Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 62420201 LÊ UYỂN THANH PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA HỒNG (Rosa spp.) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp.) TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHỊNG TRỊ BỆNH NĂM 2021 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: TS Nguyễn Đức Độ Người hướng dẫn phụ: TS Trần Đình Giỏi Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp sở Họp tại: Phòng bảo vệ luận án tiến sĩ, lầu 2, nhà điều hành, trường Đại học Cần Thơ Vào lúc 14 ngày tháng năm 2022 Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Đức Hoàng Phản biện 2: PGS TS Hà Viết Cường Xác nhận xem lại Chủ tịch Hội đồng PGS.TS Nguyễn Văn Thành Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ - Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC NHỮNG BÀI BÁO ĐÃ CƠNG BỐ [1] Lê Uyển Thanh, Tơ Lan Phương, Trần Đình Giỏi, Nguyễn Đức Độ (2021) Phân lập xác định vi khuẩn từ vùng sinh thái địa có khả đối kháng với Xanthomonas spp gây bệnh đốm hoa hồng (Rosa spp.) Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn ISSN 1859-4581 (Số chuyên đề Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, 18: 29-35 [2] Lê Uyển Thanh, Tơ Lan Phương, Trần Đình Giỏi, Nguyễn Đức Độ (2021) Đánh giá hiệu kiểm soát bệnh vi khuẩn địa đối kháng triển vọng bệnh đốm (Xanthomonas spp.) hoa hồng (Rosa spp.) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam ISSN 18591558, 10 (131): 94-99 CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, sản xuất nông nghiệp phụ thuộc nhiều vào việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật chúng cho hiệu lực cao hiệu nhanh chóng Tuy nhiên, thực trạng biến đổi khí hậu ngày khiến canh tác nơng nghiệp gặp nhiều khó khăn với vệc trồng sinh trưởng phát triển không hiệu quả, dịch bệnh dễ bùng phát, tình trạng nhiễm mơi trường ngày trở nên trầm trọng Tại Đồng Tháp, gần xuất nhiều dịch bệnh nghiêm trọng Trong đó, bệnh đốm vi khuẩn chi Xanthomonas gây hai loài trồng chủ lực tỉnh ớt hoa hồng lửa đặc biệt nghiêm trọng Do nông dân canh tác liên tục năm để tăng thu nhập, kết hợp với việc mở rộng không ngừng vùng chuyên canh tạo điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh phát triển gây hại Để đối phó với bệnh đốm vi khuẩn, bệnh phát thường bị nhổ bỏ hạn chế tưới nước, phun loại thuốc hóa học đặc trị vi khuẩn Tuy nhiên, biện pháp giải pháp tạm thời việc sử dụng thuốc hóa học phổ rộng lâu dài tốn kém, gây hại cho thiên địch vi sinh vật có lợi, gây nhiễm mơi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng dễ làm mầm bệnh kháng thuốc Do đó, cần tập trung nghiên cứu phát triển phương pháp giúp kiểm sốt bệnh trồng cách thành cơng khơng tác động xấu đến sức khoẻ người môi trường Trong trường hợp này, kiểm soát sinh học giải pháp thay tiềm mang nhiều ưu điểm tính bền vững, phương thức hoạt động độc tính so với thuốc trừ bệnh hóa học (Bale et al., 2008) Chúng phân tán nhanh vào mơi trường thường độc lồi khơng phải mục tiêu Ngồi ra, sử dụng phương thức tác động khác với thuốc trừ bệnh hóa học thơng thường nên chúng giúp ngăn chặn mầm bệnh kháng thuốc (Marasco et al., 2012; Bhattacharyya et al., 2016) Xuất phát từ trạng trên, luận án “Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm hoa hồng (Rosa spp.) ớt (Capsicum spp.) tỉnh đồng tháp tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh” nghiên cứu thực 1.2 Mục tiêu luận án Phân lập xác định dòng vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm hoa hồng lửa (Rosa spp.) ớt cay (Capsicum spp.) Tuyển chọn dịng vi khuẩn có khả kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn Xanthomonas spp gây 1.