,XR18(27%,20%,16%)luôncaohơnhẳnvàkhác biệtcóýnghĩathốngkêsovớicácnghiệmthứccóxửlývikhuẩnđốikháng.Điềunàychứngtỏ cả ba dòng vi khuẩn đối kháng đều có khả năng khống chế các dòngXanthomonasspp.,làmgiảm mứcđộbệnhtrêncâyhoahồng.Trongđó,nghiệm thứcđượcxửlýBR16hoặc BR88 lại có chỉ số bệnh tương đương nhau về ý nghĩa thống kê tương ứng 6,3%;7,9% (khi lây nhiễm XR13), 4,3%; 6,1% (khi lây nhiễm XR9), và 3,7%; 4,7% (khi lâynhiễm XR18), và thấp hơn so với nghiệm thức có xử lý BR37 (tương ứng 10,3%; 8,6%;7,2%) Kết quả này thể hiện các dòng vi khuẩn đối kháng đều có khả năng ức chế mầmbệnh,hiệuquảnhấtlàhaidòngBR16vàBR88.

Bảng4.24:ChỉsốbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyhoahồngvàAUDPCkhixửlý vớivikhuẩn đốikhángtriểnvọng(BR16,BR37,BR88)ở16NSKLNởđiềukiệnngoàiđồng

Ghichú:Cácsốtrungbìnhtrongmộtcộtđượctheosaubởimộthoặcnhữngchữgiốngnhauinthườnghoặcinhoathìkhôngkhácb iệtýnghĩathốngkêởmứcýnghĩa5%bằngphépthửTukey’s *k h á c biệtởmứcýnghĩa5%.ĐC:Đốichứngkhôngxửlývi khuẩnđối kháng hoặclâynhiễmbệnh; LNB:Chỉlâynhiễmbệnh; AUDPC:Chỉ sốtíchlũybệnhtheothờigian

Ngoài ra, phân tích chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC) của các nghiệmthức có xử lý BR16, BR37, BR88 đều ghi nhận thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thốngkê từ 2,1 đến 4,5 lần so với các nghiệm thức chỉ lây nhiễm bệnh (Bảng 4.24). Trong đó,khi lây nhiễm dòng XR9, XR18, các nghiệm thức có xử lý dòng BR16, hoặc BR88 cóchỉ số AUDPC tương đương nhau tương ứng 47,1 đến 69,6 (khi lây nhiễm XR9), từ 39,4đến 52,6 (khi lây nhiễm XR18), và cao hơn so với nghiệm thức xử lý dòng BR37 (tươngứng 97,7; 79,4) Tuy nhiên, khi xử lý lây nhiễm dòng XR13, nghiệm thức có xử lý dòngBR88, chỉ số AUDPC đạt 70,1 khác biệt có ý nghĩa thống kê và thấp hơn từ 1,3 đến 1,7lầnso với các nghiệmt h ứ c x ử l ý d ò n g

B R 1 6 ( 9 2 , 4 ) v à B R 3 7 ( 1 2 0 , 8 ) , v à t h ấ p h ơ n 4 , 2 lần so với nghiệm thức chỉ lây nhiễm bệnh (298,6) Nhìn chung, ở điều kiện ngoài đồng,để kiểm soát bệnh đốm lá doXanthomonasspp có thể sử dụng ba dòng vi khuẩn đốikháng BR16, BR37, và BR88 vì chúng có khả năng kiểms o á t m ứ c đ ộ b ệ n h , s ự p h á t triển triệu chứng bệnh khi có sự xuất hiện của mầm bệnh, và đặc biệt hiệu quả khi ápdụngdòngBR88.

Hình 4.30: Hiệu quả kiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR16,BR37,BR88)đốivớibệnhđốmlávikhuẩnở16NSKLNởđiềukiệnngoàiđồng.

Ghi chú:A:NghiệmthứclâynhiễmdòngXR13;B:NTlâynhiễmdòngXR9;C:NT lâynhiễmdòngXR18;D:NTxử lý dòng BR88 trước khi lây nhiễm dòng XR13; E: NT xử lý dòng BR88 trước khi lây nhiễm dòng XR9; F: NTxửlýdòngBR88trướckhilâynhiễmdòngXR18

4.4.1.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng ở điềukiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng từ vùng sinh thái bảnđịa Ở điều kiện ngoài đồng có sự lây nhiễm bệnh nhân tạo, khảo sát đánh giá hiệu quảkiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng bản địa triển vọng X61 (B. subtilis),T265 (Paenibacillus elgii), G24 (B subtilis) đối với ba dòngXanthomonasspp.

XR13,XR9vàXR18gâybệnhđốmlátrêncâyhoahồngđãđượctiếnhànhnhằmtìmradòngv i khuẩn đối kháng có hiệu quả cao nhất Kết quả được ghi nhận và đánh giá hiệu quảkiểmsoátbệnhquatỷlệbệnh,hiệuquảgiảmbệnh,chỉsốbệnhvàchỉsốAUDPC.

Kếtqu ả đánhg i á kh ả năngk iể m soátbệnhc ủa b a dòngvik hu ẩn đốik h á n g l ầ n lượt được thử nghiệm trên 3 dòngXanthomonasspp (Bảng 4.25) ghi nhận tại thời điểm16 ngày sau khi lây nhiễm (NSKLN), các nghiệm thức đều có sự xuất hiện triệu chứngbệnh kể cả nghiệm thức đối chứng không lây nhiễm bệnh Điều này chứng tỏ, tại đồngruộngtrồngcâyhoahồngđãcóáplựcvềnguồnbệnh.Đồngthời,cácnghiệmthứccó xử lý vi khuẩn đối kháng (G24, X61, T265) kết hợp lây nhiễm riêng biệt các dòngXanthomonasspp XR13, XR9 và XR18 đều có tỷ lệ bệnh thấp hơn so với các nghiệmthức đối chứng hoặc nghiệm thức chỉ lây nhiễm bệnh Bên cạnh đó, các nghiệm thứcđược xử lý với dòng X61 hoặc T265 đạt tỷ lệ bệnh tương đương nhau về ý nghĩa thốngkê, dao động từ 18,2% đến 17,1% (lây nhiễm dòng XR13), từ 16,2% đến 15,2% (khi lâynhiễm dòng XR9), và từ 11,8% đến 11,3% (khi lây nhiễm dòng XR18) Đặc biệt, khiđược xử lý dòng G24, nghiệm thức đạt tỷ lệ bệnh thấp nhất (lần lượt là 12,5%, 9,4%,7,3% tương ứng lây nhiễm riêng biệt các dòng XR13, XR9, XR18), thấp hơn và khácbiệt có ý nghĩa thống kê so với tỷ lệ bệnh của các nghiệm thức có xử lý dòng X61 hoặcT265 Kết quả này cho thấy việc xử lý các dòng vi khuẩn đối kháng có khả năng giúpgiảm triệu chứng bệnh khi lây nhiễm bệnh nhân tạo, và giảm nhất khi áp dụng dòng G24kiểmsoát đối vớibadòngXanthomonasspp.đượcthửnghiệm(Hình4.31). Đồng thời, khi phân tích hiệu quả giảm bệnh, kết quả ghi nhận cả ba dòng G24,X61, T265 đều có khả năng hạn chế sự gây hại từ cả ba dòngXanthomonasspp.

XR13,XR9,XR18.Trongđó,kếtquảphântíchhiệu quảgiảmbệnhcủacácnghiệmth ứccóxử lý dòng X61 hoặc T265 ghi nhận các dòng này có hiệu quả tương đương nhau về ýnghĩa thống kê, tương ứng từ 62,8% đến 65,2% (khi lây nhiễm dòng XR13), từ 58,3%đến 60,8% (khi lây nhiễm dòng XR9), và khi lây nhiễm dòng XR18 thì hiệu quả giảmbệnh dao động từ 60,5% đến 62,2% (Bảng 4.25) Bên cạnh đó, nghiệm thức có xử lýdòng G24 thể hiện hiệu quả giảm bệnh cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so vớihiệu quả giảm bệnh từ các nghiệm xử lý hai dòng vi khuẩn đối kháng còn lại, với hiệuquả giảm bệnh lần lượt đạt 74,5%, 75,7%, 75,6% tương ứng khi lây nhiễm các dòngXR13,XR9,XR18(Bảng4.23).

Lây nhiễm XR13 Lây nhiễm XR9 Lây nhiễm XR18 Nghiệmthức

Tỷlệ HQGB Tỷlệ HQGB Tỷlệ HQGB

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoathìkhôngkhácbiệtýnghĩathốngkêởmứcýnghĩa 5%bằngphép thửTukey.*k h á c biệtởmứcýnghĩa5%.ĐC:Đốichứngkhôngxửlývikhuẩnđốikhángvàkhônglâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâ ynhiễmbệnh;HQGB:Hiệuquả giảmbệnh

Kếtqu ả phânt í c h c hỉ sốb ệ n h ( B ả n g 4.26)ở 16N SK L N c ho t ấ t c ả cá c nghiệm thức đều xuất hiện vùng bị nhiễm bệnh (hay vết bệnh) Trong đó, chỉ số bệnh của cácnghiệm thức có lây nhiễm bệnh riêng bệnh(%) (%) bệnh(%) (%) bệnh(%) (%) ĐC 27,2 b - 27,2 b - 27,2 a -

G24 12,5 d 74,5 A 9,4 d 75,7 A 7,3 c 75,6 A biệt với các dòng XR13, XR9, XR18 (27%, 20%,16%) luôn cao hơn hẳn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng(14,5%) và các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng Điều này chứng tỏ cả ba dòngvi khuẩn đối kháng đều có khả năng khống chế vi khuẩnXanthomonasspp., làm giảmmức độ bệnh trên cây hoa hồng. Nghiệm thức được xử lý X61 hoặc T265 lại có chỉ sốbệnh tương đương nhau về ý nghĩa thống kê Trong khi đó, nghiệm thức xử lý dòng G24cóchỉ số bệnh khác biệt có ý nghĩa thống kê và thấp hơn hẳnsov ớ i x ử l ý d ò n g X 6 1 hoặc T265, với chỉ số bệnh lần lượt là 6,7%, 5,3%, 3,8% tương ứng khi lây nhiễm riêngbiệt với các dòng XR13, XR9,X R 1 8 K ế t q u ả n à y t h ể h i ệ n d ò n g G 2 4 c ó k h ả n ă n g ứ c chế mầm bệnh hiệu quả nhất khi tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo ở điều kiện ngoàiđồng(hình4.31).

