Tính cấpthiếtcủaluậnán
Nấm ăn là thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, có hàm lượng proteincao, chứa nhiều loại vitamin và các axit amin thiết yếu Nhiều loại nấm cótácd ụn g dượcl ý p h o n g p h ú n h ư tăngc ư ờ n g k h ả n ă n g m i ễ n dịch,kháng ung thư, kháng virus,ngăn ngừa và trịliệucác bệnh tim mạch,g i ả i đ ộ c , bảov ệ t ế b à o g a n , a n t h ầ n v à c ó l ợ i c h o v i ệ c đ i ề u c h ỉ n h h o ạ t đ ộ n g c ủ a t rung ươngthầnkinh.
Việt Nam là nước có nhiều điều kiện thuận lợi cho sản xuất nấm,trong đó nguồn nguyên liệu dồi dào, điều kiện khí hậu thời tiết phù hợp làhai yếu tố quan trong để phát triển nghề trồng nấm Nhiều công trình khoahoc cùng các mô hình thực nghiệm sản xuất đã khẳng định, trồng nấm làmột trong những giải pháp chuyển đổi sinh hoc hiệu quả nhất, nó không chỉmang lại hiệu quả kinh tế, xã hội cao mà còn góp phần gìn giữ và bảo vệmôitrường. Ởn ư ớ c t a , c á c l o ạ i n ấ m đ ư ợ c t r ồ n g p h ổ b i ế n l à m ộ c n h ĩ , n ấ m s ò , nấmr ơ m M ù n c ư a v ớ i g i á t h à n h r ẻ , đ ặ c t í n h l ý h ó a p h ù h ợ p c h o t r ồ n g nấm, nguồn cung dồi dào đã trở thành nguyên liệu sử dụng chủ yếu trongtrồng nấmhiệnnay.
Năng suất và chất lượng nấm trồng được quyết định bởi nhiều yếu tốnhư: cơ chất trồng nấm, giống nấm, các điều kiện môi trường nuôi trồng Với đặc điểm hoại sinh, ở một số loài có hệ enzyme phân giải ligno-xenluloza mạnh, nấm có thể phân hủy được các cơ chất phức tạp tạo nguồndinh dưỡng nuôi sợi nấm Tuy nhiên đa phần các loài nấm trồng không thểsử dụng được ngay nguồn nguyên liệu khó phân hủy (mùn cưa của các loạigo cứng, mùn cưa go tạp) mà phải sử dụng các cơ chất đã hoai mục hoặc cósựhotrợphângiảicơchấtcủavisinhvậttrướckhitrồngnấm.Vìvậy,xử lý nguyên liệu là công đoạn vô cùng quan trong, quyết định chất lượngnguồn dinh dưỡng trong quá trình trồng nấm, từ đó tác động đến sự sinhtrưởng, phát triển và ảnh hưởng tới tỷ lệ nhiễm hỏng của nấm Tuy nhiên,các nghiên cứu về nấm hiện nay chủ yếu tập trung vào giống nấm, biệnpháp kỹ thuật trồng, thu hoạch, chế biến và bảo quản sau thu hoạch, màchưa quan tâm nhiều tới công đoạn xử lý nguyên liệu đặc biệt là xử lý bằngcôngnghệvisinhvật.
Sử dụng vi sinh vật tổng hợp enzyme chuyển hóa hợp chất ligno –xenluloza làm tác nhân xử lý mùn cưa trồng mộc nhĩ có tác dụng tăng tốcđộ chuyển hóa, rút ngắn thời gian ủ nguyên liệu, tạo nguồn dinh dưỡngthích hợp cho nấm sinh trưởng và phát triển, giảm tỉ lệ nhiễm bệnh qua đógiảm chi phí nhân công, chi phđầu tư xây dựng nhà xưởng và gia tăng lợinhuận chongườitrồng nấm.
Bã mùn cưa sau trồng mộc nhĩ hiện nay thường bị đổ bỏ như rác thải,qua nghiên cứu chúng tôi nhận thấy: trong bã mùn cưa vẫn còn lượngxenluloza và hemixenlulozat ư ơ n g đ ư ơ n g v ớ i r ơ m r ạ , v ì v ậ y c ó t h ể t ậ n dụng nguồn nguyên liệu này để trồng tiếp nấm sò Tuy nhiên trong bã mùncưa có phần sợi và gốc nấm mộc nhĩ còn lại sau thu hoạch, đây là nhân tốgây ức chế sự sinh trưởng của các nấm khác, vì vậy nếu sử dụng ngay bãsau trồng mộc nhĩ để trồng nấm sò sẽ đem lại hiệu quả không cao Việc bổsung VSV phân giải lingo – xenluloza vào bã mùn cưa sau trồng mộc nhĩ,giúp khắc phục những nhược điểm trên đồng thời tận dụng được nguyênliệu một cách tối đa, giảm chi phđổ bỏ phế thải, tăng hiệu quả kinh tế vàgóp phầnbảovệmôitrường.
Nhằm nângcao hiệu quả sử dụngmùncưa trongs ả n x u ấ t n ấ m ă n , đáp ứng nhu cầu thực tế của người trồng nấm, đề tài luận án “Nghiên cứuứngdụngvisinhvậtxửlýmùncưalàmcơchấtnuôitrồngmộcnhĩvà tái sử dụng bã thải để trồng nấm sò” được thực hiện tại Bộ môn Sinh hocMôit r ư ờ n g - V i ệ n M ô i t r ư ờ n g N ô n g n g h i ệ p , K h o a N ô n g L â m -
T r ư ờ n g Đại hoc Hoa Lư, Ninh Bình và được sự ho trợ từ đề tài “Ứng dụng vi sinhvật trong xử lý mùn cưa nuôi trồng mộc nhĩ, tái sử dụng trồng nấm sò vàlàmphânhữucơ”doTrườngĐạihoc HoaLưchủ trì.