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả gây hại xác định dòng vi khuẩn gây bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng lửa ớt cay Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả đối kháng với Xanthomonas spp phân lập từ chất vùng rễ đất vùng sinh thái địa Nội dung 3: Khảo sát khả kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn điều kiện nhà lưới dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng Nội dung 4: Đánh giá hiệu dòng vi khuẩn kiểm sốt bệnh tiềm điều kiện ngồi đồng 1.4 Tính luận án Nghiên cứu ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh đốm hoa hồng Xanthomonas spp gây bệnh đốm ớt nhờ vào kỹ thuật sinh hóa, MALDI-TOF-MS sinh học phân tử MLSA Bên cạnh đó, nghiên cứu ghi nhận dòng B velezensis (BR16), B subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp (BP11, X32), Enterobacter spp (T11), Serratia spp (X16) có khả đối kháng đáng kể Đặc biệt, nghiên cứu tuyển chọn B amyloliquefaciens BR88, B velezensis BP103, B subtilis G24 có khả kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn hiệu dựa thí nghiệm sàng lọc in vitro, nhà lưới, đồng, xác định danh pháp kỹ thật phân tích MALDI-TOFMS Sinh học phân tử Các dịng vi khuẩn sử dụng tác nhân sinh học phòng trị bệnh đốm hoa hồng ớt 1.5 Phạm vi đối tượng nghiên cứu 1.5.1 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu thực phạm vi phịng thí nghiệm phân lập vi khuẩn gây bệnh tuyển chọn in vitro dòng vi khuẩn đối kháng Nghiên cứu đánh giá khả gây hại dòng Xanthomonas spp đánh giá hiệu kiểm sốt bệnh dịng vi khuẩn đối kháng thực điều kiện nhà lưới đồng 1.5.2 Đối tượng nghiên cứu Giống hoa hồng lửa ớt thiên sử dụng thí nghiệm, giống người dân trồng phổ biến tỉnh Đồng Tháp người dân đánh giá giống có tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều Bên cạnh đó, vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn đối kháng phân lập từ tỉnh Đồng Tháp 1.6 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.6.1 Ý nghĩa khoa học Dựa kỹ thuật phân tích liên quan đến sinh hóa sinh học phân tử đại, kết xử lý phân tích khoa học phần mềm cơng nhận cung cấp nguồn thông tin khoa học, tài liệu tham khảo cho nghiên cứu Kết xác định dòng gây bệnh đốm hoa hồng ớt Đồng thời qua kỹ thuật xác định dịng vi khuẩn đối kháng triển vọng, góp phần vào chứng minh khẳng định khả áp dụng vào thực tế sản xuất dòng vi khuẩn đối kháng 1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu cung cấp sở khoa học hướng đến sử dụng dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng kiểm soát bệnh đốm hoa hồng ớt điều kiện sản xuất thực tế, phục vụ phát triển nông nghiệp theo hướng bền vững CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược chi Xanthomonas gây bệnh thực vật Xanthomonas chi vi khuẩn lớn gây bệnh thực vật, có phản ứng gram âm, hình que sắc tố vàng Chúng gây bệnh 400 loài vật phân bố toàn giới tác nhân gây bệnh nhiều trồng quan trọng như: lúa, cam quýt, sắn, cà chua, mía đường, chanh dây, chuối Một số Xanthomonas spp gây bệnh cho loài thuộc họ Rosaceae báo cáo, Xanthomonas fragariae dâu tây (Robert et al., 1997), X pruni đào (Wert et al., 2006) Tuy nhiên, báo cáo Xanthomonas spp gây bệnh hoa hồng (Rosa spp.), thành viên họ Rosaceae, bước đầu ghi nhận dòng vi khuẩn hoa hồng thuộc loài Xanthomonas euvesicatoria (Huang et al 2013; Barak et al., 2016) Trên họ Solanaceae, Jones et al (2004) ghi nhận tất vi khuẩn thuộc Xanthomonas gây bệnh đốm vi khuẩn phân thành loài X euvesicatoria, X vesicatoria, X perforans, X gardneri Trong đó, X euvesicatoria X