Phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (cayratia trifolia) ở đồng bằng sông cửu long

Đặtvấnđề

Dây giác (Cayratia trifolia)là một loại dây leo thân gỗ mọc hoang dại trongtrảng cỏ và rừng thưa ở các nước như Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia,Thái Lan, Myanma, Indonesia, Malaysia.ỞViệt Nam dây giácm ọ c h o a n g d ạ i dọc các hàng rào, bụi từ các tỉnh miền Trung đến các tỉnh miền Nam VùngĐBSCL, dây giác có hầu hết ở tất cả các tỉnh, thành phố, đặc biệt dây giác là loàithực vật rất phong phú trên đất U Minh (Phạm Hoàng Hộ, 2000 và Võ Văn Chi,2004) với sản lượng trái giác thu hoạch khoảng 70 đến 80 tấn mỗi mùa. Trái giácđược dùng phổ biến như gia vị trong cácm ó n ă n v ì h ư ơ n g v ị đ ặ c b i ệ t v à n h ữ n g tác dụng dược học của trái giác đối với cơ thể con người Trên thế giới, nhữngnghiên cứu cho thấy trong thành phần dây giác có chứa các hợp chất có hoạt tínhsinh học cao như phenolic acids, flavonoid, stilbenes, anthocyanidin,… (Tsao,2010) Theo Gupta, 2007, các bộ phận dây giác có chứa dầu sáp màu vàng,steroids,terpenoids,flavonoid,tannins,stilbenes, acidhidrocyanic.

Rượu vang có lịch sử hàng ngàn năm, được sản xuất đầu tiên ở các nướcChâu Âu Ngày nay, các sản phẩm rượu vang đã và đang được nghiên cứu để đadạng hóa về chủng loại, cải tiến về chất lượng, năng suất lẫn quy mô nhằm đápứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng Theo truyền thống, rượu vangđược sản xuất từ nho chín, sử dụng nấm menSaccharomyces cerevisiaeđể nângcao hiệu quả lên men (Bùi Ái, 2005) Trong quá trình lên men rượu vang, mộttrong những yếu tố quan trọng nhất chính là nguồn nấm men Đối với nấm men,nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình chuyển hóa đường thành ethanol(Lương Đức Phẩm, 2006) Hiện nay, nhiệt độ trái đất đang ấm dần lên do hiệntượngbiếnđổikhíhậu Nhiệtđộtăngcaosẽảnhhưởngđếnkhảnănglên mencủa nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang cũng như cần phải tiêu tốn mộtphần năng lượng để giữ ổn định nhiệt độ cho các hệ thống lên men (Limtongetal., 2007; Yuangsaardet al.,

2013) Vì vậy, việc lựa chọn nấm men chịu nhiệt đểlên men rượu là một giải pháp hữu hiệu mang lại nhiều lợi ích đáng kể như tậndụng được nhiệt độ cao để lên men và giảm chi phí đầu tư cho thiết bị làm mát, từđó tạo ra nhiều lợi ích kinh tế trong sản xuất (Roehr, 2001; Limtonget al., 2007).Bên cạnh đó, việc phân lập và định danh các chủngnấm men cũng góp phần làmphongphúthêmsựhiểubiếtvềđadạngsinhhọcvisinhvật.Đồngthời,cóth ể tiếntớiviệcsảnxuấtgiốngthuầnchủngcungcấpchocáccơsởsảnxuấtrượuvang.

Như vậy, trái giác chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có hươngvị và màu sắc đặc trưng nên có thể được sử dụng như nguồn nguyên liệu trong lênmen rượu vang Đồng thời, việc ứng dụng chủng nấm men chịu nhiệt mang lạihiệuquảchoquátrìnhlênmentrongđiềukiệntráiđấtđangấmdầnlên.Từđó cho thấy đề tài phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lênmen rượu vang trái giác(Cayratia trifolia)ở ĐBSCL được thực hiện như một yêucầucầnthiết.

Mụctiêuđềtài

Cung cấp các dữ liệu về trái giác và đề xuất một giải pháp cho quá trình lênmen rượu vang trái giác giúp giải quyết vấn đề ấm dần lên của trái đất do sự giatăng nhiệt độ Qua đó, người dân ở khu vực có thể vận dụng để thích nghi nhanhvới sự biến đổi khí hậu của khu vực và khai thác giá trị nguồn trái giác có trongthiênnhiênđểtăngthêmthunhập.

Xác định đặc điểm và giá trị của nguyên liệu trái giác ở ĐBSCL; phân lập,tuyển chọn và xác định mối quan hệ di truyền của các chủng nấm men chịu nhiệtvà đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác(Cayratia trifolia)sử dụngchủng nấm men chịu nhiệt được tuyển chọn từ trái giác Khảo sát điều kiện thíchhợp cho quá trình lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt,tạo ra sản phẩm rượu vang trái giác có tính đặc trưng về màu sắc, hương vị, đạtcácchỉ tiêuchất lượng theo quyđịnh,đặcbiệt làkhảnăngkhángoxyhóa.

Nộidungnghiêncứu

Nội dung 1:Thu thập và đánh giá một số đặc điểm hóa lý và đặc tính khángoxyhóa củanguyênliệutráigiácvùng ĐBSCL.

Nội dung 2:Phân lập nấm men từ trái giác tự nhiên ở 13 tỉnh, thành phốvùng ĐBSCL và xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủngnấmmenphânlậpđược.

Nội dung 3:Tuyển chọn chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn và có khả năng lênmen rượu vang trái giác tốt, định danh và xác định mối quan hệ di truyền các chủng nấmmenđượctuyển chọn bằngphươngpháp sinh họcphân tử.

Nội dung 4:Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng và điều kiện thích hợp cho quátrình lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt tốt nhất được tuyểnchọn;phân tích, kiểm nghiệm chất lượngcủasảnphẩm.

Ýnghĩacủa luậnán

Luận án đã khẳng định được giá trị của nguồn nguyên liệu trái giác vùngĐBSCL, cung cấp dữ liệu tin cậy về hàm lượng polyphenol và khả năng khángoxy hóa Dữ liệu này có thể dùng làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằmkhai thác giá trị của nguồn trái giác tồn tại trong thiên nhiên, góp phần làm tăngthêmthunhậpcủangườidântrongkhuvực.

Luận án đã cung cấp bộ giống nấm men được phân lập từ trái giác tự nhiên,góp phần làm phong phú sự hiểu biết về đa dạng sinh học vi sinh vật. Nghiên cứunày có thể làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc tính sinh học và khảnăngứngdụngcủa bộgiốngnấmmen.

Luận án cũng đã tuyển chọn được các chủng nấm men chịu nhiệt có khảnănglênmenrượutốtvàđãứngdụngvàoquytrìnhlênmenrượuvangtráigiácởn h i ệ t đ ộ c a o N g h i ê n c ứ u n à y m ở r a t r i ể n v ọ n g s ả n x u ấ t r ư ợ u v a n g ổ n đ ị n h trong điều kiện nhiệt độ trái đất ngày càng tăng cao Đề tài này có ý nghĩa ứngdụngthựctếtốt,đãđềxuấtgiảipháplênmen tráigiác ởnhiệtđộcao.

Nhữngđiểmmớicủa luậnán

- Xác định trái giác có chứa hàm lượng polyphenol từ 0,47 đến 1,54 mgGAE/mLvàcókhảnăngkhángoxyhóa từ 16,60đến82,86%.

- Phân lập được 151 chủng nấm men từ trái giác tự nhiên vùng ĐBSCLthuộcgiốngSaccharomyces,Candida,Clavispora,PichiavàHanseniaspora.

- Xác định có 30 chủng nấm men tự nhiên trên trái giác có khả năng chịunhiệt từ 37 đến 45ºC, có khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ ethanoltừ9-12%vàlênmendịchtráigiácsinh hàmlượngethanoltừ6%(v/v)trởlên.

- Tuyển chọn được chủng nấm menSaccharomyces cerevisiaeH G 1 3 c ókhản ă n g c h ị u n h i ệ t đ ế n 4 3 º C , l ê n m e n r ư ợ u t r á i g i á c ở n h i ệ t đ ộ 3 5 º C v ớ i p H thích hợp là 4,5, 20 ºBrix, mật số giống chủng 10 5 tế bào/mL Sau 6 ngày lên menhàm lượng ethanol đạt 11,68% (v/v) Sản phẩm rượu vang trái giác chứa hàmlượng polyphenol 0,6 mg GAE/mL, khả năng kháng oxy hóa là 57,3%và có tínhđặctrưngvềmàusắc,hươngvị.

Rượuvang

Giớithiệuvềrượuvang

Rượu vang là loại đồu ố n g c ó đ ộ c ồ n n h ẹ , c ó g i á t r ị d i n h d ư ỡ n g c a o , đ ư ợ c lên men từ trái cây không qua quá trình chưng cất Rượu vang được tàng trữ hàngchục năm, thậm chí hàng trăm năm nên rượu có hương vị đặc trưng và hấp dẫnngườitiêudùng(LêVănNhượngvàNguyễnVănCách,2009).Rượuvang vốncó nguồn gốc từ quả nho nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine” (Lương Đức Phẩm,2009) Việc sản xuất rượu vang đã được con người biết từ thời Ai Cập cổ đại, banđầu được tiến hành bằng cách ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tựnhiên trong các hang đá và sau một thời gian thì thu được loại đồ uống có độ cồnthấp,cóhươngvịthơmngonrấtquyếnrũ.

Thànhphầnhóahọccủarượuvang rấtphứctạp,cónhững chấthiệndiệ nvới lượng tương đối lớn có thể xác định được, nhưng cũng có những chất chiếmmột tỷ lệ rất thấp như chất thơm, acid bay hơi,… Thông thường rượu vang cóchứa 85 - 89% nước, khoảng

10 - 14% ethanol, dưới 1% acid và hàng trăm loạichất tạo hương khác nhauở nồng độ rất thấp Nồng độ ethanolc ó t r o n g r ư ợ u vang ở mức có thể tiêu diệt đa số các loại vi sinh vật gây bệnh (Phạm Văn Ty,2007).Thànhphần hóahọccủa rượuvangđược trìnhbàytrongBảng2.1.

Nhìnc h u n g , t h à n h p h ầ n r ư ợ u v a n g g ồ m n ư ớ c , c ồ n , đ ư ờ n g , a c i d t ổ n g s ố , acid bay hơi, vitamin, chất tạo mùi thơm, polyphenol, tro và các muối khoáng,…

(Bruce,1 9 9 9 ) E t h a n o l l à t h à n h p h ầ n q u a n t r ọ n g t r o n g r ư ợ u v a n g E t h a n o l c ó được do lên men từ dịch trái cây nên là loại rượu tinh khiết, có mùi thơm, vị ngọtgiống như đường Đường trong rượu vang chủ yếu là fructose, glucose, galactose,có thể bổ sung thêm đường saccharose Sau khi lên men, toàn bộ đường bị thủyphân thành đường khử. Rượu vang còn nhiều đường khử, đặc biệt khi hàm lượngethanol thấp dễ bị vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí phân giải đường, chuyển thành acidlactic, giấm làm rượu bị mất mùi vị Acid là một thành phần quan trọng của rượuvang, hàm lượng acid tổng số 4-5 g/L, pHkhoảng 2,9-3,9 Acid hữu cơ có tácdụng ngăn cản hoạt động của các vi khuẩn làm hỏng rượu như acid tatric, malic,citric, oxalic,… Mặt khác, một số acid nếu hiện diện với hàm lượng cao trongrượusẽlàmthayđổimùivịcủarượunhưacidacetic,formic,propionic,butyric,

Mg, Si, Fe, Mn, Fl2,Cl2, Br2, I2, Al,… Mặc dù hiện diện vớilượng rất thấp, nhưng có tác dụng làm tăng hương vị của rượu, tăng giá trị dinhdưỡng Chất tạo hương thơm trong nguyên liệu trái cây thường bị phân hủy, tuynhiên, nấm men có khả năng sinh ra một số chất có mùi thơm đặc trưng cho từngloại trái cây Rượu vang giàu vitamin nhờ vào quá trình lên men điều chỉnh lạithành phần vitamin của trái, một phần vitamin có được là do nấm men tổng hợp.Polyphenol là hợp chất phức tạp có trong trái, gồm nhiều chất khác nhau như acidbenzoic, acid cyamic, flavol làm cho rượu có màu hồng, anthocyan tạo màu đỏchorượu,tạovịchátvàcókhảnăngức chếcácloạivikhuẩncóhại pháttriển.

Nguyênliệulàmrượuvang

Nguyên liệu để làm rượu vang đầu tiên là trái nho Chất lượng rượu vangchịu ảnh hưởng trực tiếp bởi chất lượng nho, nhiều giống nho quý đang đượctrồng và nhiều quốc gia đã sản xuất hàng nghìn loại rượu vang có hương, vị khácnhau mang những nét đặc trưng riêng của từng quốc gia, từng khu vực thậm chítừng hãng sản xuất Với nhu cầu rượu vang tăng nhanh, nhiều nguyên liệu làmrượu vang ngày càng đã và đang được mở rộng Một số loại quả có đường khácnhư dâu, mơ, điều, sherry, táo, lê, dứa, vải thiều, chuối, mận được nghiên cứulàm nguyên liệu để sản xuất rượu vang và được thị trường chấp nhận (Lê VănNhượngvàNguyễnVănCách,2009).

Theo Vũ Công Hậu (2004), nguyên liệu là một yếu tố rất quan trọng trongsản xuất rượu vang Các tiêu chuẩn chọn trái cây dùng trong chế biến rượu vangcần có hàm lượng đường tổng số trong nước trái cao, độ Brix phải từ 20 - 22, đốivớit r á i c ó đ ộ B r i x t h ấ p c ầ n đ i ề u c h ỉ n h b ằ n g c á c h b ổ s u n g t h ê m đ ư ờ n g H à m lượngacidhữucơtươngđốicao,pHthấp(2,8-3,8).Thànhphầncủanướcquả thích hợp với hoạt động của nấm men với một lượng tối thiểu các chất sau: acidamin, vitamin, muối khoáng thực hiện vai trò xúc tác với một lượng rất nhỏ,polyphenol - tanin làm cho rượu có màu sắc hấp dẫn và đóng góp vào việc ức chếhoạtđộngcủavikhuẩncóhại.

Hệvisinhvậttronglênmenrượuvang

Hiệnnaytrênthếgiớingườitasảnxuấtrượuvangtheohaiphươngpháp: lên menbằngvisinhvậttự nhiênvàlênmen bằngvisinhvậtthuầnchủng.

2.1.3.1 Lênmenrượuvangbằngvisinhvậttựnhiên Ở những nước có nghề sản xuất rượu vang truyền thống sử dụng vi sinh vậttự nhiên có ở trái nho Việc sử dụng vi sinh vật tự nhiên để sản xuất rượu vang cóưu điểm là không cần giống vi sinh vật thuần chủng, do đó không đòi hỏi kỹ thuậtcao,khôngcầnđầutưquánhiềuchoquátrìnhsảnxuất.Sảnphẩmkhákhácbiệtv ì quá trình tích lũy hương cho sản phẩm không chỉ lấy từ nguồn trái cây mà cònđược tạo ra bởi nấm men vi sinh vật tự nhiên trên trái nho và theo vào quá trìnhlên men.

Bênc ạ n h n h ữ n g ư u đ i ể m t h ì v i ệ c s ử d ụ n g v i s i n h v ậ t t ự n h i ê n c ũ n g c ó những bất lợi là chất lượng sản phẩm thường không ổn định vì không kiểm soátđược chất lượng giống vi sinh vật ban đầu cho quá trình lên men Trên thế giới,những cơ sở sản xuất rượu vang hay ở quy mô gia đình có truyền thống sản xuấtrượu vang nổi tiếng vẫn sử dụng vi sinh vật tự nhiên để thực hiện quá trình lênmen Tuy nhiên, chất lượng sản phẩm của phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệmkhi lựa chọn nguyên liệu, phối trộn nguyên liệu Những nghiên cứu của các nhàkhoahọcchothấy,hệvisinhvậttựnhiêntrongsảnxuấttheophươngphápnà ycó 76 - 90% là nấm sợi, 9 - 22% là nấm men, số còn lại là xạ khuẩn vàí t v i khuẩn Dịch nước nho có pH thấp từ 2,7 - 3,8 thường không thích hợp cho vikhuẩn phát triển Đây là điều rất thuận lợi cho việc sử dụng vi sinh vật tự nhiêntrongsảnxuất(NguyễnĐứcLượng,2002).

