Nghiên cứu tạo chủng virus prrs (porcine reproductive and respiratory syndrome) nhược độc và đánh giá khả năng làm giống phục vụ sản xuất vaccine

Hộichứngrốiloạnsinhsảnvàhôhấpở lợn

TìnhhìnhPRRStrênthế giới vàở ViệtNam

+TìnhhìnhPR RS trên thếgi ới

Theo báo cáo của tổ chức Thú y thế giới (2014),v i r u s P R R S t y p e 2 x u ấ t hiệnở T r u n g Q u ố c v à l a n r ộ n g k h ắ p C h â u Á ( Đ ô n g , N a m v à B ắ c Á ) :

(Nguồn:http://www.prrscontrol.com/wps/portal/hipra/prrscontrol/prrs-knowledge/porcine- reproductive-and-respiratory-syndrome) Đại dịch PRRS bùng phát lây lan nhanh hơn 10 tỉnh thành của Trung Quốclàm chết 2.000.000 con lợn, trong đó có hơn 400.000 sảy thai, đẻ non Trong năm2007 PRRS đã xảy ra ở trên 25 tỉnh, với trên 180.000 lợn mắc bệnh và 45.000 conchết Qua một số nghiên cứu với qui mô lớn, người ta đã xác định virus PRRS tạiTrungQuốcthuộcchủngBắcMỹthểcườngđộcgâyra(Tianetal.,2007). Ở Hàn Quốc, PRRS ở lợn chủ yếu do 2 chủng virus thuộc type EU-1 và type2(Bắcmỹ)gâyra(Yeomet al.,2015).

Từ 4/2012đến 8/2013(Marinouet al., 2015) đã thu thập359mẫu huyếtthanh từ lợn rừng tại các địa phương khác nhau thuộc Hy Lạp để xác định tỷ lệ lưuhành một số mầm bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trong đó có hội chứng rối loạn sinhsảnvàhôhấpởlợn.Kếtquảchothấy5,6%sốmẫudươngtínhvới virusPRRS.

Từ năm 2008 đến năm 2013 (Jantafonget al., 2015) cho biết: hàng năm cókhoảng13,86%s ố lợnởTháiLannhiễmvirushộichứngrốiloạnsinhsảnvàhôhấp.

Năm2008,virusPRRSlầnđầutiênđượcpháthiệnởTháiLanvàCampuchia,2nămsauđó,nótrởthàn hnguyênnhângâybùngphátdịchtại2nướcnày.

Tornimbeneet al., (2015) cho biết, năm 2006 Trung Quốc và Việt Nam đãbáo cáo về một biến thể mới xuất hiện gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ởlợn (virus HP-PRRS) Các vụ dịch hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợnthường xuyên diễn ra ở Trung Quốc và Việt Nam gây nguy cơ lây nhiễm cao đếnđàn lợn của Campuchia Năm 2010, các tác giả đã nghiên cứu tình hình bệnh PRRSở lợn tại tỉnh Takeo giáp biên giới Việt Nam và cho biết trên 85% số đàn lợn đượcđiềutracólợnnhiễm virusPRRS.

Trong vòng 3 năm, tại 140 trang trại thuộc miền Bắc Italia (Salogniet al.,2016) đã phát hiện 323 lợn bị xảy thai do virus, có nhiều loại virus đã được đề cậpđếntrongđócó108lợnbịxảythaidonhiễmvirusPRRS.

Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ trên hầu hết các châu lụcđều đã báo cáo về sự lưu hành của virus PRRS Đặc biệt, kể từ năm 2006-2007, mộtbiến chủng mới của virus PRRS xuất hiện ở Trung Quốc có độc lực cao và nhanhchóng lan rộng ra nhiều nước ở Châu Á gây ra hàng loạt vụ dịch (Tianet al., 2007).Vụ dịch PRRS làm chết hàng triệu lợn đã bùng phát từ năm 2006 (Zhou and Yang,2010) Trường hợp PRRS đầu tiên xuất hiệng â y b ù n g p h á t d ị c h ở V i ệ t N a m v à o đầu năm 2007 (Fenget al., 2008; Metwallyet al., 2010) sau đó lan sang các nướcĐông Nam Á khác như Lào, Philippines,C a m b o d i a v v … ( J a n t a f o n get al., 2015;Nietal.,2012;

Hiện nay, Tổ chức Thú Y thế giới đã có qui trình chẩn đoán, giám sát và dựphòngđốivớihộichứngrốiloạnsinhsảnvàhôhấpởlợn.

(Nguồn:http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Ourscientificexpertise/docs/pdf/

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam được phát hiện đầutiên trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam năm 1997, kết quả kiểm trahuyết thanh học cho thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu đó có huyết thanh dương tínhvới PRRS, toàn bộ số lợn này đã được xử lý Từ tháng 3/2007 đến 2008, PRRS gâythànhđạidịch tạinhiềuđịa p hư ơn g t r ê n cả n ư ớ c làmtổnth ất l ớ n v ề kinht ế c h o người chăn nuôi, hàng triệu con lợn đã mắc PRRS và bị tiêu hủy Kết quả chẩn đoánvà nghiên cứu virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam từ2007 đến 2008 cho thấy, số lợn mắc PRRS tăng lên, các virus PRRS phân lập từ cácổ dịch lợn mắc PRRS có mức độ tương đồng cao so với virus PRRS chủng độc lựccao của Trung Quốc. Bệnh phẩm chứa virus có khả năng gây chết lợn thí nghiệm100%cũngchothấyvirushoặcvikhuẩnđồngnhiễmđóngvaitròquantrọng,g âytỷlệchếtcaotrênthựcđịa(TôLongThànhvàcs.,2008)

Từ 2009 đến 2015 tình hình dịch PRRS diễn ra vẫn phức tạp, dịch còn xảy raởnhiềutỉnhtrêncảnước.

Từ 2016 đến 2019 cảnước không xuất hiệndịch PRRS, tuy nhiênc ò n t i ề m ẩn và nguy cơ phát sinh cao do virus PRRS vẫn tồn tại trong môi trường chăn nuôi,vận chuyển buôn bán,g i ế t m ổ , t i ê u t h ụ t h ị t l ợ n n g à y c à n g g i a t ă n g B i ệ n p h á p phòng bệnh hiệu quả là tổ chức tiêm phòng triệt để cho đàn lợn và áp dụng nghiêmngặtcácbiện phápvệsinhphòngbệnh,chănnuôiantoànsinhhọc.

Tháng 10/2020 xuất hiện trở lại ổ dịch PRRS tại huyện Lý Nhân tỉnh HàNam, tại Nghệ An trong năm 2020 cũng có ổ dịch thuộc các huyện: Nam Đàn, TânKỳ,NghĩaĐànvàthịxãTháiHòa.

CácSở,ngành,địaphươngnơixảyradịchđãtậptrungtriểnkhai quyếtliệt,đồngbộcácbiệnphápcấp báchphòngPRRS.

Bảng 1.1 Tổng hợpcácổdịchPRRS xảy ra ở ViệtNam từ 2007-2016

Năm Tỉnh Quận/Huyện Xã/Phường Số lợn mắcPRR S

PRRS thường xảy ratrên lợn ởmọi lứa tuổivới đặc trưng làm chol ợ n ố m , sốt cao, lợn con theo mẹ và lợn nái chửa giai đoạn cuối chết nhanh và nhiều hơn sovớilợnthịtvàlợnđựcgiống.

Dịch lây lan nhanh chủ yếu là do phát hiện chậm hoặc dấu dịch, người chănnuôi bán lợn mắc bệnh, do không kiểm soát được vận chuyển lợn ốm từ vùng códịchsangvùngkhôngcódịch.

Nguyên nhân chính là do chăn nuôi lợn ở nước ta chủ yếu là nhỏ lẻ nên khókiểm soát dịch, nhận thức của người chăn nuôi, buôn bán, giết mổ lợn về công tácphòng, chống dịch còn nhiều hạn chế Nhiều chủ gia súc chăn nuôi không tiêmphòng hoặc tiêm phòng cácbệnhđỏ (dịch tảl ợ n , t ụ h u y ế t t r ù n g , đ ó n g d ấ u l ợ n v à phó thương hàn lợn) đạt tỷ lệ thấp, hầu hết các hộ chăn nuôi không áp dụng các biệnphápantoànsinh học,việcchấphànhPháplệnhThúychưatriệtđể.