Bảng4.26:ChỉsốbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyhoahồngvàAUDPCkhixửlý vớivikhuẩn đốikhángtriểnvọng(X61,T265,G24)ở16NSKLNởđiềukiệnngoàiđồng

Lây nhiễm XR13 Lây nhiễm XR9 Lâynhiễm XR18 Nghiệm thức Chỉ sốbệ nh

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoathìkhôngkhácbiệtýnghĩathốngkêởmứcýnghĩa 5%bằngphép thửTukey.*k h á c biệtởmứcýnghĩa5%.ĐC:Đốichứng khôngxửlývikhuẩnđốikhánghoặclây nhiễmbệnh; LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;AUDPC:Chỉsốtíchlũybệnhtheothời gian

Ngoài ra, phân tích chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC) của các nghiệmthứccóxửlýX61,T265,G24đềughinhậnthấphơnvàkhácbiệtcóýnghĩathốngk êtừ2,1đến5lầnsovớicácnghiệmthứcchỉlâynhiễmbệnh(Bảng4.26).Trongđó,các

CV(%) 51,2 54,02 46,4 48,18 53,3 57,75 nghiệm thức có xử lý dòng X61, hoặc T265 có chỉ số AUDPC tương đương nhau daođộng từ 126,9 đến 109,2 (khi lây nhiễm XR13), từ 97,2 đến 93,5 (khi lây nhiễm XR9),và từ63,9đến67,6(khilâynhiễmXR18).Tuynhiên,ởnghiệmthứccóxửlýdòngG24,chỉ số AUDPC lần lượt là 67,5; 51,3; và 33,8 tương ứng khi lây nhiễm XR13, XR9,XR18 Kết quả này thấp hơn từ 1,6 đến

2 lần khi so sánh với các nghiệm thức tương ứngcó xử lý dòng X61, hoặc T265 Nhìn chung, ở điều kiện ngoài đồng, để kiểm soát bệnhđốm lá doXanthomonasspp có thể sử dụng ba dòng vi khuẩn đối kháng G24,

X61,T265vìchúngcókhảnăngkiểmsoátmứcđộbệnh,sựpháttriểntriệuchứngbệnhkhi cósựxuấthiệncủamầmbệnh,vàđặcbiệthiệuquả khi ápdụngdòngG24

Hình 4.31: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng (X61, T265, G24) đốivớibệnhđốmlávikhuẩnở16NSKLNởđiềukiệnngoàiđồng.

Ghi chú:A:NghiệmthứclâynhiễmdòngXR13;B:NTlâynhiễmdòngXR9;C:NT lâynhiễmdòngXR18;D:NTxửlýdòngG24trướckhilâynhiễmdòngXR13;E:NTxửlýdòngG24trướckhilâynhiễmdòngXR9

Đánhgiáhiệuquảkiểmsoátbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyớtở điềukiệnngoàiđồng

4.4.2.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở điều kiệnngoàiđồngcủabadòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọngtừcơchất vùngrễ Ở điều kiện ngoài đồng, ba dòng BP11 (Bacillussp.), BP49 (B subtilis), BP103(Bacillus velezensis)được thửkhả năng ức chế các dòngXanthomonasspp XP17, XP7,XP1 gây bệnh đốm lá trên cây ớt, kết quả ghi nhận cả ba dòng vi khuẩn đối kháng đềuđạthiệuquảkiểmsoát bệnh.Trongđó,dòngBP103đạthiệuquảứcchếcaonhấtđ ốivới cả ba dòng vi khuẩn gây bệnh dựa trên tỷ lệ bệnh, hiệu quả giảm bệnh (HQGB), chỉsố tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC), và chỉ số bệnh sau 16 ngày sau khi lây nhiễm(NSKLN).

Kết quả đánh giá khả năng kiểm soát bệnh (Bảng 4.27) ghi nhận tại thời điểm16NSKLN, các nghiệm thức đều có sự xuất hiện triệu chứng bệnh kể cả nghiệm thức đốichứng không lây nhiễm bệnh Điều này chứng tỏ, tại khu vực trồng ớt đã có áp lực vềnguồn bệnh Đồng thời, kết quả còn ghi nhận tỷ lệ bệnh của nghiệm thức đối chứng tạiđồng ruộng tương đương với khi lây nhiễm dòng XP1 tương ứng dòng vi khuẩn có khảnănggâybệnhthấpnhấttrongsốcácmầmbệnhđượcphânlập.Bêncạnhđó,cácnghiệmthức có xử lý vi khuẩn đối kháng (BP11, BP49, BP103) có tỷ lệ bệnh khác biệt có ýnghĩa thống kê, và thấp hơn so với các nghiệm thức chỉ lây nhiễm bệnh (LNB) Trongđó, các nghiệm thức có xử lý dòng BP11 hoặcBP49 có tỷ lệ bệnh tương đương nhau vềý nghĩa thống kê, tương ứng đạt 19,5%, 11,4%(LNB XP17), đạt 10,8%, 11,7% (LNBXP7), và đạt 8,7%, 9,2% (LNB XP1), cao hơn từ1,4 đến 1,7 lần so với nghiệm thức xửlý BP103 (tương ứng 11,4%, 6,9%, 5,4%), và thấp hơn từ 2,1 đến 4,7 lần so với nghiệmthức chỉ lây nhiễm bệnh Kết quả này cho thấy việc xử lý các dòng vi khuẩn đối khángcó khả năng giúp giảm triệu chứng bệnh khi lây nhiễm bệnh nhân tạo, đặc biệt là khi xửlýdòngBP103(hình4.32). Đồng thời, khi phân tích hiệu quả giảm bệnh, kết quả (Bảng 4.27) ghi nhận cảBP11, BP49, BP103 đều có khả năng hạn chế sự gây hại từ cả ba dòngXanthomonasspp XP17, XP7, XP1 Trong đó, các nghiệm thức có xử lý dòng

BP11 hoặc BP49 đạtHQGB tương đương nhau tương ứng đạt 61,8%, 54,1% (LNB

XP17), và 66,8%, 63,6%(LNB XP7), 61,3%, 58,8% (LNB XP1) và cao hơn 1,2 đến 1,4 lần so với nghiệm thứcxửlýBP103(tươngứng73,2%,78,4%,76,1%).Nhưvậy,ởđiềukiệnngoàiđồng, xửlýdòngBP103đạthiệuquảgiảmbệnhcaonhất.

Bảng 4.27: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt của vikhuẩn đối kháng triển vọng (BP11, BP49, BP103) sau 16 NSKLN ở điều kiện ngoàiđồng.

Nghiệmthức Lây nhiễm XP17 Lây nhiễm XP7 Lây nhiễm XP1

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s *khác biệt ở mức ý nghĩa5%.ĐC:Đốichứngkhôngxửlývikhuẩnđốikhángvàkhônglâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;HQGB:Hiệu quảgiảmbệnh

Kết quảphântíchchỉsốbệnh (Bảng4.28)ở16NSKLNcho thấytất cả cácnghiệmthức đều xuất hiện vùng bị nhiễm bệnh (hay vết bệnh) Trong đó, nghiệm thức có lâynhiễm bệnh XP1 có chỉ số bệnh tương đương với nghiệm thức đối chứng không lâynhiễm bệnh Trong khi đó, chỉ số bệnh của các nghiệm thức cól â y n h i ễ m b ệ n h r i ê n g biệt với các dòng XP17, XP7, XP1 (32,4%, 20,6%, 12,6%) luôn cao hơn hẳn và khácbiệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng Điều nàychứngtỏcảbadòngvikhuẩnđốikhángđềucókhảnăngkhốngchếcácdòngXanthomonassp p.,làmgiảmmứcđộbệnhtrêncâyớt.Trongđó,ngoạitrừkhilâynhiễmbệnh với dòng XP7, dòng

BP11 đạt chỉ số bệnh tương đương với dòng BP103, thì cácnghiệm thức được xử lý BP11 hoặc BP49 lại có chỉ số bệnh tương đương nhau về ýnghĩa thống kê tương ứng đạt 10,4%, 11,6% (LNB XP17), đạt 7,9%, 8,3% (LNB XP7),và 6,8%, 7% (LNB XP1), và cao hơn so với nghiệm thức có xử lý BP103 (tương ứng7%,5,6%,4,5%).Kếtquảnàythểhiệncácdòngvikhuẩnđốikhángđềucókhảnăn gứcchếmầmbệnh,hiệuquảnhấtlàdòngBP103.

Bảng 4.28: Chỉ sốbệnh đốm lá vi khuẩntrên cây ớt và chỉ số tíchl ũ y b ệ n h t h e o t h ờ i giankhixửlývớivikhuẩnđốikhángtriểnvọng(BP11,BP49,BP103)sau16NSKLN ởđiềukiện ngoàiđồng.

Lây nhiễm XP17 Lây nhiễm XP7 L â y nhiễm XP1

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s ĐC: Đối chứng không xử lývikhuẩn đốikhánghoặclâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;AUDPC:Chỉsốtíchlũybệnhtheothờigian

Ngoài ra, phân tích chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC) của các nghiệmthức có xử lý BP11, BP49, BP103 đều ghi nhận thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thốngkê từ 1,8 đến 5,2 lần so với các nghiệm thức chỉ lây nhiễm bệnh (Bảng 4.28) Trong đó,khi lây nhiễm bệnh, các nghiệm thức có xử lý dòng BP11, hoặc BP49 có chỉ số AUDPCtương đương nhau tương ứng 117,7 đến 142,4 (LNB XP17), từ 81,9 đến 76,1 (LNBXP7), 69,7 đến 73,4 (LNB XP1) Bên cạnh đó, khi xử lý lây nhiễm dòng XP7, nghiệmthức có xử lý dòng BP49 có chỉ số AUDPC không khác biệt có ý nghĩa so với nghiệmthức xử lý BP103 Ngoài ra, khi lây nhiễm bệnh dòng XP17 hoặc XP1, nghiệm thức cóxửlýBP103cóchỉsốAUDPCthấphơntừ1,4đến1,9lầnsovớicácnghiệmthứccóxửl ýBP11hoặcBP103.Nhìnchung,ởđiềukiệnngoàiđồng,đểkiểmsoátbệnhđốmlá doXanthomonasspp trên cây ớt có thể sử dụng ba dòng vi khuẩn đối kháng BP11,BP49, BP103 vì chúng có khả năng kiểm soát mức độ bệnh, sự phát triển triệu chứngbệnhkhicósựxuấthiệncủamầmbệnh,vàđặcbiệthiệu quảkhiápdụngdòngBP103.

Hình4.32:Hiệuquảkiểmsoátbệnhcủavikhuẩnđốikhángtriểnvọng(BP103)đốivới bệnhđốmlávikhuẩntrêncâyớtởđiềukiệnngoàiđồngsau16 NSKLN.