Công đoạn quan trọng nhất trong sản xuất rượu vang là quá trình lên men.Quá trình lên men được chia làm hai giai đoạn là giai đoạn lên men chính và giaiđoạn lên men phụ Cả hai giai đoạn lên men này, vi sinh vật đóng vai trò quantrọngnhấtlànấmmen.Nấmmenthamgiachủyếuvàoquátrìnhlênmentrướ c tiênlàphảitạothànhethanol.Nhưvậy,yêucầucủaquátrìnhlênmentrướctiênlàphả itạođược ethanol từđường,kếđó làtạohươngvàlắngtrong.

Sản phẩm rượu vang là sản phẩm lên men không qua chưng cất, do đó yêucầu về độ trong rất quan trọng Về lý thuyết, vi sinh vật sử dụng trong quá trìnhlên men rượu vang giống như trong quá trình lên men bia (bao gồm lên men cồn,khả năng lắng nhanh,chịu nhiệt độ thấp), còn phải có khả năng tạo hương(NguyễnĐứcLượng,2002).

Dịch đường lên men không chỉ là môi trường dinh dưỡng tốt cho nấm menmà còn cho các vi sinh vật khác Trong nước, không khí, nguồn nguyên liệu thamgia vào thành phầnmôi trường luôn có mộtlượngv i s i n h v ậ t g â y h ạ i c h o q u á trình lênmenrượu.Các vi sinh vật lẫnvàodịch đường sẽchuyển hóađ ư ờ n g thành các sản phẩm khác làm giảm hiệu suất lên men và chất lượng của rượu(Bảng2.2)(NguyễnĐìnhThưởngvàNguyễnThanhHằng,2007).

Tạo ra nhiều ethyl acetate (200 mg/L) và methylbutylacetate.

Gâyđụcrượu,làmrượucómùiacidvàmùihôikhóchịu SinhkhíCO 2 nêncó thể gâynổ chaivang

Schizosaccharidepombe Gâyđục rượu trongquá trình trữ rượu

Saccharomycescerevisiae Tái lên men đườngcònsótlại

Tạomùiđấtẩm(donấmmốcpháttriểntrongthùng gỗđựngrượuhoặcnútchaivang(nútgỗ))trongquátrình trữrượu.

(Nguồn:NguyễnĐình Thưởngvà Nguyễn ThanhHằng, 2007)

Cácyếutốảnhhưởngđếnquátrìnhlênmen

Nấm men thông thường rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, ở 36 o C nấm men bắtđầu bị ức chế Trong môi trường lỏng, ở nhiệt độ 40-50 o C, nấm men hầu nhưngưng hoạt động và chết sau 1 giờ 30 phút; ở nhiệt độ 60-65 o C, nấm men sẽ chếtsau 5 phút Trong môi trường khô (W%), nấm men chịu nhiệt tốt hơn, có thểchịu đến 85-105 o C Nhiệt độ càng cao, sự lên men càng hạn chế, hàm lượngethanolcàngt hấ p, l ượ ng đư ờn gc òn lạ it ro ng rư ợu cà ng nh iề u, n ồn gđ ộ đường cao có thể gây ra sự ngừng quá trình lên men (Bùi Ái, 2003) Nhiệt độ tối ưu chonấm men rượu vang phát triển là 25-28 o C (Casellas, 2005) Khi quá trình lên mendiễn ra ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài thời gianhơn, nhưng lênm e n ở n h i ệ t đ ộ c a o quá sẽ ảnh hưởng đến mùi vị của sản phẩm, hoạt tính của nấm men bị giảm mạnh,dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại Ngoài ra, khi lên men ở nhiệt độ cao, sẽtạo nhiều ester aldehyde và tổn thất rượu theo CO 2 tăng (Nguyễn Đình Thưởng vàNguyễnThanhHằng,2007)

Nấm men có thể pháttriển trongm ô i t r ư ờ n g c ó p H = 2 , 0 - 8 , 0 n h ư n g t r o n g điều kiện lên men rượu, pH thích hợp để nấm men phát triển hoạt động chuyểnhóa đường thành ethanol là 4,0-4,5; vi khuẩn bắt đầu phát triển tốt ở pH=4,2 vàcao hơn Vì vậy trong quá trình được thực hiện lên men giới hạn pH=3,8-4,0 đểngăn ngừa hiện tượng nhiễm khuẩn Tuy nhiên, trong thực tế có những loại vikhuẩn thích nghi dần với pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thíchhợp, cần kết hợp sử dụng chất sát trùng Khi pH=8,0 thì nấm men phát triển rấtkém, ngượclại vi khuẩn phát triểnmạnh.ỞpH=3,8,nấmmenphát triểnmạnh thì hầu như vi khuẩn ít phát triển pH thích hợp cho sự phát triển và hoạt động củanấm men không cố định, pH tùy thuộc vào nhiều yếu tố như chủng nấm men,thành phần môi trường lên men, điều kiện lên men,… Để tạo pH thích hợp trongmôi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) có thể bổ sung vào môi trường bấtcứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng đến hoạt độngcủanấmmen(NguyễnCôngHà,2000).

Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang là vi sinh vật kỵ khíkhông bắt buộc Khi trong môi trường đủ lượng oxy, hoạt động sinh sản của nấmmen mạnh mẽ hơn, vì vậy lượng sinh khối tăng lên nhanh và trở thành sản phẩmchủ yếu trong môi trường lên men Còn trong trường hợp thiếu oxy (kỵ khí), nấmmen sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng và lên men, tạo rasản phẩm chủ yếu là ethanol Trong quá trình lên men, ở giai đoạn đầu nấm mencần lượng oxy cao nhất để đáp ứng nhu cầu sinh sản, phát triển tăng sinh khối.Nếu có giai đoạn nhân giống thì cũng cần phải cung cấp oxy bằng cách lắc hoặcsụckhí (Lương ĐứcPhẩm,1998).

2.1.4.4 Ảnhhưởngcủanồngđộdịchđường Đường là cơ chất của quá trình lên men nên ảnh hưởng nhiều đến hiệu suấtlênm e n N ồ n g đ ộ đ ư ờ n g t h í c h h ợ p đ ể l ê n m e n r ư ợ u k h o ả n g 2 2 -

2 5 o Brix.K h i nồng độ dịch đường quá cao, tế bào nấm men sẽ bị co nguyên sinh và chết, làmhiệusu ất l ê n m e n r ư ợ u t h ấ p N ế u nồ ng độ đ ư ờ n g t h ấ p c ũ n g s ẽ l à m g i ả m nă ng suất lên men, mất nhiều thời gian (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng,2007) Trong dịch quả tự nhiên thường có hàm lượng đường không giống nhau dođó cần bổ sung thêm đường saccharose Phần lớn các loại nấm men hoạt độngbình thường trong môi trường có hàm lượng đường dưới 20% Một số chủng nấmmen hoạt động ở môi trường có độ đường cao hơn Khi nhân giống thường dùngmôitrườngcóđườngthấpdưới10% (LươngĐứcPhẩm,1998).

Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men có ảnh hưởng đến quá trìnhlên men Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên mendiễnr a t ố t , h i ệ u s u ấ t t h u h ồ i c a o v à c h ấ t l ư ợ n g s ả n p h ẩ m t ố t h ơ n N g ư ợ c l ạ i , lượngnấmmenchovàoítthìtốcđộlênmenchậm,sinhkhốitế bàonấ mmenthấp tạo điều kiện cho nấm men phát triển, hạn chế quá trình lên men kỵ khí.Nếusốlượngnhiềuthìmôitrườngdịchmenkhôngđủchonấmmenpháttriển,sản phẩmsinhramùilạ,đồngthờigâylãngphínấmmengiống(NguyễnCôngHà,200 0).

Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhiệt độ, nồng độ dịchđườnglênmen,chủngnấmmen.Quátrìnhlênmenbaogồmlênmenchín hvàlên men phụ Thời gian lên men tính từ lúc cấy men giống vào môi trường lênmen Sự lên men thật sự kết thúc khi nấm men hết khả năng chuyển hóa đườngthành rượu và CO 2 Ở nhiệt độ trung bình từ 25-28oC nếu pH khác nhau thì thờigian lên men khác nhau, nhiệt độ này thích hợp cho nấm men phát triển, thời gianlên men kéo dài từ 15-20 ngày Ở nhiệt độ cao 40-

50 o C, quá trình lên men bịdừng,tếbàonấmmenchếtdần(TrầnMinhTâm,2000).

2.1.4.7 Ảnhhưởngcủaánhsáng Ánh sáng là yếu tố ức chế hoạt động của nấm men Đặc biệt các tia cực tímtrong ánh sáng giết chết tế bào nấm men, vì vậy quá trình lên men có sựu phụthuộcvàothờitiếtcủatừngmùa.

Nấm men rượu vang có thể bảo vệ được hoạt tính ở 10-20 g/L acid tự do(acid tartric, acid malic, acid citric,…) Chúng có thể hoạt động tốt trong môitrường có 8-10 g/L acid (vi khuẩn bị ức chế) Hoạt động của vi khuẩn acetic cóảnh hưởnglớnđếnquá trìnhlênmen rượuvang,pH4) bào tử túi nhẵn, hình ovan, tròn, que hay hình thận, bào tử túiđược phóng ra Đa số giốngKluyveromycescó khả năng lên men đường, khônghoạthóaureasevàgelatinase.

GiốngS a c c h a r o m y c e s:t ế b à o n ả y c h ồ i n h i ề u h ư ớ n g , đ ô i k h i c ó k h u ẩ n t y giả, có sự hình thành bào tử Túi bào tử khá bền và hình thành trực tiếp từ một tếbào lưỡng bội, mỗi túi có chứa 1-4 (ít khi nhiều hơn) bào tử túi hình ovan hoặctròn nhẵn Chúng có khả năng lên men đường, không tạo ván trên môi trườnglỏng,khônghoạthóaureasevàgelatinase.

GiốngP i c h i a:t ế b à o nả y chồin h i ề u h ư ớ n g , c ó k h u ẩ n t y thậtv à k h u ẩ n t y giả, có sự hình thành bào tử, túi có chứa 1-4 bào tử, ít khi có 8 bào tử Bào tửnhẵn,tròn,cóhìnhnón, haycầu,cóhoặckhôngcórìaởxíchđạo.Mộtsốloà inấm men thuộc giống Pichia có khả năng lên men đường, tạo ván trên môi trườnglỏng,cókhảnănghoạthóaureasevàmộtsốchủngcókhảnănghoạthóagelatinase.

GiốngSchizosaccharomyces: các tế bào nấm men thuộc chi này không nảychồi mà phân cắt, đôi khi có khuẩn ty thật và thường ngắt ra khi giải phóng bào tửđốt Túi bào tử có từ 2-8 bào tử túi dạng tròn, ovan hay thận Giống nấm men nàycókhảnănglên menđường,không cókhảnănghoạthóa ureasevàgelatinase. Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về cây giác, đặc biệt là nghiên cứu vềtrái giác Tại trường Đại học Cần Thơ đã có nhóm nghiên cứu về thành phần hóahọc và hoạt tính kháng vi sinh vật dây giác của Nguyễn Phúc Đảmvà ctv.,2017.Nghiêncứuđãsànglọcđược5chiếtxuấttừcácthànhphần(n– hexan,chloroform, ethyl acetate, methaol và methanol – H 2 O (80:20)) có hoạt tính khángkhuẩn chống lại 8 dòng vi khuẩn, xác định được chiết xuất từ chloroform có hoạttínhchốngnấmF.oxysporum,S.cerevisiaevàC.albicansvớigiátrịMIClà200-400àg/mL.

Mộtsốkhảosátthực tếtrongphạmvi nghiêncứucủaluậnán

Thựctếsảnxuất nấmmenthương mại tạiCôngtySaf-Viet

Kết quả nghiên cứu tuyển chọn giống nấm men thích hợp cho quá trình lênmen rượu vang trái giác trong điều kiện ấm dần lên của trái đất do tình trạng biếnđổi khí hậu có thể hướng đến nghiên cứu sản xuất giống nấm men cung cấp chosản xuất rượu vang trong tương lai ở Việt Nam Nhằm trang bị cơ sở cho địnhhướng này, đề tài đã tìm hiểu thực tế kỹ thuật và công nghệ sản xuất Công ty Saf-Việt Đây là thành viên của tập đoàn Lesaffre Tập đoàn Lesaffre được thành lậpvào năm 1999,chuyêncung cấp những giải pháp cảit i ế n t r o n g n g à n h b á n h v ớ i các loại men chất lượng cao từ công nghiệp đến thủ công, nguyên liệu được trộnsẵn, phụ gia bánh mì và các nguyên liệu trong ngành bánh Tập đoàn Lesaffre hợptác với Công ty Cát Tường để thành lập nên Công ty Saf-Việt với một nhà máysản xuất tại cụm công nghiệp Long Định xã Long Định huyện Cần Đước tỉnhLong An, có trụ sở chính tại khu vực Châu Á Thái Bình Dương ở Singapore vàmột Trung tâm làm bánh tại thành phố Hồ Chí Minh Việt Nam.Việc nghiên cứuvề sản xuất giống nấm men được tìm hiểu thực tế từ quy trình sản xuất nấm mentạicôngty(Hình2.18).

Hình 2.18: Đoàn đến làm việc tại công ty Saf-

VietCác sản phẩm nấm men của Saf-Viet được trình bày ở Bảng 2.6.Bảng2.6.ĐặcđiểmsảnphẩmnấmmencủacôngtySaf-Viet

Stt Tênsản phẩm Đốitượng ápdụng Điềukiện sửdụng thíchhợp

2 Mentươi SongMã Bánhmìlạt 2% trên bột mìNhiệtđộủ: 30–40ºC

Stt Tênsản phẩm Đốitượng ápdụng Điềukiện sửdụng thíchhợp

3 Mentươi SafViet Bánhmìlạt 2% trên bột mìNhiệtđộủ: 30–40ºC Thời gianủ :2 giờ – 8giờ

Gold tươi Five Stars Cácloại bánhmì ngọt 2% trên bột mìNhiệtđộủ: 30–40ºC Thời gianủ :2 giờ – 8giờ

Bánhmìlạt 1% trên bột mìNhiệtđộủ: 30–40ºC Thời gianủ :2 giờ – 8giờ

Cácloại bánhmì ngọt 1% trên bột mìNhiệtđộủ: 30–40ºC Thời gianủ :2 giờ – 8giờ

Red khô Saf Instant Bánhmìlạt 1% trên bột mìNhiệtđộủ: 30–40ºC Thời gianủ :2 giờ – 8giờ

Gold khô Saf Instant Cácloại bánhmì ngọt 1% trên bột mìNhiệtđộủ: 30–40ºCThời gianủ :2 giờ – 8giờ

Phươngtiệnnghiên cứu

Thờigianvàđịa điểm

Thờigian: từ tháng8năm2016đếntháng8năm2019. Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiêncứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, Phòng thínghiệmHóasinh KhoaNôngnghiệpĐạihọcYamaguchi,Nhật Bản.

Nguyên liệu: trái giác được thu hái từ các tỉnh, thành phố thuộc Đồng bằngsông Cửu Long, lựa chọn những trái giác chín, mọng nước, cóm à u đ e n s ẫ m (Hình 3.1) Trái được đặt vào các thùng xốp, có lót giấy để tránh va đập, vậnchuyển ngay về phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinhhọc,TrườngĐạihọcCầnThơtrongthờigian 4-6giờ.

Tổng số mẫu trái giác là 53 mẫu tương ứng với những địa điểm cụ thể đượcmô tảởBảng3.1.

