Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏdioxin ở biên hòa, đồng nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập

VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀCÔNG NGHỆVIỆT NAM VIỆNCÔNGNGHỆSINHHỌC PHẠMQUANGHUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤTNHIỄMCHẤTDIỆTCỎ/DIOXINỞBIÊNHÒA,ĐỒNGNAIVÀĐÁNHGIÁ KHẢNĂNGPHÂNHỦYCỦAMỘTSỐCHỦNGPHÂNLẬP LUẬNÁN TIẾNSĨSINHHỌC Hà Nội,2021 PHẠMQUANGHUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤTNHIỄMCHẤTDIỆTCỎ/DIOXINỞBIÊNHÒA,ĐỒNGNAIVÀĐÁNHGIÁ KHẢNĂNGPHÂNHỦYCỦAMỘTSỐCHỦNGPHÂNLẬP Chuyên ngành: Vi sinh vật họcMãsố:9420107 LUẬNÁNTIẾNSĨSINHHỌC Ngườihướng dẫnkhoa học: PGS.TS.ĐặngThịCẩmHà Viện Công nghệ sinh họcTS.NguyễnKimThoaViện Côngnghệsinhhọc Hà Nội,2021 LỜICẢMƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đếnPGS TS Đặng Thị Cẩm HàvàTS.Nguyễn Kim Thoa, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Côngnghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt sở vật chấtcũng động viên tơi lúc khó khăn để tơi thực vàhồnthànhluậnánnày Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh họcđãtạomọiđiềukiệnthuậnlợichotơiđượchọctập,nghiêncứuvàhồnthànhluậnán Tơi xin cảm ơn tập thể cán Phịng Cơng nghệ sinh học tái tạo mơi trường đãtậntìnhgiúpđỡ tơitrongqtrìnhthực luậnán Tơi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ đề tài độc lập cấp nhà nước:“Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxinnhằm tìm kiếm gen, enzymemới có khảnăng phân hủyd i o x i n ” PGS.TS.ĐặngThịCẩmHàchủnhiệm Tôi xin chân thành cảm ơnThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đàotạo,V i ệ n C ô n g n g h ệ s i n h h ọ c đ ã t ậ n t ì n h h n g d ẫ n t ô i h o n t h n h m ọ i t h ủ t ụ c trongsuốtqtrìnhhọc tậplàmnghiêncứusinhtạiViện Cuối cùng, tơi xin gửi tới người thân gia đình bạn bè biết ơn,đặcbiệtlàbốmẹđãdànhchotơitìnhuthươngsâusắcvàtạođiềukiệntốtnhấtđểt ơihọc tậpvàhồnthànhtốtnộidungluậnán Tơixintrântrọngcảmơn! HàNội,ngày……tháng……năm2021 NCS.PhạmQuangHuy i LỜICAMĐOAN Tơixincamđoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cáccộngsự khác Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, phần cơngbố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồngtácgiả Cácthơngtintríchdẫn trongluậnánđãđượcghirõnguồngốc Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021Tácgiả NCS.PhạmQuang Huy ii MỤCLỤC LỜICẢMƠN .i