D:NTxửlýdòngBP103trướckhilâynhiễmdòngXP17;E:NTxửlýdòngBP103trướckhilâynhiễmdòngXP7;F:NTxửlýdòng BP103trướckhilâynhiễmdòngXP1

4.4.2.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở điều kiệnngoàiđồngcủabadòngvikhuẩnđốikhángtriểnvọngtừvùngsinhthái bảnđịa Ở điều kiện ngoài đồng có sự lây nhiễm bệnh nhân tạo, khảo sát đánh giá hiệu quảkiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng bản địa triển vọng G24, T11, T188 đốivới ba dòngXanthomonasspp XP17, XP7, XP1 gây bệnh đốm lá trên cây ớt đã đượctiến hành nhằm tìm ra dòng vi khuẩn đối kháng có hiệu quả cao nhất Kết quả được ghinhận và đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh qua tỷ lệ bệnh, hiệu quả giảm bệnh, chỉ sốbệnh và chỉ số AUDPC Trong đó, dòng G24 được ghi nhận có khả năng kiểm soát bệnhcao nhất.

Kết quả đánh giá (Bảng 4.29) ghi nhận tại thời điểm 16 NSKLN, các nghiệm thứcđều có sự xuất hiện triệu chứng bệnh kể cả nghiệm thức đối chứng không lây nhiễmbệnh Điều này chứng tỏ, tại khu vực trồng cây ớt đã có áp lực về nguồn bệnh.Đồngthời, các nghiệm thức có xử lý vi khuẩn đối kháng (G24, T11, T188) kết hợp lây nhiễmbệnhđềucót ỷ lệbệnh t h ấ p hơnsovớinghiệmthứcđốichứnghoặccácnghiệmt hức chỉ lây nhiễm bệnh Bên cạnh đó, khi lây nhiễm bệnh dòng XP7, và XP1, các nghiệmthức được xử lý vi khuẩn đối kháng G24, T11, T188 được ghi nhận có tỷ lệ bệnh tươngđương nhau về ý nghĩa thống kê, dao động từ 8,7% đến 12,5% (LNB XP7), từ 5,4% đến8,6% (LNB XP1) Đối với các nghiệm thức có lây nhiễm XP17, khi được xử lý dòngT188 đã được ghi nhận có tỷ lệ bệnh (14,8%) tương đương T11 (17,1%), và không khácbiệt với tỷ lệ bệnh khi có xử lý dòng G24 (9,5%) Kết quả này cho thấy việc xử lý cácdòng vi khuẩn đối kháng có khả năng giúp giảm triệu chứng bệnh khi lây nhiễm bệnhnhântạo. Đồng thời, khi phân tích hiệu quả giảm bệnh, kết quả ghi nhận cả ba dòng G24,T11, T188 đều có khả năng hạn chế sự gây hại từ cả ba dòngXanthomonasspp.

XP17,XP7, XP1 Trong đó, kết quả phân tích hiệu quả giảm bệnh của các nghiệm thức cóx ử lý dòng T11 hoặc T188 ghi nhận các dòng này có hiệu quả tương đương nhau về ý nghĩathốngkê,tương ứngtừ63,4%,68,2%(LNBXP17),từ68,9%,65,2% (LNBXP7),vàkhi lây nhiễm dòng XP1 thì hiệu quả giảm bệnh dao động từ 62,4%, 61,2% (Bảng 4.29).Bên cạnh đó, nghiệm thức có xử lý dòng G24 thể hiện hiệu quả giảm bệnh cao nhất vàkhác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm có xử lý hai dòng vi khuẩn đối khángcòn lại, với hiệu quả giảm bệnh lần lượt đạt 79,8%, 75,8%, 75,3% tương ứng khi lâynhiễmcácdòngXP17,XP7,XP1.

Bảng4.29:Tỷlệbệnhvàhiệuquảgiảmbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyớtcủavikhuẩn đốikhángtriểnvọng(G24,T11,T188)sau16NSKLNởđiềukiệnngoàiđồng.

Nghiệm Lâynhiễm XP17 Lâynhiễm XP7 Lâynhiễm XP1 thức Tỷlệ bệnh(%)

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s ĐC: Đối chứng không xử lývikhuẩnđốikhángvàkhônglâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;HQGB:Hiệuquảgiảm bệnh

Kếtqu ả phânt í c h c h ỉ sốb ệ n h ( B ả n g 4.30)ở 16NS K L N c h o t ấ t c ảc ác nghiệm thức đều xuất hiện vùng bị nhiễm bệnh Trong đó, chỉ số bệnh của các nghiệm thức cólây nhiễm bệnh riêng biệt với các dòng XP17, XP7, XP1 (29,9%, 21,8%, 13,2%) luôncao hơn hẳn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (12,5%) vàcácn g h i ệ m t h ứ c c ó x ử l ý v i k h u ẩ n đ ố i k h á n g Đ i ề u n à y c h ứ n g t ỏ c ả b a d ò n g v i k h u ẩ n đốikhángđềucókhảnăngkhốngchếvikhuẩnX a n t h o m o n a s spp.,làmgiả mmứcđộ

T11 17,1 c 63,4 B 11,2 c 68,9 B 8,1 b bệnh trên cây ớt Khi lây nhiễm bệnh dòng XP17 hoặc XP1, Nghiệm thức được xử lýT188 lại có chỉ số bệnh tương đương các nghiệm thức khi được xử lý T11, dao độngtương ứng từ 8,7% đến 10,3% (LNB XP17), từ 5,7% đến 6,3% (LNB XP1) nhưng lạikhông khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức có xử lý dòng G24 (tương ứng 6,7%,3,5%) Trong khi đó, khi lây nhiễm dòng XP7, các nghiệm thức có xử lý các dòng vikhuẩn đối kháng G24, T11, T188 đều có chỉ số bệnh tương đương nhau (lần lượt là5,5%; 6,4%; 7,5% Kết quả này thể hiện dòng G24 có khả năng ức chế mầm bệnh triểnvọngnhấtkhitiến hànhlâynhiễmbệnh nhântạoởđiềukiện ngoàiđồng(hình4.33).

Bảng4.30:ChỉsốbệnhđốmlávikhuẩntrêncâyớtvàAUDPCkhixửlývớivikhuẩn đốikhángtriểnvọng(G24,T11,T188)sau16NSKLNởđiềukiệnngoàiđồng.

LâynhiễmXP17 Lâynhiễm XP7 Lây nhiễm XP1 Nghiệmthức

Ghi chú: Các số trung bình trong một cột được theo sau bởi một hoặc những chữ giống nhau in thường hoặc inhoa thì không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Tukey’s ĐC: Đối chứng không xử lývikhuẩn đốikhánghoặclâynhiễmbệnh;LNB:Chỉlâynhiễmbệnh;AUDPC:Chỉsốtíchlũybệnhtheothờigian

Kếtluận

PhânlậpvàxácđịnhđượccácdòngvikhuẩnXanthomonasspp.g âybệnhđốmlátrêncâyhoahồnggiốnghồnglửa(Rosaspp.) và câyớt(Capsicumspp.) 120 5.1.2 Tuyểnc h ọ n đ ư ợ c n h ữ n g dòngv i k h u ẩ n c ó kh ản ăn g k i ể m s o á t

Với các triệu chứng bệnh điển hình, 20 dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá được thuthập và phân lập từ các vườn hoa hồng và 20 dòng từ các vườn ớt trong tỉnh Đồng Tháp.Trongđó,dòngXR13,XR9,XR18 đượcghi nhậngây bệnh đốml á v ớ i m ứ c đ ộ c a o nhất, trung bình và thấp nhất trên cây hoa hồng Bên cạnh đó, dòng XP17, XP7, XP1 cómức độ gây bệnh đốm lá cao nhất, trung bình và thấp nhất trên cây ớt Dựa trên kỹ thuậtphân tích MALDI-TOF- MSvàk ỹ t h u ậ t M L S A đ ã g h i n h ậ n d ò n g v i k h u ẩ n g â y b ệ n h đốm lá trên cây hoa hồng tại Làng hoa Sa Đéc tỉnh Đồng Tháp thuộc loàiXanthomonaseuvesicatoria.Trong khi đó, dòng vi khuẩn gây bệnh đốmlá trênc â y ớ t đ ư ợ c x á c đ ị n h làXanthomonasspp dựa trênđặc điểmsinhhóa.

5.1.2 Tuyểnchọn đượcnhững dòng vi khuẩn có khản ă n g k i ể m s o á t b ệ n h đ ố m l á vikhuẩndo Xanthomonasspp gâyra

203 dòng vi khuẩn (từ BR1 đến BR203) đã được phân lập từ cơ chất vùng rễ câyhoa hồng Sàng lọc khả năng đối khángin vitrođã tuyển chọn được ba dòng (BR16,BR37, BR88) thể hiện sự đối kháng triển vọng cao nhất với cả ba dòng gây bệnh (XR13,XR9, XR18) Bên cạnh đó, 253 dòng vi khuẩn vùng rễ đã được phân lập từ các mẫu đấtvùng rễ cây ớt tại tỉnh Đồng Tháp (từ BP1 đến BP 253) Trong đó, ba dòng BP11, BP49và BP103 đối khángin vitrocao nhất đối với vi khuẩn gây bệnh (XP17, XP7, XP1).Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh bệnh đốm lá vi khuẩn ở điều kiện nhà lưới và ngoàiđồng đã tuyển chọn được dòng BR88(trênc â y h o a h ồ n g ) v à d ò n g B P 1 0 3 ( t r ê n c â y ớ t ) cókhảnăngkiểmsoátbệnhnhất. Đồng thời, 543 dòng vi khuẩn đã được phân lập từ ba vùng sinh thái bản địa tỉnhĐồng Tháp là Vườn Quốc gia Tràm Chim (T1 đến T303), Khu du lịch sinh thái GáoGiồng (G1 đến G138), Khu di tích lịch sử văn hóa Xẻo Quýt (X1 đến X102) Qua sànglọc khả năng đối khángin vitroghi nhận ba dòng T265, X61, G24 có triển vọng nhấttrong việc ức chế vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng, và ba dòng G24, T11,T188 có khả năng ức chế cao nhất đối với vi khuẩngây bệnh đốmlá trênc â y ớ t

Q u a các thí nghiệm ngoài nhà lưới và ngoài đồng đã ghi nhận dòng G24 cho hiệu quả kiểmsoátbệnhcaonhất.