3 PhườngAnHòa,thành phốRạchGiá, tỉnhKiênGiang KG3

4 XãLongThạnh,huyện GiồngRiềng,tỉnhKiên Giang KG4

5 XãAnBiên,huyện UMinhThượng,tỉnhKiênGiang KG5

6 XãVọngThê, huyện ThoạiSơn, tỉnh An Giang AG1

7 Thị trấn BaChúc, huyện TriTôn,tỉnhAnGiang AG2

8 XãAn Cư,huyệnTịnhBiên, tỉnh AnGiang AG3

10 XãMỹHòa,huyện ĐồngTháp Mười, tỉnh ĐồngTháp DT1

11 Xã HòaBình,huyện TamNông, tỉnh ĐồngTháp DT2

12 Thị trấnLaiVung,huyện LaiVung,tỉnhĐồngTháp DT3

13 Thànhphố Cao Lãnh,huyện Cao Lãnh,tỉnhĐồngTháp DT4

14 XãTânTây, huyệnThạnhHóa,tỉnh LongAn LA1

15 XãThuậnMỹ, huyện ChâuThành, tỉnh LongAn LA2

16 XãThạnh Phú,huyện BếnLức, tỉnh LongAn LA3

17 XãVùngThượng, huyện Cần Giuộc, tỉnh LongAn LA4

18 XãTríPhải,huyệnThớiBình, tỉnh CàMau CM1

20 XãNguyễnPhích,huyệnU Minh,tỉnhCàMau CM3

21 XãTân ÂnTây, huyệnNgọc Hiển,tỉnh CàMau CM4

24 XãPhongThạnhTây, huyệnGiá Rai,tỉnh BạcLiêu BL3

26 Xã LongHưng, Huyện MỹTú,tỉnhSócTrăng ST1

27 Xã AnMỹ, huyện Kế Sách,tỉnhSócTrăng ST2

28 XãVĩnh Hiệp, thị xãVĩnhChâu,tỉnh SócTrăng ST3

29 Thị trấn LongPhú, huyện LongPhú, tỉnhSócTrăng ST4

30 XãTânTrung, huyện Mỏ CàyNam, tỉnh BếnTre BT1

31 XãMỹHưng, huyệnThạnhPhú,tỉnh BếnTre BT2

32 Thị trấn BaTri, huyện BaTri,t ỉ n h B ế n Tre BT3

33 XãLongĐịnh, huyện BìnhĐại,t ỉ n h B ế n Tre BT4

34 Huyện CàngLong, tỉnh TràVinh TV1

37 XãHiệpMỹTây,huyện CầuNgang, tỉnhTràVinh TV4

39 Quốc lộ 91B, Quận NinhKiều,thànhphố CầnThơ CT2

42 ẤpTrầuHôi,huyện ChâuThành,tỉnh HậuGiang HG1

43 Thành phốVịThanh, tỉnhHậu Giang HG2

46 HuyệnBình Minh,tỉnhVĩnh Long VL1

Thiết bị,dụngcụ,hóachất

Thiết bị: buồng đếm hồng cầu Thoma, lame, lamen; chiết quang kế (C20 CPLAUDAE d i t i o n 2 0 0 0 ) ; h ệ t h ố n g c h ư n g c ấ t , c ồ n k ế 0 -

3 0 o ( M e r c k , G e r m a n y ) ; kính hiển vi (Olympus BH2, BX41TF, Japan); pH kế (Schott, Đức), máy vortex(Đức), máy đo OD (Hitachi, Nhật),máy lắc ủ Eppendorf (Đức),máy ly tâm lạnh(Hettich, Đức), tủ lạnh để trữ mẫu (Sanyo, Nhật), tủ ủ vi sinh vật (Incucell 111,Đức),tủủvisinh (SANYO,Japan);tủcấy visinhvật(Pháp),cânđiệntử(Sartorius, Đức); microwave

(SANYO, Japan); nồi thanh trùng nhiệt ướt

(PBI,Italia);tủcấyvôtrùng(TELSTRAR,Spain);tủlạnh(SANYO,Japan).

Dụng cụ: bộ tỷ trọng Hydrometer; cốc 250 mL, 1000 mL; ống đong 10 mL,25mL,200mL;eppendorf2mL;bìnhtamgiác150mL,250mL;chai,lọthủ y tinh; micropipette: 10 àL, 200 àL, 1000 àL; đầu cone xanh, vàng; đĩa petri, ốngnghiệm,đèncồn, quecấy,khăngiấy, dao,bọcnhựa,…

Hóachấtthanhtrùng:NaHSO3;hóachấtđiềuchỉnhpH:acidc i t r i c , NaHCO3(M erck);hóachấtthửhoạttínhkhángoxyhóa:1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

Hóa chất cho phản ứng PCR: PCR buffer,TaqDNA polymerase, DNA nấmmen,dNTPs(dATP,dTTP,dGTP,dCTP),BiH 2 O,),MgCl2.

Cặp mồi: NL-1 (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) và NL-4 (5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG.

Môitrườngtăngsinhkhối:môitrườngYPD(Bảng3.2),môitrườngphânlậpnấm men:môitrườngYPDagar (Bảng3.3).

Môitrường Chistensenureabroth(Bảng3.4),môitrườngGelatine(Bảng3.5).

Phương phápnghiêncứu

Thuthập,đánhgiáđặc điểmcủatráigiác

Mục đích: xác định đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu sắc của trái giáctrong tự nhiên ở ĐBSCL gồm giá trị pH, độ Brix, hàm lượng đường và khả năngkhángoxyhóa củatráigiác.

Phương pháptiến hành: Trái giácđược thut ừ c á c v ị t r í đ ị a l ý k h á c n h a u , saukhithuvềđược rửasạch, đểráo

Quan sát mắt thường các đặc điểm về hình dạng, màu sắc trái khi chín, kíchthước trung bình của trái giác ở các địa điểm khác nhau Xác định kích thướctrung bình của trái ở mỗi địa điểm bằng cách chọn ngẫu nhiên một số trái chín bấtkỳnhưngđảmbảotínhđạidiệncủamẫuthuvề,dùngthướccóđộchianhỏnhấtlà mmđặtlêngiữatrái,đođườngkính tráivàchụphìnhlại.

Mục tiêu: xácđịnh được các chỉ số vềh à m l ư ợ n g đ ư ờ n g t ổ n g , đ ư ờ n g k h ử , độBrix,pH.

Phươngpháptiếnhành:mẫusaukhithuthậpsẽđượcrửasạch,đểráo,éplấy dịchtríchtiếnhànhthínghiệm. a Xácđịnhhàmlượngđườngtổng

Xây dựng đường chuẩn: dung dịch glucose gốc có nồng độ 1 mg/mL, phathànhcácnồngđộ0;25;50;75;100;125;150;175;200mg/mL,sauđócho 1mL các dung dịch này vào từng ống nghiệm Tiếp tục thêm 1 mL phenol vào, sauđó thêm 5 mL H 2 SO4đậm đặc vào, vortex đều, để nguội 10 phút Đo độ hấp thụ ởbước sóng 490 nm Lặp lại thí nghiệm 3 lần Thu kết quả và tiến hành vẽ đườngconghiệuchuẩnđểxácđịnhhàmlượngđường tổng(Hình3.2).

Thínghiệmvớimẫu:hút1mLdungdịchmẫuphaloãngởnồngđộthíchh ợp cho vào ống nghiệm rồi cho thêm 1 mL phenol Sau đó cho 5 mL H2SO4đậmđặcvào,vortex đều, đểnguội10 phút.Đođộhấpthụởbướcsóng490nm. b Xácđịnhhàmlượngđườngkhử

Hàm lượng đường khử theo phương pháp acid dinitro - salicylic (DNS) (Tasunet al.,1970) dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử aciddinitrosalicylic Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độđường khử trong phạm vi nhất định Dựa trên đồ thị đường chuẩn đối với glucosetinhkhiếttínhđượchàmlượngđườngkhử trong mẫuphântích.

Xây dựng đường chuẩn: dung dịch glucose gốc có nồng độ 1 mg/mL, phathànhc á c n ồ n g đ ộ 0 ; 2 5 ; 5 0 ; 7 5 ; 1 0 0 ; 1 2 5 ; 1 5 0 m g / m L , s a u đ ó c h o 2 m L c á c dung dịch này vào từng ống nghiệm, hút tiếp 1 mL dung dịch thuốc thử DNS chovào các ống ống nghiệm, lắc đều và đun sôi cách thủy trong 5 phút, để nguội Đođộ hấp thụ ở bước sóng

540 nm Lặp lại thí nghiệm 3 lần Thu kếtq u ả v à t i ế n hànhvẽđườngconghiệuchuẩnđểxácđịnhhàmlượngđườngkhử(Hình3.3).

Thí nghiệm với mẫu: hút 2 mL dung dịch mẫu ở nồng độ thích hợp cho vàoống nghiệm, cho thêm 1 mL dung dịch thuốc thử DNS vào các ống nghiệm, lắcđều và đun sôi cách thủy trong 5 phút, để nguội Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm. c ĐochỉsốpH bằng pHkế d ĐođộBrixbằngchiếtquangkế

Chỉtiêuđánhgiá:hàmlượngđườngtổngsố,hàmlượngđườngkhử,giátrịpH,đ ộBrix.

Mục tiêu: xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng kháng oxyhóacủatráigiác.

Phươngpháptiếnhành:mẫusaukhithuthậpsẽđượcrửasạch,đểráo,éplấy dịchtríchtiếnhànhthínghiệm a Xácđịnhhàmlượngpolyphenoltổngsố

Dịch trích trái giác được xác định hàm lượng polyphenol bằng phương phápFolin-Ciolcateau(Singletonvà Rossie,1956).

Xây dựngđường chuẩnacidgalic:dungdịchacidgaliccónồngđộ1 mg/mL được pha thành cỏc nồng độ 20; 40; 60; 80; 100; 120 àg/mL, sau đú rỳt0,5 mL cỏc dung dịch này cho vào ống nghiệm Tiếp tục thêm 1,25 mL dung dịchFolin 10% vào để yên 5 phút Hút tiếp 1 mL Na2CO32 % c h o v à o m ỗ i ố n gnghiệm, lắc đều và để yên 45 phút trong tối Sau 45 phút ta tiến hành xác định độhấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 765 nm Thí nghiệm được thực hiệnlặplại3lần Thukết quảvẽđường conghiệuchuẩn(Hình3.4)

Thínghiệmvớimẫu:hút0,5mLdungdịchmẫuđượcphaloãngvớimethanol ở nồng độ thích hợp cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 1,25 mL dungdịchFo li n 1 0 % và đ ể y ê n 5 p hú t đ ể du ng d ị c h phả nứ ng T iế p t ụ c t h ê m 1 m L dungdịchNa 2 CO32 % ,lắcđều.Đểyên45phúttrongtốiởnhiệtđộphòngvàtiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 765 nm Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.Dựavàođườngchuẩnxácđịnhhàmlượngpolyphenoltrong mẫuthínghiệm. b Xácđịnhkhảnăngkhángoxyhóadựavàogốctựdo DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp sử dụng DPPH (Tabartet al.,2007) dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ragốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụngkháng oxy hóa của các chất nghiêncứu Hoạt tính kháng oxy hóat h ể h i ệ n q u a việcgiảmmàucủaDPPH và được xácđịnh bằng cáchđ o q u a n g p h ổ D P P H l à gốc tự do cóm à u t í m h ấ p t h ụ c ự c đ ạ i ở b ư ớ c s ó n g 5 1 7 n m n ó đ ạ i d i ệ n c h o c á c gốc tự do có bản chất hóa học Chất thử có khả năng khử gốc tự do này nghĩa làchúng làm mất màu DPPH, quan sát khả năng làm mất màu DPPH của chất thửnhiềuhayítđểcóthểđánhgiámứcđộkhángoxyhóacủachấtthử.

XâydựngđườngchuẩnVitaminC:dungdịchVitaminCcónồngđộgốclà1 mg/mL được pha thành cỏc nồng độ 2; 4; 6; 8; 10; 12 àg/mL Hỳt 1 mL dungdịch này vào cỏc ống nghiệm, sau đó thêm 2 mL dung dịch DPPH (39,4 μg/mL)vàomỗi ống nghiệm.Để trong tối 30g/mL)vàomỗi ống nghiệm.Để trong tối 30 phút để dung dịchphản ứngv à đ o đ ộ h ấ p thụ ở bước sóng 517 nm Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần Thu kết quả vàtiếnhànhvẽđườngconghiệuchuẩnđểsosánhphầntrămứcchế(IC).

Thí nghiệm vớimẫu:c h o 1 m L d u n g d ị c h m ẫ u đ ư ợ c p h a l o ã n g v ớ i d u n g môi methanol ở nồng độ thích hợp vào các ống nghiệm, sau đó thêm 2 mL dungdịch DPPH (39,4 μg/mL)vàomỗi ống nghiệm.Để trong tối 30g/mL) Để trong tối 30 phút để dung dịch phản ứng và đo độhấp thụ ở bước sóng 517 nm Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần Kiểm soátđối chứng âm (mẫu control) được chuẩn bị bằng cách trộn

2 mL DPPH với 1 mLdung dịch methanol và dung dịch đối chứng dương được chuẩn bị bằng 3 mLmethanol Công thức tính phần trăm bắt gốc như sau: IC ( T r o n g đ ó , IC là phần trăm ức chế, AC là bước sóng đo được của mẫu control và AS là bướcsóngđođượccủamẫuthử).

Phânlậpcácchủngnấmmentừtráigiáctựnhiênvàxácđịnhcácđặcđi ểmhình thái,sinhlý,sinhhóa

3.2.2.1 Phânlập cácchủngnấm men từ trái giáctựnhiên

Cho100 mLmôi trườngvào mỗi bìnhtamgiác

Phương pháp tiến hành: mẫu trái giác được tiến hành thu trong 3 đợt nhưsau: đợt 1 tiến hành thu mẫu trái giác ở các tỉnh phía Tây của ĐBSCL, gồm tỉnhKiên Giang, An Giang, Đồng Tháp và Long An; đợt 2 tiến hành thu mẫu trái giácở các tỉnh, thành phố ở giữa của ĐBCSL, gồm tỉnh Hậu Giang, Vĩnh Long, TiềnGiang và thành phố Cần Thơ; đợt 3 tiến hành thu mẫu trái giác ở các tỉnh còn lạicủa ĐBSCL, gồm tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre và Trà Vinh Tráigiác sau khi thu hái được mang về phòng thí nghiệm, lựa chọnnhững trái giácchín,mọng nướcvàcăng,cómàuđensẫmrửasạchvới nướcnhiều lần,đểráo.

Nuôi tăng sinh:sử dụng môi trường nuôi tăng sinh YPD Các bước thựchiệnquátrìnhnuôităngsinh đượctrìnhbàyởHình3.5. Đểnguội

Cấy trải mẫu:môi trường cấy trải YPD agar Các bước thực hiện quátrìnhcấytrãimẫu (Hình3.6).

Cấytrãimẫu Ủở30°Ctrong 48giờ Chuẩnbị môitrường,đĩapetri,ốngnướccấtphaloãng

Cấychuyển mẫu nấm men:cácmẫusaukhi cấy trãi và ủ, chọnc á c khuẩn lạc rời có hình dạng và kích thước khác nhau cấy vào đĩa petri chứa môitrường YPD mới (ủ ở 30ºC trong 48 giờ) Sau đó tiếp tục tiến hành cấy chuyểnnhiều lần cho đến khi ròng, hình dạng tế bào nấm men đồng nhất (quan sát dướikinhhiểnviđểxácđịnhđộđồngnhấtcủatếbào).

Cácchủngnấmmen phânlậpđượcxácđịnhcácđặcđiểmsinhhóabaogồmxácđịnhđặcđiểmhìnhthái,khả nănglênmencácloạiđường nh ư saccharose, maltose và glucose, hoạt tính phân giải urea, thủy phân gelatin, cách nảy chồi, đặcđiểmhình thànhbàotử.

Mục đích:Xác định được hình dạng và kích thước tế bào nấm men của cácchủngnấmmenđãphânlậpđược.