LỜICAMĐOAN .ii MỤCLỤC .iii DANHMỤCCÁCBẢNG vi DANHMỤCCÁCHÌNH vii DANHMỤCCÁCKÝHIỆUVÀCHỮVIẾTTẮT .ix MỞĐẦU CHƯƠNG1:TỔNGQUANTÀILIỆU .4 1.1 Phânhủysinhhọcchấtdiệtcỏ/dioxin 1.1.1 Đặcđiểmvàảnhhưởngcủachấtdiệtcỏ/dioxintớimôitrườngvà conngười 1.1.2 Ơnhiễmchấtdiệtcỏ/dioxinởsânbayBiênHịavàĐàNẵng 1.1.3 Phânhủysinhhọcchấtdiệtcỏ/dioxintrongđấtônhiễm 1.2 ĐadạngVSVvàgenechứcnăngtrongđ ấ t ô n h i ễ m c h ấ t d i ệ t cỏ/dioxin 12 1.2.1 ĐadạngVSVhiếukhínicấyđượctrongđấtơnhiễm .12 1.2.2 Đadạngvikhuẩnkịkhínicấyđượctrongđấtơnhiễmdioxin 13 1.2.3 Đadạnggenechứcnăngmãhóachoenzymethamgiaphânhủy chấtdiệtcỏ/dioxin 18 1.3 Sửd ụ n g c ô n g c ụ m e t a g e n o m i c n g h i ê n c ứ u đ a d n g V S V ô nhiễmP O P s 19 CHƯƠNG2:VẬTLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 27 2.1 Vậtliệu 27 iii 2.1.1 Đốitượngnghiêncứu .27 2.1.2 Cáchóachấtvàthiếtbịmáymóc 29 2.1.3 Môitrườngnuôicấy 30 2.1.4 Sơđồthínghiệm 30 2.2 Phươngphápnghiêncứu 32 2.2.1 Thuthậpvàbảoquảnmẫuđấtđểnghiêncứumetagenome 32 2.2.2 Phântíchthànhphầncơgiớivànồngđộdioxintrongmẫunghiêncứu .32 2.2.3 Phânlập,phânloạiVSVtừnguồnđấtnhiễmchấtdiệtcỏ/dioxin 32 2.2.4 Phươngphápxácđịnhhoạttínhlaccasevàlaccase-like 33 2.2.5 Đánhg i p h â n h ủ y , , , TCDDtrongđấtônhiễmbởihỗn hợpVSV .34 2.2.6 PhươngpháptáchchiếtDNAmetagenome 35 2.2.7 PhươngphápxácđịnhhàmlượngvàđộtinhsạchcủaDNAmetagenome 35 2.2.8 PhântíchtrìnhtựDNAmetagenomecủaCvàBHR 36 CHƯƠNG3:KẾTQUẢNGHIÊNCỨU 39 3.1 Phânhủysinhhọcchấtdiệtcỏ/dioxinbởitổhợpvikhuẩn,xạkhuẩn quymơphịngthínghiệm 40 3.1.1 Vikhuẩntừđấtnhiễmdioxinphânlậpđược,địnhdanhvàkhảnăng phânhủydioxinbởitổhợp5chủngvikhuẩncótiềmnăng 40 3.1.2 Xạ khuẩntừ đấtnhiễmdioxinđã đượcphânlập, địnhdanhvàkhả năngphânhủydioxinbởitổhợp5chủngxạkhuẩntiềmnăng 42 3.2 ĐadạngVSVvàgenechứcnăngtừtrìnhtựDNAmetagenomeC vàBHR 46 3.2.1 ThunhậnDNAmetagenometừmẫuCvàBHR 46 iv 3.2.2 Trìnht ự , c o n t i g v g e n e c h ứ c n ă n g t m e t a g e n o m e c ủ a m ẫ u C vàBHR 47 3.2.3 ĐadạngVSVcủametagenomeCvàBHR 49 3.2.4 Mốiliênhệgiữamộtsốchivikhuẩnvớitổngđộđộcvàcácđặc tínhlýhóacủađất .69 3.2.5 ĐadạnggenechứcnăngthamgiaphânhủyxenobioticcủametagenomeC vàBHR 70 3.2.6 Nhómgenemãhóaenzymethamgiaphânhủy,chuyểnhóachất diệtcỏ/dioxin 72 3.2.7 Genethamgiavàophânhủychuyểnhóaxenobiotictừmetagenome đãđượcpháthiện 76 CHƯƠNG4:BÀNLUẬNKẾTQUẢNGHIÊNCỨU .79 4.1 ĐadạngVSVvàgenechứcnăngtừtrìnhtựDNAmetagenomeC vàBHRthuđược 79 4.2 