Mụctiêucủaluậnán
Mục tiêu của đề tài luận án là phân lập, tuyển chon và xác định đượckhả năng ứng dụng vi sinh vật chuyển hóa hợp chất ligno – xenluloza trongxử lý mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ, tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩlàm cơ chất trồng nấm sò và xây dựng được qui trình sản xuất, sử dụng chếphẩm sinh hoc từ vi sinh vật tuyển chon để xử lý có hiệu quả mùn cưa làmcơ chất trồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chấttrồng nấmsò.
3 Ýnghĩakhoahọcvàthực tin củaluận án Đề tài luận án đã cung cấp các luận cứ, cơ sở khoa hoc và thực tiễnchoviệcsửdụngvisinhvậtchuyểnhóahợpchấtligno–xenlulozatrongxử lý mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải trồng mộcnhĩl à m c ơ c h ấ t t r ồ n g n ấ m s ò K ế t q u ả p h â n l ậ p , t u y ể n c h o n v i s i n h v ậ t phâ n giải ligno – xenluloza đồng thời góp phần làm giàu nguồn gen vi sinhvậtn ô n g nghiệp.
5 có khả năng tổng hợp enzyme xenlulaza, ligninperoxidaza và mangan peroxidaza thúc đẩy nhanh quá trình xử lý mùn cưalàm cơ chất trồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chấttrồngnấmsò.ChếphẩmsinhhoctừchủngxạkhuẩnStreptomycesthermocoprophilusMC05 được nghiên cứu phát triển và thử nghiệm thànhcông ởmộtsố cơ sởtrồng nấmtạiNinhBình,mởra giải phápmớicho việc sử dụng hiệu quả mùn cưa trong sản xuất nấm ăn, góp phần tích cực bảo vệmôitrườngvànângcaohiệuquảsảnxuất. Đề tài luận án là công trình nghiên cứu tổng hợp đầu tiên tại ViệtNam về phân lập, tuyển chon, xác định chủng vi sinh vật chuyển hóa hợpchất ligno – xenluloza để sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong xử lýmùncưalàmcơchấttrồngmộcnhĩvàtáisửdụngbãthảitrồngmộcnhĩlàmcơ chấttrồngnấmsò.Nhữngđónggóp mớicủa luậnán cụthểnhưsau:
Phânlập,tuyểnchonvàxácđịnhđượcchủngxạkhuẩnStreptomyces thermocoprophilusMC05 thuộc nhóm an toàn sinh hoc rủi rocấp độ 1 có khả năng tổng hợp enzyme xenlulaza, lignin peroxidaza vàmangan peroxidaza thúc đẩy nhanh quá trình xử lý mùn cưa làm cơ chấttrồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồng nấmsò.
Xác định được các điều kiện tối ưu trong nhân sinh khối chủng xạkhuẩnStreptomycesthermocoprophilusMC05.Đâylànhữngkếtquảnghiên cứu đầu tiên về tối ưu hóa trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm visinh vậtápdụngtrongxửlýcơ chất trồngnấmởnước ta.
Xây dựng được qui trình sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh vậttrong xử lý mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ, tái sử dụng bã thải trồngmộc nhĩlàmcơ chấttrồngnấmsò.
Kết quả sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong xử lý mùn cưa làm cơchất trồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải trồng mộc nhĩ làm cơ chất trồngnấm sò mở ra giải pháp mới cho việc sử dụng hiệu quả mùn cưa trong sảnxuất nấm ăn, góp phần bảo vệ môi trường và nâng cao hiệu quả sản xuấtnấmăn từmùncưa.
Ýnghĩakhoa hocvà thực tiễncủa luậnán
Giới thiệuchungvềmộc nhĩ vànấmsò
Mộcn h ĩ c ó t ê n k h o a h o c l àA r i c u l a r i a s p p,q u ả t h ể h ì n h đ ĩ a t r ò n (hình tai) đường kính từ 2,0-15,0cm, có nhiều màu sắc và hình thái khácnhau Tác giả X.C.Luo, 1993 (trích theo Lê Duy Thắng, 1999) cho rằngmộc nhĩ có khoảng 15-20 loài khác nhau Theo Đo và Trịnh năm 1 75(Trích theo Vương Bá Triệt và cộng sự, 1994) phân loại mộc nhĩ dựa vàolớp lông tơ trên bề mặt quả thể Năm 1 51, Lowy (1 51) đã đưa ra phươngpháp phân loại dựa vào hình thái cấu tạo bên trong của nấm (Trích theoVương BáTriệt,1994).
TheoTrịnhTamKiệt(1986),ởViệtNamhiệnnaymớichỉtìmthấy6 loài mộc nhĩ và trong đó có 2 loài được trồng phổ biến làAuriculariapolytricha(Mont) Sacc vàAuricularia auricula(L.ex Hook.) Underw.Hiện nay, giống mộc nhĩ ngày một đa dạng nhưng chưa được nuôi trồng vàđánh giá đúng tiềm năng của giống để đưa vào sản xuất (Trịnh Tam Kiệt,2001).
Theo phân loại của Lowy (1 51) (tr ch theo Vương Bá Triệt, 1994),mộcnhĩthuộc:ngành–Mycota,lớp–Basidiomycetes,lớpphụ-
Phragmobasidiomicetidae,bộ -Auriculariales,ho -Auriculariaceac,loài - Auricularia spp
Nấm sò có hơn 30 loài, cùng có tên khoa hoc chung làPleurotus sp.,thuộc chiPleurotus, hoPleurotaceae, bộAgaricales, lớpAgaricomycetes,ngànhphụAgaricomycotina,ngànhNấmđảm–
–Fungi Ở Việt Nam, nấm sò còn có tên goi khác lànấm bào ngư (ĐinhXuân Linh và cộng sự, 2012) Việc nuôi trồng loại nấm này bắt đầu từnhữngnăm14 (NguyễnLânDũng,2004).