Hiệnnay,v ớ i c ô n g t á c p h ò n g d ị c h b ằ n g v a c c i n e v à x ử l ý k ị p t h ờ i k h i c ó dấu hiệu dịch nênh ộ i c h ứ n g r ố i l o ạ n s i n h s ả n v à h ô h ấ p ở l ợ n đ ã đ ư ợ c k i ể m s o á t ỞViệt Nam cũngđã banhànhqui trìnhchẩnđ o á n , g i á m s á t h ộ i c h ứ n g r ố i l o ạ n sinhsảnvàhôhấpởlợn(TCVN8400-21:2014).

Triệuchứng bệ nh th ể h i ệ n r ất khá cn hau, th eo ước tí nh , cứ 3 đàn đầut iê ntiế p xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện bệnh, một đàn có biểu hiện ởmức độ vừa và một đàn ở mức độ nặng Lý do cho việc này vẫn chưa có lời giải, tuynhiên với những đàn khoẻ mạnh thìmức độb ệ n h c ũ n g g i ả m n h ẹ h ơ n , v à c ũ n g c ó thểd o v i r u s t ạ o n h i ề u b i ế n c h ủ n g v ớ i đ ộ c l ự c k h á c n h a u T h ự c t ế n h i ề u đ à n c ó huyết thanh dương tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng Mức độ lâm sàng thayđổi tuỳ chủng virus, sựbiến độngkhảnănggây bệnhc ủ a v i r u s , h à m l ư ợ n g v i r u s tăng trong máu và các mô, khả năng của các chủng có độc lực cao có thể tái sảntrongcơthểkýchủ.

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp có biểu hiện đặc trưng là vô sinh, chếtthai muộn, sảy thai, đẻ non và sinh ra lợn con yếu ớt, lợn con thường chết sớm saukhi sinh do bệnh đường hô hấp Lợn lớn hơn có thể biểu hiện các triệu chứng nhẹcủa bệnh đường hô hấp, thường phức tạp thêm do đồng nhiễm virus, vi khuẩn khácgây bệnh trên lợn Ở lợn nọc và lợn nái (hậu bị) có thể quan sát thấy sốt và biếng ăntạmthời,khóthở (thoi thóp),lờ đờ.Mọi lứatuổilợn đềucảmnhiễmvớivirus,mầm bệnh thường tồn tại lâu trong đàn nái Lợn nái thường truyền mầm bệnh cho bàothai. Lợn rừng mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm virus, có thể phát bệnh, nhưng cũng cóthể không phát bệnh, đây có thể coi là nguồn tàng trữ bệnh tự nhiên rất nguy hiểm.Người và các động vật khác không mắc bệnh, trong thiên nhiên có loài vịt trời(Mallard duck) có mẫn cảm với virus (Zimmermanet al.,1997), đây là nguồn gieorắcmầmbệnhtrêndiệnrộngrấtkhókiểmsoát.

Các triệu chứng chủ yếu là tím âm hộ, sảy thai, thai chết lưu, thai gỗ hàngloạt, đẻ non, lợn con đẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao Tỷ lệ thai chết tăng lên theo độtuổicủathai:Thaidưới2,5thángtuổitỷlệchết20%,thaitrên2,5thángtỷlệchếtlà 93,75%(Phạm Ngọc Thạch và cs, 2007) Lợn nái trong giaiđ o ạ n n u ô i c o n thườnglườiuốngnước,viêmvú,mấtsữa,viêm tửcungâmđạo,mímắtsưng,có thể táo bón hoặc ỉa chảy, viêm phổi Triệu chứng điển hình đặc trưng ở lợn nái khimắc hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp là hiện tượng sảy thai ồ ạt ở giai đoạn lợncó chửa thời kỳ 2 (giai đoạn bào thai đã hình thành đầy đủ các bộ phận của cơ thể).Điều này này đã gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi lợn nái sinh sản vàgây cản trở cho việc áp dụng công nghệ sinh sản gây động dục đồng loạt để có đượclượnglớnlợnnáichửavàđẻđồngloạt cholượnglớnlợnconcùng mộtthờiđiểm.

Triệu chứng chủ yếu là viêm dịch hoàn, bìu nóng đỏ, (chiếm 95%), dịch hoànsưngđau,lệchvịtrí(85%),giảmtínhhưngphấngiaophối(LêVănNăm,2007).

Thể trạng gầy yếu, triệu chứng phát ra đột ngột, đường huyết hạ thấp dokhông bú mẹ, mí mắt sưng, có dử màu nâu, trên da xuất hiện những đám phồng rộp(Phạm Ngọc Thạch và cs, 2007) Lợn con thường tiêu chảy hàng loạt và rất nặng,phân dính đầy xung quanh hậu môn Đây là triệu chứng đặc trưng của PRRS ở lợncon chưa cai sữa, biểu hiện này không phổ biến ở lợn lớn Phát ban đỏ là biểu hiệnphổ biến thứ 2 và xảy ra ngay sau khi bệnh bắt đầu xuất hiện Chảy nước mắt, mắtcó rỉ và mí mắt sưng húp là biểu hiện phổ biến thứ 3, kết hợp với triệu chứng lạcgiọng, khản tiếng,thở khó, thở thể bụng, chảy nước mũi, khớp đau, sưng nên chânthườngchoãira,đilạikhókhăn,tỷlệtử vongcao(LêVănNăm,2007).

- Ởlợnconsaucaisữavàlợnthịt Ởlợnconsaucaisữa, mímắtthườngsưnghúp,cómàuđỏthâm,làmchomắt lõm sâu tạo nên một quầng thâm xung quanh mắt nên nhìn lợn giống như được“đeo kính râm” Tỷ lệ táo bón ở lợn loại này rất cao nhưng tỷ lệ tiêu chảy thấp hơnlợncontheomẹ(LêVănNăm,2007). Ở lợn thịt, các triệu chứng tập trung chủ yếu ở đường hô hấp Lợn bị viêmphổi nặng, ho nhiều, thở rất khó khăn, thở dốc, thở thể bụng, ngồi thở, hắt hơi, chảynước mắt Do phổi bị viêm nặng nên hiện tượng da xanh, đặc biệt là tai xanh xuấthiện sớm, điển hình và chiếm tỷ lệ lớn ở loại lợn này Tỷ lệ chết đôi khi lên đến12%- 20%doviêmphổivà đồngnhiễmvớivikhuẩn(Rossowetal.,1995).

BệnhtíchPRRS

Bệnh tích biến đổi phổ biến trên lợn chủ yếu ở phổi, phổi bị mủ hóa và chắcđặc, nhục hoá, thuỳ phổi bị bệnh màu đỏ xám, mặt cắt ngang của thuỳ phổi lồi ra,khôvàxuấthiệnnhững nốtloéttrên cáccơquannộitạng(LêVănNăm, 2007).

Virus PRRS gây ức chế miễn dịch nên khi lợn nhiễm virus trong tử cung, lợncon sinh ra nếu không chết thì có thể nhiễm virus tiềm tàng với bệnh tích như viêmgian thuỳ phổi, sưng hạch lympho, teo tuyến ức và có những tổn thương do đồngnhiễm vi khuẩn, dấu hiệu đặc trưng là hiện tượng lợn nhiễm virus huyết và kéo dài(TôLong Thành,2007).

Tác nhân gây bệnh là virus PRRS, chúng được phát hiện từ nhiều loại chấttiếtv à c á c c h ấ t t h ả i c ủ a l ợ n b ệ n h b a o g ồ m : m á u , t i n h d ị c h , n ư ớ c b ọ t , p h â n , h ơ i thở, sữa Sau cảm nhiễm, lợn bệnh có thể chứa virus trong huyết thanh đến 210ngày, trong tinh dịch 92 ngày, trong dịch mũi 21 ngày và trong dịch hầu họng đến157ngày.Trongđó,tinhdịchvàdịchmũilàhainguồnlâynhiễmđángquantâm.

Virusx â m n h i ễ m ở c á c c ơ q u a n n h ư : đ ạ i t h ự c b à o p h ế n a n g , p h ổ i , t i m , thận, não, lách, hạch lympho, tuyến ức, amidan, tuỷ xương, bạch cầu mạch máungoạiv i , h u y ế t t h a n h c ủ a l ợ n n h i ễ m b ệ n h V i r u s h u y ế t c ó t h ể p h á t h i ệ n n g a y 1 ngàysaukhitiêmnhiễm,nhưngphổbiếnhơnở28ngày(Halbure t al.,1995a).