vesicatoria gây bệnh ớt cà chua Trong khi, số loài Xanthomonas spp gây bệnh cà chua X perforans and X gardneri Tuy nhiên, gần Potnis et al (2015) lại ghi nhận X perforans xuất ớt Tại Hàn Quốc, Myung et al (2015) Kyeon et al (2016) ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh ớt (Capsicum sp.) 2.2 Các nghiên cứu Xanthomonas sp gây bệnh đốm hoa hồng ớt 2.2.1 Vi khuẩn gây bệnh đốm hoa hồng Năm 2013, Huang et al tiến hành nghiên cứu bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng (Rosa spp.) Hoa Kỳ Kết ghi nhận dòng vi khuẩn có biến đổi di truyền đáng kể, có hai haplotype, rơi vào X axonopodis phân nhóm 9.2 (Rademaker et al., 2005), cách đặt tên mầm bệnh rosa đề xuất theo định danh pháp mô tả trước Barak et al (2016) giải trình tự tồn gen kết luận dòng vi khuẩn gây bệnh đốm hoa hồng Xanthomonas euvesicatoria pv rosa Tên X euvesicatoria pv rose công nhận sử dụng để nghiên cứu vi khuẩn Xanthomonas gây bệnh hoa hồng (Fan et al., 2022) 2.2.2 Vi khuẩn gây bệnh đốm ớt Myung et al (2009) tiến hành ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh đốm ớt (Capsicum annuum L.) nhà kính thương mại Jinju, Hàn Quốc vào năm 2014, kết cho thấy có tỷ lệ mắc bệnh đốm 35%, với triệu chứng đốm điển hình Chuỗi gen dịng phân lập có tương đồng 100% với gen X euvesicatoria ICMP 109T Một nghiên cứu khác Kyeon et al (2016) với 72 mẫu bệnh ớt khắp Hàn Quốc sử dụng để xác định tác nhân gây bệnh Kết nghiên cứu cho thấy đốm vi khuẩn ớt Hàn Quốc X euvesicatoria gây Gần đây, Myung et al (2015) ghi nhận dòng gây bệnh đốm vi khuẩn ớt Hàn Quốc X euvesicatoria 2.3 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn việc kiểm soát mầm bệnh Xanthomonas spp gây trồng Các dịng vi sinh vật thuộc nhóm xạ khuẩn Streptomyces sp., Bacillus spp có khả đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây bệnh bạc lúa, với dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus spp PD17, PD13.1 (Oanh, 2020) Ngoài ra, Bacillus velezensis, B subtilis, B amyloliquefaciens việc kiểm soát mầm bệnh thực vật vi khuẩn (Mirik et al., 2008, Huang et al., 2012; Liu et al., 2016; Fira et al., 2018; Liu et al., 2018) Kiểm soát sinh học cách sử dụng vi sinh vật sản phẩm chúng chứng minh đạt hiệu việc kiểm sốt lồi thuộc chi Xanthomonas (Lanna Filho et al., 2010; Murate et al., 2015; Daungfu et al., 2018; Príncipe et al., 2018) Vì vậy, nghiên cứu gần việc tìm kiếm vi sinh vật để kiểm soát sinh học số loài Xanthomonas quan trọng kinh tế giới ngày quan tâm CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Thời gian: Từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 12 năm 2019 - Địa điểm thực hiện: Nghiên cứu thực Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần thơ; Viện Lúa Đồng Sông Cửu Long; Trường Đại học Đồng Tháp 3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.2.1 Dụng cụ thiết bị Lame, Lamelle, đĩa petri, ống nghiệm, ống falcon, bình tam giác, đũa khuấy, eppendorf, micropipette,… Tủ cấy, máy đo pH, Vortex, máy ly tâm, máy lắc ngang, water bath, tủ ủ ấm, tủ lạnh trữ mẫu, kính hiển vi, tủ trùng khô, autoclave, cân điện tử 3.2.2 Vật liệu Các hóa chất cần thiết cho mơi trường, isoamyl alcohol (Merk), sodium acetate (Merk), ethanol 95%, ethanol 70%, nước cất lần, Tris HCl (pH 8,0), TE buffer 1X (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA), Mastermix (Phusa), ethium bromide (Merk), loading buffer 10 X, ladder kb (Thermo scientific), ladder 100 bp (Thermo scientific), agarose (Merk), 1X TAE buffer (400mM Tris acetate, mM EDTA, pH 8), cặp mồi chung 27F/1492R (Weisburg, 1991), cặp mồi cho gen housekeeping