Phương pháp tiến hành: cấy các chủng nấm men đã phân lập được lên đĩapetri chứa môi trường YPD agar Ủ các đĩap e t r i ở n h i ệ t đ ộ 3 0 º C t r o n g 4 8 g i ờ Ghi nhận hình dạng và kích thước khuẩn lạc các chủng nấm men trên đĩa Làmtiêu bản các chủng nấm men quan sát dưới kính hiển vi để xác định hình dạng,kíchthướccủatếbào.

Chỉ tiêu đánh giá: Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men khi quan sátdướikínhhiểnvi.

Mục đích: Khảo sát khả năng lên men các loại đường của các chủng nấmmenđãphânlậpđược.

Phương pháp tiến hành: cho 1 mL dung dịch nấm men đã được ủ sau 24 giờcho vào ống nghiệm có chứa 9 mL dung dịch saccharose 2% đã được khử trùng,lắc đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống Durham úp ngược, ủ ở 30°C (Hình3.7) Những chủng nấm men có khả năng lên men sẽ tạo ra CO 2 , quan sát cột khíCO2sinh ra trong ống Durham úp ngược sau 48 giờ ủ, thí nghiệm được quan sátlặp lại 3 lần Khảo sátkhả năng lênmen đườngm a l t o s e v à g l u c o s e đ ư ợ c t h ự c hiệncácbướctươngtựđốivớidungdịchđườngsaccharose.

Chỉ tiêu đánh giá:sựh ì n h t h à n h c ộ t k h í C O2t r o n g c h u ô n g

Hình 3.7: Bố trí thí nghiệm khả năng lên men đường saccharosecủacác chủngnấmmentrongốngnghiệmcó chuôngDurham

Phương pháp tiếnhành:chuẩnbịm ô i t r ư ờ n g C h i s t e n s e n u r e a b r o t h C h o vào mỗi ống nghiệm 5mL môi trường Khử trùng môi trường và ống nghiệm ở121ºC trong 20 phút Các chủng nấm men đã phân lập được chủng vào ốngnghiệm có chứa môi trường Chistensen urea broth ủ ở 30ºC trong 24 giờ. Chủngnấmmencósinhraenzymureasesẽphângiảiureathànhammoniavàcarbondioxi de, ammonia sinhra làm kiềm hóamôi trường và làm thay đổic h ấ t chỉthịmàu.

Kếtquảdươngtính khimôitrường chuyểnsangmàu đỏsẫm(Hình 3.8)

Phương pháp tiến hành: chuẩn bị môi trường gelatine, điều chỉnh pH đến7,7 ± 0,2 Khử trùng môi trường và ống nghiệm ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút.Các chủng nấm men đã phân lập được chủng vào ống nghiệm có chứa 5 mL môitrường gelatin, ủ ở 30°C trong 48 giờ, sau đó để trong tủ lạnh 4°C Chủng nấmmen có khả năng sinh ra enzyme gelatinase sẽ làm hóa lỏng môi trường gelatine.Biến dưỡng protein bởi enzyme gelatinase có hai bước và kết quả là tạo hổn hợpcácaminoacidsriênglẽ.

(a) Một số chủng nấmmenkhôngcó khả năng phân giải gelatine (b) Mộtsốchủng nấmmencó khảnăngphân giảig e l a t i n e

Phương pháp tiến hành: nấm men được chủng vào môi trường YDP, ủ ởnhiệtđộphòngtrong3ngày,sauđólấyraquansátdướikínhhiểnvi, khiquansát cần phân biệt tế bào nẩy chồi hay phân cắt hay cả hai Nếu chồi xuất hiện thì xuấthiện ở đâu, có mấy chồi con trên tế bào mẹ, chồi con có tách rời tế bào mẹ haykhông.

Chỉ tiêu đánh giá:vị trí, cách nảy chồi của nấm men khi quan sát dưới kínhhiểnvi.

Mục đích: quan sát đặc điểm hình thành bào tử của các chủng nấm menPhươngpháptiếnhành:nấmmen trẻ saukhinuôicấy quađêmđược đưa vào môi trường YPD, nuôi cấy từ 2-3 ngày, sau đó chuyển sang môi trường sinhbào tử thạch-nước, nuôi trong 3 ngày sau đó quan sát dưới kính hiển vi Nếu quansátkhôngthấybàotửthìtiếptụcgiữvàquansáttrong6tuầnliền.Quansátnấm men có hình thành bào tử hay không, bào tử hình thành từ sự tiếp hợp hai tế bàosinhdưỡng,cũngcóthể xảyrasựtiếphợpgiữa tế bàomẹvàtếbào con,hìn hdạngbàotử,số bàotử.

Chỉ tiêu đánh giá: hình dạng và số lượng bào tử của nấm men khi quan sátdướikínhhiểnvi

Tuyểnc h ọ n , đ ị n h d a n h v à x á c đ ị n h m ố i q u a n h ệ c á c c h ủ n g n ấ m m

Mục đích: tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng sinh trưởng vàpháttriểnởnhiệtđộcao.

Phương pháp tiến hành: thí nghiệm 2 nhân tố là chủng nấm men và nhiệt độvới 3 lần lặp lại Các chủng nấm men phân lập được sẽ cấy ria được trên petri cóchứa môi trường YPD agar Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ khác nhau: 30ºC, 35ºC,37ºC, 39ºC, 41ºC, 43ºC, 45ºC và 47ºC trong 48 giờ (Casellas, 2005) Quan sát sựhình thành khuẩn lạc của các chủng nấm men ở điều kiện nhiệt độ cao trong thờigiantrong48giờ.

Chỉ tiêu đánh giá: Sự hình thành khuẩn lạc của các chủng nấm men ở cácmức nhiệt độ khác nhau từ đó chọn những chủng nấm men có khả năng phát triểnở nhiệt độ từ 37ºC Các chủng nấm men tuyển chọn sẽ được đánh giá khả năngchịuethanol.

Mục đích: tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng phát triển trongmôitrườngcóethanol.

Phương pháp tiến hành: thí nghiệm 2 nhân tố là chủng nấm men và nồng độethanolv ớ i 3 l ầ n l ặ p l ạ i C á c c h ủ n g n ấ m m e n đ ư ợ c c h ị u n h i ệ t đ ư ợ c c h ọ n t ừ

3.2.3.1 được cấy ria trên môi trường YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết 3%,6%,9%,12%, 15%v/v (CaseyvàIngledew,1986)v à mẫuđốichứng 0% Cácđĩa petri được ủ ở nhiệt độ 30ºC trong thời gian 48 giờ Quan sát sự hình thànhkhuẩn lạc của các chủng nấm men ở điều kiện môi trường cónồng độ ethanolkhácnhau.

Chỉ tiêu đánh giá: Sự hình thành khuẩn lạc của các chủng nấm men trongmôit r ư ờ n g c ó n ồ n g đ ộ e t h a n o l k h á c n h a u t ừ đ ó c h ọ n đ ư ợ c n h ữ n g c h ủ n g n ấ m men chịu nhiệt có khả năng chịu được nồng độ ethanol trong môi trường từ 9%v/ v trở lên Các chủng nấm được tuyển chọn sẽ sử dụng để đánh giá khả năng lênmenrượuvangtráigiác.

3.2.3.3 Đánh giá khả năng lên men ethanol của nấm men chịu nhiệt,chịuethanol

Mục đích: tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men ethanolmạnh bằng phương pháp lên men dung dịch đường glucose 2% và dịch trái giáctrongốngnghiệmcóchuôngDurham.

Phương pháp tiến hành: nuôi tăng sinh các chủng nấm men được chọn, ủ ở30 o C trong 24 giờ, chủng 1 mL dịch tăng sinh nấm men vào ống nghiệm cóchuôngD u r h a m ú p n g ư ợ c c h ứ a 9 m L d u n g d ị c h đ ư ờ n g g l u c o s e 2 % ( w / v ) , đ ã được khử trùng ở 121 o C trong 20 phút Tương tự, chủng 1 mL dịch tăng sinh nấmmen vào ống nghiệm có chuông Durham úp ngược chứa 9 mL dịch trái giác đượcđiều chỉnh về pH=4 và 22ºBrix và được thanh trùng bằng NaHSO3(140 mg/Ltrong 2 giờ) để loại bỏ vi sinh vật tạp nhiễm chứa trong dịch ép (Trần Thị Thanh,2007), lắc đều để dung dịch đường hoặc dịch trái giác tràn đầy vào chuôngDurham bên trong ống nghiệm Đo chiều cao cột khí trong chuông Durham sau 6,12, 18, 24, 30, 36, 42 và 48 giờ ủ ở nhiệt độ phòng (28-

30 o C) để xác định khảnăng lên men ethanol của các chủng nấm men (Dunget al.,

Chỉtiêuđánhgiá:chiềucaocộtkhí(mm)sau6,12,18,24,30,36,42,48 giờ.

Phươngpháptiếnhành:nhữngchủngnấmmencókhảnănglênmenethanol được nuôi trong môi trường tăng sinh đến khi mật số tế bào nấm men đạt

10 8 tếbào/mL Trái giác được rửa sạch, ép, lọc để thu dịch và đo pH, độ Brix, sau đóchỉnh pH về 4,5 và 22oBrix, thanh trùng dịch trái giác bằng NaHSO 3(140mg/

Ltrong 2 giờ) để loại bỏ vi sinh vật tạp nhiễm Sau đó, sử dụng 99 mL dịch trái giácvà chủng 1 mL dung dịch nấm men đã được nuôi tăng sinh vào các bình tam giác,mậtsốnấmmensaukhichủnglà10 6 tếbào/mL.Ủ5-7ngàytrongđiềukiệnkỵ

30 chu kì khí ở nhiệt độ 37ºC Đo pH và độ Brix để xác định sự thay đổi pH và độ Brix củamôi trường dịch ép trái giác sau thời gian lên men Chưng cất để thu ethanol, đonhiệt độ và nồng độ ethanol thu được, quy về nồng độ ethanol ở 20ºC (Phụ lụcA5) Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với nhân tố khảo sát là chủngnấmmen,thực hiện3lầnlặplại.

Chỉ tiêu đánh giá: đo pH, độ Brix sau lên men và hàm lượng ethanol sau khichưngcấtđểchọnđượcchủngnấmmentốtnhấtlên menrượuvangtráigiác.

3.2.3.5 Định danh các chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt, chịuethanolvà khảnănglên menrượu vangtráigiác đượctuyểnchọn

Mục đích: xác định tên khoa học và mối quan hệ di truyền của các chủngnấm men chịu nhiệt, chịu ethanol và có khả năng lên men rượu vang trái giác tốtđượctuyểnchọn.

Phương pháp tiến hành: các chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt, chịuethanol có khả năng lên men dịch trái giác sinh ra ethanol ≥ 6,0% (v/v) được địnhdanh bằng phương pháp sinh học phân tử với cặp mồi NL1 (5’-GCA TAT CAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) vàNL4 (5’-

D2của các ch ủ n g n ấ m menvớ ich uk ỳ nhiệtcủ aq uá trình PC Rđ ượ cb iểu diễn ởHình3.10,giảitrìnhtựvàđịnh danhtại ĐạihọcYamaguchi, NhậtBản.

Sosánhmức độtươngđồngvớidữliệutrênngânhànggencủaNCBIđể xác định loài của chủng nấm men được tuyển chọn Xây dựng cây phả hệ 26SrDNA của các chủng nấm men chịu nhiệt đã được định danh dựa trên multiplealigment, chương trình MEGA 6 (theo thông số Neighbor – Joining (NJ)) Độ tincậy của nhánh phả hệ được tính toán theo chương trình Boostrap với 1.000 lần lặplại.

Chỉ tiêu đánh giá: xác định tên loài và mối quan hệ di truyền của các chủngnấmmenchịunhiệtdựatrên sựphânnhánhtrongcâyphảhệvàchỉsốbootstrap.

Nghiênc ứ u đ i ề u k i ệ n t h í c h h ợ p c h o q u á t r ì n h l ê n m e n r ư ợ u v a n g t r á i giác 59

Mục đích: xác định nhiệt độ và pH thích hợp cho quá trình lên men rượuvangtráigiác.

Bố trí thí nghiệm: bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố là nhiệt độ và pHmôi trường với 3 lần lặp lại Nhân tố nhiệt độ gồm các nghiệm thức nhiệt độphòng (28-32ºC), 35ºC, 37ºC, 39ºC và 41ºC Nhân tố pH môi trường gồm cácnghiệm thức 4,0; 4,5; 5,0 và pH tự nhiên (trong dịch trái giác) Tổng cộng có4×5×3` đơn vị thí nghiệm được thực hiện Mỗi đơn vị thí nghiệm được tiếnhànhởthểtích100mLdịchtráigiác.

Phương pháp tiến hành: chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn và có hoạt tínhlên men rượu trái giác tốt nhất được nuôi trong môi trường tăng sinh đến khi mậtsố tế bào nấm men đạt 10 8 tế bào/mL Trái giác được rửa sạch, ép và lọc để đo pHvà độ Brix ban đầu của dịch trái Cho 99mL dịch trái giác vào bình tam giác, điềuchỉnh dịch trái về 22 o Brix, pH ở các mức 4; 4,5; 5 và pH tự nhiên, thanh trùngdịch trái giác bằng NaHSO3140mg/L trong 2 giờ để loại bỏ vi sinh vật chứa trongdịch ép.Chủng1mLdung dịchnấmmenđ ã đ ư ợ c n u ô i c ấ y v à o c á c b ì n h t a m giác, mật số nấm men sau khi chủng là 10 6 tế bào/mL, ủ 5-7 ngày trong điều kiệnkỵ khí (đậy bằng waterlock) ở các mức nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ phòng (28-32 o C), 35 o C, 37 o C, 39 o C và 41ºC Đo pH và độ Brix để xác định sự thay đổi pHcủa dịch quả.Chưng cất để thu ethanol, đo nồng độ ethanol và quy về hàm lượngethanolở20ºC.

Chỉ tiêu đánh giá: giá trị pH, độ Brix và nồng độ ethanol từ đó chọn nhiệt độvàpH lênmenchokhảosáttiếptheo.

3.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm men, độ Brix và thời gianlên men

Mục đích: xác định mật số nấm men, độ Brix và thời gian lên men thích hợpchoquá trình lênmen.

Bố trí thí nghiệm: bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 3 nhân tố, mỗi nhân tố 3 mứcđộ với 3 lần lặp lại Tổng cộng có 3×3×3×3 nghiệm thức được thực hiện. Mỗiđơn vị thí nghiệm được tiến hành ở thể tích 100 mL dịch trái giác Cụ thể: mật sốgiốngc h ủ n g l ầ n l ư ợ t là1 0 3 ,1 0 5 ,1 0 7 t ế b à o / m L , đ ộ B r i x : 2 0 , 2 2 ,

2 4 º B r i x (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2002), thời gian lên men: 5, 7, 9ngày.

Phương pháp tiến hành: chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn và có hoạt tínhlên men rượu trái giác tốt nhất được nuôi trong môi trường tăng sinh khối đến khimậtsốtếbàonấmmenđạt10 9 tếbào/mL.Tráigiácđượcrửasạch,épvàlọcđểđo pHvàđộBrixbanđầucủadịchtráigiác.Cho99mLdịchtráigiácvàobìnhtam giác Điều chỉnh giá trị pH được chọn ở nội dung 3.2.4.1 Thanh trùng dịchtrái giác bằng 140mg/L NaHSO3trong 2 giờ để loại bỏ vi sinh vật chứa trong dịchquả Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã nuôi cấy vào bình tam giác có chứa 99mLdịchtráigiácvàđậy lạibằngwaterlock,lênmenởnhiệtđộđượcchọnởmục

3.4.2.1 Đo pH vàđộBrix để theo dõiquá trình lênm e n , c h ư n g c ấ t đ ể t h u ethanol,đohàmlượngethanolvàquyvề nồngđộethanolở20ºC.

Chỉ tiêu đánh giá: mật số nấm men, độ Brix và thời gian lên men thích hợpchoquátrìnhlênmen.

3.2.4.3 Lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệtđượctuyểnchọn

Mục tiêu: đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm rượu vang trái giácsửdụng chủngnấmmenchịunhiệtđượctuyểnchọn.