Qua kỹ thuật MALDI-TOF-MS, một số dòng được xác định đến loài như BP49,X61 (loàiB subtilis), được xác định đến chi như BR16, BR37, BR88, BP11, BP49,BP103, X32, X61, G24 (thuộc chiBacillus), dòng T11 (thuộc chiEnterobacter),dòngX16 (thuộc chiSerratia) Các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được xác định qua kỹthuậtp h â n t í c h s i n h h ọ c p h â n t ử n h ưB v e l e z e n s i s M W 6 7 7 5 6 5( B R 1

MW828613(BR37),B.amyloliquefaciensMW828656(BR88),X a n t h o m o n a s veleze nsisOM017175(BP103),PaenibacilluselgiiMZ841643(T265),B.subtilisMZ841644 (G24) Các dòng này có thể được sử dụng như tác nhân kiểm soát bệnh đốmlávikhuẩntrêncâyhoahồngvàcâyớt.

Trongtươnglai,cóthểtiếptụckhảosátsựđadạngditruyềncủatấtcảcácdòngvi khuẩn đã được phân lập, cũng như xác định phân dòng (race) Ngoài ra, các đặc điểmliên quan hiệu quả kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn cần đượckhảo sát, hướng đến nghiên cứu phối hợp các dòng này trong việc kiểm soát mầm bệnhđốmlátrêncâytrồng.

(2015)EfficacyofBacillussubtilisQST713formulations,copperhydroxide,andtheirta nkmixesonbacterialspotoftomato.CropProtection,74:70-76.https://doi org/

(2008)IntegrationofPseudomonasfluorescensand acibenzolar-S-methyl to control bacterial spot disease of tomato.CropProtection,27:1118-

Adesemoye, A O., Torbert, H A., & J W Kloepper (2009) Plant growth- promotingrhizobacteria allow reduced application rates of chemical fertilizers.MicrobialEcology, 58:921-929.

Ahemad,M.,&Kibret,M.(2014)Mechanismsandapplicationsof plantgrowthpromotingrhizobacteria:Currentperspective.JournalofKing S audU n i v e r s i t y

Schuenzel, E.L., Lacy, G.H , Sun, X.A., Jones, J.B., Castillo, J.A., Bull,

C(eds)Mechanismsofresistancestoplantdiseases.KluwerAcademicPublishers,Do rdrecht,pp21-52.

Araújo,E.R.,Pereira,R.C.,Ferreira,M.A.S.V.,Quezado-Duval,A.M.,&Café-Filho,

A.C (2012) Sensitivity of xanthomonads causing tomato bacterial spot to copperand streptomycin and in vivo infra-specific competitive ability inXanthomonasperforansresistant and sensitive to copper.Journal of Plant Pathology, 94 (1),79-87.

Bale, J.S., Van-Lenteren, J.C., Bigler F (2008) Biological control and sustainable foodproduction.PhilosTransRSocLondBBiolSci363:761-776.https://doi.org/ 10.1098/rstb.2007.2182

Balouiri, M., Sadiki, M., & Ibnsouda, S K (2016) Methods for in vitro evaluatingantimicrobialactivity:Areview.Journal ofPharmaceuticalAnalysis.6:71-79

Berg, G., & Smalla, K (2009) Plant species and soil type cooperatively shape thestructureandfunctionofmicrobialcommunitiesintherhizosphere.FEMSMicrobi ologyEcology,68:1–13.

Berg,G., Roskot,N., Steidle, A.,Eberl, L., Zock,A., &Smalla,K.(2002) Plantdependentgenotypicandphenotypicdiversity ofantagonisticRhizobacteriaisolatedfromdifferentVerticilliumhost plants.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,68:3328–3338

Berg,G.,Krechel,A.,Ditz,M.,Faupel,A.,Ulrich,A.,&Hallmann,J.

Berg, G., Opelt, K., Zachow, C., Lottmann, J., Gotz, M., Costa, R., & Smalla, K. (2006)The rhizosphere effect on bacteria antagonistic towards the pathogenic fungusVerticilliumdiffersdependingonplantspeciesandsite.FEMSMicrobiolEcolog y,56:250–261.

Bhattacharyya, P.N., Goswami, M.P., Bhattacharyya, L.H (2016) Perspective of beneficialmicrobesinagricultureunderchangingclimaticscenario:areview.JPhytol,8:26- 41.https://doi org/10.19071/jp 2016.v8.3022

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (1995) Chất lượng đất – lấy mẫu – yêu cầuchung-TCVN5297:1995.HàNội. http://tieuchuan.mard.gov.vn/ViewDetails.aspx? idq29&lv=3&cap=1 ( N g à y cập nhật 30/1/2017)

BộNôngnghiệp vàPháttriểnnôngthôn (2010)Quychuẩn kỹthuậtquốc gia vềphươngpháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng - QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT, HàNội. http://tieuchuan.mard.gov.vn/ViewDetails.aspx? ida73&lv=2&cap=3 ( N g à y c ậ p nhật 30/1/2017)

Burgess, L W., Knight, T E., Tesoriero, L., & Hiền, P.T (2009)Cẩm nang chẩn đoánbệnhcây ởViệtNam.ChuyênkhảoACIAR,129a:210.

Chithrashree, Udayashankarb, A.C., Chandra Nayaka, S., Reddy, M.S., & Srinivasa, C. (2011)Plantgrowth-promotingrhizobacteriamediateinducedsystemicresistance in rice against bacterial leaf blight caused byXanthomonas oryzaepv.oryzae.B i o l o g i c a l Control5 9 : 1 1 4 - 1 2 2 https://doi.org/10.101 6/).biocontrol

Cúc,N.T.T.& Thủy,T.T.T (2014)Dịchhạitrênhoahồng, cúc,mai,vạnthọ.NXB ĐạihọcCầnThơ,p117.

Daungfu, O., Youpensuk, S., Lumyong, S (2018) Endophytic bacteria isolated fromCitrus plants for biological control of citrus canker in lime plants Tropical lifesciences research online https:// www.tlsr.usm.my/tlsr29032018/29032018_EV05.pdf Accessed 07 July 2018

Dewdney,M.M.,Graham,J.H.(2017)2017-2018Floridacitrusproductionguide.Citrus canker Institute of Food and Agricultural Sciences University of Florida.https://ccms.farmjournal.com/sites/default/files/inline- files/ 2017_FLCitrusPestGuide.pdf

El-Hendawy,H.H.,Osman,M.E.,&Sorour,N.M.(2005)Biologicalcontrolo f bacterial spot of tomato caused byXanthomonas campestrispv.vesicatoriabyRahnellaaquatilis.Microbiological Research, 160:343—352.

Fira, D., Dimkic, I., Beric, T., Lozo, J., & Stankovic, S (2018) Biological control ofplantpathogensbyBacillusspecies.JournalofBiotechnology,285:4455.https:// doi.org/10.1016/j.jbiotec.2018.07.044

Furnkranz, M., Muller, H., Berg, G (2009) Characterization of plant growth promotingbacteriafromcropsinBolivia.JournalofPlantDiseasesandProtection,11 6(4):149–155.

Gade, R.M., & Lad, R (2018) Biological management of major citrus deseases inCentral India—a review.International Journal of Current Microbiology andApplied Sciences,6:296-308.

Gamalero, E., Berta, G., & Glick, B R (2009)The use of microorganisms to facilitatethegrowthofplantsinsalinesoils.In:Khan,M.S.,Zaidi,A.,Musarrat,J.

(Eds.),MicrobialStrategiesforCropImprovement.Springer,Berlin,Heidelberg.

Ghazalibiglar, H., Hampton, J.G., Jong, E.Z., & Holyoake, A (2015) Enhanced growthof cabbage seedlings by aPaenibacillusisolate in the presence ofXanthomonascampestrispv.campestris.NewZealandPlantProtectionSocie ty,68:173-178.

(2016)IsinducedsystemicresistancethemechanismforcontrolofblackrotinBra ssicaoleracea byaPaenibacillussp.?BiologicalControl,92:195-201.https://doi.org/10.1016/ j.biocontrol.2015.10.014

Gerhardson, B (2002) Biological substitutes for pesticides.Trends Biotechnol, 20:338– 343.

Gholami,D.,Aminzadeh,S , Alavi,S M , Kazemipour,N ,Ghoroghi,A.,&Emruzi,

Z (2018) Comparison of antibiotics and bacteriocins antibacterial activity onXanthomonas citrisubsp.citri.Iranian Journal of Fisheries Sciences17:162- 178.https://doi.org/10.22092/ijfs.2018.115592

(2012)Lipids,LipophilicComponentsandEssentialOilsfromPlantSources.Sprin gerScience BusinessMedia,p992

Halfeld-Vieira, B.A., Silva, W.L.M., Schurt, D.A., Ishida, A.K.N., Souza, G.R.,

&Necheta, K.L (2015) Understanding the mechanism of biological control ofpassionfruit bacterial blight promoted by autochthonous phylloplane bacteria.BiologicalControl,80:40-49.https ://doi.org/10.1016/j.biocontr ol.2014.09.011

S c h n e i d e r , C., Hong, J., Jones, J.B., Ong, K., & Norman, D.J (2013) A novelXanthomonassp.causes bacterialspotofrose(Rosaspp.).PlantDis97:1301-

HuangT.-P.,Amy,D.D.S.,Wong,C L.,Chen, C.H.,Lu,K.-M.,Lee,Y.-H.,Huang, W.-D.,Hwang,B.F.,&Tzeng,K.-C.(2012)DNAPolymorphismsandbiocontrol ofBacillusantagonistic to citrus bacterial canker with indication oftheinterferenceofphyllospherebiofilms.PLoSONE,7(7):e42124.https://doi.org/ 10.1371/journal.pone.0042124

Hungria, M.,Campo, R.J.,Souza, E.M.,& Pedrosa,F.O.(2010)Inoculationwithselected strains of Azospirillum brasilense and A lipoferum improves yields ofmaizeandwheatinBrazil.PlantSoil,331:413-425.

Hungria, M., Nogueira, M A., & Araujo, R.S (2013) Co-inoculation of soybeans andcommonbeanswithrhizobiaandazospirilla:Strategiestoi m p r o v e sustainabi lity.BiologyandFertilityofSoils,49:791-801.

Jeger, M.J., & Viljanen-Rollinson, S.L.H (2001) The use of the area under the disease- progresscurve(AUDPC)toassessquantitativediseaseresistanceincropcultivars.Th eoriticalandAppliedGenetic,102(1):32-40.

Ji, G.H., Wei, L.F., He, Y.Q., Wu, Y.P., & Bai, X.H (2008) Biological control of ricebacterialblightbyLysobacterantibioticusstrain13-

1.BiologicalControl,45:288-296.https://doi.Org/10.1016/ j.biocontrol 2008.01.004

Jones,J.B.,Lacy,G.H.,Bouzar,H.,Stall,R.E.,&Schaad,N.W.

