Phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (cayratia trifolia) ở đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNGĐẠIHỌCCẦNT HƠ ĐOÀNTHỊ KIỀUTIÊN PHÂNLẬP,TUYỂNCHỌNNẤMMEN CHỊUNHIỆTVÀĐÁNHGIÁ KHẢNĂNGLÊN MEN RƯỢUVANGTRÁIGIÁC(Cayratiatrifolia) ỞĐỒNGBẰNGSÔNGCỬULONG 2020 LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINHNGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌCMÃNGÀNH:62420201 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNGĐẠIHỌCCẦNT HƠ ĐỒNTHỊ KIỀUTIÊN PHÂNLẬP,TUYỂNCHỌNNẤMMEN CHỊUNHIỆTVÀĐÁNHGIÁ KHẢNĂNGLÊNMEN RƯỢUVANGTRÁIGIÁC(Cayratiatrifolia) ỞĐỒNGBẰNGSƠNGCỬULONG LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINHNGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌCMÃNGÀNH: 62420201 CÁNBỘHƯỚNGDẪNGS TS.HÀTHANHTỒN PGS.TS.NGƠTHỊPHƯƠNGDUNG 2020 LỜICẢMƠN Luận án hồn thành nhận hỗ trợ quý báu từ đơnvị cá nhân Trường Xin trân trọng gởi lời tri ân sâu sắc QThầy,Cơ,giađình,ngườithân,đồngnghiệpvàbạnbè! Đầu tiên, tơi xin trân trọng bày tỏ lịngb i ế t n s â u s ắ c đ ế n T h ầ y hướng dẫn Giáo sư Tiến sĩ Hà Thanh Tồn Cơ hướng dẫn phụ PhóGiáo sư Tiến sĩ Ngơ Thị Phương Dung tận tình hướng dẫn, động viên, giúpđỡ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu, chăm bồi kiếnthức hoàn thành luận án Xin cảm ơn sâu sắc đến Phó Giáo sư Tiến sĩNguyễnVănThànhđãhướngdẫngiúptơihồnthànhchunđềchunmơn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, BộmônC ô n g n g h ệ s i n h h ọ c t h ự c p h ẩ m , V i ệ n N g h i ê n c ứ u v P h t t r i ể n C n g nghệsinhhọc,KhoaSauĐạihọcđãgiúpđỡvàtạomọiđiềukiệnchotơiđượcthựchiệnchươngtrìnhNghiên cứusinhtrongnhữngnămqua.X i n c ả m n đến Giáo sư Mamoru Yamada Trường Đại học Yamaguchi nhiệt tình giúpđỡ điều kiện vật chất phịng thí nghiệm Nhật Bản cho nội dung giải trìnhtựDNAtrongluậnán.Kếtquảcủaluậnáncũngnhờ vào đóng góp khơngnhỏ Tiến sĩ Huỳnh Xuân Phong, Thạc sĩ Nguyễn Ngọc Thạnh, Thạc sĩ BùiHồngĐăngLong,cánbộViệnNghiêncứuvàPháttriểnCơngnghệsinhhọc,cácemhọcviên caohọc,sinhviênđạihọcngànhCơngnghệsinhhọcTrườngĐạihọcCầnThơ Bên cạnh đó, thời gian vừa học tập vừa làm việc, nhậnđược giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi Ban Giám hiệuTrường ĐạihọcKỹ thuật- CôngnghệCầnThơ; chia sẻ, độngviênc ủ a đồngnghiệpKhoaCơngnghệthực phẩmvàCơngnghệsinhhọc Xin gửi đến gia đình, chồng con, anh, chị, bạn bè ngườithân lịng biết ơn vànhững tình cảmy ê u t h n g n h ấ t v ề s ự g i ú p đ ỡ , đ ộ n g viên,chiasẻđểtơicóthêmnghịlựchồnthànhluậnán Cuối cùng, xin gửi lịng biết ơn kính u vơ đến Ba, Mẹ tôi,người nuôi dưỡng giáo dục tất lịng u thương ln làđiểmtựatinhthầnchotơiphấnđấuđểvượtquamọithửthách! Trân trọng,ĐồnThịKiều Tiên TÓM TẮT Trái giác(Cayratia trifolia)chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh họccao, có khả kháng oxy hóa, giảm tăng trưởng khối u sửdụngl m d ợ c l i ệ u , l n g u n n g u y ê n l i ệ u t ố t l ê n m e n r ợ u v a n g , m ộ t s ả n phẩmrấtphổbiếnhiệnnay.Ngàynaytráigiácđãđượcnghiêncứunhiềutrênthế giới thành phần hoạt tính nó, nhiên Việt Nam cácnghiên cứu trái giác hạn chế Nghiên cứu thực vớimục tiêu tìm nấm men chịu nhiệt có khả lên men rượu vang trái giác.Kết phân tích 53 mẫu trái giác thu 13 tỉnh/thành phố thuộc Đồngbằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cho thấy trái giác chứa hàm lượng polyphenoltừ 0,47 đến 1,54 mg đương lượng acid gallic mL (GAE/mL) khảnăng kháng oxy hóat 16,6 đến 82,86%, hàm lượng đường tổng t r i giác từ 0,41 đến 2,17 g/100 mL, hàm lượng đường khử từ 0,22 đến 0,96mg/100 mL Từ 53 mẫu trái giác thu 13 tỉnh phân lập 151 chủngnấmmenđượcphânloạisơbộthuộcbốngiốngSaccharomyces,Hanseniaspo ra, Pichia,vàCadida Các chủng nấm men đềup h t t r i ể n t ố t mức nhiệt độ 30ºC đến 35oC, có 64/151 chủng có khả phát triểnở nhiệt độ 37ºC mơi trường cónồng độ ethanol từ đến 12% v/v Dựavào kết đánh giá khả lên men rượu vang trái giác ở37ºC tuyểnchọn 30/64 chủng nấm men có khả chịu nhiệt từ 37ºC đến 45ºC, cókhả phát triển nồng độ ethanol môi trường từ - 12% lên mensinh ethanolđạt từ6% (v/v).Kếtquả địnhdanh phươngp h p g i ả i trình tự DNA 30 chủng nấm men chịu nhiệt tuyển chọn, dựa cơsở liệu GenBank (NCBI) với kết phân tích hình thái, sinh lý vàsinhhóa đãxácđịnh30chủngnấmmenthuộcbốngiốngSaccharomyces,Candida,Pichia Clavispora, đóSaccharomyces cerevisiaeđược tìmthấykháphổbiến.KếtquảnghiêncứuchothấychủngnấmmenSaccharomyces cerevisiaeHG1.3 có khả chịu nhiệt đến 43ºC, lên menrượu trái giác nhiệt độ 35ºC với pH ban đầu 4,5, 20 ºBrix mật số chủngnấmmen10 5tếbào/ mL,sau6ngày lênmenđạthàm lượngethanolđ t 11,68%(v/v).Sảnphẩmrượuvangtráigiáccó chứahàmlượngpolyphenol0,60 mg GAE/mL, có khả kháng oxy hóa 57,3% có tính đặc trưngvềmàusắc,hươngvị Từ khóa: khả kháng oxy hóa, nấm men nhiệt,p o l y p h e n o l , rượuvang,Saccharomycescerevisiae,tráigiác chịu ABSTRACT Cayratia trifolia(L.) Domin berry is a source of high biological activitycompounds, having the antioxidant capacity, reducing the growth of tumors,and is used as a medicinal ingredient as well as a good source for alcoholicwine, a very popular product Nowaday, in the world,Cayratia trifolia(L.)Domin has been studies chemical component and biological activity, however,in Vietnam, this studies are limited The aim of this study was to isolate and toselectthethermotolerantyeastshavingthefermentationabilityfortheproduction of three-leaf cayratia wine The analysis results of 53 samples ofCayratia trifoliaberries collected in 13 cities and provinces in the MekongDelta showed that the threeleaf Cayratia contained 0.47 to 1.54 mg equivalentgallicacidin1mL(GAE/mL),16.6to82.86%antioxidantability,and0 41to 2.17 mg/100 mL total sugar and 0.22 to 0.96/100 mL reducing sugar From 53threeleaf cayratia samples, 151 yeast strains were isolated and classified into 4generaSaccharomyces,Hanseniaspora,Pichia,andCandida.They e a s t strain s could grow on plates incubated at 30ºC and 35 oC Among them, 64/151strains could grow at37°Co n p l a t e s s u p p l e m e n t e d w i t h t o % ( v / v ) ethanol Thirty over sixty-four strains could tolerate to the temperature at 37 to45°Candcouldgrowonplatesaddedwith9to12%(v/v)ethanol.Theproducedethanolc ontentreachedatleast6%(v/v)withoutoptimizationproccess Based on the DNA sequencing, sequences of 30 strains of yeastswereclassifiedandalignedwithGenBankDatabase(NCBI).Withthecombin ation with morphological, physiological and biochemical properties, 30yeaststrainswereidentifiedtobebelongedto4generaincludingSaccharomyces,C andida,PichiaandClavispora, in whichSaccharomycescerevisiaeaccounted for the highestproportion.TheresultsindicatedthatSaccharomyces cerevisiaestrain HG1.3 could tolerate to 43°C, could