fusA, gap1, gltA, gyrB, lacF, lepA (Ameida et al., 2010), giống hoa hồng lửa, ớt thiên, vi khuẩn gây bệnh đốm (từ bệnh Đồng Tháp) vi khuẩn phân lập từ chất, đất vùng rễ, đất vùng sinh thái địa Đối với thí nghiệm nhà lưới đồng sử dụng Cây hoa hồng thuộc giống hồng lửa trồng chậu nhựa, giá thể rơm oai mục, sau 45 ngày trồng cắt cành vào ngày trước thí nghiệm Cây ớt trồng từ hạt (2 tuần),sau trồng chậu nhựa chứa giá thể vơ trùng gồm đất, xơ dừa trấu, phân mùn với tỷ lệ 5:3:2, xử lý thí nghiệm đạt tuần tuổi 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Luận án thực 14 thí nghiệm, tương ứng với nhóm nội dung (1) Phân lập, khảo sát khả gây hại xác định dòng vi khuẩn gây bệnh đốm hoa hồng lửa ớt cay, với thí nghiệm; (2) Tuyển chọn vi khuẩn có khả đối kháng với Xanthomonas spp phân lập từ chất vùng rễ đất vùng sinh thái địa, thí nghiệm; (3) Khảo sát khả kiểm sốt bệnh đốm vi khuẩn điều kiện nhà lưới dịng vi khuẩn đối kháng triển vọng, thí nghiệm; (4) Đánh giá hiệu dòng vi khuẩn kiểm sốt bệnh tiềm điều kiện ngồi đồng, thí nghiệm 3.3.1 Nội dung 1: Phân lập xác định dòng vi khuẩn gây bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng ớt 3.3.1.1 Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp từ mẫu bệnh Mục tiêu: Phân lập dòng vi khuẩn gây bệnh hoa hồng lửa ớt phục vụ cho thí nghiệm khảo sát khả lây nhiễm, định danh đối kháng sau Phương pháp - Thu thập mẫu bệnh đốm vi khuẩn: Mẫu bệnh đốm vi khuẩn có triệu chứng bệnh điển hình (Lowell et al., 1991; Jones et al., 2004; CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nội dung 1: Phân lập dòng vi khuẩn gây bệnh đốm 4.1.1 Phân lập xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh hoa hồng tỉnh Đồng Tháp 4.1.1.1 Phân lập dòng Xanthomonas spp hoa hồng Phân lập 20 dòng vi khuẩn từ mẫu bệnh với triệu chứng điển hình bệnh đốm vi khuẩn (hình 4.1), đặt tên từ XR1 đến XR20 Hình 4.1: Triệu chứng bệnh đốm vi khuẩn Rosa spp khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh A: Triệu chứng tự nhiên; B: Vi khuẩn rỉ từ vị trí cắt ngang bị nhiễm bệnh; C: Khuẩn lạc mầm bệnh ria môi trường King’s B; D: Khuẩn lạc 36 nuôi cấy; E: Khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy 4.1.1.2 Khảo sát khả gây bệnh hoa hồng dòng Xanthomonas spp phân lập Ở điều kiện nhà lưới, tất 20 dịng Xanthomonas spp có khả bệnh hoa hồng với triệu chứng bệnh ghi nhận rõ sau ngày sau lây nhiễm (NSKLN) Bệnh phát triển giai đoạn đến NSKLN, sau đó, tiến triển chậm lại Tại 16 NSKLN, dịng XR13 có khả gây hại cao nhất, XR18 gây hại thấp so với tất dòng gây bệnh, dòng XR9 gây hại 15 mức độ trung bình Các dịng XR13, XR18, XR9 chọn nhằm phục vụ nghiên cứu (Hình 4.4; 4.5) Hình 4.4: Biểu đồ thể tỷ lệ bệnh (A), số bệnh (B), số AUDPC (C) từ dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm hoa hồng điều kiện nhà lưới Hình 4.5: Khả gây bệnh ba dòng vi khuẩn (XR9, XR13, XR18) gây bệnh đốm hoa hồng điều kiện nhà lưới 16 A: Nghiệm thức (NT) đối chứng khơng lây bệnh; B: NT lây bệnh dịng XR9; C: NT lây bệnh dòng XR13; D: NT lây bệnh dòng XR18 Các nghiệm thức B, C, D có bị rụng nhiều 4.1.1.3 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm hoa hồng theo phương pháp MALDI-TOF-MS Ba dịng XR9, XR13 XR18 ghi nhận có trùng khớp với loài thuộc chi Xanthomonas, với giá trị điểm chúng cao 2,00 nhỏ 2,3, chi Xanthomonas, chưa có chắn loài (Bảng 4.3) Bảng 4.3: Danh pháp ba dòng Xanthomonas spp (XR9, XR13, XR18) dựa vào kỹ thuật MALDI-TOF-MS Tên phân tích Dịng VK Dịng vi sinh vật (phù hợp nhất) C10( ++ ) XR13 C11( ++ ) XR18 C12( ++ ) XR9 Xanthomonas axonopodis Xanthomonas axonopodis Xanthomonas axonopodis Giá trị Dòng