(2004)Reclassificationofthexanthomonadsassociatedwithbacterialspotdiseaseofto matoa n d pepper.SystematicandAppliedMicrobiology,27:755-762.https:// doi.org/10.1078/0723202042369884

Kang, J G., Shin, S.Y., Kim, M.J., Bajpai, V., Maheshwari, D.K., & Kang, S.C. (2004)Isolation and antifungal activities of 2-hydroxy methyl chroman 4-one producedbyBurkholderiasp.MSSP.y).TheJournalofAntibiotics,57:1-6.

(2008)E v a l u a t i o n o f pseudomonads bacterial isolates in biological control of citrus bacterial cankerdisease.International Journal of Agricultural Research, 3(4):268-272.https:// doi.org/10.3923/ijar.2008.268.272

(2012)MicrobialCH4andN2Oconsumptionina c i d i c wetlands.FrontierinMicro biol 3:78.

Korner, C (2000) Biosphere responses to CO2enrichment.Ecological

Xanthomonas euvesicatoriaCauses Bacterial Spot Disease on Pepper Plant inKorea.PlantPathol.J.32(5):431-440.

Lamers,L.P.M.,VanDiggelen,J.M.H.,OpDenCamp,H.J.M.,Visser,E.J.W.,Lucassen,E.C. H.E.T.,&Vile,M.A.(2012)Microbialtransformationsofnitrogen, sulfur, and iron dictate vegetation composition in wetlands: a review.Frontier inMicrobiol,3:156.

Lanna-Filho, R., Romeiro, R.S., & Alves, E (2010) Bacterial spot and early blightbiocontrolbyepiphyticbacteriaintomatoplants.PesquisaAgropecuáriaBrasi leira45:1381-1387.https://doi.org/10.1590/S0100-204X2 0 1 0 0 0 1 2 0 0 0 0 7

Lanna-Filho, R., Souza, R.M., Magalhães, M.M., Villela, L., Zanotto, E , Ribeiro- Júnior, P.M., & Resende, M L.V (2013) Induced defense responses in tomatoagainst bacterial spot by proteins synthesized by endophytic bacteria.TropicalPlantPathology,38:295-302.https://doi.org/10.1590/S1982- 56762013005000011

Le,D.K.,Kim,J.,Yu,N.H.,Kim,B.,Lee,C.W.,&Kim,J.C.(2020)BiologicalControlof Tomato Bacterial Wilt, Kimchi Cabbage Soft Rot, and Red Pepper BacterialLeaf Spot UsingPaenibacillus elgiiJCK-5075.Frontiers in Plant Science,

Li, B., Xie, G L., & Swings, J (2006) First report of leaf spot caused byXanthomonascampestrisonpoinsettiainChina.Plant Pathol,55,293

Li, B., Xu, L.H., Lou, M.M., Li, F., Zhang, Y.D., & Xie, G.L (2008) Isolation andcharacterization of antagonistic bacteria against bacterial leaf spot of Euphorbiapulcherrima.LettersinAppliedMicrobiology,46:450–455.

Li, S.B., Fang, M., Zhou, R.C., & Huang, J (2012) Characterization and evaluation ofthe endophyteBacillusB014 as a potential biocontrol agent for the control ofXanthomonas axonopodispv.dieffenbachiae—

InducedblightofAnthurium.BiologicalControl,63:9-16.https://doi.org/

Liu, K., Garret, C., Fadamiro, H., & Kloepper, J.W (2016) Antagonism of black rot incabbagebymixtureofplantgrowth- promotingr h i z o b a c t e r i a ( P G P R ) BiologicalControl,61:605-

Liu, K., McInroy, J.A., Hu, C.H., & Kloepper, J.W (2018) Mixtures of plant- growth- promoting Rhizobacteria enhance biological control of multiple plant diseasesandplant- growthpromotioninthepresenceofpathogens.PlantDisease,102:67-72.https:// doi.org/10.1094/ PDIS-04-17-0478-RE

Lovell, C.R., & Davis, D.A (2012) Specificity of salt marsh diazotrophs for vegetationzonesandplanthosts:resultsfromaNorthAmericanmarsh.FrontierinMic robiol, 3:84.

Lộc,V.T.T.,An,N.T.T.,Son,N.P.,Thọ,H.H.,Kiệt,T.H.V.T.,Huôn,L.,&Giang,L.T.

Maheshwari, D.K (editor) (2012)Bacteria in Agrobiology: Plant Probiotics, Springer-VerlagBerlinHeidelberg,p371

Marasco, R., Rolli, E., Ettoumi, B., Vigani, G., Mapelli, F., & Borin, S (2012) Adroughtresistance- promotingmicrobiomeisselectedbyrootsystemu n d e r desert farming PLoS ONE, 7:e48479 https

Marcuzzo, L.L (2009) Aspectos epidemiológicos de sobrevivencia e de ambiente nogeneroXanthomonas.Agora:RDivulgCient,16:13-19.https://doi.org/10.24302/ agora.v16i1.3

(2008)Biologicalcontrolof bacterialspotdiseaseof pepper withBacillusstrains.Turkish Journal of Agriculture and Forestry,32:381-390

Mishra, S., & Arora, N.K (2012) Evaluation of rhizosphericPseudomonasandBacillusas biocontrol tool forXanthomonas campestrispvcampestris World Journal ofMicrobiology and Biotechnology,

Monteiro, L., Mariano, R.L.R., & Souto-Maior, A.M (2005) Antagonism of Bacillusspp.againstXanthomonascampestrispv.campestris.BrazilianArchivesofB iologyandTechnology,48(1):23-29.https://dx.doi.org/10.1590/S1516-

Murate, L.S., de Oliveira, A.G., Higashi, A.Y., Barazetti, A.R., Simionato, A.S., daSilva,C.S.,Simões,G.C.,Santos,I.M.O, Ferreira,M.R.,Cely,M.V.T., Navarro, M.P.,Duin,V.F.F.,Nogueira,M.,Mello,J.C.P.,Leite,R.,&Andrade,G.

Sciences,06: 295-303. http://dx.doi.org/10.4236/as.2015.63030.

B a c t e r i a l s p o t of tomato caused byXanthomonas perforans, a new disease in Korea.Plant Dis.93:1349.

Myung,I.-S.,Yoon, M.-J., Lee,J.-Y.,Kim, Y S.,Kwon, J.-H., Lee,Y.-K.,& Shim, H. S.

(2015)BacterialSpotofHotPepper,CausedbyXanthomonaseuvesicatoria,aNe wDiseaseinKorea.PlantDisease,99(11):150609065107006.https://doi.org/10.1094/PDIS-02- 15-0229-PDN

Neelja, S., Manish, K., Pawan K K., & Jugsharan S V (2015)MALDI-TOF massspectrometry:anemergingtechnologyformicrobialidentificationa n d diagno sis.FrontiersinMicrobiology,6:791.doi:10.3389/fmicb.2015.00791

Oanh, P.T.T (2020) Research on production of environmentally friendly antagonisticmicroorganismsi n t h e p r e v e n t i o n o f r i c e b l i g h t d i s e a s e f o r a g r i c u l t u r a l production in vietnam,TNU Journal of Science and Technology, 225(05): 77 – 83.

Obradovic, A., Mavridis, A., Rudolph, K., Janse, J.D., Arsenijevic, M., Jones, J.B.,Minsavage, G.V., & Wang, J.F (2004) Characterization and PCR-based typingof Xanthomonas campestris pv vesicatoria from peppers and tomatoes in Serbia.EuropeanJournalofPlantPathology,110:285–292.

(2005)RhizospherecompetentPseudomonasaeruginosaGRC1p r o d u c e s c h a r a c t e r i s t i c siderophores andenhancesgrowth of Indian mustard(Brassicacompestris).Curr.Microbiol.51(5):303-309.

Paul, L.E B., Peter, F., Harold, L D., Thomas, H., Kirsten, K., Charles, L., Patrick, M.,Barbara,R.-H.,&Brian,S.

Peitl, D.C., Araujo, F.A., Gonỗalves, R.M., Sumida, C.H., Balbi-Peủa, M.I. (2017)Biologicalcontroloftomatobacterialspotbysaprobefungifromsemi- aridareasofnortheasternBrazilSemina.CienciasAgrarias,38:1251-1263.https:// doi.org/10.5433/1679- 0359.2017v38n3p1251

Pernezny, K., Davis, R.M., & Monol, T (2012)Management of important bacterialdiseases.In:DavisRM,PerneznyKL,BroomeJC.

(ed.).Tomatohealthmanagement.AmericanPhytopathologicalSociety,SaintPaul,p p103-112.https://doi.org/10.1094/9780890544884.011

Pester, M., Knorr, K.-H., Friedrich, M W., Wagner, M., & Loy, A (2012) Sulfate- reducing microorganisms in wetlands – fameless actors in carbon cycling andclimatechange.FrontierinMicrobiol, 3:72.

Ponnamperuma,F.N.(1984)Effectsoffloodingonsoils.In: KozlowskiTT (ed)Floodingandplantgrowth.Academic,NewYork,p9–45.

Potnis, N., Timilsina, S., Strayer, A., Shantharaj, D., Barak, J.D., Paret, M.L., Vallad,G.E.,&Jones,J.B.,

(2015)Bacterialspotoftomatoandpepper:diverseXanthomonasspecieswithawidev arietyofvirulencefactorsposingaworldwidechallenge.MolecularPlantPathology, 16:907-920.https://doi.org/10.1111/mpp.12244

Príncipe, A., Fernandez, M., Torasso, M., Godino, A., & Fischer, S (2018) Effec- tiveness of tailocins produced byPseudomonas fluorescensSF4c in controllingthebacterial- spotdiseaseintomatoescausedbyX a n t h o m o n a s vesicatoria.

Microbiological Research, 212-213:94-102. https://doi org/10.1016/j.micres.2018.05.010

Ribeiro, C.M.C., De Souza, G.R., Schurt, D.A., & Halfeld-Vieira, B.A (2017) Pyo- verdineuseforthecontrolofpassionfruitbacterialblight.PesquisaAgropecuáriaB r a s i l e i r a.52:956-959 https://doi.org/10.1590/S0100- 204X2

Ribeiro, D.G., Carmo L.S.T., Santos I.R., Almeida R.F., Silva L.P., Oliveira-Neto O.B.,Scherwinski-PereiraJ.E.,&MehtaA.(2019)MALDITOFMS- profiling:Applicationsforbacterialandplantsampledifferentiationandbiologicalva riabilityassessment.JournalofProteomics,213:103619.https://doi.org/10.1016/ j.jprot.2019.103619

Roberts, P D., Berger, R.D., Jones, J.B., Chandler, C.K., & Stall, R.E (1997) Diseaseprogress, yield loss, and control ofXanthomonas fragariaeon strawberry plants.PlantDisease 81:917-921.