VirusPRRSc h ủ yế u t r u y ề n l â y quah a i đ ườ ng c h í n h đól à lâytruyềnt r ự c tiế pvàlâytruyềngiántiếp:

- Đườngt r u y ề n l â y t r ự c t i ế p:V i r u s g â y PR RS t r ê n l ợ n l â y q ua đ ư ờ n g h ô hấp, gieo tinh, tiêu hoá, chất chứa mầm bệnh.V i r u s P R R S l â y t r ự c t i ế p t r o n g v à giữacácquần thểlợnq u a g i e o t i n h S ự t r u y ề n l â y t h e o c h i ề u d ọ c x ả y r a t r o n g suốtgiai đoạn giữa đếng i a i đ o ạ n c u ố i c ủ a t h ờ i k ỳ m a n g t h a i L â y t r u y ề n t h e o chiềungangquatiếpxúctrựctiếpgiữalợnnhiễmb ệ n h v à q u a t i n h d ị c h t ừ nhữnglợnđựcnhiễmbệnh.

- Đườngtruyềnlâygiántiếp:VirusPRRSchủyếuquacácdụngcụ,thiếtbịchănnuôinh ư:thứcăn,nướcuống,ủng,giàydép,quầnáobảohộ,kimtiêm vàcácphươngtiệnvậnchuyểncó mangvirusPRRSlàmộtđườnglâylancơhọctiềmnăng.Viruscóthểtheogióđixatới3km,dovậyvir uscókhảnăngpháttánrấtrộngthôngquaviệcvậnchuyểnlợnốm,lợnđãnhiễmPRRS.

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus PRRS nhân lên trong đại thực bào ở tiểuphế nang và trong tế bào nội mô của hệ thống lưới võng nội Tế bào biểu mô đườnghô hấp trên cũng là nơi thích hợp cho sự nhân lên của virus PRRS Quá trình virusnhân lên và phá hủy đại thực bào gây ra bệnh tích ở thành mạch, làm thủy thũng tếbào nội mô của tĩnh mạch, giảm hàm lượng protein huyết tương đến các mô và tạocác cục huyết khối gây nhiều hậu quả bệnh lý khác nhau Những biểu hiện khácnhau của bệnh tuỳ thuộc vào khả năng nhân lên hay phá hủy tiểu phế nang, tế bàonội mô và tế bào lympho. Virus PRRS có thể tiêu diệt tới 40% đại thực bào làm pháhuỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và virus khác có cơhộipháttriểnvàgâybệnh.Saukhixâmnhậpvàotếbàođạithựcbàochúngnhânlênv à p h á hu ỷrấtn han h t ế b à o bả o vệ c ơ t h ể L ú c đầu, v i r u s P RR Sc ó th ể k í c h thíchcáct ếbàonày,nhưngsau3hoặc4ngàyvirussẽgiếtchếtchúng,cácvirion

Cơchếbệnhsinh

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus PRRS nhân lên trong đại thực bào ở tiểuphế nang và trong tế bào nội mô của hệ thống lưới võng nội Tế bào biểu mô đườnghô hấp trên cũng là nơi thích hợp cho sự nhân lên của virus PRRS Quá trình virusnhân lên và phá hủy đại thực bào gây ra bệnh tích ở thành mạch, làm thủy thũng tếbào nội mô của tĩnh mạch, giảm hàm lượng protein huyết tương đến các mô và tạocác cục huyết khối gây nhiều hậu quả bệnh lý khác nhau Những biểu hiện khácnhau của bệnh tuỳ thuộc vào khả năng nhân lên hay phá hủy tiểu phế nang, tế bàonội mô và tế bào lympho. Virus PRRS có thể tiêu diệt tới 40% đại thực bào làm pháhuỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và virus khác có cơhộipháttriểnvàgâybệnh.Saukhixâmnhậpvàotếbàođạithựcbàochúngnhânlênv à p h á hu ỷrấtn han h t ế b à o bả o vệ c ơ t h ể L ú c đầu, v i r u s P RR Sc ó th ể k í c h thíchcáct ếbàonày,nhưngsau3hoặc4ngàyvirussẽgiếtchếtchúng,cácvirion được giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai đoạn đầu của quátrình xâm nhiễm của virus PRRS, dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loạivirus và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của lợn tăngc a o d o s ự k í c h hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫntrongviệcđánhgiá mứcđộmiễndịchđối với cácbệnhtruyềnnhiễmởcơthểlợn.

Tác động phá huỷ đại thực bào phế nang, đặc biệt trên lợn con, làm giảm khảnăng đề kháng của vật chủ chống lại xâm nhập đồng nhiễm của các virus, vi khuẩnkhác Hầu hết sự đồng nhiễm được quan sát sau ổ dịch PRRS là bệnh đường hô hấp.Những tế bào bảo vệ đầu tiên như PAM bị phá huỷ thì nó sẽ ảnh hưởng rất lớn đếnkhả năng củavật chủchống lại vi khuẩnv à v i r u s g â y b ệ n h ( H o à n g V ă n N ă m , 2001) Khi tế bào đại thực bào bị virus phá hủy, đại thực bào không còn các "chângiả", mất khả năng bắt giữ và tiêu diệt tác nhân gây bệnh, các phản ứng miễn dịchkhông xảy ra được, lợn rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch từ đó dễ dàng mắc cácbệnhnhiễmtrùngthứphát,điềunàycóthểthấyrõởđànlợnvỗbéochuẩnbịgiếtthịt,khi bị nhiễm virus PRRS sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm kẽ phổi kế phát donhữngvikhuẩnvốncósẵntrongđườnghôhấp,PRRSsuygiảmmiễndịchmởđườngchonhữngvisi nhvậtnhư:Pasteurellamultosida,Haemophilusparasuis,Streptococcussuis,A.pleuropneumoni ae,Chlamydiapsittaci,Leptospirainterrogans,virusgiảdại,viruscúm,Enterovirus,Parvovirus.

Trong nghiên cứu gần đây, Ma Het al, 2021 đã làm sáng tỏ sự lây nhiễmVirusPRRS-2 qua trung gian CD163 và giúp chúng ta hiểu sâu hơn về cơ chế bệnhsinhcủavirus,điềunàysẽcungcấp manhmốiđểphòng ngừavàkiểmsoátPRRS.

Virusgâyhộichứngrốiloạnsinhsảnvàhôhấpởlợn

Cấutrúc,chứcnănghệgenvirusPRRS

Cấu trúc virus PRRS quan sát dưới kính hiển vi điển tử có dạng hình cầu, cóvỏ bọc,trênbềmặtcó nhiều gainhô ra,kích thước45-80nm và chứa nhânnucleocapsidekíchthước 25-35nm.

Hệ gen của virus PRRS là một chuỗi RNA đơn dương, dài khoảng 15 kb vàchứa

9 khung đọc mở (ORF) ORF1a và ORF1b chiếm khoảng 80% hệ gen virus vàđượcd ị c h t h à n h h a i p o l y p r o t e i n l ớ n l à p r o t e i n s a o c h é p p p 1 a v à p p

1 b N h ữ n g protein này sau khi dịch mã bởi 4 protease thành 14 protein phi cấu trúc (NSPs),NSP1α,N S P 1 βvà v à N S P 2 đ ế n N S P 1 2 N S P 9 m ã h ó a c h o R N A p o l y m e r a s e p h ụ thuộc RNA và NSP10 mã hóa cho helicase, là hai protein phi cấu trúc chính chịutrách nhiệm sao chép và phiên mã của hệ gen virus Người ta đã chứng minh đượcrằng có một vùng đặc biệt thuộc protein NSP11 đóng vai trò quan trọng trọng chutrình sao chép của tất cả các virus thuộc chi Arterivirus (Bautistaet al., 2002; Fangand Snijder, 2010) ORFs 2a, 2b và ORF3-7 nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus, sau dịchmã được phân cắt thành các protein cấu trúc của virus PRRS (Deaet al., 1996;Meulenberget al., 1995; Wuet al., 2001) Các protein cấu trúc được biểu hiện ra từcácđoạnmRNAnằmởđầu3’củahệgenvirusvàcócùngtrìnhtựđiềukhiểnnằmở đầu 5’ của các đoạn này (Snijder and Meulenberg, 1998) Glycoprotein 5 (GP5),protein màng (M) và nucleoprotein (N) được mã hóa bởi các ORFs 5-7, là các thànhphầnchínhcủahạtvirus (Deaet al.,2000).