vi sinh vật điểm (phù hợp thứ hai) (SV) 2.042 Xanthomonas perforans 2.002 Xanthomonas perforans 2.12 Xanthomonas perforans Giá trị điểm (SV) 1.942 1.999 2.037 (+): Ký hiệu thể giá trị điểm từ 1,700 đến 1,999 tương ứng xác định đến chi, (++): Ký hiệu thể giá trị điểm từ 2,000 đến 2,299, tương ứng xác định xác chi xác định đến lồi; SV: giá trị điểm (Score value) 4.1.1.4 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm hoa hồng theo kỹ thuật Phân tích trình tự đa locus (MultiLocus Sequence Analysis – MLSA) Trình tự sáu gen Xanthomonas sp XR13 đăng ký “accession number” hệ thống Banklt thuộc Genbank (NCBI) OK044140 (fusA), OK044141 (gap1), OK044142 (glta), OK044143 (gyrb), OK044144 (lacf), OK044145 (lepA) BLASTN gen Genbank (NCBI) ghi nhận loài X perforans CP019725, CP018475, X axonopodis pv citrumelo CP002914, X axonopodis pv commiforeae CP031059, X euvesicatoria 17 pv alfalfae CP072268, X euvesicatoria pv rosa R07 có tương đồng cao với dịng XR13 Dịng XR13 với trình tự nối (2.692 bp) có phát sinh lồi nhánh, gần gũi với loài X euvesicatoria pv rosa R07 có nguồn gốc từ Hoa Kỳ (Huang et al., 2013; Barak et al., 2016), X perforans ICMP16690, X euvesicatoria ICPB10461, X citri pv malvacearum ICPB1053, X axonopodis pv manihotis LMG784 từ hệ thống PAMDB.org (Almeida et al., 2010) Khi phân tích giá trị tương đồng ghi nhận nhánh có giá trị tương đồng nhóm dao động từ 93,5% đến 98,6% Trong đó, dịng Xanthomonas sp XR13 có tương đồng cao với X euvesicatoria pv rosa R07 với 98,6%, X euvesicatoria ICPB10461 (97,9%) X perforans ICMP16690 (97,6%) Qua phân tích MALDI-TOF-MS, MLSA, dòng XR13 gây bệnh đốm hoa hồng Làng hoa Sa Đéc tỉnh Đồng Tháp thuộc chi Xanthomonas, đề xuất loài Xanthomonas euvesicatoria 18 Hình 4.7: Phát sinh lồi dịng Xanthomonas sp XR13 gây bệnh hoa hồng dựa trình tự nối gen fusA, gap-1, gltA, gyrB, lacF lepA 4.1.2 Phân lập xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh ớt (Capsicum spp.) tỉnh Đồng Tháp 4.1.2.1 Phân lập dòng Xanthomonas spp gây bệnh ớt 20 dòng vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh với triệu chứng điển hình bệnh đốm vi khuẩn (hình 4.8), đặt tên từ XP1 đến XP20 19 Hình 4.8: Đặc điểm vi khuẩn gây bệnh đốm Capsicum spp khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh A: Triệu chứng tự nhiên bệnh đốm vi khuẩn ớt; B: Dòng chảy vi khuẩn từ vết cắt ngang mẫu bệnh; C: Cấy ria vi khuẩn gây bệnh dòng XP18; D: Khuẩn lạc vi khuẩn có vịng nhẫn sau 4-5 ngày ni cấy 4.1.2.2 Khảo sát khả gây bệnh ớt dòng Xanthomonas spp phân lập Ở điều kiện nhà lưới, 20 dịng Xanthomonas spp có khả gây bệnh ớt với triệu chứng bệnh ghi nhận rõ sau NSKLN Bệnh phát triển giai đoạn đến NSKLN, sau đó, tiến triển chậm lại Tại 16 NSKLN, XP17 có khả gây hại cao nhất, XP1 có gây hại thấp nhất, XP7 có gây hại mức độ trung bình so với tất dịng gây bệnh (Hình 4.11; 4.12) Các dòng XP1, XP7, XP17 lựa chọn phục vụ cho việc tuyển chọn vi khuẩn đối kháng điều kiện in vitro, nhà lưới đồng 20 Hình 4.11: Biểu đồ hộp thể tỷ lệ bệnh (A), số bệnh (B), số AUDPC (C) từ dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm ớt điều kiện nhà lưới Hình 4.12: Khả gây bệnh ba dòng vi khuẩn (XP1, XP7, XP17) gây bệnh đốm ớt điều kiện nhà lưới A: Nghiệm thức đối chứng không lây nhiễm bệnh; B: NT lây nhiễm dòng XP1; C: NT lây nhiễm dòng XP7; D: NT lây nhiễm dòng XP17; Các nghiệm thức B, C, D bị rụng nhiều, đặc biệt nghiệm thức D 4.1.1.3 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm ớt theo hình thái, sinh hóa 21 Ba dịng XP1, XP7, XP17 có triệu chứng bệnh điển hình lây bệnh nhân tạo tạo đốm nhỏ, ngấm nước, (Hình 4.13, mục