ĐadạnggenechứcnăngthamgiaphânhủyxenobioticcủametagenomeC vàBHR( m ộ t t r o n g c o n đ n g p h â n h ủ y v khốnghóadioxin) 92 KẾTLUẬNVÀKIẾNNGHỊ 95 NHỮNGCƠNGTRÌNHC Ủ A T Á C G I Ả Đ Ã C Ô N G B Ố L I Ê N QUA NĐẾNĐỀTÀI .97 TÓMTẮTLUẬNÁNBẰNGTIẾNGANH 98 TÀILIỆUTHAMKHẢO 105 PHỤLỤC v DANHMỤC CÁCBẢNG Bảng 3.1 Hiệusuấtphânhủydioxintrongđấtô n h i ễ m c h ấ t d i ệ t cỏ/dioxi nbởi tổhợp5chủngvikhuẩn 42 Bảng 3.2 Hiệusuấtphânhủydioxintrongđấtô n h i ễ m c h ấ t d i ệ t cỏ/dioxi nbởichủngXKBHA22 45 Bảng 3.3 Hiệusuấtphânhủydioxintrongđấtô n h i ễ m c h ấ t d i ệ t cỏ/dioxi nbởi tổhợp5 chủngxạkhuẩn 45 Bảng 3.4 Trìnhtựread chất lượng cao 47 Bảng 3.5 Lắp rápdenovotrìnhtựDNA metagenomeC,BHR .48 Bảng 3.6 Phân bốgenetừtrìnhtựDNAmetagenome C,BHR .48 Bảng 3.7 ĐadạngởcácmứcđộphânloạicủametagenomeCvàBHR 52 Bảng 3.8 Mộts ố c h i c ó c c đ i d i ệ n đ ã đ ợ c c h ứ n g m i n h c ó k h ả năngphânhuỷchấtdiệt cỏ/ dioxin 57 Bảng 3.9 ĐadạngnấmsợivànấmđảmtrongmetegenomecủaCvà BHR 66 Bảng 3.10.Sốlượngtrìnhtựtươngđồngcaovớicácgenechứcnăng trongtập dữliệu chuẩn hóa 71 Bảng 3.11.S ố lượngtrình tựliênquan đặcthùtớicon đườngphân2,4Dv p o l y c h l o r i n a t e d b i p h e n y l ( P C B ) d ự a t r ê n c s d ữ liệuKEEG 72 DANHMỤC CÁCBẢNG vi DANHMỤCCÁCHÌNH Hình1.1.C ấ u trúchóa học củaPCDD, PCDF PCB Hình1.2.C chếtạora2,3,7,8-TCDDtrongqtrìnhtổnghợp2,4,5-T .5 Hình1.3:Cácconđườngchuyểnhóa,phânhủy,khốnghóahỗnhợpchấtd iệtcỏ/dioxinvàcácchấttraođổichấtbằngphương phápsinhhọc Hình1.4.N g h i ê n c ứ u t h e o h n g - O m i c s t r o n g sinhhọc 20 Hình1.5.C c bướcthựchiệnphântích metagenomic 22 Hình2.1.M ẫ u đấtnhiễmnặng chấtdiệt cỏ/dioxin(kýhiệu C) .27 Hình2.2.M ặ t cắtdọccủalơxửlý 28 Hình2.3.M ẫ u đấttrongl ơxử lýbằngcơng nghệphân h ủy sinhhọc (kýhiệuBHR) .28 Hình2.4.S đ thực hiệnnghiên cứu 31 Hình2.5.Q u y trìnhphântíchdữliệuDNAmetagenometrênhệthống MGRAST 37 Hình3.1.H ì n h tháik h u ẩ n l c c h ủ n g v i k h u ẩ n B H B i , B H B i , BHBi5,BHBi7 vàBHO9từmẫul m g i u t r ê n m ô i t r n g MSM chứadịchchiếtđất 40 Hình 3.2.Hìnhtháitếbào5chủngvikhuẩndướikínhhiểnviđiệntửqt 41 Hình3.3.C â y phát sinhchủngloạicủa5 chủngvikhuẩn 41 Hình3.4.K h ả năngphânhủychấtdiệtcỏ/dioxintrong đấtbằng tổhợpvikhuẩnA:Đốichứng(khơngcóVSV);B:Tổhợp5chủng vikhuẩn 42 Hình 3.5.Hìnhtháikhuẩnlạc5 c h ủ n g x k h u ẩ n v s i n h t r n g c ủ a chúngtrên môi trườngGauseMchứaDCĐ 43 vii