ORF 2a, 3 và 4 mã hóa cho các protein khác thuộc hạt virus bao gồm GP2a,GP3 và GP4 Các protein này tương tác với nhau và tụ hội thành virion như mộtphức hệ đa thành phần và cũng tham gia vào quá trình nhiễm trùng của virus(Wissinketal.,2005).ORF2bmãhóachoproteinvỏ(E).

ORF2a, ORF2b và ORFs 3-7 mã hóa lần lượt cho protein cấu trúc virusGP2a, GP2b (E), GP3, GP4, GP5, M và N (Snijder and Meulenberg, 1998); GP2b làmột ORF nhỏ ở bên trong, nằm hoàn toàn trong ORF2 GP2a, GP3, và GP4 là cácproteinvỏphụbịglycosylhóaởđầuN,tạothànhdịtamhợpbằngliênkếtdisulphide

(Nguồn:http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-VirusPRRS-structure.asp)

Bảng1.3.Hệgencủa virusPRRS vàcácthôngtinliên quan

TT ORF Protein đượcmã hóa

Chứcnăng Vai trò trong miễn dịch,bảo hộ

P ro te in in k hô ng c ấu tr úc nsp 1  Cysteinprotease, giốngpapain IFN và TNF, chất đối khángmạnh nsp1 Cysteinprotease, giốngpapain nsp 2 Cysteinprotease,giốngpapain ChấtđốikhángIFNmạnh nsp 3 Proteinchuyển màng Chưa cósốliệu -chưa biết nsp 4 Serineprotease Chưa biết nsp 5 Proteinchuyển màng Chưa biết nsp 6 Chưabiết Chưa biết nsp 7 Chưabiết Khángn g u y ê n c h o x á c đ ị n h huyếtthanhhọcvềsựcảmnhiễ mvirus nsp7 Chưabiết nsp 8 Chưabiết Chưa biết

2 ORF 1b nsp 9 PolymeraseRNAphụthuộc Chưa biết nsp 10 Helicase Chưa biết nsp 11 Endoribonuclease Chấtđối khángIFN mạnh nsp 12 Chưabiết Chưa biết

P ro te in cấ ut rú c

4 ORF2b GP2b Protein vỏ nhỏ Chưa biết

5 ORF3 GP3 Protein vỏ nhỏ Epitop trunghòanhỏ

8 ORF5 GP5 Proteinvỏc hí nh, tương tácvới sialoadhesin Epitoptrunghòa chính

8 ORF6 Mprotein Proteinvỏc hí nh, tương tácvới heparansulfate

9 ORF7 Nprotein Nucleocapside Epitop khôngtrunghòa

ĐadạngditruyềnhệgenvirusPRRS

Virus PRRS có hai genotype với sự tương đồng về nucleotide là 60%, tuynhiên cáctính chất vềsinh họccủavirus PRRS thuộc haigenotypelại rấtg i ố n g nhau(Kimetal.,2008).Sự tư ơn g đồngvền ucl eo ti de giữacácchủng phânlậpởMỹv à v ù n g L e l y s t a d c ủ a H à L a n c h ỉ l à 4 5 , 7 % t r o n g O R F 1 b ,

Cácg e n t h u ộ c k h u n g đ ọ c O R F 6 v à O R F 7 l à t ư ơ n g đ ố i b ả o t h ủ g i ữ a c á c chủng phân lập ở Mỹ hoặcgiữac á c c h ủ n g p h â n l ậ p ở C h â u Â u , t u y n h i ê n c ó s ự bếnđổiditruyềnkhá m ạ n h trongcácgenthuộckhungđọcORF6vàORF7giư ̃a các chủng phân lập ở Châu Âu và Mỹ Sự khác biệt giữa các chủng ở Mỹ chỉ là2,5%-7,9%, trong khi đó sự khác biệt giữa cácc h ủ n g ở M ỹ v à v ù n g L e l y s t a d l à 35% (Kapuretal.,1996).

Trình tự ORF1 cũng có sự sai khác rất lớn giữa các chủng phân lập ở ChâuÂu và Mỹ, sự tương đồng chỉ đạt 55% (Allendeet al., 1999; Nelsenet al., 1999).ORF1b có tính bảo thủ cao hơn ORF1a và độ tương đồng về nucleotide đạt 63,4%.Sự biến đổi nhiều nhất được tìm thấy trong vùng NSP2 của hệ gen virus Độ tươngđồng về axit amin chỉ đạt 47% giữa các mẫu phân lập ở Châu Âu và Mỹ Sự đa hìnhgenlớnnhấtđượctìmthấytrongvùngNSP2củavirusLV.Kháiniệmvềnhómviruscó liên quan với nhau được hình thành bởi một hoặc nhiều đột biến giống nhau(quasispecies)khivirusđồngnhiễmởđộngvậtđãđượcGoldbergvàcôngsự(2003)đề xuất khi phân tích trình tự các chủng virus PRRS khác nhau nhiễm trùng lây langiữacácloài.ĐãcócácbằngchứngvềsựxuấthiệncácquầnthểphụcủavirusPRRSbiến đổi về mặt di truyền các chủng phân lập từ cơ quan sinh sản của lợn sau khi cótiếnhóakiểuquasispecies(quasispeciesevolution) (Rowlandetal.,1999).Điềuquantrọnglàviệcxuấthiện cácquầnthểphụcủavirusPRRSbiếnđổivềmặtditruyềnsẽgây khó khăn cho việc tiêm chủng phòng PRRS do vaccine sẽ không còn hiệu lựchoặc giảm hiệu lực chống lại các chủng virus PRRS biến đổi di truyền (Domingoetal.,1998;Duarteetal.,1994;DomingoandHolland,1992).

Cácproteinkhángnguyên quantrọngcủavirusPRRS

Hiểu biết về vai trò của protein trong sự sao chép của virus và sự gây bệnhcòn chưa đầy đủ Vai trò của protein N, M,G P 5 r ấ t q u a n t r ọ n g v ớ i s ự h ì n h t h à n h các hạt virus, nhưng các protein phụ cũng cần thiết cho sự lây nhiễm của virus(Wissinketal.,2004).

CácphântửglycoproteinnhỏGP2,GP3,GP4vàproteinEtươngtácvớinhauđể tạo thành một cấu trúc heterotetrameric phức hợp trong các tế bào bị nhiễm. Việchìnhthànhphứchợpnàylàcầnthiếttrongviệctruyềnnhiễmcủavirion(Das,2011).

Glycoprotein5(GP5),proteinmàng(M)vànucleoprotein(N)đượcmãhóabởi cácORFs5-

7,làcácthànhphầnchínhcủahạtvirus(Deaetal.,2000).ProteinNtươngtácvớihệgenvirusđểhìnht hànhnucleocapsid.M6tươngtácvớiGP5đểhìnhthànhheterodimercầnthiếtchoviệclắpráphạtvirus.H ạtvirussẽkhônggiảiphóngranếuthiếuproteinMhoặcGP5(Mardassietal.,1996;Wissinketal.,2005).

Protein M (membrane protein) có khối lượng phân tử khoảng 18-19 kDa,không được glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và cótính bảo tồn cao nhất với mức độ tương đồng axit amin giữa hai nhóm châu Âu vàBắc Mỹ đạt đến 78%-81% (Mardassi, 1995).P r o t e i n M c ó c ấ u t r ú c t ư ơ n g t ự n h ư cấu trúc protein M của các virus thuộc nhóm Coronavirus Protein M hình thành cầunối disunfit với GP5 cấu thành một phần virus và được tìm thấy trong tế bào nhiễmnhưng cầu nối sunfit này không cấu thành hạt virus (Meulenberg, 1997) Mặc dùchức năng của nó được biết rất ít nhưng nóđ ư ợ c x e m n h ư c ó v a i t r ò t r o n g s ự k ế t hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 đểkếthợpvớithụthểtrêntếbàođích.