D, E, F), kết hợp lại gây vết hoại tử lớn làm chuyển sang màu vàng rụng sớm Các đặc điểm tương tự với triệu chứng ghi nhận đồng ruộng Các dịng XP1, XP7, XP17 có phản ứng Gram âm (–); màu vàng nutrient agar, có hoạt tính catalase dương tính (+) Kết thể dịng vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas (Schaad, 2001) 4.2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả đối kháng với Xanthomonas spp phân lập từ chất vùng rễ đất vùng sinh thái địa 4.2.1 Phân lập vi khuẩn Từ 20 mẫu chất vùng rễ hoa hồng phân lập 203 dòng vi khuẩn đánh số thứ tự từ BR1 đến BR203; Bên cạnh đó, 253 dịng vi khuẩn vùng rễ trồng ớt phân lập, đánh số ký hiệu từ BP1 đến BP253 Từ 36 mẫu đất ba vùng sinh thái địa tỉnh Đồng Tháp, 543 dòng vi khuẩn phân lập, bao gồm 303 dòng vi khuẩn từ Tràm Chim (từ T1 đến T303), 138 dòng vi khuẩn từ Gáo Giồng (từ G1 đến G138) 102 dòng vi khuẩn từ Xẻo Quýt (X1 đến X102) 4.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng điều kiện in vitro Từ 203 dòng vi khuẩn vùng rễ hoa hồng, 14 dòng vi khuẩn thể đối kháng triển vọng với ba dịng gây bệnh Trong đó, với ba dịng BR16, BR37 BR88 có khả đối kháng cao (hình 4.11; 4.12) Từ 543 dịng phân lập từ vùng sinh thái, 131 dòng vi khuẩn ghi nhận có khả ức chế ba dịng Xanthomonas spp Trong đó, dịng T265 (từ Tràm Chim), G24 (Gáo Giồng), X61 (Xẻo Quýt) có khả đối kháng cao (hình 4.11) 22 Hình 4.14: Biểu đồ thể khả đối kháng dòng vi khuẩn vùng rễ vùng sinh thái địa ba dòng XR13, XR9, XR18 Hình 4.15: Hiệu dịng vi khuẩn đối kháng (BR16, BR37, BR88) ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh hoa hồng A: Đối kháng dòng XR13; B: Đối kháng dòng XR9; C: Đối kháng dòng XR18; a: Đối chứng với giấy thấm dung dịch oxolinic acid 20%; b: Đối chứng sử dụng môi trường nutrient broth khử trùng; c: Giấy thấm huyền phù dòng BR16; d: Giấy thấm huyền phù dòng BR37; e: Giấy thấm huyền phù dòng BR88; f: Giấy thấm huyền phù dòng BR51 4.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm vi khuẩn ớt điều kiện in vitro Từ 253 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ trồng cây, 14 dòng vi khuẩn thể đối kháng triển vọng với ba dòng gây bệnh Trong đó, ba dịng dịng BP103, BP11 BP49 thể khả đối kháng cao (Hình 4.18) Từ 543 dòng vi khuẩn phân lập vùng sinh thái địa, 13 dòng vi khuẩn ghi nhận khả đối kháng cao ức chế dòng XP17 XP7, XP1 Trong đó, dịng T11, T188 (Tràm Chim), G24 (Gáo Giồng) đạt khả đối kháng cao (hình 4.18) 4.2.4 Xác định dịng vi khuẩn đối kháng triển vọng 23 Dựa vào kỹ thuật phân tích MALDI-TOF-MS, đa số dịng vi khuẩn đối kháng xác định chi như: dòng BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24 thuộc chi Bacillus, dòng T11 thuộc chi Enterobacter, dòng X16 thuộc chi Serratia Trong đó, dịng BP49, X61 xác định đến lồi B subtilis Ngồi ra, dịng T265 chưa xác định chi Các dòng BR16, BR37, BR88, T265, G24, BP103 tiếp tục phân tích trình tự gen 16S rRNA đăng ký “accession number” Nhìn chung, BR16 đề nghị B velezensis MW677565; dòng BR37 B subtilis MW828613; dòng BR88 tương ứng B amyloliquefaciens MW828656; BP103 đề xuất Bacillus velezensis OM017175; T265 định Paenibacillus elgii MZ841643, dòng G24 B subtilis MZ841644 4.2.5 Khảo sát mật độ đối kháng dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng Xanthomonas spp XP17 XR13 Khi giảm mật độ dòng XP17, XR13 xuống làm xuất tăng khả ức chế dòng vi khuẩn đối kháng Tuy nhiên, dòng vi khuẩn đối kháng với quần thể nhỏ 106 CFU/mL không hiệu hiệu thấp việc hình thành vùng ức chế vi khuẩn gây bệnh, khơng hiệu việc kiểm sốt bệnh điều kiện ngồi nhà lưới, ngồi đồng Do đó, mật độ khoảng 107 CFU/mL lựa