Robison H.L., Schwartz, C.C., Petty, J.D., & Brussard, P.F (2006) Assessment ofpesticide residues in army cutworm moths (Euxoa auxiliaries) from the greaterYellowstoneecosystemandtheir potential consequences toforaging grizzlybears(Ursus arctos horribilis).Chemosphere,64:1704–1712

Rodriguez-R,L.M.,Grajales,A.,Arrieta-Ortiz,M.L.,Salazar,C.,Restrepo,S.,&Berna, A (2012) Genomes-based phylogeny of the genusXanthomonas BMCMicrobiology,12:1- 14.https://doi org/10.1186/1471-2180-12-43

Ryan, R.P., Vorhửlter, F.-J., Potnis, N., Jones, J.B., Sluys, M.-A.V., Bogdanove, A.J.,& Dow, J.M (2011) Pathogenomics of Xanthomonas: understanding bacterium-plantinteractions.NatureReviewsMicrobiology,9:344-355.

Schaad, N.W., Jones, J.B., & Chun, W (2001)Laboratory Guide for Identification ofPlant Pathogenic Bacteria, 3 rd edn St Paul, M.N.: American PhytopathologicalSociety.

Senthilkumar, M., Swarnalakshmi, K., Govindasamy, V., Lee, Y.K., & Annapurna, K.

(2009) Biocontrol potential of soybean bacterial endophytes against charcoal rotfungus,Rhizoctoniabataticola.CurrentMicrobiology,58:288–293.

Singh, D., Dhar, S., & Yadav, D.K (2010) Effect of endophytic bacterial antagonistsagainst black rot disease of cauliflower caused byXanthomonas campestrispv.campestris.IndianPhytopathol,63(2):122-126.

Smith, K.P., & Goodman, R.M (1999) Host variation for interaction with beneficialplantassociatedmicrobes.AnnuRevPhytopathol,37:473–491

Strejcek, M., Smrhova, T., P Junkova & Uhlik, O (2018) Whole-Cell MALDI- TOFMS Versus 16S rRNA Gene Analysis for Identification and Dereplication ofRecurrentBacterialIsolates.FrontiersinMicrobiology,9:1294.https://doi.org/ 10.3389/fmicb.2018.01294

Sundin, G.W., Castiblanco, L.F., Yuan, X., Zeng, Q., & Yang, C (2016) Bacterialdisease management: challenges, experience, innovation and future prospects.MolPlantPathol,17:1506-1518.https://doi.org/10.1111/ mpp.12436

Szekeres, A., Kredics, L., Antal, Z., Kevei, F., & Manczinger, L (2004) Isolation andcharacterization of protease overproducing mutants of Trichoderma harzianum.FEMSMicrobiologyLetters,233:15–222.

Thước, T.L (2007)Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước và mỹ phẩm. NXBGiáo dục:p235

Trung, T.T., Vân, Đ.T.T., Liên, N.P Lương, Đ.T., & Hợp, D.V (2017) Tiềm năng ứngdụng tạo chế phẩm làm phân bón hữu cơ sinh học từ các dòng vi khuẩnBacillusvelezensisphân lập từ các vùng sinh thái khác nhau tại việt nam;Tạp chí CôngnghệSinhhọc15(1):169-179.

Vauterin, L.,Rademaker, J.,&Swings,J (2000)Synopsison thetaxonomyofthegenus

P r e l i m i n a r y s t u d i e s for controlling bacterial spot in low-chill peaches.Proceedings of the

Whipps, J (2001) Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere.Journal ofExperimentalBotany,52:487–511

Zaidi, A., Khan, M.S., Ahemad, M., & Oves, M (2009) Plant growth promotion byphosphatesolubilizingbacteria.ActaMicrobiologicaetImmunologicaHungaric a, 56: 263–284.

Zeriouh, H., Romero, D., García-Gutiérrez, L., Cazorla, F.M., Vicente, A., & Pérez-

García, A (2011) The iturin-like lipopeptides are essential components in thebiologicalcontrolarsenalofBacillussubtilisagainstbacterialdiseasesofcucurbits.MPMI24:1540-1552.https://doi.org/10.1094/ MPMI-06-11-0162

PHỤLỤC PHỤCLỤC1 CÁCKẾTQUẢPHÂNTÍCHSINHHỌCPHÂNTỬ,VÀMALDI-TOF-MS

1 KếtquảBLASTNtrìnhtựsáugen housekeeping(fus A, gap 1, glt A, gyr B, lac F, lep A)củadòng Xa nthomonasaxonopodisXR13 gâybệnhtrêncâyhoahồng

3.1 Phân tích cácdòng vi khuẩn XR13, XR18,XR9,BP11,BR88,BP49,BR16,T11, T265,X32, X61,X16, G24(từtrangviiđếntrangxxiii)

) XR13 Xanthomonasax onopodis 2.042 Xanthomonasper forans 1.942

) XR18 Xanthomonasax onopodis 2.002 Xanthomonasper forans 1.999

) XR9 Xanthomonasax onopodis 2.12 Xanthomonasper forans 2.037

D2(+)(B) BP11 Bacillus subtilis 1.988 Bacillus subtilis 1.984

D3(+)(B) BR88 Bacillus moj avensis 1.7 not reliableidentifi cation

D4(++)(A) BP49 Bacillus subtilis 2.054 Bacillus subtilis 1.988

D6(+)(B) BR16 Bacillus v allismortis 1.775 Bacillus subtilis 1.733

D8(+)(B) T11 Enterobacterradi cincitans 1.726 not reliableidentifi cation

D9(+)(B) T265 Salmonella sp 1.681 not reliableidentifi cation

Speciesofthisgenushaveverysimilarpatterns: Therefore distinguishing their species isdifficult.

BacillusacidicolaDSM14745TDSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedegr eeofsporulation:Usefreshmaterial.

BacillusatrophaeusDSM2277DSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedeg reeofsporulation:Usefreshmaterial.

BacillusatrophaeusDSM5551DSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedegr eeofsporulation:Usefreshmaterial.

BacillusatrophaeusDSM675DSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedegr eeofsporulation:Usefreshmaterial.

BacillusatrophaeusDSM7264TDSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedegr eeofsporulation:Usefreshmaterial.

BacillusflexusDSM1320TDSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedegr eeofsporulation:Usefreshmaterial.

BacillusmojavensisDSM9205TDSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedegr eeofsporulation:Usefreshmaterial.

BacillusrurisDSM17057TDSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedegr eeofsporulation:Usefreshmaterial.

BacillussonorensisDSM13779TDSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedegr eeofsporulation:Usefreshmaterial.

Bacillussubtilis107_W_7_QSAIBS is a member of Bacillus subtilis group.

Thequality ofspectra(score)dependsonthedegreeofspor ulation:Usefreshmaterial.

BacillussubtilisDSM5552DSM is a member of Bacillus subtilis group.

Thequality ofspectra(score)dependsonthedegreeofspor ulation:Usefreshmaterial.

BacillussubtilisDSM5611DSM is a member of Bacillus subtilis group.

Thequality ofspectra(score)dependsonthedegreeofspor ulation:Usefreshmaterial.

DSM15029T BRB is a member of Bacillus subtilis group.

Thequality ofspectra(score)dependsonthedegreeofspor ulation:Usefreshmaterial.

DSM15029TDSM is a member of Bacillus subtilis group.

Thequality ofspectra(score)dependsonthedegreeofspor ulation:Usefreshmaterial.

DSM is a member of Bacillus subtilis group.

Thequality ofspectra(score)dependsonthedegreeofspor ulation:Usefreshmaterial.

M is a member of Bacillus subtilis group.

Thequality ofspectra(score)dependsonthedegreeofspor ulation:Usefreshmaterial.

M is a member of Bacillus subtilis group.

Thequality ofspectra(score)dependsonthedegreeofspor ulation:Usefreshmaterial.

BacillusvallismortisDSM11031TDSM Thequalityofspectra(score)dependsonthedegr eeofsporulation:Usefreshmaterial.

Speciesbeijerinckii/ diolisofthegenusClostridiumhaveverysim ilarpatterns:Therefore distinguishing theirspecies isdifficult.

M 15824THAM isamemberofPseudomonasfluorescensgroup Pseudomonasfulva013_W30NFI isamemberofPseudomonasputidagroup PseudomonasfulvaLMG11722THAM isamemberofPseudomonasputidagroup

PseudomonasputidaATCC49128THL isamemberofPseudomonasputidagroupPseudomonasputidaB342TUFL isamemberofPseudomonasputidagroupPseudomonasputidaB401UFL isamemberofPseudomonasputidagroupPseudomonasputidaDSM50198HAM isamemberofPseudomonasputidagroupPseudomonasputidaMu15117_1CHB isamemberofPseudomonasputidagroup

Klebsiellaoxytocaandspeciesornithinolytic a/planticola / terrigena of the genus Raoultellahave very similar patterns:

Klebsiellaoxytocaandspeciesornithinolytic a/planticola / terrigena of the genus Raoultellahave very similar patterns:

Thereforedistinguishingtheirspeciesisdifficult. Salmonellasp(choleraesuis)08LAL Salmonellacanonlybeidentifiedongenuslevel.

Stenotrophomonas_maltophilia(Ps eudomonas_hibiscicola_#)LMG980

2.299 securege nusidentific ati on, pr obablesp ec ies identification (++) green

Species Consistency:The best match was classified as 'green' (see above).Further'green'matchesareofthesamespeciesasthefirstone.Further'yello w'matchesareatleastofthesamegenusasthefirstone.

Genus Consistency:The best match was classified as 'green' or 'yellow'

(seeabove).Further'green'or'yellow'matcheshaveatleastthesamegenusasthefirst one.Theconditionsofspeciesconsistencyarenotfulfilled.