Protein N là một protein nhỏ, có khối lượng phân tử khoảng 14-15 kDa, đâylà protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên và tính kiềm cao, điều này có thể giúpnó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA Protein N hiện diện ở mức độ cao trongnhữngtếbàobịnhiễmvirusPRRSvàchiếmtừ20%-

GlycoproteinGP5làvỏbọckếthợpglycogen,đâylàproteinbiếnđổinhấtcủavirus PRRS, mức độ tương đồng axit amin giữa hai nhóm châu Âu và Bắc Mỹ chỉkhoảng50-55% (Mardassietal.,1995;Mengetal.,1995b).KhángnguyênGP5kíchthích tạo đáp ứng kháng thể trung hòa chính vì thế do áp lực chọn lọc bởi kháng thểtồn lưu, kháng nguyên bắt buộc phải thay đổi để virus có thể thoát khỏi sự trung hòacủa kháng thể tồn lưu Các kháng thể trung hòa chủ yếu liên kết trực tiếp với cácepitope có trên bề mặt của protein GP5 để trung hòa virus Những epitope trung hòanày nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá Có ba vị trí epitope kích thích tế bàolymphoBđãđượcxácđịnh,mộtepitopetrunghòachínhnằmởgiữacủaectodomainGP5 (aa 36-52),một epitope không trung hòa (epitope A) và một epitope trung hòa(epitopeB)trongectodomaincủaproteinGP5(Ostrowski,2002).

(Nguồn:http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-VirusPRRS-structure.asp)

Sau khibịnhiễmvirusPRRS,lợncóđápứngmiễndịchngay,tuynhiênsựsảnsinhkhángthểcónhữngđặc điểmkhácthườngởcảmiễndịchdịchthểvàmiễndịchtếbào.Sựxuấthiệnkhángthểnàysớmhaymuộnc óbiếnđộngkhácnhauởtừngcáthểlợnvàcảtheotuổilợncũngnhưsựtồntạikhángthểnàykéodàicũn grấtkhácnhau.

Bảng 1.4 Phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS qua cácphươngpháp xétnghiệm

Ngày phát hiện đượcsaunhiễm virus

Ngày cuối phát hiệnđượcsaunhiễmvir us

Nghiên cứuvề đáp ứng miễn dịch dịch thểở lợn kháng lạivirusP R R S đ ã cho thấy lợn xuất hiện kháng thể trực tiếp kháng lại protein N sớm nhất, tiếp theo làkháng thể kháng protein M rồi đến kháng thể kháng glycoprotein GP5 Hầu hết cáctest chẩn đoán phát hiện các kháng thể kháng lại các protein N của virus khoảng sau1 tuần nhiễm bệnh và tồn tại nhiều tháng nhưng hầu như không có tác động đến sựbảo vệ cho lợn khỏi bị bệnh Các kháng thể đặc hiệu sinh ra ở giai đoạn đầu nàykhôngtrunghòađượcv i r u s PRRSinvitrocũngnhưkhithínghiệminvivodù ng kháng thể này tiêm cho lợn gây miễn dịch thụ động, lợn vẫn không được bảo hộ khicôngcườngđộc(Lopezet al.,2004).

Sự xuất hiện sớm các kháng thể đặc hiệu không trung hòa, có ảnh hưởng lớnđến sự phát triển PRRS Các kháng thể không trung hòa này vô tình tạo điều kiệncho virus PRRS tăng cường sinh sản trong đại thực bào Hiện tượng này miễn dịchhọcgọilà"Sựtăngcườngbệnhphụthuộcvàokhángthể"(ADE:Antibody-Dependent

Enhancement), nên đáp ứng kháng thể này lại trở thành có hại cho vậtchủ Đáp ứng dịch thể không trung hòa củav i r u s P R R S đ ã c h e b ọ c c h o v i r u s v à thúc đẩy sự tiếp thu phân tử virus vào trong đại thực bào (Mateuet al.,2008) Đó làmột chiến lược virus dùng để xâm nhập gây bệnh Vì vậy các test chẩn đoán pháthiện kháng thể đặc hiệu trong máu không liên quan đến kháng thể bảo vệ, nó khôngphảilàkhángthể trunghòavirus.

Sự tương quan khác thường của virus PRRS với các phản ứng miễn dịch củalợn theo thời gian Ở giai đoạn nhiễm đầu, khi có virus huyết lợn sản sinh kháng thểđặc hiệu không trung hòa, virus và các kháng thể này song song tồn tại cho đến 4tuần sau nhiễm các tế bào sản sinh IFN-và kháng thể trung hòa virus mới pháttriển Những kháng thể trung hòa này chủ yếu chống lại protein GP5 nơi bao gồmchủ yếu các epitope trung hòa (Leiet al.,2014) Đáp ứng miễn dịch chống GP5 yếuvà chậm là do mức N-glycosyl hóa bao quanh epitope trung hòa, một hiện tượng gọilàràochắnN-glycan.Hơnnữaepitopetạivịtríaxitamin27-30trênGP5củavirus

PRRS type 2 không bị tác động trung hòa mà ngược lại, có chức năng làm giảm đápứng miễn dịch dịch thể, dẫn đến việc làm chậm sản sinh kháng thể trung hòa chốngvirus PRRS Sự xuất hiện sớm các kháng thể không phải trung hòa có vai trò lớntrong sự tiến triển của hội chứng Cụ thể nó thúc đẩy sự nhân lên của virus trong đạithực bào ở phế nang thông qua các yếu tố bám dính (Duanet al.,1998) giữa virusPRRS và đạithực bàohay cònđược gọi làsự tăng cườngy ế u t ố p h ụ t h u ộ c k h á n g thể( Y o o ne t a l , 1 9 9 7 ) N g ư ờ i t a n h ậ n t h ấ y đ á p ứ n g m i ễ n d ị c h c ủ a l ợ n đ ố i v ớ i PRRS có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của dịch tả lợn Ở những lợnmắc PRRS, virus sẽ làm giảm khả năng đáp ứng miễn dịch đối với việc tiêm phòngvaccinedịchtảlợn(LýThịLiênKhaivàcs.,2012).

Virus PRRS có vỏ bọcngoài, sựsốngsót của virus bênn g o à i v ậ t c h ủ c h ị u tác động của nhiệt độ, pH và sự tiếp xúc với các chất sát trùng Các chất sát trùngthông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệt virus Ánh sáng mặt trời vàtiatử ngoạivôhoạtvirus nhanhchóng.

20 o C,20phútở56 o C,24giờở30 o Cvà6ngàyở21 o C.TuynhiênkhảnăngsốngcủavirusPRRSgiảmn hanhkhinhiệtđộtănglên.

Ngoài ra virus cũng bị vô hoạt bởi các điều kiện bất lợi của môi trường ngoàinhưánhsángmặttrời,tiatửngoại.

Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus như: Đại thực bào phếnang lợn Porcine Alveolar Macrophage (PAM), dòng tế bào CL 2621, tế bào MA104,tếbàoMarc145.

PAMlàmôitrườngtốtnhấtchophânlậpvirusvìnócóđộnhạycaonhất,viruscó thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virus PRRS lưuhànhtrênthếgiới.NhượcđiểmcủaPAMlàphảichuẩnbịmôitrườngtừnhữngconlợnkhỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lên của tế bào là có giớihạndođókhôngthểlưugiữvirustrongthờigianlâudài(Kimetal.,1993).

SứcđềkhángcủavirusPRRS

Virus PRRS có vỏ bọcngoài, sựsốngsót của virus bênn g o à i v ậ t c h ủ c h ị u tác động của nhiệt độ, pH và sự tiếp xúc với các chất sát trùng Các chất sát trùngthông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệt virus Ánh sáng mặt trời vàtiatử ngoạivôhoạtvirus nhanhchóng.

20 o C,20phútở56 o C,24giờở30 o Cvà6ngàyở21 o C.TuynhiênkhảnăngsốngcủavirusPRRSgiảmn hanhkhinhiệtđộtănglên.

Ngoài ra virus cũng bị vô hoạt bởi các điều kiện bất lợi của môi trường ngoàinhưánhsángmặttrời,tiatửngoại.

ĐặcđiểmnuôicấyvirusPRRS

Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus như: Đại thực bào phếnang lợn Porcine Alveolar Macrophage (PAM), dòng tế bào CL 2621, tế bào MA104,tếbàoMarc145.

PAMlàmôitrườngtốtnhấtchophânlậpvirusvìnócóđộnhạycaonhất,viruscó thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virus PRRS lưuhànhtrênthếgiới.NhượcđiểmcủaPAMlàphảichuẩnbịmôitrườngtừnhữngconlợnkhỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lên của tế bào là có giớihạndođókhôngthểlưugiữvirustrongthờigianlâudài(Kimetal.,1993).