Từ xưa đến nay nấm ăn luôn được coi là thực phẩm đặc biệt NgườiLa Mã coi nấm là “thức ăn của thượng đế”, chỉ dùng trong những ngày lễtết Người Trung quốc coi nấm là thức ăn của sức khoẻ và goi là “Sơn trân”(Ngoc quí của núi) Theo Nuhu Alam et al.,
(2008) hàm lượng protein củanấm sò tươi đạt trung bình 2,6 – 3,4%(bảng 1.1) và chứa nhiều axit aminquí (bảng 1.2) Theo FAO (1972) mộc nhĩ là một trong các loại nấm ăn cóvai trò quan trong trong khẩu phần ăn ở châu Á Thành phần dinh dưỡngcủa mộc nhĩ khô gồm protein thô (7,9%), chất béo (1,2%), cacbonhydtrat(84,2%).
Bảng1.1.Thànhphần dinhdưỡng củamột sốloại nấmsòtươi
Hàm lượng protein trong các loài nấm ăn khác nhau, phụ thuộc vàotừng giống nấm, điều kiện ngoại cảnh và môi trường nuôi trồng (NguyễnLân Dũng, 2001). Theo Changet al.,(1993), Tổ chức nông lương thế giới(FAO) đã công nhận nấm là thức ăn bổ sung dinh dưỡng protein cho nhữngquốcgiaphụthuộc vàonguồnngũcốc.
Bên canh protein, hydratcacbon của nấm ăn chiếm khoảng từ 3-28%khối lượng nấm tươi, gồm các loại đường pentoza, hexoza, disaccharide,trong đó glucoza được dùng như là thành phần t ch lũy năng lượng, so sánhđượcvớitinhbộtcủathựcvậtthượngđẳng.Ngoàira,trongnấmcóchứa polysaccharide thu hút sự quan tâm củan h i ề u n g ư ờ i v ì h o ạ t t í n h c h ố n g khối u (Changetal.,1993).
Chất xơ chứa trong nấm chủ yếu là chitin, chiếm tỷ lệ 7,3-8,0%.Chitin không đóng vai trò về dinh dưỡng nhưng thành phần chất xơ trongthức ăn cao sẽ làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư kết tràng và ổn địnhhàmlượngđườngtrongmáucho cácbệnhnhântiểuđường.
Nấmănlànguồncungcấpvitamindồidàonhưthiamin,riboflavinvà tiền vitamin D2 Vitamin D2giúp tăng cường hấp thụ Ca, P, chống lãohóa và còi xương (Stamentset al.,2000) Trong 140 loài nấm phân tích ởNhật Bản có tới 118 loài chứa bình quân 0,126 mg vitamin B2/100g nấm.Vitamin B12vốn không có trong thức ăn thực vật nhưng lại có chứa trongnấmA bisporus, Morchella spp Vitamin có mặt phổ biến trong nấm ăn,hàm lượng trung bình khoảng 13mg/100g nấm (Nguyễn Lân Dũng, 2001).Hayeset al.,(1981) cho biết 3g nấm tươi có thể đủ cung cấp nhu cầuvitamin B12cho 1 người trong một ngày (trích theo Nguyễn Lân Dũng,2001).Lưu, (1984)cho rằng 100gmộcnhĩtươi chứa200mg vitaminC.
Nấm ăn rất giàu chất khoáng, đặc biệt là kali, canxi, photpho, magie,natri.Trong nấm ăn hàm lượng photpho và canxicó nhiều hơn trong hoaquảvà rau(LinZhanxiet al.,1999).
1.1.3 Điềukiệnsinhtrưởng và phát triểncủamộcnhĩ và nấmsò
Nấm sống dị dưỡng, lấy thức ăn từ các nguồn chất hữu cơ Nguồndinh dưỡng cơ bản để nấm sinh trưởng và phát triển gồm: Cacbon (C), Nitơ(N), chất khoáng và vitamin Với cấu trúc sợi, nấm dễ dàng len lỏi ăn sâuvào trong cơ chất, lấy dinh dưỡng nuôi cơ thể Tuy nhiên,cũng có nhữngloại nấm không thể phân giải ngay được cơ chất, mà phải nhờ sự phân giảicơchấtcủa visinhvật.
Theo Hassanet al.,(2012), cacbon là yếu tố dinh dưỡng bắt buộc đểnấm sinh trưởng, phát triển và đặc biệt tác động mạnh ở giai đoạn mầmquả thể Sợi nấm tiết ra enzymex e n l u l a z a p h â n h u ỷ c á c n g u ồ n c a c b o n thành dạng monosaccharide, disaccharide để cung cấp năng lượng cho cácquá trình biến dưỡng của tế bào nấm Đa phần các loại nấm trồng sử dụngnguồnc a c b o n d ư ớ i d ạ n g c a c b o n h y d r a t e c ó n g u ồ n g ố c t ừ t h ự c v ậ t B ê n cạnhđó,nấmcũngcóthểsửdụngnguồncacbonkhôngphảilàcacbonhydrate như ethanol, glycerin Nấm sinh trưởng tốt hơn trên môitrường đường đơn với nồng độ thích hợp khoảng 2% (Miles, 1999;
Horr,1936).N g u ồ n c a c b o n t h í c h h ợ p c h o s ự s i n h t r ư ở n g c ủ a h ệ s ợ i n ấ m gồm ti nh bột, glucoza, fructoza, maltoza, mannoza, sucaroza, pectin, xenluloza,lignin, ethanol, trong đó glucoza là nguồn cacbon tốt nhất Citrat, oxalat vàcácaxithữucơkháckhôngcólợi chosựpháttriểncủanấm.
Nitơcóvaitròquan trong trongviệchình thànhcấu trúcv à h o ạ t động chức năng ở nấm Nấm sử dụng nitơ để tổng hợp protein, purines,pyrimidines hình thành cấu trúc tế bào Nitơ còn được sử dụng để tổng hợpchitin của hệ sợi (Miles, 1999) Thiếu nitơ, sự sinh trưởng của sợi nấm sẽ bịhạn chế Hàm lượng nitơ trong cơ chất quá thấp, sợi nấm không thể pháttriển được, ngược lại hàm lượng nitơ trong cơ chất quá cao sẽ kích thíchhìnhthành sợi khísinh, từ đólàm giảm khảnăng tạoquảthểnấm.M ộ t chức năng quan trong nữa của nitơ là tổng hợp enzyme xenlulaza để phângiảixenlulozatừcơchấttạonguồndinhdưỡngcacbonchon ấ m s i n h trưởngvà pháttriển.