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

6(+ ) Xanthomonasc odi aei DSM 18812TA

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

3(+ ) Xanthomonasc odi aei DSM 18812TA

Stenotrophomonas_maltophilia (Pseudomo nas_hibiscicola_#) L M G 9 8 0 T HAM 1.566 86189

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

7(+ ) Xanthomonasc odi aei DSM 18812TA

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

1(+ ) Bacillus subtilisDSM5552 DSM 1.988 1423 2(+ ) Bacillus subtilisDSM5611 DSM 1.984 1423

4(+ ) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 10T

6(-) Bacillus subtilis ssp spizizenii DS

8(-) Bacillus atrophaeus DSM 5551 DSM 1.634 1452 9(-) Bacillus vallismortisDSM11031TDSM 1.622 72361 10(-) Bacillus atrophaeus DSM 7264T DSM 1.6 1452

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

3(-) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 10T

4(-) Bacillus subtilisDSM5552 DSM 1.45 1423 5(-) Bacillus subtilis DSM 5611 DSM 1.432 1423 6(-) Bacillus atrophaeus DSM 5551 DSM 1.397 1452

8(-) Bacillus subtilis ssp spizizenii DS

9(-) Bacillus atrophaeus DSM 2277 DSM 1.288 1452 10(-) Bacillus flexus DSM 1320T DSM 1.286 86664

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

2(+ ) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 10T

7(-) Bacillus atrophaeus DSM 2277 DSM 1.647 14528(-) Bacillus vallismortisDSM11031TDSM 1.576 723619(-) Bacillus subtilis 107_W_7_QSA IBS 1.57 142310(-) Bacillus atrophaeus DSM 5551 DSM 1.535 1452

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

2(+ ) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 10T

3(+ ) Bacillus atrophaeus DSM 2277 DSM 1.706 1452 4(-) Bacillus atrophaeus DSM 5551 DSM 1.693 1452

7(-) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 10T

8(-) Bacillus subtilisDSM5552 DSM 1.6 1423 9(-) Bacillus mojavensis DSM 9205T DSM 1.588 72360 10(-) Bacillus subtilisDSM5611 DSM 1.575 1423 11(-) Aeromonas veronii0807M090438 I BS 1.514 654 12(-) Bacillus vallismortisDSM11031TDSM 1.51 72361 13(-) Bacillus atrophaeus DSM 7264T DSM 1.469 1452 14(-) Bacillus atrophaeusDSM 675 DSM 1.453 1452 15(-) Bacillus atrophaeus DSM 5551 DSM 1.439 1452

16(-) Bacillus subtilis ssp spizizenii DS

18(-) Aeromonas veronii0807M090438 I BS 1.395 65419(-) Bacillus acidicola DSM 14745T DSM 1.37 209389

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

4(-) Enterobacter cloacaeMB_5277_05THL 1.655 550 5(-) Enterobacter cloacaeMB_8779_05THL 1.644 550

7(-) Escherichia coli DH5alpha BRL 1.609 562 8(-) Salmonella sp (choleraesuis) 08 LAL 1.608 591

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

1(-) Salmonella sp (enterica st Dublin)

2(-) Salmonella sp (enterica st Anatum) 11

3(-) Escherichia coli DH5alpha BRL 1.651 562

8(-) Salmonella sp (enterica st Stanley) 15 L

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

1(+ ) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 10T

2(+ ) Bacillus subtilisDSM5552 DSM 1.774 1423 3(+ ) Bacillus subtilisDSM5611 DSM 1.769 1423

6(-) Bacillus vallismortisDSM11031TDSM 1.53 72361 7(-) Bacillus mojavensis DSM 9205T DSM 1.498 72360

8(-) Bacillus subtilis ssp spizizenii DSM 1

9(-) Bacillus subtilis ssp spizizenii DS

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

3(+ ) Bacillus subtilisDSM5552 DSM 1.924 1423 4(+ ) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 10T

5(+ ) Bacillus mojavensis DSM 9205T DSM 1.742 72360 6(-) Bacillus atrophaeus DSM 5551 DSM 1.534 1452 7(-) Bacillus vallismortisDSM11031TDSM 1.511 72361

8(-) Bacillus subtilis ssp spizizenii DS

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

(+) Bacillus subtilis sspsubtilis DSM 10T DSM 1.892 135461

(+) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 5660 DSM 1.837 135461

(-) Bacillus subtilis ssp spizizenii DSM 15029T DSM 1.402 96241

(-) Bacillus subtilis ssp spizizenii DSM 618DSM 1.365 96241

A2(+)(B) BP103 Bacillus atro phaeus 1.73 notreliableid entification 1.626

A5(+)(B) 1LAMA Bacillus lich eniformis 1.821 notreliableid entification 1.597

A6(+)(B) 2LAMA Bacillus lich eniformis 1.728 notreliableid entification 1.365

A7(+)(B) 3LAMA Bacillus subtilis 1.863 Bacillus subtilis 1.842

Thequalityofspectra(score)dependson the degree of sporulation: Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependson the degree of sporulation: Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependson the degree of sporulation: Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependson the degree of sporulation: Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependson the degree of sporulation: Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependson the degree of sporulation: Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependson the degree of sporulation: Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependson the degree of sporulation: Use freshmaterial.

Stenotrophomonas_maltophilia(Pseudom onas_geniculata_#)L M G 2 1 9 5 T HAM is a member ofStenotrophomonasmaltophiliagroupor closelyrelated

2.299 securegenusi de ntif ication,probabl esp ecie sidentification (++) green

SpeciesConsistency:Thebestmatchwasclassifiedas'green'(seeabove).Further

'green'matchesareofthesamespeciesasthefirstone.Further'yellow'matchesarea tleastofthesamegenusasthefirstone.

Genus Consistency:The best match was classified as 'green' or 'yellow'

(seeabove) Further 'green' or 'yellow' matches have at least the same genus as thefirstone.Theconditionsofspeciesconsistencyarenotfulfilled.

C NoConsistency:Ne ither speciesnorgenusconsistency(Pleasecheckforsynony msofnamesormicrobialmixture).

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

1(+ ) Bacillus atrophaeus DSM 5551 DSM 1.73 1452 2(-) Bacillus mojavensis DSM 9205T DSM 1.626 72360 3(-) Bacillus subtilisDSM5552 DSM 1.555 1423 4(-) Bacillus atrophaeus DSM 2277 DSM 1.525 1452 5(-) Bacillus atrophaeus DSM 7264T DSM 1.52 1452

8(-) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 10T

B4(+)(B) BR37 Bacillus v allismortis 1.713 Bacillus moja vensis 1.71

Species of this genus havevery similarpatterns:

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Usefreshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Usefreshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Usefreshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Usefreshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Use freshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Use freshmaterial.

AI BS is a member ofBacillus subtilis group The quality ofspectra(score)dependsonthedegreeofsporulation:Us efreshmaterial.

DSM is a member ofBacillus subtilis group The quality ofspectra(score)dependsonthedegreeofsporulation:Us efreshmaterial.

DSM is a member ofBacillus subtilis group The quality ofspectra(score)dependsonthedegreeofsporulation:Us efreshmaterial.

Bacillussubtilissspspizizen iiDSM15029TBRB is a member ofBacillus subtilis group The quality ofspectra(score)dependsonthedegreeofsporulation:Us efreshmaterial.

Bacillussubtilissspspizizen iiDSM15029TDSM is a member ofBacillus subtilis group The quality ofspectra(score)dependsonthedegreeofsporulation:Us efreshmaterial.

DSM10TDSM is a member of Bacillus subtilis group The quality ofspectra(score)dependsonthedegreeofsporulation:Us efreshmaterial.

DSM5660DSM is a member ofBacillus subtilis group The quality ofspectra(score)dependsonthedegreeofsporulation:Us efreshmaterial.

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Use freshmaterial.

Speciesof this genus have very similarpatterns:

Thequalityofspectra(score)dependsonthedegreeofsporula tion:Use freshmaterial.

2.299 securegenusi de ntif ication,probabl esp ecie sidentification (++) green

SpeciesConsistency:Thebestmatchwasclassifiedas'green'(seeabove).Further

'green'matchesareofthesamespeciesasthefirstone.Further'yellow'matchesarea tleastofthesamegenusasthefirstone.

Genus Consistency:The best match was classified as 'green' or 'yellow'

(seeabove) Further 'green' or 'yellow' matches have at least the same genus as thefirstone.Theconditionsofspeciesconsistencyarenotfulfilled.

C NoConsistency:Ne ither speciesnorgenusconsistency(Pleasecheckforsynony msofnamesormicrobialmixture).

AppliedTa xonom yTree: Projects,Br uk e r Taxonomy,Taxonomy

Rank(Quality) MatchedPattern ScoreValue NCBIIdentifier

1(+ ) Bacillus vallismortisDSM11031TDSM 1.713 72361 2(+ ) Bacillus mojavensis DSM 9205T DSM 1.71 72360 3(-) Bacillus subtilisDSM5552 DSM 1.675 1423 4(-) Bacillus subtilisDSM5611 DSM 1.666 1423

5(-) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 10T

6(-) Bacillus subtilis ssp subtilis DSM 5660

7(-) Bacillus atrophaeus DSM 5551 DSM 1.565 14528(-) Bacillus atrophaeus DSM 7264T DSM 1.559 14529(-) Bacillus atrophaeusDSM 675 DSM 1.548 145210(-) Bacillus atrophaeus DSM 2277 DSM 1.535 1452

Phụbảng6:Kết quảphântíchANOVA chỉsốbệnhđốm lávikhuẩn docác dòng vikhuẩn

Phụbảng7:Kết quảphântíchANOVA chỉsốbệnhđốm lávikhuẩn docác dòng vikhuẩn

Phụbảng8:Kết quảphântíchANOVA chỉsốbệnhđốm lávikhuẩn docác dòng vikhuẩn

Source DF SS MS F P Nghiệmthức2 0 1 3 1 3 8 4 7 6 5 6 9 2 2 5 8 1 8

Phụbảng9:Kết quảphântíchANOVA chỉsốbệnhđốm lávikhuẩn docác dòng vikhuẩn

1.2 Khảosátkhảnănggâybệnhtrên câyớt củacácdòng Xanthomonas spp gây bệnhđượcphânlập

2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có nguồn gốc từ cơ chất vùng rễ và đất vùngsinh thái bản địa có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp gây bệnh đã đượcphânlập

2.1 Tuyểnchọnvikhuẩnđốikhángcácdòng Xanthomonas spp gâybệ nh đốmlá vikhuẩntrêncâyhoahồngtrongđiềukiện invitro

Phụ bảng 23:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngrễ có khả năng đối kháng triển vọng theo ba dòng vi khuẩn gây bệnh (XR13, XR9, XR18) trongđiềukiệninvitro

Source DF SS MS F P Vikhuẩngâybệnh 2

Phụbảng25:KếtquảphântíchANOVAđườngkínhvùngứcchếcủacácdòngvikhuẩnvùng rễcókhảnăngđốikhángtriểnvọngvớidòngXR9 trongđiều kiệnin vitro

2.1.2 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên câyhoahồngcủavikhuẩnphânlậptừđấtvùngsinh thái bảnđịatỉnhĐồngTháp