Với các dòng tế bào như: MA-104, Marc 145, CL-2621 hiện đang được sửdụngnhiềuhơnvàkhắc phụcđượcnhượcđiểmcủatếbàoPAM.Trongđó Marc

145 có thể phân lập được 11 dòng virus của cả 2 chủng Châu Âu và Bắc Mỹ, hơnnữa thời gian và mức độ gây bệnh tích tế bào, số lượng virus thu được sau khi phânlập đều đảm bảo yêu cầu nên dòng tế bào này đang được ứng dụng nhiều cho chẩnđoánvànghiêncứu.

Hiện nay, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đang dùng loại tế bào Marc145 để phân lập virus PRRS, sau 12, 24, 36, 72 giờ nuôi cấy, quan sát các CPE(Cytopathic effect hay cytopathogenic effect) để đánh giá sự nhân lên của virus, đãcócôngbốvềnhữngnghiêncứutácđộngcủavirusPRRSlên tếbàoMarc145.

Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đường nội bào (endocytosis) qua trunggianreceptor.Ngườitađãxácđịnhheparansulfatelàthụthểcủađạithựcbàophếnangđối với virus và trên Marc 145 là vimentin Vimentin là một yếu tố quan trọng trongviệclàmổnđịnhcấutrúccủatếbàochấttrongnhiềuloạitếbàokhácnhau.

Những thay đổi có tính thoái hoá do apoptosis gây ra trong tế bào bao gồmnhân tế bào cô đặc lại, vỡ ra, không bào bị thoái hoá, tế bào chất cô đặc, nhiễm sắcthểbịđứtratừngmảnh.

Quá trình nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc 145, hiệu giávirus có thể đạt tối đa 108,5TCID 50 /0,1ml sau 48-72 giờ nuôi cấy Hiệu giá virus đạtđỉnhcaolúc24-48giờvàcóthểduytrìtới60-70giờsaunuôicấy(Kimetal.,1993).

NghiêncứutạovaccinePRRS

Kháiniệm

Tác dụng của phòng bệnh bằng vaccine làs a u t i ê m p h ò n g l ợ n v ẫ n k h ỏ e mạnh, phát triển bình thường Trong một số trường hợp, sau khi tiêm phòng vẫn bịnhiễm virus PRRS thì biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể, vi thể đều nhẹ hơn,thời gian bài thải virus cũng ngắn hơn rất nhiều so với lợn không được tiêm vaccine(TôLong Thànhvàcs.,2014).

Vaccine là một trong những công cụ can thiệp phòng và dập dịch bệnh hữuhiệunhất, việc giámsátvi ru s PRRSt rê n cơ sở thông tinditruyền,đặc điểmc ấu trúc kháng nguyên, nguồn gốc chủng giữa chủng làm vaccine và chủng virus đanglưu hành là yếu tố quyết định đảm bảo sự thành công của giải pháp can thiệp bằngvaccine(ĐỗHữuDũng,2015).

Từ khi hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được xác định, vaccineđầu tiên được nghiên cứu và đưa vào sử dụng rộng rãi ở châu Âu từ 1993 và châuMỹ năm

P R R S , h à n g loạt thế hệ vaccine PRRS ra đời và thương mại hóa rộng rãi Tuy nhiên, tùy theochiến lược của mỗi quốc gia, trình độ phát triển công nghệ và điều kiện cụ thể đểquyết định dạng vaccine PRRS thiết kế và sử dụng loại vaccine phù hợp với tìnhhình thực tế Hiện tại các loại vaccine PRRS theo công nghệ đã được sản xuất và sửdụnggồm3nhómchính:

PRRS vôh o ạ t đ ư ợ c s ả n x u ấ t b ằ n g c á c h n u ô i c ấ y t á c n h â n v i r u s PRRS,sauđóbấthoạtvirusbằngnhiệthoặchóachấthoặcchỉ táchlấymộtphần cầnthiếttừtácnhânvirusPRRS. Đặc tính an toàn của vaccine PRRS vô hoạt: Vaccine vô hoạt không gây raphản ứng không mong muốn hoặc ảnh hưởng bất lợi đối với sức khỏe của đàn lợnđượctiêmphòng.VaccinevôhoạtPRRSđược xemlàcóđặctínhantoàncao. Đặc tính sinh miễn dịch của vaccine PRRS vô hoạt: Nhược điểm của vaccinePRRS vô hoạt là chỉ tạo mức kháng thể dịch thể không cao đặc biệt là kháng thểtrung hòa rất kém và dường như không có Tuy nhiên, vaccine PRRS vô hoạt có tácdụng kích thích cơ thể lợn tăng cường sản sinh kháng thể đồng thời tăng miễn dịchtế bào kháng virus, ở đàn lợn đã nhiễm virus PRRS chúng làm tăng sinh tế bàolympho và thải tiết chất kháng virus Interferon gamma Tác dụng này có thể lượnghóa được từ sau 2 tuần tiêm vaccine (Bassaganya-Rieraet al.,2004; Piraset al.,2005; Kimet al.,2011) Trong một số trường hợp, vaccine vô hoạt hoàn toàn khôngcóhiệulực hoặc hiệulực rấtthấp,vaccinevôhoạtkhông giảmđượcvirushuyết.

Vaccine vô hoạt có khả năng tạo kháng thể trung hòa, nhưng không bảo vệđược lợn khỏi sự nhiễm trùng virus PRRS khi công cường độc với chủng độc lực(Zuckermannet al.,2007).

Vaccinevôhoạtkhôngcókhảnăngbảovệchéolợnchốnglạinhiễmtrùng của virus PRRS trong thai Bằng chứng là từ các dấu hiệu lâm sàng, mất khả năngsinh sản, virus huyết và nhiễm trùng qua đường nhau thai ở đàn lợn con Vaccine vôhoạtcũngkhôngcókhảnăngbảovệlợn náivàlợnđựcgiống(Scorttiet al.,2007).

Mộtvàiloạivaccinevôhoạtđangđượclưuhành,nhưProgressis®củaMerial,Ingelvac®- PRRSKVcủaBoehringerIngelheim,hoặclàSuipravac®-PRRScủaHipra.

CácđịnhhướngnghiêncứuvaccinePRRSthếhệmớitrênnguyênlýcôngnghệgen hiện đang tập trung vào mục tiêu nâng cao tính sinh miễn dịch, bảo hộ phổ rộngnhằm tạo “vaccine lý tưởng”, theo đó việc sử dụng đa chủng vaccine và bổ trợ nângcao đáp ứng miễn dịch được ưu tiên Một loạt các công trình nghiên cứu tạo vaccinethếhệmớithaythếchoconđườngvaccinekinhđiểnnhư:vaccineDNA,vaccinetiểuphần,vacci nesinhtổnghợppeptide;cácvaccinesửdụngvectormangvirus,vikhuẩnvàthựcvật.Tuynhiên,trênthự ctếhiệuquảphòngPRRScủavaccinethếhệmớichưađạthiệuquảrõràngnênchưasửdụngphổbiếnđ ểphòngPRRS.

Tínhsinh miễndịch Khảnăng bảo hộ

Kháng thể CMI Chủng tươngđồn g

Vaccinedướiđơn vị GP5 Yếu Yếu - ND

(Nguồn:WasinCharerntantanakul,2012) Chúthích:(+):có;(-):Không;ND:Không xácđịnh;CMI: Miễndịchquatrunggiantếbào

Một hướng phát triển vaccine phòng bệnh tại cửa vào phổi, âm hộ là vaccineniêm mạc Đối với virus PRRS, sử dụng vaccine tái tổ hợpmangG P 5 , p r o t e i n N gắn với giải độc tố phẩy khuẩn tả là một vaccine niêm mạc Tuy nhiên,bằng đườngtiêm bắp, vaccine này không bảo hộ lợn, gây triệu chứng phổi và không làm giảmvirushuyết(Hylandetal.,2004).

Protein tái tổ hợp GP5-ELP của virus PRRS được tổng hợp trong mô lá câythuốc lá có khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột thínghiệm gợi mở hướng nghiên cứu phát triển vaccine tiểu đơn vị từ thực vật phòngchốngvirusPRRS ởViệtNam(NguyễnThịMinhHằngvàcs.,2018).

Vaccine nhược độc tái tổ hợp với virus Giả dại (chủng Bartha) làm vector đểbiểu hiện protein GP 5 vỏ của virus PRRS đã chế tạo được nhưng vaccine không tạođược kháng thể trung hòa, chỉ làm giảm triệu chứng lâm sàng, giảm được thời gianvirusmáukhicôngcườngđộc virusPRRS.