chọn làm mật độ để xử lý thử nghiệm hoa hồng, ớt điều kiện nhà lưới, đồng 4.3 Nội dung 3: Khảo sát khả kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn điều kiện nhà lưới dòng vi khuẩn triển vọng 4.3.1 Đánh giá hiệu kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng điều kiện nhà lưới Kết phân tích ghi nhận dịng vi khuẩn đối kháng đạt hiệu kiểm soát bệnh, giúp giảm bệnh nhiều Riêng dịng BR88 có khả kiểm soát bệnh cao so với hai dòng vi khuẩn đối kháng 24 BR16, BR37, đặc biệt lây nhiễm dịng XR18 Vì thế, ba dịng lựa chọn xử lý tiếp tục thử nghiệm ngồi đồng Trong đó, dịng G24 có khả kiểm sốt bệnh vượt trội so với hai dịng vi khuẩn đối kháng X61, T265 Vì thế, ba dịng lựa chọn xử lý tiếp tục thử nghiệm ngồi đồng Hình 4.26: Hiệu kiểm sốt bệnh dòng vi khuẩn đối kháng bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng sau 16 NSKLN A: Nghiệm thức lây nhiễm dòng XR13; B: NT lây nhiễm dòng XR9; C: NT lây nhiễm dòng XR18; D: NT xử lý dòng BR88 trước lây nhiễm dòng XR13; E: NT xử lý dòng BR88 trước lây nhiễm dòng XR9; F: NT xử lý dòng BR88 trước lây nhiễm dòng XR18; G: NT xử lý dòng G24 trước lây nhiễm dòng XR13; H: NT xử lý dòng G24 trước lây nhiễm dòng XR9; I: NT xử lý dòng G24 trước lây nhiễm dòng XR18 Các nghiệm thức A, B, C nhiễm bệnh với mức độ bệnh cao hơn, thể qua tán bị nhiễm bệnh rụng nhiều Trong khi, nghiệm thức D, E, F, G, H, I có xử lý vi khuẩn đối kháng, có có hiệu giảm bệnh cao thể qua tán phát triển tốt 25 4.3.2 Đánh giá hiệu kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn ớt điều kiện nhà lưới Kết ghi nhận có lây nhiễm bệnh, ba dòng vi khuẩn đối kháng đạt hiệu kiểm sốt bệnh Riêng dịng BP103 có khả kiểm sốt bệnh cao so với hai dòng vi khuẩn đối kháng BP11, BP49, đặc biệt lây nhiễm dòng XP17 XP1 Trong dòng G24 có khả kiểm sốt bệnh vượt trội so với hai dịng vi khuẩn đối kháng T11, T188 Vì thế, dịng vi khuẩn đối kháng lựa chọn xử lý tiếp tục thử nghiệm đồng Hình 4.28: Hiệu kiểm sốt bệnh vi khuẩn đối kháng triển vọng (BP103) bệnh đốm vi khuẩn ớt sau 16 NSKLN A: Nghiệm thức lây nhiễm dòng XP17; B: NT lây nhiễm dòng XP7; C: NT lây nhiễm dòng XP1; D: NT xử lý dòng BP103 trước lây nhiễm dòng XP17; E: NT xử lý dòng BP103 trước lây nhiễm dòng XP7; F: NT xử lý dòng BP103 trước lây nhiễm dòng XP1; G: NT xử lý dòng G24 trước lây nhiễm dòng XP17; H: NT xử lý dòng G24 trước lây nhiễm dòng XP7; I: NT xử lý dòng G24 trước lây nhiễm dòng XP1 26 Các nghiệm thức A, B, C nhiễm bệnh với mức độ bệnh cao Trong khi, nghiệm thức D, E, F, G, H, I có xử lý vi khuẩn đối kháng, có hiệu giảm bệnh cao thể qua tán phát triển tốt 4.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng ớt điều kiện ngồi đồng dịng vi khuẩn đối kháng 4.4.1 Đánh giá hiệu kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng điều kiện ngồi đồng dịng vi khuẩn đối kháng Ở điều kiện ngồi đồng, dịng vi khuẩn đối kháng đạt hiệu kiểm soát bệnh Nghiệm thức có xử lý dịng BR16 BR88 đạt HQGB tương đương ý nghĩa thống kê tương ứng đạt 67%; 73,2% (khi lây nhiễm XR9), 66,2%; 71,9% (khi lây nhiễm XR18), cao 1,2 đến 1,4 lần so với nghiệm thức xử lý BR37 Như vậy, xử lý dòng BR88 (B amyloliquefaciens MW828656) đạt hiệu giảm bệnh tương đương với dòng BR16 (B velezensis MW677565), cao dịng BR37 Bên cạnh đó, kết phân tích hiệu giảm bệnh xử lý dịng X61 T265 cho thấy dịng có hiệu tương đương ý nghĩa thống kê, tương ứng từ 62,8% đến 65,2% (khi lây nhiễm dòng XR13), từ 58,3% đến 60,8% (khi lây nhiễm dòng XR9), lây nhiễm dịng XR18 hiệu giảm bệnh dao động từ 60,5% đến 62,2% Trong khi, nghiệm thức có xử lý dịng G24 (B subtilis) thể hiệu giảm bệnh cao so với hai dòng