fermentwinefromCayratiatrifoliaat35°C,pH4.5,20°Brixwiththeinitialinoculati on density at 105cell/mL After a six-day fermentation, the ethanolcontent reached 11.68%(v/v)withthe polyphenolcontent ofproducedwineat 0.60 mg GAE/mL and the antioxidant abilities at 57.3% The produced winehaduniquecolor,flavorandaroma Keywords:antioxidant,Cayratiatrifolia,polyphenol,Sacchoromycescerevi siae,thermotoleranceyeast,wine MỤCLỤC Trang LỜICẢM ƠN i TÓMTẮT ii ABSTRACT iii LỜICAMĐOAN iv MỤCLỤC v DANHSÁCHBẢNG viii DANHSÁCHHÌNH .x CÁCTỪVIẾTTẮT xii CHƯƠNG1.GIỚITHIỆU .1 1.1 Đặtvấnđề 1.2 Mụctiêuđềtài 1.3 Nộidungnghiêncứu 1.4 Ýnghĩacủa luậnán 1.5 Nhữngđiểmmớicủa luậnán CHƯƠNG2.LƯỢCKHẢOTÀILIỆU 2.1 Rượuvang 2.1.1 Giớithiệuvềrượuvang 2.1.2 Nguyênliệulàmrượuvang 2.1.3 Hệvisinhvậttronglênmenrượuvang 2.1.4 Cácyếutốảnhhưởngđếnquátrìnhlênmen 2.1.5 Rượuvangđốivớisức khoeconngười 11 2.2 Nấmmen 11 2.2.1 Đặcđiểmcủanấmmen 12 2.2.2 Đặcđiểmnuôicấy 13 2.2.3 Đặctínhlênmen .15 2.2.4 Nấmmenchịunhiệt 15 2.3 Câygiác(Cayratiatrifolia(L.)Domin) 21 2.3.1 Phân loạikhoahọc 21 2.3.2 Đặctínhvàđiềukiệntự nhiên 21 2.3.3 Thànhphầnhóahọc 22 2.3.4 Hoạttínhsinhhọc 23 2.3.5 Côngdụngcủacâygiác 34 2.4 Tìnhhìnhnghiêncứuởtrongvàngồinước 34 2.4.1 Thếgiới 34 2.4.2 Trongnước 37 2.5 Mộtsốkhảosátthực tếtrongphạmvi nghiêncứucủaluậnán 38 2.5.1 Sảnlượngtráigiác ởĐBSCL 38 2.5.2 Thựctếsảnxuất nấmmenthương mại tạiCôngtySaf-Viet 40 CHƯƠNG3.PHƯƠNGTIỆNVÀPHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU 42 3.1 Phươngtiệnnghiên cứu .42 3.1.1 Thờigianvàđịa điểm .42 3.1.2 Thiết bị,dụngcụ,hóachất .44 3.2 Phương phápnghiêncứu 45 3.2.1 Thuthập,đánhgiáđặc điểmcủatráigiác 46 3.2.2 Phânlậpcácc hủng nấmmentừtráigiác tựnhiênvà xácđịnhcácđặcđi ểmhình thái,sinhlý,sinhhóa .50 3.2.3 Tuyểnc h ọ n , đ ị n h d a n h v x c đ ị n h m ố i q u a n h ệ c c c h ủ n g n ấ m m e n chịunhiệt, chịucồnvàcókhảnănglênmenrượuvangtráigiáctốt 56 3.2.4 Nghiênc ứ u đ i ề u k i ệ n t h í c h h ợ p c h o q u t r ì n h l ê n m e n r ợ u v a n g t r i giác 59 3.3 Xửlýsốliệu .61 CHƯƠNG4.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN 62 4.1 Nộidung1: Đặc điểmcủa tráigiác ởĐBSCL 62 4.1.1 Đặcđiểmhìnhdạng,kíchthước 62 4.1.2 Đặcđiểmcácchỉtiêuhóalýcủadịchtráigiác .63 4.1.3 Hàmlượngpolyphenolvàkhảnăngkhángoxyhóacủatráigiác… .67 4.2 Nội dung 2: Phân lập chủng nấm men từ trái giác tự nhiên xác địnhcácđặcđiểmhìnhthái, sinhlý,sinhhóa .72 4.2.1 Phân lậpcácchủngnấmmentừtráigiáctựnhiên 72 4.2.2 Đặcđiểmhìnhthái,sinhlý, sinhhóacủacácchủngnấmmen 74 4.2.3 Đặcđiểmnảychồicủacácchủngnấmmenphânlập .79 4.2.4 Đặcđiểmhìnhthànhbàotử củacácchủngnấmmenphânlập 81 4.2.5 Đặcđiểmsinhlý, sinhhóacủacácchủngnấmmenphânlập 81 4.3 Nội dung 3: Tuyển chọn, định danh xác định mối quan hệ chủngnấmmenchịunhiệt,chịucồn,cókhảnănglên menrượuvangtráigiáctốt .86 4.3.1 Khảnăngchịunhiệtcủacácchủngnấm men 86 4.3.2 Khản ă n g c h ị u e t h a n o l c ủ a n h ữ n g c h ủ n g n ấ m m e n c h ị u n h i ệ t 88 4.3.3 Tuyểnchọnnhữngchủngnấmcókhảnănglênmenrượuvang 90 4.3.4 Lên menrượuvangtráigiác .97 4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho trình lên men rượuvangtráigiác 109 4.4.1 Khảo sátảnhhưởngcủanhiệt độlênmenvàpH .109 4.4.2 Ảnhhưởngcủamậts ốgiốngchủng,độ Brixvàthờigianlên menđếnq uátrìnhlên menrượu vangtráigiác 112 CHƯƠNG5.K Ế T LUẬNVÀĐỀ XUẤT 121 5.1 Kếtluận 121 5.2 Đềxuất 122 DANHMỤCCÁCCƠNGTRÌNHĐÃCƠNGBỐ 124 TÀILIỆUTHAMKHẢO 126 PHỤLỤC