Vaccine dùng vi khuẩn lao (Mycobacterium tubercelosis) chủng BCG tái tổhợpbiểuhiệnGP 5và proteinMcủavirusPRRSkhitiêmcholợnvàcôngcườngđộc cũngchỉtácdụngbảovệđược mộtphầnnhưcácvaccinetrên.

Các tác giả cũng đã thử nghiệm chế tạo vaccine niêm mạc, nhằm gây miễndịch niêm mạc để bảo vệ, phòng bệnh ngay ở cửa vào của virus PRRS như ở đườnghô hấp, đường âm đạo, tương tự một số virus khác (poliovirrus, influenza virus, ởngười) Đã dùng GP5và protein N của virus PRRS cho cộng hợp với độc tố cholera(một yếu tố gây miễn dịch niêm mạc mạnh) để chế tạo vaccine cho uống, khi uốngvaccine này đã tăng cường được đáp ứng kháng thể trên bề mặt niêm mạc đườngruột, đường sinh dục; nhưng hiệu quả bảo vệ chưa được đánh giá; vaccine này saukhi tiêm bắp không bảo vệ được lợn (không chống được virus máu và bệnh ở đườnghôhấp) (Charerntantanakul,2012).

Vaccine PRRS nhược độc gồm vaccine nhược độc kinh điển và vaccinenhược độc biến đổi gen Vaccine thương phẩm phòng PRRS đầu tiên là vaccinenhượcđộcđượcsảnxuấttừ chủngBắcMỹVR-2332. Đặc tính sinh miễn dịch của vaccine nhược độc: Các vaccine nhược độc đềukíchthíchlợnsảnsinhmiễndịchtrunggiantếbàovàmiễndịchdịchthểvàokhoảng2 đến 4 tuần sau tiêm vaccine (Darwichet al.,2010) Về miễn dịch, lượng lớn khángthểsinhrakhángproteinN,chúngkhôngcótácdụngtrunghòavirusnhưnglạicótácdụnggiảmtriệ uchứnglâmsàngrõrệt.Khángthểtrunghòathườngchỉxuấthiệnsau4 tuần sau khi tiêm vaccine (Ansariet al.,2006) Đáp ứng miễn dịch tế bào đối vớivaccinePRRSnhượcđộccũngthườngxuấthiện2-4tuầnsautiêmvaccine.

Nghiên cứu sự tương đồng về cấu trúc kháng nguyên giữa các chủng viruslàm vaccine PRRS và các chủng virus lưu hành thực địa là vô cùng quan trọng bởinó quyết định đến hiệu quả bảo hộ của vaccine Nghiên cứu cho thấy vaccine PRRSnhược độc tương đồng cao với chủng gây nhiễm có tác dụng bảo vệ hữu hiệu đànlợn,tuynhiênmộtsốnguycơtừvaccinenhượcđộccũngcầnphảiđềcậpnhưsựbài thải virus vaccine, sự tái tổ hợp giữa chủng thực địa với chủng vaccine hay sựhồiđộclực củacácchủngvaccine (ĐỗTiếnDuyvàcs,2016).

Kimmanet al.,2009 đã giả thiết rằng, tất cả các protein cấu trúc của virusPRRS đều cần thiết cho sự gây bệnh của nó Cho nên định hướng cắt bỏ gen để tạora virus nhược độc, sẽ bị hạn chế bởi virus nhược độc bị thiếu gen (phải bổ sung genđó bằng gen của dòng tế bào dùng nuôi virus) Khi tiêm vaccine chủng nhược độcvào lợn, virus vaccine lại sinh sản trong tế bào không có gen bổ sung, gọi đó làvaccine "1 chu kỳ" Phương pháp này đã làm và tạo ra chủngORF2vàORF4,virus này có gây ra kháng thể trung hòa, làm giảm được số lượng virus công độcnhưngkhônggiảmtriệuchứnglâmsàng,thậm chílạităngcườngsựgâybệnh.

TácgiảNguyễnThịLanvàcộngsựđãnghiêncứuphânlậptừcácchủngvirusthực địa để tạo vaccine nhược độc, theo nhận xét ban đầu vaccine có ưu điểm là ổnđịnhvềđặctínhditruyềngiữacácđờicấytruyền(NguyễnThịLanvàcs.,2016).

Vaccinen h ư ợ c đ ộ c h i ệ n n a y c ó t á c d ụ n g p h ò n g b ệ n h t ố t , đ ồ n g t h ờ i g i ả m thiểu các triệu chứng lâm sàng ở lợn nhưng không ngăn chặn được sự lây truyềnbệnh,h ạ n c h ế l à v i r u s v a c c i n e c ó t h ể c ó n g u y c ơ h ồ i đ ộ c l ự c t r ở l ạ i ( B i ne t a l.,2009;Cruzetetal.,2010).

Đốitượng,vậtliệunghiêncứu

Chủng virus PRRS độc lực 02HY phân lập từ lợn mắc PRRS ổ dịch HưngYên và chủng virus PRRS độc lực 05TB phân lập từ lợn mắc PRRS ổ dịch TháiBình ở Việt Nam năm 2010 do Trung tâm Nghiên cứu và sản xuất sinh phẩm dượcthúy H a n v e t c u n g c ấ p C h ủ n g P R R S c ư ờ n g đ ộ c V N 0 7 1 9 6 V i ệ t N a m s ử d ụ n g nghiên cứu trong kỹ thuật IPMA và thử thách công cường độc do Trung tâm ChẩnđoánThúytrungương,CụcThúycungcấp.

Lợnthínghiệm:Sửdụnglợnkhỏemạnhtừ4-5thángtuổi.Tấtcảlợnsửdụngtrong thí nghiệm đều được kiểm tra xác định âm tính với: Porcine reproductive andrespiratory virus (PRRS), Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),

Transmissiblegastroenteritisvirus(TGEV),Classicalswinefevervirus(CSFV),P o r c i n e circovirustype 2 (PCV2),Porcineparvovirus(PPV).

Tếbàodòng:Marc 145(Sốhiệu CRL12231)củahãngATCC. Địađiểmthựchiệnnghiêncứu

Trung tâm Chẩn đoán Thú y trung ương, Cục Thú y.PhòngVisinhphântử, ViệnCôngnghệsinh học.

Tủ an toàn sinh học Cấp II (Esco), tủ ấm CO2(kính hiển vi soi ngược (Leica),máy PCR (Biorad), máy giải trình tự gen (ABI), máy điện di, máy votex (IKa), máylytâm(Eppendorf),tủ-

Dụng cụ: Pipet (Eppendorf), đầu típ các loại (Corning), bình nuôi cấy tế bàoT25, T75 (Corning), màng lọc (corning), khay 96 (Corning), ống Eppendorf, ống lytâm15ml,50ml(corning),bơmtiêm,găngtay,khẩutrang.

Hóa chất: Môi trường nuôi cấy tế bào, MEM, DMEM (Gibco), tế bào dòngMarc145,KittổnghợpcDNA,DNAmộtsốloạivirus:SuperSciptTMFirst-

PCR,PCR(Invitrogen).Kittáchdònggen:TAcloningKit(Invitrogen) Kit giải trình tự gen: BigDye Terminator v3.1

Kit(AppliedBiosystems).Cáchóachấtdùngtrongnghiêncứusinhhọcphântửcóđộtinhkhiết cao được cung cấp bởi các hãng như Sigma, Merck, Invitrogen, Biosystems:TaqDNA polymerase, Cao nấm men, Trypton, Agar, Amp (Ampicilin), X-gal, EDTA(Ethylendiamintetraaceticacid),SDS(Sodiumdodecylsulphat),Chloroform,Trizol,Aceta t natri, Ethanol, NaCl, Tris-HCl, NaOH, TAE (Tris-Acid acetic-Ethylendiamintetraaceticacid),cácloạihóachấtnuôicấytếbào,cácloạihóachấtdùngchophảnứngm iễndichgắnenzymeIPMA(khángthểgắnenzymeperoxydase,cơchấtAEC…)

Phươngphápnghiêncứu

Phươngphápmổkhám

Mổk h á m l ợ n đ ể x á c đ ị n h đ ư ợ c c á c b i ế n đ ổ i đ ạ i t h ể c ủ a c á c c ơ q u a n , t ổ chức của lợn mắc PRRS, cần tiến hànhmổkhám những lợn cób i ể u h i ệ n t r i ệ u chứngl â m s à n g đ ặ c t r ư n g c ủ a b ệ n h L ợ n đ ư ợ c c ố đ ị n h , m ổ k h á m q u a n s á t c á c bệnh tích đại thể và thu mẫu bệnh phẩm phục vụ nghiên cứu Bệnh phẩm được bảoquản ở -70 o C để phục vụ phân lập virus PRRS Quá trình mổ khám được thực hiệntheo(TCVN8402:2010).