Theo Chang và Miles, (2004), nguồn nitơ mà hệ sợi nấm dễ sử dụngđược cung cấp từ peptone, bột đậu tương, bột nấm men, ammonium sulfate,asparagin,serine,alaninevà glycine,trongđóđạmurêt được sửdụng.
TheoTrịnhTam Kiệt, (2012), nitơ làyếutốdinh dưỡngcơb ả n trong môi trường nuôi cấy sợi nấm, nitơ cần thiết cho sự tổng hợp các axitamin và các protein Nguồn nitơ bổ sung cho quá trình trồng nấm có thể lànitơ vô cơ hoặc nitơ hữu cơ, trong đó, nitơ hữu cơ giúp nấm phát triển tốthơn sovớinitơvôcơ.
Ngoài vai trò riêng biệt của từng nguyên tố cacbon và nitơ, tỉ lệ C/Nrất quan trong đối với sự sinh trưởng, phát triển của nấm Ở mộc nhĩ, sựsinh trưởng diễn ra trong điều kiện cơ chất có tỷ lệ C/N nhỏ hơn 60 1, trongđót ốt nh ất là 3 5 / 1 Vớim ù n cư a câycaosu, tỷlệC/Nlà 56 /1 , nhưng ở mùn cưa go tạp tỷ lệ này rất cao có thể lên tới trên 100/1, vì vậy trong quátrình trồng nấm phải bổ sung cân đối dinh dưỡng để đảm bảo tỷ lệ C/N phùhợpchosựpháttriểncủatừngloạinấm(Lê DuyThắngvà cộngsự,2001).
Nấm sò sử dụng nguồn dinh dưỡng giàu cacbon vàt n i t ơ V ì v ậ y , hầu hết các chất hữu cơ có chứa xenluloza, hemixenluloza và lignin đều cóthể được sử dụng làm cơ cơ chất trồng nấm sò (Sharmaet al.,2013) Tỉ lệC/N tốt nhất cho nấm sò vào khoảng 20 – 30/1 và không quá 50/1 (Lê DuyThắng và cộng sự, 2001) Các nguồn đạm mà hệ sợi nấm sò sử dụng làpeptone,bộtđậutương,bộtnấmmen,ammoniums u l f a t e , a s p a r a g i n , serine, alanine và glycine Theo Chang và Miles, (2004) đạm ure được ítđượcsửdụnglàmnguồndinhdưỡngchonấmsò.
Hợp chấtligno-xenluloza
Theo Field et al., (1998), Falkowski, (2000), Lynde t a l , ( 2 0 0 2 ) ligno
- xenluloza là nguồn sinh khối phong phú nhất trên trái đất, quá trìnhchuyển hóa các hợp chất này có tác động đáng kể đến phát triển nôngnghiệp, nhiên liệu sinh hoc và môi trường Trong sản xuất nông nghiệp, tàndưthựcvậttrênđồngruộngkhôngchỉlàmộtnguồndinhdưỡngchođấtmà còn có tác dụng cải thiện tính chất hóa hoc, vật lý đất trồng trot (Kumaret al, 1999,Hasanuzzamanet al.,2014) Hợp chất ligno – xenluloza chínhgồmxenluloza,hemi–xenluloza và Lignin.
Xenluloza là polyme đồng nhất, tuyến tính cao phân tử từ các đơn vịlặp đi lặp lại của xenlobioza (hai vòng glucoza khan kết nối thông qua liênkếtβ-1,4glycosidic) (Klemmetal.,1998).Cácchuoipolymec ủ a xenluloza liên kết với nhau bằng các liên kết hydro và Van der Walls, làmcho xenluloza được sắp sếp thành các sợi nhỏ (Haet al., 1998) Bằng cáchhình thành các giới hạn của hydro, chuoi có xu hướng sắp xếp song song vàtạot h à n h m ộ t c ấ u t r ú c t i n h t h ể D o đ ó , c á c s ợ i n h ỏ x e n l u l o z a c ó c ả h a i vùng là vùng kết tinh (khoảng 2/3 tổng lượng xenluloza) và vùng vô địnhhình Xenluloza có cấu trúc dạng tinh thể nên khó bị phân hủy và hòa tan(Zhanget al., 2004;Taherzadehet al., 2008).V ù n g k ế t t i n h c ó t r ậ t t ự c a o và bền vững với các tác động bên ngoài và vùng vô định hình có cấu trúckhôngchặtchẽ,dođókémbềnvữnghơn.Vùngvôđịnhhìnhcóthểhấpthụ nước và trương lên Trong khi đó ở vùng kết tinh, mạng lưới liên kếthydro ngăn cản sự trương này, các dung môi hữu cơ, các dung dịch axit haykiềm loãng cũng không có tác dụng, các enzyme chỉ có thể tác dụng lên bềmặt của các sợi (Tăng Thị Chính, 2001; Nguyễn Thị Hoài Hà, 2004; Linderetal,1997).
Xenluloza là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật với tỷ lệtrong khoảng 30- 80% tính theo khối lượng khô Xenluloza là một polymemạch thẳng bao gồm nhiều gốc anhydroglucoza gắn với nhau nhờ liên kếtβ-1,4 glycozit và liên kết chặt chẽ với các polisacarit khác như hemi-xenluloza, pectin, lignin tạo thành những phức hợp bền vững Moi phân tửxenlulozathườngchứa10.000- 14.000gốcglucoza,khốilượngtươngứnglà1 , 5 t r i ệ u k D a , v ớ i c h i ề u d à i p h â n t ử c ú t h ể l ớ n h ơ n h o ặ c b ằ n g 5 à m (TăngThịChớnh,2001;Nguyễn ThịHoài Hà,2004; Linderetal,1997).