Phươngp há p t i ế n h à n h : n u ô i c ấ y tế b à o n ấ m m e n đ ư ợ c t u y ể n c h ọ n t r o n g môi trường tăng sinh đến khi đạt mật số tế bào nấm men 10 9 tế bào/mL Sử dụngtrái giác tròn, rửa sạch, ép và lọc để thu dịch trái giác, chỉnh giá trị pH được chọnở nội dung3.2.4.1, độ Brix và mật số nấm men được chọn ở nội dung 3.2.4.2, bổsungNaHSO3(140 mg/L) vào, để yên trong 2 giờ Sau đó, sử dụng 990 mL dịchtrái giác đã thanh trùng vào các bình tam giác 2 L và chủng 10 mL dung dịch nấmmenđãđượcnuôicấyvào,ủtrongđiềukiệnkỵkhí(đậybằngwaterlock)ởnhiệt độ được chọnở nội dung 3.2.4.1 trongthời gian được chọnở n ộ i d u n g

3 2 4 2 Kết thúc thời gian lên men tiến hành đánh giá các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và visinhvậtcủasảnphẩm.

Chỉ tiêu cảm quan: Đánh giá cảm quan rượu vang trái giác về độ trong vàmàusắc,mùi,vị,ýthíchđốivới mẫuthửtheotiêuchuẩnTCVN3217:79 (P hụlụcB).

Chỉ tiêu hóa lý: hàm lượng ethanol, SO2, acid hydrocyanic, aldehyt theoQCVN 6-3:2010/BYT (Phụ lục B), hàm lượng đường tổng số, hàm lượng đườngkhử,giátrịpH, độBrix,hàmlượngpolyphenoltổngsố,hoạttính kháng oxyhóa.

Chỉ tiêu vi sinh vật: vi sinh vật tổng số, nấm men, nấm mốc,E.

Xửlýsốliệu

Kết quả được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và phầnmềmthốngkêStatgraphicsCenturionXV.

Nộidung1: Đặc điểmcủa tráigiác ởĐBSCL

Đặcđiểmhìnhdạng,kíchthước

Kết quả quan sát về hình dạng bên ngoài của 53 mẫu trái giác thu được ở 13tỉnh, thành phố thuộc ĐBSCL cho thấy có hai dạng chủ yếu là trái tròn hoặc tráidẹp, ở một số vùng có trái tròn hơi dẹp Bề mặt trái bóng hoặc hơi nhám, kíchthước trung bình khoảng 1,5 – 2 cm, màu đen sậm Kết quả quan sát ghi nhận đặcđiểm của trái giác gắn với đặc điểm của lá Đối với trái giác có hình tròn thì bềmặtlákhôngcólông,bìa lácóíthoặckhôngcórăngcưa.Đốivớitráigiácc óhình dẹp thì bề mặt lá có lông nhám, bìa lá có nhiều răng cưa Đặc điểm của lá vàtráigiác đượcmôtảởBảng4.1. Bảng4.1.Đặcđiểmcủa2dạngtráigiácởvùngĐBSCL

1 Tráidạngtròn,bềmặttráihơinhám, có màu đen sậm, kích thướckhoảng1,5 – 2,0cm

2 Trái có dạng hình dẹp, có màu đensậm,k í c h t h ư ớ c k h o ả n g 1 ,

Bề mặt lá có lông, bìa lá có nhiềurăngcưa

Năm mươi ba mẫu trái giác thu được ở các địa điểm gồm có dạng trái trònhoặc trái dẹp Trái màu đen sậm, kích thước trung bình khoảng 1,5 cm Đối vớidạngtráitròncólátrơnkhôngcólông,bìalácóítrăngcưatậptrungởcáctỉnhCà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Bến Tre, Kiên Giang và Long An đây làcác tỉnh có vị trí địa lý giáp với biển, nguồn nước có khả năng bị nhiễm mặn Tuynhiên, trái giác ở các tỉnh Vĩnh Long, Tiền Giang và Hậu Giang có dạng trái trònnhưng hơi dẹp Mẫu trái giác dạng dẹp lá có lông tơ mịn, bìa lá chia nhiều răngcưa tập trung ở Cần Thơ với đặc điểm đất phù sa ngọt Bên cạnh đó, ở một số địađiểm thuộc tỉnh Kiên Giang và Hậu Giang tiếp giáp Cần Thơ mẫu trái giác thuđượccũngcódạngdẹp(PhụlụcC).Sựkhácbiệtvềhìnhdạng,đặcđiểmtráivàlá của cây giác có thể bị ảnh hưởng bởi vị trí địa lý, đặc điểm của đất, nước và cácđặcđiểmvềđiềukiệntự nhiênkhác.

Đặcđiểmcácchỉtiêuhóalýcủadịchtráigiác

Kết quả xác định giá trị pH, ºBrix, hàm lượng đường tổng và đường khử củadịchtráigiác đượctrìnhbàyởBảng4.2

Bảng4.2 pH,ºBrix, hàm lượngđườngtổngvà đườngkhửcủa dịch trái giác ºBrix Hàmlượng Hàmlượng

Tỉnh Mẫu pH đường tổng đường khử

Cà Mau ºBrix Hàmlượng Hàmlượng

Tỉnh Mẫu pH đường tổng đường khử

Ghi chú: Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại, các ký tự theo sau các giá trịtrongcùng mộtcộtkhác nhau thìkhác biệtcó ý nghĩavề mặtthốngkêởmức 5%(p < 0,05)

Trái giác có giá trị pH và ºBrix khác nhau tùy thuộc vào vị trí thu mẫu trái.Điều kiệntự nhiên,khí hậu củatừng địađiểm thu trái giáck h á c n h a u t h ì g i á t r ị pH và ºBrix khác nhau Giá trị pH trong khoảng từ 3,01- 4,75, ºBrix tương đốithấp từ 3,5-10,0 (Bảng 4.2) Mẫu trái giác thu ở thành phố Cần Thơ có pH vàºBrix tương đối cao so với các mẫu được khảo sát, mẫu CT4 đạt pH là 4,71 và cóºBrix cao nhất là 10,0. Trong công nghệ lên men yêu cầu các loại trái đạt độ chínchế biến, có hương vị đặc trưng Đường tổng số trong nước trái cao và là thànhphần quan trọng nhất trong nước trái Dưới ảnh hưởng của men rượu đườngchuyển hóa thành cồn etylic do đó cần có ºBrix phù hợp để đảm bảo hàm lượngethanol ºBrix phải từ 20-22º, đối với quả có ºBrix cao chỉ cần bổ sung một ítđường,cònºBrixthấpthìphảithêmnhiều đường(VũCôngHậu, 2004).

Theo Vũ Công Hậu (2004) cũng cho rằng acid hữu cơ cũng là thành phầnquantrọng của nước t r á i và ả n h hư ởn g đếnp H, t ức l à đ ộ chu a t ự nhiênc ó t á c động trực tiếp đến hoạt động của vi sinh vật Nếu không có một lượng acid tốithiểu thì rượu sẽ lạt vì thiếu chua; quan trọng hơn, nếu thiếu acid, pH cao thì tạpkhuẩn phát triển mạnh, gây khó khăn cho hoạt động của nấm men Nhưng nếulượng acid này quá cao cũng không tốt vìs ẽ k h ó l ê n m e n v à r ư ợ u g i á t r ị c ả m quan về vị kém Như vậy, nguyên liệu trái giác có giá trị pH phù hợp cho việc lênmenrượuvang,đồng thờicầnbổsungđường đểtănggiátrịºBrixđạtyêucầu.

Kết quả được xác định dựa trên phương trình đường chuẩn y = 0,0043x +0,3867 với R 2 = 0,9884 Mẫu trái giác qua phân tích có hàm lượng đường tổngthấpt r o n g k h o ả n g t ừ 0 , 4 1 - 2 , 1 7 g / 1 0 0 m L ( B ả n g 4 2 ) C á c m ẫ u t r á i g i á c đ ư ợ c phân tích có pH thấp hơn 7,0, có tính acid mạnh, hàm lượng đường tổng thấp; tráigiác có giá trị thấp nhất là mẫu HG4 có pH là 3,35, ºBrix là 4,0 và đạt hàm lượngđường tổng là 0,41±0,11 g/100 mL Tuy nhiên mẫu BT1 (2,1±0,5 g/100 mL) cópH và ºBrix lần lượt là 3,36 và 6,0 lại có hàm lượng đường tổng cao hơn HG4 vàđạt cao nhất trong các mẫu khảo sát, khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% (p 35 o CvàpH≥5,thìhàmlượngethanolgiảmvàkhácbiệtcóýnghĩ athốngkêsovới30 o Cv à 35 o Cvơiđộtincậy95%.Theokếtquảxửlý thống kê,P-Valuecủa 2 yếu tố nhiệt độ và pH nhỏ hơn 0,05 (P-Value 0,0039),điềunàychothấyyếutốnhiệtđộvàpHcósựtươngtácvớinhaunêncầnkếthợp2yếu tố này để có hàm lượng ethanol tối ưu Arthurvà Watson (1976) đã xác địnhnấm men chịu nhiệt có nhiệt độ phát triển trong khoảng 8-42 o C Nấm men chịunhiệt có các khoảng nhiệt độ tối thiểu (Tmin), tối ưu (Topt), tối đa (Tmax) tương ứnglà 20-26 o C, 26-35 o C và 37-45 o C và có thể phát triển ở nhiệt độ trên 45 o C Tuynhiên, những khoảng nhiệt độ trên không hoàn toàn thích hợp với nhiều loại nấmmen, ví dụCandida macedoniensis(Tmin5oC, Tmax45oC) vàSaccharomycopsisguttulata(Tmin34oC,

Tmax42oC) (McCracken và Gong, 1982) Theo đó, chủngS.cerevisiaecó khả năng lên men ở nhiệt độ trên 35 o C đã được phân lập, chủ yếu từcác vùng nhiệt đới (Banatet al.,

1992) Như vậy, cho thấy kết quả lên men với giátrị pH 4,5 ở mức nhiệt độ 35°C được lựa chọn đáp ứng mục đích tuyển chọn nấmmen chịu nhiệt và có sự phù hợp với các nghiên cứu đã công bố Nhiệt độ và pHnàyđược chọnchocácthínghiệmtiếptheo.

Ảnhhưởngcủamậtsốgiốngchủng,độBrixvàthờigianlênmenđếnq uátrìnhlên menrượu vangtráigiác

ChủngSaccharomyces cerevisiaeHG1.3 được lên men ở các điều kiện: 5, 7và 9 ngày lên men, mật số nấm men là 10 3 , 10 5 , 10 7 tb/mL và độ Brix là 20; 22;24,kếtquảđược thểhiệnởBảng4.20.

Bảng4.20.Ảnhhưởngcủa mậtsố giốngchủng, o Brixvà thờigianlênmen

STT Ngày- o Brix-Mậtsốnấmmen o Brixsaulênmen Hàmlượngethanol ở 20 o C(%v/v)

STT Ngày- o Brix-Mậtsốnấmmen o Brixsaulênmen Hàmlượngethanol ở 20 o C(%v/v)

Ghi chú: Các số liệu trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại; Các chữ số mũtrêncácsố liệugiống nhau, khác biệtkhông cóý nghĩa thốngkê 5%

Bảng 4.20cho thấy,c á c n g h i ệ m t h ứ c c ó s ự ả n h h ư ở n g c ủ a h à m l ư ợ n g đường đối với quá trình lên men Ở những nghiệm thức có độ Brix thấp hàmlượng ethanol sinh ra thấp như nghiệm thức 25, 26, 27 lần lượt là 8,86% (v/v),8,05% (v/v) và 8,05% (v/v) Hàm lượng đường càng cao thì hàm lượng ethanolcàng cao như nghiệm thức 2, 5 và 11 khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tincậy95%.

Trong lên men, hàm lượng ethanol có liên quan đến nồng độ đường trongmôi trường Hàm lượng đường thấp, nấm men bị thiếu nguồn dinh dưỡng dẫn đếngiảm số lượng sản phẩm nhưng nếu tăng hàm lượng đường quá cao nồng độethanol cũngbịgiảm(Tahiretal.,2010)vì hàmlượngđườngquácaosẽlàmtăng áp suất thẩm thấu, mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Dẫn đến nấmmenbịứcchếlàmảnh hưởngđếnkết quảlênmennhưnghiệmthức24,25và26.

Mật số nấm men và thời gian lên men cũng là những yếu tố ảnh hưởng đếnsự lên men Mật số nấm men thấp khi vào môi trường mới cần có thời gian thíchnghi, phát triển đến mật số thích hợp và khi thời gian lênm e n n g ắ n s ẽ l à m h ạ n chế khả năng lên men tối đa của nấm men như ngiệm thức 2 và2 0 l à 1 3 , 4 7 % (v/v) và 10,77% (v/v) Nếu mật số nấm men thấp nhưng kéo dài thời gian lên mensẽ làm ảnh hưởng đến tiến độ, tốn chi phí, thời gian cho việc lên men Ban đầu,nồng độ ethanol khá thấp, sau đó mật số nấm men tăng lên và nồng độ ethanol bắtđầutăng,hàmlượngđườnggiảm.Nhưngkhiquagiaiđoạntốiưucholênm ennếu kéo dài thời gian lên men khi hàm lượng còn lại quá thấp thì hàm lượngethanolkhôngtăngmàbắtđầugiảm(Tahiretal.,2010).

Nhận thấy rằng ở các nghiệm thức có ºBrix 20 cho hàm lượng ethanol cao(13,47% (v/v), phù hợp với hàm lượng ethanol trong rượu vang.N ồ n g đ ộ c h ấ t khôhòatanquácaosẽlàmtăngápsuấtvàlàmmấtcânbằngtrạngtháisin hlýcủa nấm men Kết quả là nồng độ ethanol cao sẽ ức chế không những các tạpkhuẩn mà cả nấm men Mặt khác, nồng độ chất khô hòa tan cao sẽ dẫn đến tổnthất hoặc phải kéo dài thời gian lên men Do vậy, chọn cố định 20 o Brixđáp ứngđượctiêuchíhàmlượngethanoltrongrượuvangcũngnhưtiếtkiệmchiphí vàrútngắnthờigianchuẩnbịcholênmen. Để xác định điều kiện lên men tối ưu từ các thông số như ngày lên men, độBrixvàmậtsốgiống,cácthôngsốnàyđượcphântíchbằngchươngtrìnhStatgraphics Centurion

XV với độ tin cậy 95% Phương trình hồi quy (1) đượcthiếtlậptừ sốliệuPhụlụcPLC3như sau:

Trongđó:H=hàmlượngethanol, X=ngày, Y=mậtsố,Z=ºBrix.

CốđịnhºBrix20(Z ).Phương trìnhhồiquy(2)nhận đượcnhưsau:

Hình 4.6: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự tương quan giữa nồng độ đườngvàthờigianlênmenđếnquátrìnhlênmen

Hình 4.7: Biểu đồ đường mức thể hiện sự tương quan giữa ngày và mật sốgiốngchủngđếnquátrìnhlênmendịchtráigiác

Nhưvậy,điềukiệntốiưuđểlênmendịchtráigiáccủachủngSaccharomyces cerevisiaeHG1.3 là 6 ngày lên men, mật số nấm men 10 5 tb/mL,20 o Brix, và pH ban đầu là 4,5 ở 35ºC với nồng độ ethanol đạt được theo lý thuyếtlàH,37%.Môhìnhcũngchothấyhàmlượngethanolsinhratăngtheothờ i gian lên men từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 6 Tuy nhiên, khi tiếp tục kéo dài thờigian lên men thì hàm lượng ethanol sinh ra không tăng nữa mà có xu hướng giảmdần như ở ngày thứ 9 Mặt khác, khi thời gian lên men quá dài có thể làm tăng độacid do sự chuyển hóa của ethanol dẫn đến ảnh hường chất lượng cảm quan củarượu nên thời gian lên men là một nhân tố cần khảo sát trong quá trình lên menrượuvangtráigiácbởichủngSaccharomycescerevisiaeHG1.3.