X61, T265, với hiệu giảm bệnh đạt 74,5%, 75,7%, 75,6% tương ứng lây nhiễm dòng XR13, XR9, XR18 4.4.2 Đánh giá hiệu kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn ớt điều kiện ngồi đồng dịng vi khuẩn đối kháng Ở điều kiện ngồi đồng, ba dịng BP11 (Bacillus sp.), BP49 (B subtilis), BP103 (Bacillus velezensis) đánh giá hiệu giảm bệnh, kết ghi nhận BP11, BP49, BP103 có khả hạn chế gây 27 hại từ ba dòng Xanthomonas spp XP17, XP7, XP1 Trong đó, nghiệm thức có xử lý dịng BP11 BP49 đạt HQGB tương đương tương ứng đạt 61,8%, 54,1% (LNB XP17), 66,8%, 63,6% (LNB XP7), 61,3%, 58,8% (LNB XP1) cao 1,2 đến 1,4 lần so với nghiệm thức xử lý BP103 (tương ứng 73,2%, 78,4%, 76,1%) Như vậy, điều kiện đồng, xử lý dòng BP103 đạt hiệu giảm bệnh cao Trong đó, ba dịng G24, T11, T188 có khả hạn chế gây hại từ ba dòng Xanthomonas spp., với dòng T11 T188 ghi nhận có hiệu tương đương Bên cạnh đó, nghiệm thức có xử lý dịng G24 thể hiệu giảm bệnh cao so với hai dòng T11 T188, với hiệu giảm bệnh đạt 79,8%, 75,8%, 75,3% tương ứng lây nhiễm dòng XP17, XP7, XP1 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Luận án ghi nhận dòng Xanthomonas euvesicatoria tác nhân gây bệnh đốm hoa hồng qua phân tích MALDI-TOF-MS MLSA; Trong đó, xác định Xanthomonas spp gây bệnh đốm ớt dựa đặc điểm sinh hóa Qua sàng lọc in vitro, kết ghi nhận ba dòng BR16, BR37, BR88 (từ chất vùng rễ hoa hồng) ba dòng T265, X61, G24 (từ đất vùng sinh thái địa) thể đối kháng triển vọng với ba dòng Xanthomonas euvesicatoria (XR13, XR9, XR18) gây bệnh hoa hồng Đồng thời, ba dòng BP11, BP49, BP103 (từ đất vùng rễ ớt) G24, T11, T188 (từ đất vùng sinh thái địa) có khả đối kháng triển vọng ba dòng Xanthomonas spp (XP17, XP7, XP1) gây bệnh ớt Các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng xác định qua kỹ thuật phân tích MALDI-TOF-MS, dịng BP49, X61 xác định đến loài B subtilis, ghi nhận dòng BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24 thuộc chi Bacillus, dòng T11 thuộc chi 28 Enterobacter, dòng X16 thuộc chi Serratia Một số dòng tiếp tục xác định qua phân tích sinh học phân tử đăng ký “accession number” loài B velezensis MW677565 (BR16), B subtilis MW828613 (BR37), B amyloliquefaciens MW828656 (BR88), B velezensis OM017175 (BP103), Paenibacillus elgii MZ841643 (T265), B subtilis MZ841644 (G24) Ở điều kiện nhà lưới đồng, B amyloliquefaciens MW828656 (BR88) B velezensis OM017175 (BP103) ghi nhận hiệu kiểm soát bệnh cao đối tượng chủ tương ứng, đặc biệt B subtilis MZ841644 (G24) phân lập từ đất vùng sinh thái địa đạt hiệu kiểm soát bệnh cao hai loại chủ Các dịng vi khuẩn sử dụng tác nhân sinh học phòng trị bệnh đốm hoa hồng ớt 5.2 Đề xuất Trong tương lai, đa dạng di truyền tất dòng vi khuẩn phân lập, xác định phân dịng (race) tiếp tục xác định Ngồi ra, với tiềm kiểm sốt bệnh dòng vi khuẩn phân lập, tương lai hướng đến nghiên cứu phối hợp dịng việc kiểm sốt mầm bệnh đốm trồng 29 ... tỉnh đồng tháp tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh? ?? nghiên cứu thực 1.2 Mục tiêu luận án Phân lập xác định dòng vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm hoa hồng lửa (Rosa spp.) ớt cay (Capsicum. .. dung 1: Phân lập xác định dòng vi khuẩn gây bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng ớt 3.3.1.1 Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp từ mẫu bệnh Mục tiêu: Phân lập dòng vi khuẩn gây bệnh hoa hồng lửa ớt phục vụ... euvesicatoria gây bệnh ớt (Capsicum sp.) 2.2 Các nghiên cứu Xanthomonas sp gây bệnh đốm hoa hồng ớt 2.2.1 Vi khuẩn gây bệnh đốm hoa hồng Năm 2013, Huang et al tiến hành nghiên cứu bệnh đốm vi khuẩn hoa hồng