Xenluloza là hợp chất phức tạp, bền vững không tan trong nước vàtrong nhiều dung môi hữu cơ, không chịu tác dụng của các dung dịch axitvà kiềm loãng, chỉ bị thuỷ phân khi đun nóng với axit hoặc kiềm Do liênkết glycozitkhông bền với axit, xenlulozadễ bịthuỷ phân bởiaxitt h à n h các sảnphẩmthuỷphânkhônghoà tan,cóđộbềncơhockémhơn.
Xenluloza tự nhiên khi bị thuỷ phân hoàn toàn sẽ cho sản phẩm cuốicùng là D-glucoza Dung dịch kiềm làm trương phồng mạch xenluloza vàhoà tan một phần các xenluloza phân tử nhỏ Ở điều kiện bình thường mộtsố vi sinh vật có thể thuỷ phân xenluloza thành xenlobioza và glucoza(Beguinetal.,1992;Brunoetal.,1998).
Lignin là một trong số các polyme hữu cơ phổ biến nhất ở thực vật,chỉ sau xenluloza Hàm lượng lignin trong go khoảng 20-40% Lignin đượctạonênbởicácđơnphântử p-coumarylalcohol,coniferylalcoholvàsinapyl alcohol. Lignin cùng với xenluloza tạo thành những bó sợi vữngchắc trong thành tế bào thực vật Lignin tạo liên kết hóa hoc với hemi -xenluloza và ngay cả với xenluloza
(nhưng không nhiều) Độ bền hóa hoccủanhữngliênkếtnàyphụthuộcvàobảnchấtliênkết,cấutrúchóahoccủalign in vàcácgốcđường thamgialiênkết (Nguyễn ĐứcLượng,2004).
Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại go, tuổi của cây hoặccấu trúc của nó trong go Go mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, go cứng chứachủ yếu syringyl.Theo Palonen, (2004), guaiacyl lignin hạn chế sự trươngnở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzymehơns y r i n g y l l i g n i n C ấu t r ú c h ó a h o c c ủ a l i g n i n r ấ t d ễ b ị t h a y đ ổ i t r o n g điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200 o C,lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi xenluloza.Những nghiên cứu trước đây cho thấy đối với go cứng, nhóm ether β-O-4aryl bị phá hủy trong quá trình nổ hơi Đối với go mềm, quá trình nổ hơilàm bất hoạt các nhóm hoạt động của lignin ở vị trí α như nhóm hydroxylhayether.Cácnhómnàybịoxyhóathànhcacbonylhoặctạocationbenzylicvà tiếptục tạo liênkết C-C (Palonen,2004).
Lignin là một hợp chất tự nhiên, có cấu trúc phức tạp, đa dạng và rấtkhó bị phân hủy Xử lý bằng biện pháp hóa hoc và sử dụng hóa chất đãđược tiến hành, xong hiệu quả còn hạn chế do chi phí cao và thường gây ranhững tác hại xấu về mặt môi trường (Dashtbanet al.,2009) Lignin có thểbị thủy phân bởi các enzyme nhưmanganese peroxidaza, lignin peroxidazacellobiose dehydrogenase(Lenihanet al., 2010) Khi phân hủy, lignin chosảnphẩmlàmethoxyphenol.
Hemi - xenluloza là thành phần chính khác trong hệ sợi củathựcvật.Schulz,(1891)tríchtheoZhangetal,(2006),chorằngcácpolysaccharide dễ dàng tách ra khỏi mô thực vật là các bán thành phẩm củacác phân tử xenluloza hoặc tiền chất của xenluloza, vì vậy chúng được goilà hemi - xenluloza Ông cũng phát hiện ra rằng thành phần này dễ dàngđược thủy phân thành monosaccharide trong axit khoáng nóng pha loãnghoặcdungdịchNaOH5%NaOH.Aspinall(1962)xácđịnhhemi- xenluloza có nguồn gốc từ các polysaccharide của thực vật và bao gồmchuoi cơ bản chứa D-xylose, D-mannose, D-glucoza, hoặc D-galactose vàcác glycosyl khác như các mạch nhánh liên kết với chuoi cơ bản này.Whistler (1968) cho rằng hemi – xenluloza là polysaccharide chiết xuấtbằng dung dịch kiềm, trừ xenluloza và pectin.
Không giống như xenluloza,hemi- xenlulozalàmộtpolymeđồngtrùnghợpgồmnhiềuphântửsaccharidekhácnhau
TheoY i ne t a l,( 1 9 9 9 ) , h e m i - x e n l u l o z a l à g l u c a n t r o n g matrậncủatếbàovàcácthànhphầnchínhlàxylan,xylogluc an,glucomannan,manna,galactomannan,callose,.v.v.
Hemi – xenluloza là polyme mạch thẳng, có nhánh vớithành phần đơn phân đa dạng gồm năm phân tử đường chính là D-glucoza,D-galactose, D- mannose, D-xylose, L-arabinose và một số thành phần khácnhư D-glucuronic axit và 4-O-methyl- D-glucuronic axit với số lượng đơnphândưới200vàcóthểbịacetylhóa(Kuhadetal.,1997).Hemi– xenlulozađượcchiathànhnhiềuloạinhưxylan,mannan,glucan,glucuronoxylan,arabinoxyla n,glucomannan,galactomannan,galactoglucomannan, β-glucan hoặc xyloglucan. Loàithựcvậtkhácn h a u cóthành phần hemi – xenluloza khác nhau, trong đó thực vật thuộc ho Cỏ(Poaceae) như lúa, lúa mì và kiều mạch có thành phần khung cấu trúc chủyếu là glucuronoarabinoxylan (Carpita,1996), các loại cây go mềm và câygocứngcóthànhphầnhemixenlulozalầnlượtlàacetylated(galacto)glucomannan (hay còn goi là arabinoglucuronoxylan) và glucuronoxylan(Schelleretal,2010).