Kết quả kiểm chứng sự phù hợp của phương trình hồi quy được bố trí lênmen rượu vang trái giác ở quy mô 1 L vớic á c đ i ề u k i ệ n t ố i ư u s ử d ụ n g c h ủ n g nấm men chịu nhiệtS cerevisiaeHG1.3 ở 35 o C với điều kiện tối ưu nói trên thuđượch à m l ư ợ n g e t h a n o l 1 2 , 0 % v / v đ ư ợ c t h ể h i ệ n ở ( B ả n g 4 2 1 ) K ế t q u ả c h o thấy hàm lượng ethanol thực tế thu được có sự chênh lệch không đáng kể so vớiphương trình lý thuyết (12,37% v/v) Như vậy, kết quả xác nhận khi lên men 1 Lcho thấy sự phù hợp của phương trình tối ưu đã thu được và tương đương với cácnghiên cứu lên men rượu vang dưa hấu (Ngô Thị Phương

So sánh với quy trình sản xuất rượu vang truyền thống cần giữ pH của dịchquả từ 3-3,5 để nấm men phát triển tốt và ức chế sự phát triển của vi sinh vật cóhại Nhiệt độ lên men thích hợp khoảng từ 20-30ºC cấy từ 3-10% dịch men giống,thờigianlênm e n hìnhthànhrượutừ4-

3 0 n g à y (TrầnT h ị T h a n h , 2 0 0 9 ) Q u y trìnhs l ê n m e n r ư ợ u va n g t r á i giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệtS cerevisiaeHG1.3 thực hiện ở điềukiện nhiệt độ 35 o C Điều này cho thấy khả năng lên men ổn định của giốngS.cerevisiaeHG1.3 trong điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ lên men bình thường.Đồng thời, tỷ lệ dịch men giốngS cerevisiaeHG1.3 sử dụng là 1% cũng thể hiệnkhả năng lên men hiệu quả của giống được tuyển chọn ở điều kiện nhiệt độ cao,đápứng mụctiêucủađềtàivềviệctuyểnchọngiốngnấm menchịu nhiệt.

Từ các kết quả của thí nghiệm tìm điều kiện thích hợp cho lên men rượuvang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệtSaccharomyces cerevisiaeHG1.3 là 6 ngày lên men, mật số nấm men 10 5 tb/mL, 20 o Brix và pH ban đầu là4,5 ở 35ºC Cácthông số này được áp dụng cho việc tiếp tục thử nghiệm lên menởthểtíchlớnhơnvàkiểmkiểmcácchỉtiêu vềchấtlượngrượuthànhphẩm.

Từ kết quả của thí nghiệm 4.4.1 và 4.4.2, xác định được điều kiện thích hợpchoviệclênmenrượuvangtráigiácsửdụngchủngnấmmenchịunhiệtSaccharomyc es cerevisiaeHG1.3 là nhiệt độ lên men thích hợp 35ºC; giá trị pH4,5; 20 ºBrix; mật số nấm men 10 5 tb/mL; thời gian lên men là 6 ngày Thực hiệnlên men ở thể tích 1 L/mẻ, tiến hành kiểm nghiệm, đánh giá các chỉ tiêuhàmlượng polyphenol, khả năng kháng oxy hóa, 9 chỉ tiêu hóa học, 4 chỉ tiêu vi sinhvậtvà các chỉtiêucảm quan của sảnphẩmchokếtquảnhư sau:

Phân tích chỉ tiêu hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng kháng oxy hóacủarượuvangtráigiácđượctrìnhbàytrongBảng4.21.

Bảng 4.21 Hàm lượng polyphenol và khả năng oxy hóa trước và sau khi lênmenrượuvangtráigiác

Khả năng bắt gốc tự do DPPH(%)

Hàm lượng polyphenol trước khi lên men của dịch trái giác là 0,66 mgGAE/ mL, sản phẩm rượu trái giác sau khilên men là0 , 6 0 m g G A E / m L

S ả n phẩm rượu vang trái giác khả năng bắt gốc tự do DPPH là 57,3% thay đổi khôngđáng kể so với nguyên liệu ban đầu là 54,7% Như vậy, kết quả của quá trình lênmen rượu vang trái giác sử dụng nấm men chịu nhiệtSaccharomyces cerevisiaeHG1.3 cho thấy hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của dịch tráigiác trước và sau lên men không bị ảnh hưởng bởi quá trình lên men, chủng nấmmen sử dụng và trái giác là một trong những nguồn nguyên liệu thích hợp và cógiátrịchosảnxuấtrượuvang.

TheonghiêncứucủaMarkoLjekočević(2018)chothấyhàmlượngpolyphenol của ba loại rượu mận Crvena ranka, Požegača và Trnovača lần lượt là0,124;0,145; 0,158 mg GAE/mL thấp hơn nhiều so với rượu vang giác (0,60 mgGAE/ mL) Cũng theo nghiên cứu này khả năng kháng oxy hóa của ba loại rượumậnCrvenaranka, Požegača và Trnovačalần lượt là 0,94; 1,33; 1,40m g / L Trong nghiên cứu về hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của nhovàrượunhochokếtquả hàmlượngpolyphenol củarượunhođượclên m entừ nguyênl i ệ u n h o t h u h á i t ừ v ù n g k h á c n h a u l ầ n l ư ợ t l à C a b e r n e t

S a u v i g n o n (121,617 mg GAE/mL), Kalecik Karası (133,621 mg GAE/mL), Narince (21,706mg GAE/mL)caohơnrấtnhiềuso vớirượu vanggiáckhảosátđược.

Kết quả kiểm nghiệm các hàm lượng ethanol của rượu vang đạt ở mức12,0% v/v, hàm lượng methanol là 2,534 g/L, hàm lượng SO2là 1,4 mg/L vàkhông phát hiện hàm lượng acid hydrocyanic, các chỉ tiêu phân tích đều đạt theoquychuẩnViệtNam(QCVN)6-3:2010/BYT.SảnphẩmkhôngpháthiệnColifrom svàE.colitrong sảnphẩm rượuvang trái giác cho thấy sản phẩm antoàn về mặt vi sinh Kết quả kiểm nghiện các chỉ tiêu hóa học, vi sinh vật của sảnphẩmrượuvangđượcthểhiệnởBảng4.22.

STT Chỉtiêu Kếtquả QCVN6-3:2010/BYT Nhậnxét

8 Rượub ậ c c a o , t í n h t h e o methyl 2-propanol 2,425g/L rượu100° Tựcôngbố

10 E.coli 0CFU/mL sản phẩm 0 CFU/mL sản phẩm Đạt

11 Coliforms 10CFU/mL sản phẩm ≤ 10 CFU/ mL sản phẩm Đạt

12 Tổngsốvi s i n h vậ t h i ế u khí 7,2x 10 2 CFU/g 10 3 CFU/g Đạt

13 Tổngsố nấmmen–mốc 3,6x 10 1 CFU/g 10 2 CFU/g Đạt

B Y T v ề đánh giá chất lượng rượu vang, các chỉ tiêu đạt các quy định Đồng thời, kết quảkiểm chứng sự tương thích của phương trình hồi quy được bố trí lên men rượuvang tráigiácởquymô 1

L với cácđiều kiện tối ưu sửdụng chủngnấmmen chịu nhiệtS.cerevisiaeHG1.3ở35 o C,độBrix20,mậtsốnấmmen10 5 tb/mLvàpHlà 4,5 sau6 ngày lênmen thu được hàm lượng ethanol12,0%v / v K ế t q u ả n à y cho thấy hàm lượng ethanol thực tế thu được không có sự chênh lệch đáng kể sovớiphươngtrìnhlýthuyết(12,37%v/v).Nhưvậy,kếtquảxácnhậnkhilênmen1L chothấysự phùhợpcủaphươngtrìnhtốiưuđãthuđượcở4.4.2.

Kếtluận

TráigiácởvùngĐBSCLcóhaidạnglàtráitrònvàtráidẹt,tráichínmàutím đen, đường kín trung bình của trái là 1,5 cm Dịch trái giác có màu tím rất đặctrưng, giá trị pH 3,01-4,75, giá trị độ Brix 3,5-10,0, hàm lượng đường tổng số0,47-2,17 g/100mL,hàm lượng đường khử0 , 2 2 - 0 , 9 6 g / 1 0 0 m L Đ ặ c b i ệ t , d ị c h trái giác chứa hàm lượng polyphenol 0,47- 1,54 mg GAE/mL và khả năng khángoxy hóa là1 6 , 6 0 - 8 2 , 8 6 % Đ â y l à n g u ồ n n g u y ê n l i ệ u t i ề m n ă n g c h o n g à n h s ả n xuấtrượuvangvàgiúp tăngthunhậpchongườidânởvùngnguyênliệu.

Phân lập đượcbộ chủng nấm men gồm 151chủng từ5 3 n g u ồ n t r á i g i á c khác nhau trong tự nhiên ở vùng ĐBSCL Kết quả phân loại sơ bộ các chủng nấmmen từ đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóacho thấy 151 chủng nấm men thuộcgiống nấm men làSaccharomyces, Hanseniaspora, PichiavàCadidatồn tạitrêntrái giác vùng ĐBSCL trong tự nhiên Trong đó giốngSaccharomycesphân bốrộngrãi,phânlậpđượcvớisốlượnglớntrênnhiều mẫutráigiác.

Xác định được 64/151 chủng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 37ºC trongmôi trường cónồng độ ethanol từ 9 đến 12% v/v Tuyển chọn được 30/64 chủngnấm men chịu nhiệt từ 37 đến 45ºC, có khả năng phát triển ở nồng độ ethanoltrong môi trường từ 9 - 12% và có khả năng lên men sinh ra ethanol đạt từ

0 chủng nấm men đã cho thấy các chủng thuộc giốngSaccharomyces,Candida,PichiavàClavispora.TrongđóSaccharomycescerevis iaeHG1.3,C M 3 2 , AG2.1, TV4.2, DT3.2, LA1.3, KG2.1, TG3.1 và HG2.1 là những chủng có quanhệgầnvới nhauvì cómứcđộtincậycaovớichỉsốbootstrap100%. Điều kiện thích hợp lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm menchịu nhiệtSaccharomyces cerevisiaeHG1.3 là 20 o Brix , pH là 4,5, mật số nấmmen 10 5 tb/mL trong thời gian 6 ngày lên men ở 35ºC Sản phẩm rượu vang tráigiác tạo thành có tính đặc trưng về màu sắc, chứa hàm lượng ethanol 12,0 % (v/v)và đạt các yêu cầu chất lượng cảm quan, hóa lý, vi sinh vật theo quy định Đặcbiệt, sản phẩm rượu vang trái giác chứa hàm lượng polyphenol 0,6 mg

Rửasạch,đểráo Ép Điềuchỉnh20ºBrixvàpH=4,5

Rửa sạch, để ráo Ép Điều chỉnh 20º Brix và pH = 4,5

Thanh trùng bằng NaHSO 3 (140 mg/L) trong 2 giờ

Bổ sung 1% giống nấm men S cerevisiae HG1.3

Trái giác chín QuytrìnhlênmenrượuvangtráigiácđượcđềnghịởHình4.9nhưsau: Ủkỵkhíở 35ºC trong6ngày

Đềxuất

Nghiên cứu tác dụngk h á c c ủ a m ộ t s ố t h à n h p h ầ n k h á c t r o n g t r á i g i á c ở vùng ĐBSCL và theo dõi sự ổn định của các thành phần này khi lên men bằngnấmmenchịunhiệt.

Nghiên cứu về đặc điểm, cơ chế biểu hiện đặc tính chịu nhiệt của bộ gen củacácchủngnấmmenchịunhiệt,từđócóhướngnghiêncứukiểmsoátđược c ácđặcđiểmcólợimộtcáchổnđịnhvàtheoý muốn.

Khảo sát, đánh giá đặc tính của các chủng nấm men được phân lập, tuyểnchọntheothờigianvàđiềukiệntồntrữ.

Khảo sát thêm thời gian tồn trữ rượu vang trái giác và định hướng cho cácnghiêncứu tiếptheo nhằm hoànthiệnsảnphẩm.

Thử nghiệm diện rộng và nghiên cứu quy mô sản xuất rượu vang trái giác ởmứcđộcông nghiệp.

1 Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Hoàng Anh, Nguyễn Ngọc Thạnh,Huỳnh Xuân Phong, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung,

2017.Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt lên men rượu vang trái giác (CayratiatrifoliaL.) của tỉnh Kiên Giang” Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nôngthôn.328:54-62.

2 Đoàn Thị Kiều Tiên, Viên Thị Hải Yến, Huỳnh Xuân Phong, BùiHoàng Đăng Long, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung,

2018.Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và ứng dụng lên men rượu vang trái giác(Cayratia trifoliaL.) từ tỉnh Hậu Giang Tạp chí Khoa học Trường Đại họcCầnThơ.54(4B):64-71.

3 Đoàn Thị Kiều Tiên, Lữ Hằng Nghi, Nguyễn Ngọc Thạnh, HuỳnhXuân Phong, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung, 2018.

Phân lậpvà tuyển chọn nấm men chịu nhiệt ứng dụng trong lên men rượu vang tráigiác (Cayratia trifoliaL.), Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp 55-64.

4 ĐoànThịKiềuTiên,HuỳnhThịNgọcMi,NguyễnĐứcĐộ,H à ThanhToàn vàNgôThịPhươngDung,2018.Khảosáthàmlượngpolyphenol và khả năng kháng oxy hóa của dịch trái giác (Cayratia trifolia)trước và sau lên men sử dụng nấm men chịu nhiệtSaccharomyces cerevisiaeHG1.3,2018 Tạp chíKhoahọcvàCông nghệViệtNam.60-64

5 Doan Thi Kieu Tien, Huynh Xuan Phong, Mamoru Yamada, HaThanh Toan and Ngo Thi Phuong Dung, 2019 Characterization of newlyisolated thermotolerant yeast and evaluation of their potential for use inCayratia trifoliawine production, Vietnam Journal of Science,TechnologyandEngineering.68-73

6 Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Lữ Hằng Nghi, HuỳnhXuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Bùi Hoàng Đăng Long, Hà ThanhToàn và Ngô Thị Phương Dung, 2019 Đánh giá khả năng duy trì hàmlượngpolyphenolvàhoạttínhkhángoxyhóakhilênmenrượuvangtừtrái giácở t ỉ n h C à M a u s ử d ụ n gS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e C M 3

1 Doan Thi Kieu Tien,Ha Thanh ToanandNgo Thi Phuong Dung,2016.

Exploration of yeasts applied for wine fermentation fromCayratiatrifoliain the Mekong Delta The 12 th Young Scientist Seminar; Nov 22 nd -

2 Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Huỳnh Thị Hoàng Anh,Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Bùi Hoàng Đăng Long, HàThanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung, 2018 Hoạt tính sinh học của tráigiácthuởtỉnhKiênGiangvàlênmenrượuvangtráigiácsửdụngSaccharomyce s cerevisiaeAG2.1 Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệViệt Nam, Báo cáo Khoa học proceeding Hội nghị Công nghệ Sinh học toànquốc2018.NhàxuấtbảnKhoahọctự nhiênvàCôngnghệ.978-983

3 Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Lữ Hằng Nghi, HuỳnhXuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị PhươngDung Hoạt tính sinh học của trái giác từ tỉnh Cà Mau và lên men rượu vangtrái giác sử dụngSaccharomyces cerevisiaeCM3.2, 2018 Kỷ yếu Hội thảoCông nghệ Sinh học vùng Đồng bằng sông Cửu Long 2018 “Thành tựu vàpháttriển”.104.

Abdallah,I.I.andW.J.Quax,2017.AGlimpseintotheBiosynthesisofTerpenoids. International Conference on Natural Resources and Life Sciences(2016),pp81 – 98.

Fattah,W.R.,M.Fadil,P.NigamandI.M.Banat,2000.Isolationofthermotolerant ethanologenic yeasts and use of selected strains in industrialscalefermentationinanEgyptiandistillery.Biotechnol.Bioeng.,68(5),p p.531-535.