Phụ bảng 27:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngsinh thái bản địa có khả năng đối kháng triển vọng theo ba dòng vi khuẩn gây bệnh (XR13,XR9,XR18)trongđiềukiệninvitro

Phụ bảng 28:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngsinhtháibảnđịacókhảnăngđốikhángtriểnvọngvớidòngXR13trongđiềukiệninvitro

Phụ bảng 29:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngsinhtháibảnđịacókhảnăngđốikhángtriểnvọngvớidòngXR9trongđiềukiệninvitro

Phụ bảng 30:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngsinhtháibảnđịacókhảnăngđốikhángtriểnvọngvớidòngXR18trongđiềukiệninvitro

2.2 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng các dòng X a n t h o m o n a s spp gâyb ệ n h đ ố m l á vikhuẩntrêncâyớttrongđiềukiện invitro

2.2.1 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây ớtcủavi khuẩnphânlậptừđấtvùngrễ

Phụ bảng 31:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngrễcókhả năngđốikhángtriểnvọngtheobadòngvikhuẩngâybệnh(XP17,XP7,XP1)trongđiềukiệninvitro

Source DF SS MS F P VKgâybệnh 2 321.71 6 0 9 4 8 2 0 0 1 0 Error 1324 4 0 7 2 33.4

Phụbảng32:KếtquảphântíchANOVAđườngkínhvùngứcchếcủacácdòngvikhuẩnvùng rễcókhảnăngđốikhángtriểnvọngvớidòngXP17trongđiều kiệninvitro

2.2.2 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây ớtcủavikhuẩnphânlậptừđấtvùngsinhtháibảnđịa

Phụ bảng 35:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngsinh thái bản địa có khả năng đối kháng triển vọng theo ba dòng vi khuẩn gây bệnh (XP17,XP7,XP1) trongđiềukiệninvitro

Phụ bảng 36:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngsinhtháibảnđịacókhảnăngđốikhángtriểnvọngvớidòngXP17trongđiềukiệninvitro

Phụ bảng 37:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngsinhtháibảnđịacókhảnăngđốikhángtriểnvọngvớidòngXP7 trongđiềukiệninvitro

Phụ bảng 38:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của các dòng vi khuẩn vùngsinhtháibảnđịacókhảnăngđốikhángtriểnvọngvớidòngXP1 trongđiềukiệninvitro

Phụ bảng 39:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của dòng vi khuẩn

BP49(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XP17 trongđiềukiệnin vitro

Phụ bảng 40:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của dòng vi khuẩn

BP11(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XP17 trongđiềukiệnin vitro

Phụbảng41:KếtquảphântíchANOVAđườngkínhvùngứcchếcủadòngvikhuẩnBP103(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XP17 trongđiềukiệnin vitro

Phụ bảng 42:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của dòng vi khuẩn

G24(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XP17 trongđiềukiệnin vitro

Phụ bảng 43:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của dòng vi khuẩn

T11(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XP17 trongđiềukiệnin vitro

Phụ bảng 44:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của dòng vi khuẩn

T188(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XP17 trongđiềukiệnin vitro

Source DF SS MS F P Mậtđộphaloãng 32 9 3 6 6 7 9 7 8 8 9 3 9 1 5 6 0 0 0 0

Phụbảng45:KếtquảphântíchANOVAđườngkínhvùngứcchếcủadòngvi khuẩnBR16(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XR13 trongđiềukiệnin vitro

Phụbảng46:KếtquảphântíchANOVAđườngkínhvùngứcchếcủadòngvi khuẩnBR37(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XR13 trongđiềukiệnin vitro

Phụbảng47:KếtquảphântíchANOVAđườngkínhvùngứcchếcủadòngvi khuẩnBR88(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XR13 trongđiềukiệnin vitro

Phụ bảng 48:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của dòng vi khuẩn

G24(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XR13 trongđiềukiệnin vitro

Phụ bảng 49:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của dòng vi khuẩn

X61(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XR13 trongđiềukiệnin vitro

Phụ bảng 50:Kết quả phân tích ANOVA đường kính vùng ức chế của dòng vi khuẩn

T265(vùng rễ) ở các mật độ đối kháng (10,100, 1000, 10000 lần pha loãng) đối với dòng XR13 trongđiềukiệnin vitro

3.1 Đánhgiáh i ệ u quảk i ể m soátbệnh đốmláv i khuẩntrêncây h o a h ồ n g t r o n g điềukiệnnhàlưới

Phụbảng51:KếtquảphântíchANOVAtỷlệbệnhđốm lávikhuẩndo dòngXanthomonasspp XR13 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BR16, BR37, BR88 trongđiềukiệnnhàlưới

Phụbảng52:KếtquảphântíchANOVAtỷlệbệnhđốm lávikhuẩndo dòngXanthomonasspp XR9 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BR16, BR37, BR88 trongđiềukiệnnhàlưới

Phụbảng53:KếtquảphântíchANOVAtỷlệbệnhđốm lávikhuẩndo dòngXanthomonasspp XR18 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BR16, BR37, BR88 trongđiềukiệnnhàlưới

BR37, BR88 ở thời điểm 16 NSKLN dòngXanthomonasspp XR13 trong điềukiệnnhàlưới

BR37, BR88 ở thời điểm 16 NSKLN dòngXanthomonasspp XR9 trong điều kiệnnhàlưới

BR37, BR88 ở thời điểm 16 NSKLN dòngXanthomonasspp XR18 trong điềukiệnnhàlưới

Phụ bảng 57:Kết quả phân tích ANOVA chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn do dòngXanthomonasspp XR13 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BR16,

Phụ bảng 58:Kết quả phân tích ANOVA chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn do dòngXanthomonasspp XR9 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BR16,

Phụ bảng 59:Kết quả phân tích ANOVA chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn do dòngXanthomonasspp XR18 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BR16,

Phụbảng60:KếtquảphântíchANOVA chỉsố AUDPC củabệnhđốmlá vikhuẩndodòngXanthomonasspp XR13 gây ra có kết hợp xử lý các dòng BR16, BR37, BR88 trong điều kiệnnhàlưới

Source DF SS MS F P Nghiệmthức

Phụbảng61:KếtquảphântíchANOVA chỉsố AUDPC củabệnhđốmlá vikhuẩndodòngXanthomonasspp XR9 gây ra có kết hợp xử lý các dòng BR16, BR37, BR88 trong điều kiệnnhàlưới

Phụbảng62:KếtquảphântíchANOVA chỉsố AUDPC củabệnhđốmlá vikhuẩndodòngXanthomonasspp XR18 gây ra có kết hợp xử lý các dòng BR16, BR37, BR88 trong điều kiệnnhàlưới

3.1.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trongđiều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọngt ừ v ù n g s i n h t h á i bảnđịa

Phụbảng63:KếtquảphântíchANOVAtỷlệbệnhđốm lávikhuẩndo dòngXanthomonasspp XR13 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng G24, T265, X61 trong điềukiệnnhàlưới

Phụbảng64:KếtquảphântíchANOVAtỷlệbệnhđốm lávikhuẩndo dòngXanthomonasspp XR9 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng G24, T265, X61 trong điềukiệnnhàlưới

Phụbảng65:KếtquảphântíchANOVAtỷlệbệnhđốm lávikhuẩndo dòngXanthomonasspp XR18 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng G24, T265, X61 trong điềukiệnnhàlưới

Phụbảng66:KếtquảphântíchANOVAhiệuquảgiảmbệnhđốmlávikhuẩnkhixửlý cácdòngG24,T265,X61ởthờiđiểm16NSKLNdòngXanthomonasspp.XR13trongđiềukiệnnhàlưới

X61 ở thời điểm 16 NSKLN dòngXanthomonasspp XR9 trong điều kiệnnhàlưới

Phụbảng68:KếtquảphântíchANOVAhiệuquảgiảmbệnhđốmlávikhuẩnkhixửlý cácdòngG24,T265,X61ởthờiđiểm16NSKLNdòngXanthomonasspp.XR18trongđiềukiệnnhàlưới

Source DF SS MS F P Nghiệmthức

Phụ bảng 69:Kết quả phân tích ANOVA chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn do dòngXanthomonasspp XR13 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng G24,

Phụ bảng 70:Kết quả phân tích ANOVA chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn do dòngXanthomonasspp XR9 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng G24,

Phụ bảng 71:Kết quả phân tích ANOVA chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn do dòngXanthomonasspp XR18 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng G24,

Phụbảng72:KếtquảphântíchANOVA chỉsố AUDPC củabệnhđốmlá vikhuẩndodòngXanthomonasspp XR13 gây ra có kết hợp xử lý các dòng G24, T265, X61 trong điều kiện nhàlưới

Phụbảng73:KếtquảphântíchANOVA chỉsố AUDPC củabệnhđốmlá vikhuẩndodòngXanthomonasspp XR9 gây ra có kết hợp xử lý các dòng G24, T265, X61 trong điều kiện nhàlưới

Phụbảng74:KếtquảphântíchANOVA chỉsố AUDPC củabệnhđốmlá vikhuẩndodòngXanthomonasspp XR18 gây ra có kết hợp xử lý các dòng G24, T265, X61 trong điều kiện nhàlưới

Phụbảng75:KếtquảphântíchANOVAtỷlệbệnhđốm lávikhuẩndo dòngXanthomonasspp XP17 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BP11, BP49, BP103 trongđiềukiệnnhàlưới

Phụbảng76:KếtquảphântíchANOVAtỷlệbệnhđốm lávikhuẩndo dòngXanthomonasspp XP7 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BP11, BP49, BP103 trongđiềukiệnnhàlưới

Phụbảng77:KếtquảphântíchANOVAtỷlệbệnhđốm lávikhuẩndo dòngXanthomonasspp XP1 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BP11, BP49, BP103 trongđiềukiệnnhàlưới

BP49, BP103 ở thời điểm 16 NSKLN dòngXanthomonasspp XP17 trong điềukiệnnhàlưới

BP49, BP103 ở thời điểm 16 NSKLN dòngXanthomonasspp XP7 trong điều kiệnnhàlưới

BP49, BP103 ở thời điểm 16 NSKLN dòngXanthomonasspp XP1 trong điều kiệnnhàlưới

Phụ bảng 81:Kết quả phân tích ANOVA chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn do dòngXanthomonasspp XP17 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BP11,

Phụ bảng 82:Kết quả phân tích ANOVA chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn do dòngXanthomonasspp XP7 gây ra ở thời điểm 16 NSKLN có kết hợp xử lý các dòng BP11,