Trong các loại hemi - xenluloza, xylan là polyme chính của thành tếbào thực vật, trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liênkếtβ-1,4-D- xylopyranose.Đasốphântửxylanchứanhiềunhómởtrục chính và chuoi bên (Beily, 1985) Các gốc thay thế chủ yếu trên khungchính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl Các nhómnày có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không hóa trị với lignin,xenlulozavà các polymerkhác(Pulset al.,1993).
Visinhvậtphângiảiligno-xenluloza
Phân giải xenluloza là quát r ì n h s i n h h o c đ ư ợ c t ạ o r a v à k i ể m s o á t bởi các enzyme xenlulaza có vai trò thủy phân cầu nối β-1,4 giữa hai phântử glucoza (Wilson, 2011) Hệ thống enzyme phân giải xenluloza bao gồmbaenzymengoạibàocóthểhòatanlà:1,4-β-endoglucanaza,1,4-β-exoglucanazavàβ- glucosidaza(β-D-glucoside,glucohydrolasehoặccellobiase) Endoglucanaza chịu trách nhiệm trong sự phân cắt ngẫu nhiênliên kết β-1, 4-glycosidic doc theo chuoi xenluloza Exoglucanaza cần thiếtcho sự phân cắt đoạn cuối của chuoi và phân tách các sợi cơ bản của tinhthể xenluloza β-1,4 - glucosidaza thủyphânc e l l u b i o s e v à c e l l o d e x t r i n hòat a n t h à n h g l u c o z a ( S h e w a l e , 1 9 8 2 ; W i s e m a n , 1 9 8 3 ) T r ê n t h ự c t ế , mặc dù đều sử dụng cơ chất xenluloza nhưng cơ chế phân giải xenlulozacủacác loàivi sinhvậtrấtkhácnhau(Wilson,2008).
Xenlulaza có hoạt tính rất thấp đối với xenluloza dạng tinh thểnhưng chúng có sự tăng cường xúc tác rất cao là do chu kỳ bán rã dài củatinh thể xenluloza.Xenlulaza khác biệt so với hầu hết các enzymek h á c , vì chúng phân giải cơ chất không hòa tan, trong đó xenlulaza khuếch tánđếnc ơ c h ấ t v à m a n g n h ữ n g m ẫ u c ơ c h ấ t k h ô n g h ò a t a n đ ế n t â m h o ạ t động, trong khi các cơ chất hòa tan thì khuếch tán và gắn vào tâm hoạtđộng của nhữngenzymekhác (Wilson,2011).
Trong các vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza, vi khuẩn kịkhícóhiệuquảhơncácvikhuẩnhiếukhí.Trongkhicácvikhuẩnhiếu khí sản sinh lượng lớn enzyme, vi khuẩn kị khí thì lại hạn chế hơn (Bayeret al.,2004).Quá trình phân giải xenluloza rất phức tạp, đòi hỏi sự phốihợp chặt chẽ giữa các enzyme xenlulaza, hiệu quả của sự phối hợp đượctạo ra bằng cách kết hợp trong xenlulozaxome Theo Fonteset al., (2010)xenlulozaxomel à c o m á y cấp đ ộ na no c ó c ấ u t ạ o p h ứ c t ạ p n h ư n g h i ệ u quảnhấttrongthếgiớitựnhiên.
Cácv isin h vật phângiải xe nl ul oz a c h ủ yế uđ ư ợ c p h â n lậpt ừ h ệtiêu hóa động vật ăn cỏ như bò, cừu, dê (Oyelekeet al., 2008), côn trùng(Huanget al.,
2012;Huet al., 2014) và trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từnướcthải(Bayeretal.,2004).
Vi khuẩn phân giải xenluloza bao gồmClostridium,
Bacteroidessucinogenes,Butyrivibriofibrisolvens,Ruminococcusalbus,Me thanobrevibacterruminatium,Siphonobacteraquaeclarae,Cellulosimicrob iumfunkei,Paracoccussulfuroxidans,Ochrobactrumcytisi,Ochorobactrum Haematophilum,Kaistiaadipata,Desvosiariboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides,Citrobacter freundii,vàPseudomonas nitroreducens.Các loài này phầnlớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, được phân lập chủ yếu từ hệ thống tiêuhóa của động vật ăn thực vật (Huanget al., 2012;Milalaet al., 2005;Schwarz,2001).
Trong đất người ta cũng phân lập được các vi khuẩn gram (+) hiếukhígiảixenlulozanhưBrevibacllus,Paenibacillus,Bacillus,vàGeobacill us, trong đó các vi khuẩn ưa ấm có pH và nhiệt độ tối thích choenzymecacbonmethylxenlulazahoạtđộnglà5,5và55 0 C,cácvikh uẩnưanhiệt làpHvànhiệtđộ tốithíchlà5,0và75 0 C(Rastogietal.,2009).
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm Gram (+), hiếu khí có mặtkhắpnơitrongtựnhiên,chiếmưuthếtrongđấtphènkhô(Jeffrey,2008).
ADN của xạ khuẩn rất giàu G+C, chiếm tới 57- 75 % (Loe t a l ,2002).Xạ khuẩn còn được biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai,nổi bật là các loại kháng sinh nhưstreptomycin, gentamicin, rifamycinvàerythomycin.N g o à i r a , x ạ k h u ẩ n c ò n c ó k h ả n ă n g c h u y ể n h ó a c á c h ợ p chất hữu cơ nên được ứng dụng nhiều trongnông nghiệp và xử lý môitrường.
Streptomyceslà giống chủ đạo trong xạ khuẩn có khả năng sản sinhxenlulaza mạnh và được được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, trong đóđặc biệt là các giốngStreptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii,Streptomyceslividans(Kluepfeletal.,1986;Schrempf,1995).T hermoactimnomycesđượctìmthấytrongtrầmtíchđạidương,Streptosporangi umtrong quặng apatit cũng là những loài có khả năngphânhủyxenluloza
Theo Shahriarinouret al.,(2011) vi nấm có cơ chế sinh hóa độcđáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đượcnghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy xenluloza Các xenlulazatừ nấm thường có hoạt lực cao và dường như không có các dạng vật lýphứctạpnhưx e n l u l a z a t ừ vikhuẩn.