Adom,K.K.andR.H.Liu,2002.Antioxidantactivityofgrains.JournalofAgriculture andFoodChemisty50:6182-6187.

Arthur,H.andK.Watson,1976.Thermaladaptationinyeast:growthtemperatures, membrane lipid, and cytochrome compositionof psychrophilic,mesophilicandthermophilicyeast.Journalof

Anderson, P J., K McNeil and K Watson, 1986 High-efficiency carbohydratefermentationtoethanolattemperaturesabove40degreesCb y Kluyv eromyces marxianusvar.marxianusisolated from sugar mills.Appl.Environ.Microbiol,51:1314-1320.

Afzal,M.andD.Armstrong,2002.“Fractionationofherbalmedicineforidentifying antioxidant activity Methods in Molecular Biology, OxidativeStress Biomarkers and Antioxidant Protocols”, Humana Press Inc., 186: 293-299.

Bakker,B.M.,C.A.Reijenga,C.C.VanderWeijden,E.Esgalhado,H.V.Westerhoff, J. Passage, J Snoep, K Van dam, M.C Walsh, M SchepperandB.Teusink, 2000 Can yeast glycolysis be understood in terms of in vitrokinetics of the constituent enzymes? Testing biochemistry.Eur J biochem.,267(17):5313-5329.

Banat,I.M.,P.NigamandR.Merchant,1992.Isolationofthermotolerant,fermentative yeasts growing at 52 o C and producing ethanol at 45 o C and

Barron,N.,R.Marchant,L.McHaleandA.P.McHale,1994.Growthofathermotolerant ethanol-producingstrainKluyveromycesmarxianusoncellobiose-containing media.BiotechnologyLetter,16:625-630.

Basso,C.L.,A.D.V.Herique,O.D.J.AntinoandL.L.Mario,2008Y e a s t selection for fuel ethanol production in Brazil National library of medicine,8(7):1155-

Barry, H., 2001 Free Radicals andother reactive species in Disease.

C Kurtzman (Editors) The Yeast a Toxonomy Study Elsevier New York.

Brady,D.,R.Marchant,L.McHaleandA.P.McHale,1994.Productiono f ethanol by the thermotolerant yeast,Kluyveromyces marxianusIMB3 duringgrowthonlactose-containing media.BiotechnologyLetter,16:737-740.

Brooks, M F., 2008 Ethanol production potential of local yeast strains isolatedfromripebananapeels.AfricanJournalofBiotechnology,7(20):3749-

Buddiwong, S., S Thanonkeo, J Phetsom, P Jaisil and P Thanonkeo,

Bùi Ái, 2005 Công nghệ lên men ứng dụng trong Công nghệ Thực phẩm.NXBĐạihọc QuốcgiaTP.HồChíMinh 234trang

Bruce, W.Z, K.C Fugelsang, B.H Gump and F.S Nury, 1999 Wine analysis andproduction.

Brune, M., M Hallberg and A.B Skanberg, 1991 Determination of iron- bindingphenolicgroupsinfoods.JournalofFoodScience56:128-131.

Burin,V.M.,L.D.Falcão,L.V.Gonzaga,R.Fett,J.P.RosierandM.T.BordignonLuiz,

2010 Colour, phenolic content and antioxidant activity ofgrapejuice.CiênciaeTecnologiadeAlimentos,30(4):1027-1032.

Casey, G.P and W M Ingledew, 1986 Ethanol tolerance in yeast.Crit

Casellas, I G., 2005 Effect of low temperature fermentation and nitrogen contentonwineyeastmetabolism.Tarragona.

Raventos,2 0 0 0 I s o f l a v o n e s , lignansandstilbenes– origins,metabolismandpotentialimportancet o human health.Journal of the

Science of Food and Agriculture80(7):1044-1062,ISSN0022-5142.

Chan, E.W.C., Y.Y Lim, S.K Wong, K.K Lim, S.P Tan, F.S Lianto and M.Y.Yong, 2009 Effects of different drying methods on the antioxidant propertiesofleavesandteaofgingerspecies.FoodChemistry113:166-172.

Chandrasekara, A and F Shahidi, 2010 Content of insoluble bound phenolics inmillets and their contribution to antioxidant capacity.Journal of

Chella , P., P Pratibha, S Sowmya, K Enock, P Anusooriya, B Vidya, D.Malarvizhi,K.Poornima,S.RamkumarandV.K.Gopalakrishnan,2015.Discovery of Novel Inhibitors for HER2 from Natural Compounds Present inCayratia trifolia(1): An In silico

Cavalieri, D., P.E McGovern, D.L Hartl, R Mortimer and M Posinelli, 2003.Evidence forS cerevisiaefermentation in ancient wine.Journal

Chamnipa,N.,S.ThanonkeoandP.Thanonkeo,2013.I s o l a t i o n a n d identificati on of thermotolerant yeast for ethanol.Technology of Value

Choudhary, K., and M Singh, 2008 Ethnobotanical Survey ofRajasthan- AnUpdate.AmEurasJournalBot,1:38-45.

Coyle, C H., B J Philips, S N Morrisroe, M B Chancellor and N.Yoshimura,2008 Antioxidant effects of green tea and its polyphenol on bladder cells.LifeSciences83(1):12-18.

D’Amore Tony T., C.J Panchal, I Russell, G.G Stewart, 1990 “A study oftoleranceinyeast”,Crit.Rev.Biotechnol.,9(4),pp.287-304.

Di Cesare, L.F., E Forni, D Viscardi and R.C Nani, 2003 Changes in thechemical composition of basil caused by different drying procedures.JournalofAgricultural&FoodChemistry51:3575-3581.

Dinesh, K., K Sunil, G Jyoti, A Renu and G Ankit, 2011 A review on chemicaland biological propertie ofCayratia trifoliaLinn.

Dong, Z., Y.J Surh, L Packer and E Cadenas, 2009 Dietary Modulation of CellSignaling Pathways CRC Press, Taylor & Francis Group: Boca Raton, FL,USA.

Dung, N T P., Thanonkeo, P., and Phong, H X., 2012 Screening useful isolatedyeasts for ethanol fermentation at high temperature International Journal ofAppliedScienceandTechnology.2(4):65-71.

Fell,J.W.,1984.Teliospore-forming yeasts.In:N.J.W.KregervanRij(Editors). TheYeasts, ATaxonomic Study Elsevier,Amsterdam, 491-495pp.

Fleming,M.,N.Barron,R.Marchant,L.McHaleandA.P.McHale,1 9 9 3 Studies on the growth of a thermotolerant yeast,Kluyveromyces marxianusIMB3 during growth on lactose containing media.Biotechnology Letter, 16:1195-1198pp.

Fonseca, G.G., E Heinzle, C Wittmann, and A.K Gombert 2008 The yeastKluyveromycesmarxianusanditsbiotechnologicalpotential.AppliedMicr obiologyandBiotechnology,79:339-354.

Fonseca, Á and J Inácio, 2006 Phylloplane yeasts.In:G Péter and C.A. Rosa(Editors) Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts Springer, Berlin,

Gupta, A K and M Shamar, 2007 Review on Indian medical plant.NewDelhi:IndianCouncilofMedical Research,7:879-882.

Guo, J.J., H.Y Hsieh and C.H Hu, 2009 Chain-breaking activity of carotenes inlipid peroxidation: A theoretical study.The Journal of Physical Chemistry

Hacking, A.J., W.F Taylor and C.M Hana, 1984 Selection of yeast able toproduceethanolfromglucose40°C.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,1 9:361-363pp.

Henry,T.,C.P.IwenandS.H.Hinrichs,2000.IdentificationofAspergilusSpecies Using

Internal Transcripbed Spacer Regione 1 and 2.Journal ofClinicalMicrobiology,1510-1515.

Homhual S., T Pajaree, S Sutharut and B Juntra, 2007 Evaluation of BiologicalActivities of CrudeExtractsfromCratoxylumformosum(Jack.) Dyer.

DianaandN.P.B r u n t o n , 2 0 1 0 Effectofdryingmethodontheantioxidan tcapacity ofsix Lamiaceaeherbs.FoodChemistry1:85-91.

Hughes,D.B,N.J.TudroszenandC.J.Moye,1984.Theeffectoftemperature onthekineticsofethanolproductionbyathermotorlerantstrainofKluyveromycesm arxianus.BiotechnologyLetter,6:1-6.

Hsu, C.L., W.L Chen, Y.M Weng and C.Y Tseng, 2003 Chemical composition,physical properties, and antioxidant activities of yam flours as affected bydifferentdryingmethods.FoodChemistry1:85-92.

Jacobson, G.K and S.O Jolly, 1989.Yeasts, molds and algae.Biotechnology,7:279-314.

Keskin, S., I Tahirovic, A Topcagic, L Klepo and M Salihovic, 2012. Totalphenoliccontentandantioxidantcapacity offruitjuices.BulletinoftheChemistandTechnologistofBosnisaandHerzegovina39

Kim, K.H., R Tsao, R Yang and S.W Cui, 2006 Acid phenolic profiles andantioxidant activities of wheat bran extracts and the effect of hydrolysisconditions.FoodChemistry95:466-473.

Kreger-van Rij, N.J.W., 1984 The Yeast, A Taxonomic Study, 3 th ed.,Elsevier,Amsterdam.

Korabecna,M.,2007.TheVariability intheFungalRibosomalDNA( I T S 1 , ITS2,and5.8SrRNAGene:ItsBilogicalM eaningandApplicationinMedicalMycology.CommunicatingCurrentResearcha ndEducationalTopicsandTrendsinAppliedMicrobilogy,1:783-787.

Kurtzman, C.P and J.W Fell, 1997 The Yeasts, a Taxonomic Study.ElsevierSciencePublishingCompany.

Kurtzman,C.P.andC.J Robnett,1997.Identification ofclinically importantascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5' end of thelarge-subunit (26S) ribosomal DNA gene.Journal of cinical microbiology,35(5):1216-1223

Kurtzman, C.P., J Piskur, 2006 Taxonomy and phylogenetic diversity among theyeasts.TopicsinCurrentGenetics,15:29-36.

Kurtzman,C.P.,J.W.FellandT.Boekhout,2011.Theyeast:AtaxonomicSudy. Elsevier'Science and TechnologyRights Deparment,1:2077.

Leahu, A., C.E HreNcanu and S Ropciuc, 2013 Radical scavenging activity andtotal phenolic content – comparison between apple and red grape.Annals ofthe University of Oradea, Ecotoxicology Fossil, Animal Husbandry and FoodIndustryTechnologies,pp239-249.

Lee, J.H., D Williamson and P.L Rogers, 1980 The effect of temperature on thekineticsofethanolproductionbySaccharomycesuvarum.BiotechnologuLetter, 2:83-88.

Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh,Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn và Lê Doãn Diên, 2002 Hóa sinh công nghiệp NXBKhoahọcvàkỹthuật.HàNội.389trang.

Legras, J.L., D Medinoglu, J M Cornuet and F Karst, 2007 Bread beer andwine:Saccharomycesdiversity reflects human history.Molecular

Lê Văn Nhượng và Nguyễn Văn Cách (Chủ Biên), 2009 Cơ sở công nghệ sinhhọctập4-Côngnghệvisinh.Nhàxuất bảnGiáodụcViệtNam.

Ljekocevic, M., 2018 Phenolic composition and anti-DPPH radical activity ofplumwineproducedfromthreeplumcultivars.Journaloftheserbianchemicalso ciety,84(00):96-96

Lương Đức Phẩm, 2009 Nấm men công nghiệp Nhà xuất bản Khoa học và

Lương Đức Phẩm, 2006 Nấm men công nghiệp NXB Khoa học và Kỹ thuật.

Lương Đức Phẩm, 2005 Nấm men công nghiệp Nhà xuất bản Khoa học và

Marinova, D., F.Ribarova and M Atanassova, 2005 Total phenolics and totalflavonoid in Bulgarian fruits and vegetables.Journal of the University ofChemicalTechnologyandMetallurgy,40:255-260.

McCallum,J.L.,R.Yang,J.C.Young,J.N.StrommerandR.Tsao,2007.Improvedhigh performanceliquidchromatographicseparationo f anthocyanincompoundsfro mgrapesusinganovelmixed-modeion-exchangereversed-phasecolumn.

McCracken,L.D.andC.S.Gong,1982.Fermentationofcelluloseandhemicellulosecar bohydratesbythermotolerantyeasts.BiotechnologyBioengineering,12.

McGovern, P.E., U Hartung, V.R Badler, D.L Glusker and L.J Exner,

1997.The beginnings of wine making and viniculture in the ancient Near

Melo, E.A., 2006 Polyphenol, Ascorbic Acid and Total Carotenoid Contents inCommon Fruits and Vegetables Brazilian Journal of Food Technology,9(2):89-94.

Mishra,K.,H.OjhaandN.K.Chaudhury,2012.Estimationofantiradicalproperties of antioxidants using DPPH assay: A critical review and results.FoodChemistry,130:1036-1043.

Murata, Y., H Danjarean, K Fujimoto, A Kosugi, T Arai , W.A Ibrahim, O.Suliman,R.HashimandY.Mori,2015.Ethanolfermentationbythethermotoler ant yeast,Kluyveromyces marxianusTISTR5925, of extracted sapfromoldoilpalmtrunk.AIMSEnergy.3(2):201-213.

Navarro, J.M and J.D Finck, 1982.Saccharomyces uvanrumhexokinase behaviorduringalcoholicfermentation,Cell.Mol.Biol.,18-85.

Navarro, J.M and G Durand, 1978 Alcohol fermentation: effect of temperatureon ethanol accumulation within yeast cells Annals of Microbiology 129B:215-224.

NevoigtE.,2008.ProgressinmetabolicengineeringofS a c c h a r o m y c e s cerevis iae.Microbiol MolecularBiology Revolution,72:379–412.

Ngô Thị Phương Dung, 2009 Khảo sát khả năng lên men và tính chịu cồn củanấmmen.TạpchíKhoahọcTrườngĐHCT 2009:11374-382.

Ngô Thị Phương Dung, Lý Huỳnh Liên Hương và Huỳnh Xuân Phong, 2011.Phân lập, tuyển chọn nấm men và xác định điều kiện ảnh hưởng quy trình lênmenrượuvangdưahấu.TạpchíKhoahọcTrườngĐạihọcCầnThơ18b:137- 145.

Nguyễn Phúc Trường, 2011 Phân lập và tuyển chọn nấm men lên men tự nhiêndùng sản xuất rượu vang cam Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học. TrườngĐạihọc CầnThơ.

Nguyễn Anh Diệp, Trần Ninh và Nguyễn Xuân Quýnh, 2007 Nguyên tắc phânloạisinhvật NXBKhoahọc và Kỹthuật HàNội.

NguyễnĐ ì n h T h ư ở n g v à N g u y ễ n T h a n h H ằ n g , 2 0 0 5 C ô n g n g h ệ s ả n x u ấ t v à kiểmtracồn etylic.NXBKhoahọc và Kỹthuật.HàNội.281trang.

Nguyễn Đức Lượng, 2002 Công nghệ vi sinh vật, các sản phẩm lên men truyềnthống,tập3.TrườngĐạihọcKỹthuậtThànhphốHồChíMinh.

Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, PhạmThành Hổ, Lê Văn Hiệp, Chung Chí Thành và Lê Thị Hòa, 2019 Vi sinh vậthọc.NXBKhoahọcvàKỹthuật.

Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Văn Thành và Bùi Thị Thúy Ngân, 2011Tuyển chọncác dòng nấm men được phân lập từ nước thốt nốt Tạp chí Khoa học TrườngĐHCT2011:18b117- 126.

Nguyễn Minh Thủy, 2010 Ổn định và nâng cao chất lượng rượu vang sim bằngphương pháp hóa học và sinh học.Tạp chí Khoa họcTrường ĐHCT 2010: 14195-204.

Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy Thảo, 1986 Thực hành vi sinh vật học. NXB.Giáodục.

Nguyễn Văn Thành,Nguyễn Minh Thủy,Trần Thị Quế vàNguyễn Thị MỹTuyền,

2013 Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men rượuvangKhóm.TạpchíkhoahọcTrườngĐạihọcCầnThơ; 25:27-35.