Theo Yanget al., (2011); Shahriarinouret al., (2011)Acremoniumspp.,Chaetomiumspp.,Trichodermareesei,Trichoderm aviride,penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani,Talaromycesemersonii,Trichodermakoningii,Fusariumoxysporium ,Aspergillus niger, Aspergillus terreusandRhizopus oryzaelà các giốngnấmcó vaitròquantrongtrongquá trìnhphânhủyxenluloza.
Trong tự nhiên lignin bị phân hủy rất chậm, thường kéo dàihàngtháng,thậmchíhàngnăm.Sựphânhủyligninnhanhchóngvànhiều nhất là do một số vi nấm, đặc biệt là nấm mục trắng trong môi trường hiếukhí.HầuhếtligninbịphânhủybởicácloạinấmmụctrắngnhưPhanerochaete chrysosporium,Phlebiaradiata,Trametesversicolor,Bjerkanderaadusta,Chr ysoniliasitophilathuộcloàinấmđảmbasidiomycetes(Kirk&Farrell,1987;Blan chette,1991)vàmộtsốascomycetes(Duranet al.1987) hoặcActinomycetesnhưStreptomycesbadiusvàStreptomyces flavovirens(Crawford et al., 1983; Ramachandra etal.,1988).Cácenzymechínhphânhủylignin(ligninolytic)làligninperoxidaza, manganeseperoxidazavàlaccaza(Yanget al.,2005).
Manganese peroxidaza(MnP) hoạt độngnhưmộtp h e n o l o x y d a z a trên cơ chất phenolic bằng cách sử dụng Mn 3+ /Mn 2+ làm cặp oxy hoá khửtrungg i a n N h i ệ m vục h í n h củ aMnP làtham giavàop h ả n ứ n g o xy hoáhợp chất phenol cũng như cấu trúc phenolic của lignin MnP tấn công trựctiếp vào cấu trúc vòng thơm lignin, chuyển hóa thành những gốc có tronglượng phân tử thấp theo thông qua oxy hóa khử Mn gián tiếp (Daljit
SinghAroraetal.,2002).MnPđượctìmthấytrongmôitrườngnuôicấyP.chrysosporium(K uwaharaet al.,1984) MnP xuất hiện sớm hơn LiP khinuôi cấyP.chrysosporiumvà là enzyme chính trong hệ enzyme phân hủylignin MnP có thể oxy hóa các phần cấu trúc phenolic, như vậy nếu điềukiện thuận lợiMnP phốihợp vớiLiP hình thành hệenzymec ó t h ể p h â n hủyvậtliệugiàulignin.
Lignin peroxidaza (LiP) là enzyme thực hiện xúc tác các quá trìnhoxi hóa khác nhau trong mối liên kết aryl của phức hợp lignin, cắt mối liênkết Cα-Cβ của nhánh bên lignin, thực hiện oxi hóa veratryl alcohol và cáccấutrúctươngtựtạothànhandehytvàceton,phâncắtmốiliênkếtintradiol của cấu trúc phenylglycol và hydro hóa nhóm benzylic metylen.LiPl ầ n đ ầ u t i ê n đ ư ợ c t ì m t h ấ y t r o n g m ô i t r ư ờ n g n u ô i c ấ y P chrysosporium Hiện nay có thể tìm thấy enzyme này trong một số loàinấm mục trắng khác nhưPhlebia radiate, Phlebia tremellose,
Sự hoạt động của LiP cần phải có sự tham gia của (H2O2) sinh ra từcác enzyme khác, ngoài ra còn tìm thấy khả năng này với veratryl alcohol,axit phenolic LiP phản ứng với cơ chất qua hai giai đoạn oxy hóa kế tiếpchuyển dịch một điện tử, hình thành cation - gốc tự do trung gian Do thếoxy hóa khử cao, LiP cũng có thể oxy hóa đơn vị mắt xích của lignin làphenyl propanởdạngphi phenolic.
Laccaza là polyphenol oxidase có khả năng xúc tác phản ứng chuyểnhóa hợp chất phenol thành các gốc quinin và sau đó oxy hóa thành quinon.Ngoài ra laccaza còn liên kết với các chất nhận điện tử trung gian có khảnăng oxy hóa các hợp chất không có bản chất là phenol. Laccaza có khốilượng phân tử từ 60-80 kDa, tuy nhiên vẫn có một vài ngoại lệ như laccazatừMonociliumindicumcókhốilượngphântử100kDa,từA g a r i c u s biporus10
Cho đến năm 1990, laccaza mới được biết đến với vai trò phân giảicác hợp chất phenol của lignin và hiện nay các nhà khoa hoc đã nhận thấydảicơchấtcủalaccazacóthểmởrộngđốivớicáctiểuphầnkháckhôngcó bản chất phenol của lignin (non-phenolic) khi có mặt chất trung gian(mediator)thíchhợp.Cácchấttrunggiangồm2,2’- azino-bis3-etylthiazolin-6sunfonat(ABTS),guaiacol,syringaldazine.ABTS,guaiacol,syringaldazine đóngvaitròlà chấtvậnchuyểnđiệnt ử t r u n g gian, có khả năng oxy hóa các tiểu phần không có bản chất phenol (PetrBaldrian,2005).
1.3.3 Cácyếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân giải ligno - xenlulozacủa visinhvật
Nguyên liệutrồngmộc nhĩ,nấmsòvàtáisửdụngbã thảitrồngmộc nhĩ
Nấm ăn,nấm dược liệuđược nuôitrồng trênc á c n ề n c ơ c h ấ t c h ế biến từ các phụ phẩm trồng trot, chế biến nông sản, thực phẩm như rơm rạ,cám, bã mía, lõi và thân cây ngô, mùn cưa, bông phế thải Sanchez, (2010)chorằng,trồngnấmăncóthểcoilàquátrìnhduynhấtkếthợpviệcsảnxuất thực phẩm có chất lượng cao với việc giảm ô nhiễm môi trường, trongđó chất thảivàphụphẩmnông nghiệpđượctái sửdụnghiệuquả.