NuanpengS.,S.Thanonkeo,M.Yamada,andP.Thanonkeo,2016.Ethanolproduction from sweet sorghum juice at high temperatures using a newlyisolatedthermotolerantyeastSaccharomycescerevisiaeDBKKUY-

Nielsen,S.S.,2010.Food AnalysisLaboratoryManual Second Edition.Springer. NewYork 171pp.

Nick,A.Zürich:SwissFederalInstituteofTechnology,1995.BiologicalScreeningofT raditionalMedicinalPlantfromPapuaNewGuineaandsubsequentphytochemic alinvestigationofDilleniaPapuana,DoctoralTheses(Diss.ETHNo.11231)pp.2 –5.

Ohta,K.,S.C.WijeyaratneandS.Hayashida,1988.Temperature- sensitivemutantsofathermotolerantyeast,Hansenulapolymorpha.JournalFer mentationTechnology,66:455–459.

Osho,A.,2005.Ethanolandsugartoleranceofwineyeastsisolatedfromfermenting cashew apple juice African fournal of biotechnology, 4(7): 660-662.

Pecota,D.C.,V.RajgarhiaandN.A.DaSilva,2007.Sequentialg e n e intergration for the engineering ofKluyveromyces marxianus J Biotechnol,127:408-416.

Phạm Hoàng Hộ, 2000 Cây cỏ Việt Nam quyển II Nhà xuất bản trẻ 952 trang.PhạmVănTy,2007.CôngnghệSinhhọc.NhàxuấtbảnGiáoDục.

Mathematicalmodeling to investigate temperature effect on kinetic parameters of ethanolfermentation,J.Biochem.Eng.,28,pp.36-43.

Phong, H X., N.T.C Giang, S Nitiyon, M Yamada, P Thanonkeo and

N.T.P.Dung,2016.Ethanolproductionfrommolassesathightemperaturebyther motolerant yeasts isolated from cocoa.Can Tho University Journal ofScience3: 32-37.

Price,M.L.andL.G.Butler,1977.Rapidvisualestimationandspectrophotometricdete rminationoftannincontentofsorghumgrain.JournalofAgricultural and

Price, M.L., S.V Scoyoc and L.G Butler, 1978 A critical evaluation of thevanillin reaction as an assay for tannin in sorghum.Journal of

Prewitt,M.,Lynn,S.V.Diehl,C.M.ThomasandandJ.D.Walter,2008.Comparison of general fungal and basidiomecete-specific ITS primers oridentificationofwooddecayfungi.ForestProductsJournal,58:66-71.

Quy chuẩn Việt Nam 6-3:2-10/BYT, 2010 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối vớicácsảnphẩmđồuốngcócồn.HàNội.

Rabeta, M.S and S.P Lin, 2015 Effects of different drying methods on theantioxydantactivitiesofleavesandberriesofCayratiatrifolia.SainsMalaysia na,44(2):275-280.

Ragasa,C.Y.,A.I.Buluran,E.H.MandiaandC.C.Shen,2014.Chemicalconstituentsof

Rice-Evans,C.A.,N.J.MillerandG.Paganga,1996.S t r u c t u r e - a n t i o x i d a n t activity relationships of flavonoid and phenolic acids.Free Radicial BiologyMedicine20:933-956.

Roehr,M.,2001.TheBiotechnologyofEthanol:ClassicalandFutureApplications.Fed eral Republicof Germany.Page:203–210.

Ueno, R., N Urano and S Kimura, 2002 “Effect of temperature and cell densityon fermentation by a thermotolerant aquatic yeast strain isolated from a hotspringenvironment”,Fish.Sci.,68(3),pp.571-578.

Sesagirriravu,R.,1986.FloraofSrikakulamdistrict,AndhraP a r d e s h TheJournal ofIndianBotanical Society,147.

Shela, G., M B Olga, K Elena, L Antonin, G.M Nuria, H Ratiporn, P Yong- Seo, J Soon-Teck and T Simon, 2003 Comparison of the contents of themainbiochemicalcompoundsandantioxidantactivityofsomeS p a n i s h oli veoilsasdeterminedby fourdifferentradicalscavengingtests.TheJournalofNutritionalBiochemistry,1 4(3):154-159.

Shikha,B.B.,2013.Preliminaryphytochemicalstudiesandevaluationofantidiabetica ctivity ofrootsofCayratiatrifolia(L.)Domininalloxaninduced diabetic albino rats.Journal of Applied Pharmaceutical Science,3:97-100.

Shivraj, H.N,S H Kim,E.Y KoandS.W Park, 2013 Polyphenolic ContentsandAntioxidantPropertiesofDifferentGrape( V v i n i f e r a ,

V l a b r u s c a , andV.hybrid)Cultivars.BioMedResearchInternational,5pag es.

Singleton,V.L.andJ.A.Rossi,1956.Colorimetryoftotalphenolicswithphosphomoly bdic- phosphotungsticacidreagent.AmericanJournalofEnologyandViticulture,16:1 44-158.

Soejima, A and J Wen, 2015 Phylogenetic analysis of Grape Family (Vitaceae)basedonthreechloroplastmarkers.AmJBot,93:278.

Souza,C.J D., D.A Costa, M.Q Rodrigues, S.A.F Dos, M.R Lopes,A.B.Abrantes, S.C.P Dos, W.B Silveira, F.M Passos, L.G Fietto, 2012.

Theinfluenceo f p r e s a c c h a r i f i c a t i o n , f e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e a n d y e a s t s t r a i n on ethanol production from sugarcane bagasse Bioresource Technology,109:63–69.

Sowmyal,S.,P.C.Perumal,P.Anusooriya1,B.Vidya1,P.Pratibha,D.MalarvizhiandV K.Gopalakrishnan,2015.Comparativepreliminaryphytochemicalanalysisvar iousdifferentparts(stem,leafandfruit)ofCayratiatrifolia(L.).IndoAmericanJo urnalofPharmResearch.

Sree, K.N., M Sridhar, K Suresh, I.M Banat and L Venkateswar-Rao, 2000.Isolationofthermotolerant,osmotolerant,flocculatingSaccharomycescer evisiaeforethanolproduction.Bioresour.Technol.,72(1),pp.43-46.

Sripiromrak, A., 2006.Isolation and characterization of thermotolerant yeast forethanolproduction.SuranareeUniversity:SuranareeUniversity.

Swan,T.andW.E.Hillis,1959.PhenolicconstituentsofPrunusdomesticaquantitative a n a l y s i s o f p h e n o l i c c o n s t i t u e n t s J o u r n a l o f S c i e n c e o f F o o d andAgriculture 10:63-68.

Swarnkar,S.andS.S.Katewa,2008 Ethnobotanical observationont u b e r o u s plant from tribal areas of Rajasthan (India).Ethnobotanical Leaflets,2: 647-660.

Tabart, J., C Kevers, A Sipel, J Pincemail, J.O Defraigne andJ

D o m m e s , 2007 Optimisation of extraction of phenolics and antioxidants from blackcurrant leaves and buds and of stability during storage Food Chemistry 105:1268-1275.

Tahir, A., M Aftab and T Farasat, 2010 Effect of cultural conditions on ethanolproduction by locally isolatedSaccharomyces cerevisiaebio- 07.Journal ofAppliedPharmaceutical,3(2):72-78pp.

Techaparin, A., P Thanonkeo and P Klanrit, 2017 High-temperature ethanolusing thermotolerant yeast newly isolated from Greater Mekong Subregion.BraziliaJournalofMicrobiology.48:461-475.

Torija, M.J., N Rozes, M Ponlet, J.M Guillamon and A Mas, 2003 Effects offermentationtemperatureonthestrainpopulationofSaccharomycescerevisia e.InternationalJournal ofFoodMicrobiology, 80:47-53.

Trần Minh Tâm, 2000 Công nghệ vi sinh ứng dụng NXB Nông nghiệp, ThànhphốHồChíMinh.

Trần Thị Thanh, 2009 Công nghệ vi sinh NXB Giáo dục Thành phố Hồ ChíMinh.168trang

Tsao, R., 2010 Chemistry and Biochemistry of Dietary Polyphenol. Nutrients2:1231-1246.

Ulber,R.,andK.Soyez,2004.Fromwinetopenicillin5000yearsofbiotechnology.Che mieinUnsererZeit.38:172-180pp.

Van der Klei, I.J and M Veenhuis, 2007 Protein targeting to yeast peroxisomes.In: M van der Giezen (Editors), Protein Targeting Protocols. Humana Press,Totowa,NewJersey.390:373-391pp

Velayutham,P.,A.BabuandD.Liu,2008.Greenteacatechinsandcardiovascularhealth :anupdate.CurrentMedicinalChemistry15(18):1840-1850.

Võ Văn Chi, 2004 Từ điển thực vật thông dụng- tập 1 NXB Khoa học và kỹthuật.Trang621.

Vũ Công Hậu, 2004.Làm rượu vang trái cây trong gia đình NXB Nông nghiệpThànhphốHồChíMinh,tr.9-16.

Wang,Z.X., J Zhuge, H Fang and B.A Prior, 2001 Glycerol production bymicrobialfermentation:Areview.BiotechnologyAdvances.19: 201-223.

Williams, L and I Wilkins, 2008 Concepts of Altered Health States.Instructor’sResource,Parth’sPathophysiology7:102-104.

Williams, R.J., J.P Spencer and C Rice-Evans, 2004 Flavonoid: Antioxidants orsignalling.FreeRadicalBiology Medicine36:838-849.

Trangwebhttps://thanhnien.vn/tai-chinh-kinh-doanh/do-xo-hai-trai-giac-

0àL 20àL 40àL 60àL 80àL 100àL120àL

Hình PLA1:Phản ứngxácđịnh hàmlượngđườngtổngcủa dịchtráigiác

Hình PLA2: Phản ứng chất chuẩn acid galic xác định đường chuẩntrongkhảo sáthàmlượngpolyphenol

Ghi chú: ĐC (đối chứng với 3 mL methanol), C (mẫu control với 1 mL methanol và 2 mLDPPH), ống 1  6cúnồngđộ vitaminCtương ứngtừ2 –12 àg/mL

HìnhPLA4:Trái giác chín,đo Brix,pHdichhtrái

HìnhPLA5: Nuôităngsinhnấmmen từ trái giác chín

Nguyên tắc: có thể sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định số lượng vi sinh vật có kíchthước tế bào lớn như nấm men, bào tử nấm mốc, các loại tảo có trong mẫu dưới kính hiển vi cóđộ phóng đại X100 đến X400 Phương pháp đếm trực tiếp còn giúp quan sát được hình thái tếbào Hình thái tế bào không bình thường giúp nhận biết tế bào không phát triển trong điều kiệntốiưu hoặc tế bàobịthayđổikiểu gen haykiểu hình.

Buồng đếm hồng cầu là mộtp h i ế n k í n h d ầ y h ì n h c h ữ n h ậ t , g i ữ a c ó p h ầ n l õ m p h ẳ n g , t ạ i đây có kẻ một lưới gồm 400 hình ô vuông nhỏ có diện tích tổng cộng 1mm 2 Ô trung tâm có 25 ôvuông lớn, mỗi ô vuông lớn gồm có 16 ô vuông nhỏ Thể tích diện tích một hình vuông nhỏ là1/400mm 2 vàmộthình vuônglớn là1/25 mm 2

Tiến hành: khuấy đều dịch huyền phù tế bào, nhỏ một giọt lên buồng đếm kề với cạnh củalá kính nhờ một pipet Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn Buồng đếmđược chuẩn bị đúng khi có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được điền bởi dịchhuyền phù tế bào, còn các rảnh xung quanh thì không bị ướt; di chuyển nhẹ nhàng buồng đếm đểdịch huyền phù di chuyển nhẹ nhàng vào trong khoang có chiều dày khoảng 0,1 mm Đặt buồngđếm lên bàn kính hiển vi. Điều chỉnh cường độ ánh sáng để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫnđường kẻ Tùy thuộc vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm, tất cả tế bào có trong một ôtrung tâm hay chỉ đ ế m c á c t ế b à o t r o n g m ộ t s ố c á c ô v u ô n g l ớ n đ ạ i d i ệ n P h ả i đ ế m c á c t ế b à o nằmtrên đườngkẻnhưngkhônglặp lạikhiđếmtế bàoởô kế cận.

Cách tính: thể tích dịch chứa trên một ô trung tâm (gồm 25 ô vuông lớn hay 400 ô vuôngnhỏ)là1x0,1 = 0,1 mm 3 (vìdiệntích tổngcộngcủa cácô trungtâmlà 1 mm 2 ).

Tuy nhiên, chỉc ầ n đ ế m s ố t ế b à o t r ê n 5 ô l ớ n đ ạ i d i ệ n c h o 2 5 ô v u ô n g l ớ n t r ê n ô t r u n g tâm.Khiđó, sốlượngtế bàotrong1 mlmẫu nghiên cứuđược tính bằngcôngthứcau.

N:sốlượngtế bàotrong1 mLnghiêncứu. a:sốtếbàotrong5ôvuônglớn(80ôvuôngnhỏ). b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16x5 ô vuông nhỏ).400:tổngsố ô vuôngnhỏ trongôtrungtâm.

0,1: thể tích dịch chứa tế bào trên ô trung tâm.10 3 : sốchuyển mm 3 thànhmL.

Quan sát đặc tính nuôi cấy: quan sát khuẩn lạc trên môi trường YPD agar trên đĩa haythạch nghiêng: sau khi có các khuẩn lạc riêng biệt trong đĩa petri cần quan sát và ghi chép đầy đủcácđặc điểmhình thái, kích thước khuẩnlạc.

Quan sát hình thái của tế bào nấm men và đo kích thước: nuôi cấy nấm men trên môitrườngYPD,ủ25-30 o Ctrong3ngày,sauđólàmtiêubảnquansát.Sửdụngtrắcvithịkínhđểđo kích thước tế bào nấm men Tế bào nấm men được đo kích thước không ít hơn 20 tế bào, đokích thước các tế bào trưởng thành. Kích thước tế bào nấm menkhác nhau tùy loài, tùy giống,tùytheo điều kiện sinh dưỡngvàcó thể thayđổitừ 1-5ì5-30àmhaycú khidàihơn.

Tiêu bản giọt ép quan sát tế bào nấm men: nhỏ 1 giọt nước cất lên phiến kính khô, dùngque cấy lấy một ít tế bào nấm men cho vàog i ọ t n ư ớ c , t r ã i đ ề u t ế b à o t r ê n g i ọ t n ư ớ c , đ ậ y l a m kínhtrên giọtnướcrồiquan sátdưới kính hiển vi.

A.4 PhươngphápđiềuchỉnhđộBrix Để có được độ Brix mong muốn, áp dụng công thức xác định độ khô cần cho dịch quả lênmenđể bổ sungthêmđường. b/100 = (a+x)/(100+x)Tổng lượngđườngbổ sung: c = m d × x × 10Trongđó: a:độ Brixdịch quảsau khilọc b: độBrixcầnđạt được x: khối lượng đường cần bổ sung cho 100 g dịch quảm d :khốilượngdịch quả ban đầu

Saukhithêmđường,dùngđũathủytinhkhuấytừ từ chođườngtan hoàn toàn,kiểmtralạiđộ BrixbằngBrix kế cầmtay.

A.5 Phươngpháp xácđịnh hàmlượng cồnsinhrabằng phươngphápchưngcất

Lấy 100 mL dung dịch sau khi lên men xác định hàm lượng ethanol bằng phương phápchưng cất, cho 100 mL dung dịch sau khi lên men vào bình cầu của hệ thống chưng cất cồn, tiếnhành chưng cất và thu lấy 100 mL, chú ý không để cho rượu bay hơi Sau khi để dịch cất ổn địnhnhiệt độ, cho dịch cất vào ống đông có đường kính gấp 2 lần đường kính nơi to nhất của rượu kế.Thả rượu kế vào đọc hàm lượng ethanol (dùng rượu kế 0-30 o ) và nhiệt độ, sau đó quy về nồnghàmlượngethanolởnhiệtđộ chuẩn 20°C.