Theo Philippoussis, (2009), ligno – xenluloza, thành phần chính củaphụ phẩm nông nghiệp và chế biến thường bị coi là chất thải, nhưng có thểđượcchuyểnđổithànhcácsản phẩmgiá trịgiatăngkhácnhau,trongđócó giá thể trồng nấm thông qua quá trình ủ Chiuet al., (2000) và Chang,(2006) cho rằng, so với các ứng dụng khác của quá trình lên men chất rắn,trồng nấm là một giải pháp đã được chứng minh về tính khả thi của sự giatăng kinh tế và quan trong hơn là đáp ứng cho việc quản lý bền vững sinhthái từcácnguồn chấtthảinông nghiệpvàchếbiếnnông,lâmnghiệp.
Martinez-Carreraet al.,(2000);Chiu và Moore., (2001)c h o r ằ n g , sản xuất nấm thương mại là một quá trình sinh hoc tạo nguồn protein làmthứcăn từl i g n o – xenlulozathông quakhảnăng chuyểnhóacủanấm.
Các loài nấm nấm mỡ, nấm sò, mộc nhĩ, nấm hương và nấm rơm cókhả năng sinh trưởng, phát triển trên các nguyên liệu giàu ligno – xenluloza(Rajarathnamet al.,1998; Philippousis, 2009),thông qua quát r ì n h t ổ n g hợp các loại enzyme cần thiết đểchuyển hóa ligno– x e n l u l o z a t r o n g c ơ chấtvà do đó có khả năng phát triển khác nhau trên từng loại cơ chất cóchứaligno –xenluloza. (Chenetal.,2003;Baldrianet al.,2008).
Trong thời gian qua, các nhà khoa hoc người Trung Quốc đã nghiêncứutrôngmộcnhĩtrênnhiềuloạicơchấtkhácnhau,trongđótácgiảLiuFu Ping đã bổ sung 20% lá cây keo dậu thay thế nguồn đạm của cám lúa mìtrong cơ chất nuôi trồng mộc nhĩ (tỷ lệ C/N của cơ chất khoảng 32,79). Kếtquả nghiên cứu cho thấy, tốc độ lan tơ của nấm mộc nhĩ nhanh hơn, hiệusuất sinh hoc là 98,0% cao hơn so với sử dụng cám lúa mì Nghiên cứu củaWangY ue t a l ,
( 2 0 0 8 )c h o t hấ ym ù n c ư a g o t h ô n g c ó kh ản ă n g l à m cơchất tốt để nuôi trồng mộc nhĩ Nghiên cứu của Ling Quing Songet al.,(2009) chứngminh có thể thay thế đườngsucrose bằng vỏd ứ a đ ể t r ồ n g mộc nhĩ Onyanggoet al.,(2011)nghiên cứu nuôi trồng hai chủng mộc nhĩcónguồngốc từKenyatrên4loạicơchấtkhác nhaulà ngô,rơmlúamì, cỏ và bã mía có bổ sung lúa mì hoặc cám gạo và xác định cơ chất ngô và rơmlúamìcóbổsungcámmìcho hiệuquả cao nhất.
Irawatie t a l ,(2 01 2) nghiênc ứ u n u ô i t r ồ n g m ộ c n h ĩ tr ê n m ù n c ư a cây keo dậu,cả sao, giá tỵ)và cho biết sợi tơ của mộcn h ĩ t h í c h n g h i t ố t trên trên nền cơ chất là mùn cưa cây cả sao nhưng cho năng suất cao trênnền cơ chấtcủa mùncưa câykeodậu. Ở Việt Nam, người dân bắt đầu trồng mộc nhĩ từ những năm 1970 tạicác tỉnh miền Bắc trên go khúc Sau đó, việc sản xuất vàn u ô i t r ồ n g m ộ c nhĩ đã được nâng cấp, rút ngắn thời gian khi phương pháp trồng nấmtừmùn cưa rađời.
Mùn cưa là một sản phẩm phụ từ quá trình cắt, khoan, mài, hoặc xaychế biến go Thành phần chủ yếu của mùn cưa là ligno - xenluloza (sinhkhốithựcvật)baogồmcácpolysaccharidechủyếulàxenluloza,hemixenluloza(xylan )vàlignin,trongđóxenlulozavàhemixenlulozachiếm tỉ lệ cao nhất Xenluloza chiếm khoảng từ 35% đến 50% khối lượngkhô thực vật, còn hai hợp chất, hemixenluloza và lignin lần lượt chiếmkhoảng20-30% và 5-20% Hàm lượng ligno- xenlulozak h á c n h a u g i ữ a các loài cây và ngay trong cùng một loài, giữa các cây khác nhau cũng khácnhautùythuộc vào độtuổi,giai đoạnsinhtrưởng,pháttriểncủathựcvật.
Nguồn:Paraveen Kumar et al.,
2009 Ngoàihợpchấtl i g n o – x e n l u l o z a , t r o n g m ù n c ư a c ò n c h ứ a m ộ t s ố lượngn h ấ t đ ị n h p r o t e i n , l i p i d l à c á c c h ấ t d i n h d ư ỡ n g c ầ n t h i ế t c h o s i n h trưởngphát triển củamộcnhĩ (bảng1.5).
Thànhphần Proteinthô Lipidthô Xenluloza vàlignin
Mùn cưa sử dụng trong trồng nấm có chứa sợi go tạo ra từ vỏ các tếbào go với thành phần hoá hoc chủ yếu là xenluloza và keo go (keo ligninthiên nhiên) gắn kết các sợi go và các thành phần khác thành khối go Keogotantrongkiềmmạnh cópH>10 vàbịphá hủybởiaxitcópH