Lấymẫuxétnghiệmkhángnguyên

Bệnhphẩmlàh uyế tt ha nhc ủa lợnng hi m ắc bệ nh đa ng cót ri ệu ch ứ n g sốtc ao Dùng bơm tiêm lấy máu lợn kiểm tra (khoảng 5 ml), đặt nghiêng, yên tĩnh chomáu đông và tránh dung huyết, sau đó thu lấy huyết thanh cho xét nghiệm (1 ml).Tấtc ả m ẫ u s a u k h i l ấ y phả i đ ư ợ c b a o g ó i c ẩ n t h ậ n k h ô n g l à m l ây lan b ệ n h , b ả o quản lạnh ở 2 o C đến 8 o C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm sớm nhất có thể(trong vòng 24h) (kèm theo phiếu bệnh phẩm) Tại phòng thí nghiệm mẫu được bảoquảnở-70 o C(TCVN8400-21:2014).

Lấymẫuxétnghiệmkhángthể

Mẫu lấy xét nghiệm kháng thể là huyết thanh (1ml) của lợn cần kiểm tra:dùng bơm tiêm lấy máu lợn kiểm tra, đặt nghiêng, yên tĩnh cho máu đông và tránhdunghuyết,sauđólấyhuyếtthanhchoxétnghiệm(TCVN8400-21:2014).

Xửlýbệnhphẩm

Mẫubệnhphẩmlàphổi,hạch:Lấy1g,cắtnhỏrồinghiềntrongcốichàysứvô trùng với 10 ml dung dịch PBS (pH 7,4) thành huyễn dịch 10% Chuyển toàn bộhuyễnd ị c h v à o ố n g l y tâm50m l , l y tâm2 0 0 0 v ò n g / p h ú t t r o n g 1 5 p h ú t H ú t l ấ y dịchnướctrongởphíatrênxửlývớikhángsinhpenicillin(200UI/ml)vàStreptomycin (200 àg/ml) hoặc lọc vụ trựng qua màng lọc cú kớch thước lỗ lọc 0,45àm.KiểmtralạiđộvụtrựngtrờnmụitrườngBHI.

Bệnhphẩmlàhuyếtthanh:Lắcbằngmáylắctrộn,rồilyt â m 8 0 0 0 vòng/ phúttrong1phút,sauđóđemtáchchiếtARN(TCVN8400-21:2014).

Phươngpháp làmtiêu bảnvithể

Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trongformol trung tính10%để làm tiêub ả n v i t h ể C ầ n t i ế n h à n h l à m t i ê u b ả n đ ể x á c định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quytrình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin-Eosin (HE) Các bước của quátrìnhlàmtiêubảnvithểnhư sau:

- Đưa mẫuvàohệthống máychuyểnđúcmẫutựđộng. Đúcblock:Đúcmẫu bệnhphẩmtrongparafin.

- Khửparafin:Chotiêubảnquahệthốngxylengồm3lọ:XylenI:6h;XylenII:6h;Xy lenIII:12h.

- Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 100 o : 2 lần(mỗilần1phút).Cồn95 o :1lần;Cồn70 o :1 lần;Cồn50 o :1lần.

Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước Sau đó cho tiêu bảnquahệthốngcồn:Cồn 50 o :1lần;Cồn 70 o : 1lần;Cồn95 o :1lần;Cồn 100 o :2 lần.

Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút, rửa nước Cho tiêu bản qua hai lọ cồn100 0 mỗilọ1phút.

Nhỏm ộ t giọtBau me c a na d a lênl ame n rồi g ắ n nhanh lênti êu bản khivẫn c ònxylentrêntiêubản Kiểmtratiêubảntrênkínhhiểnviquanghọc.

Phươngpháp nuôicấytếbào

Khôi phục tế bào: Tế bào Marc 145 được bảo quản ở -196 o C trước khi tiếnhành nuôi cấy cần khôi phục lại tế bào Chuẩn bị môi trường đầy đủ (MEM, 10%FBSlàmấmtrongtủấm37 o Ctrong30phúttrước khi lấytếbàoranuôicấy).

Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ 25 o C-30 o C trong bể ủ cách thủy trongkhoảng2phút,chovàotubecó10mlmôi trườngđầyđủ(MEM,10%FBS).

Bước 2: Ly tâm loại bỏ nước nổi và giữ lại cặn tế bào, cho môi trường vàođánhtancặntếbào.

Bước3:Chuyểntếbào vàobìnhnuôicấychứa5ml môitrườngđầyđủ.

Bước 4: Đưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào Giữ tế bào ở37oC, 5% CO2hàng ngày theo dõis ự p h á t t r i ể n c ủ a t ế b à o K h i t ế b à o đ ạ t 1 0 0 % diệntíchnuôicấycóthểchuyểnđờisangchainuôikhác.

Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi trong chai 75cm 2 , rửa tế bào bằng20mldungdịchPBS(khôngchứaCa 2+ hoặcMg 2+ ),sauđóhútbỏdungdịchrửa.

EDTA.Ủtrong5đến10phút.Thêm7mlmôitrườngkhôngđầyđủ,trộnđềuchuyểnsangốnglytâm.

Bước3:Loạibỏtrypsin,lytâmloạibỏphầndungdịchvàgiữlạicặnmàutrắng.Bước4:C ânbằ ng môitrường vàđ ếm sốt ế bào,h òat an tế bàotr on g6 ml môitrường đầy đủ.Đếm tếbào, phaloãngtếb à o 1 0 0 l ầ n

( 1 0 à l t ế b à o t r o n g 990àlm ụ i t r ư ờ n g k h ụ n g đ ầ y đủ)d ự n g b u ồ n g đ ế m đ ế m s ố t ế b à o t r ê n k í n h h i ể n vi,tínhsốtếbàotrong1ml.

Bước 6: Nuôi tế bào vàkiểm tra sựphát triển,giữtế bàoở 3 7 oC, 5%CO2hàngngàytheodõisựpháttriểncủatếbào.

Bước 5: Chia ống tếbào, pha loãng tế bàoở 5x10 6 tế bào/ml trongm ô i trườngđ ầ y đủ c ó b ổ s u n g 1 0 % D M S O , c h i a h u y ễ n d ị c h t ế b à o v à o c á c ố n g b ả o quản1ml/ống.

Bước6:Bảoquảntếbào,giữ ốngtếbàotronghộplạnhở-20 o Ctrong2-3giờ,chuyển sang -80 o C khoảng 15 giờ, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng (TCVN8400-21:2014).

PhươngphápnhânvirusPRRS

Tiến hành nhân virus trên tế bào Marc 145 khi tế bào được nuôi cấy trongchai nuôi T25 có độ che phủ đáy bình 60-70% Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ vàrửa tế bào 2 lần bằng PBS 1X Bổ sung 0,5ml virus gốc/T25 Ủ virus và tế bào trong 1 giờ ở

37 o C Sau khi ủ, loại bỏ dịch ủ và bổ sung 5ml môi trường duy trì MEM 2%FBS Nuôi virus trong tủ ấm 37oC, 5% CO2, quan sát biến đổi bệnh tích tế bào Marc145 dưới kính hiển vi soi ngược sau 24 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ Thu virus khibệnhtíchtếbàođạt80% (TCVN8400-21: 2014).

Phươngpháp xácđịnh hiệugiávirus

Tế bào Marc 145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng (2,0×10 5 tế bào/giếng).Virusđượcphaloãngtheocơsố10từ10 -1 -10 -

8rồiđemủtrờnbềmặttếbàomộtlớp của cỏc giếng theo thứ tự đỏnh dấu trước (25àl/giếng), mỗi độ pha loóng gâynhiễmcho8giếngtếbào.Sau1giờủ,dungdịchduytrìMEMcóchứa2%FBS đượcbổsungvào (100àl/giếng)trongsuốtthờigiantheo dừikhụngt h a y m ô i trườngnuôicấy.

CPEđượcquansáthàngngày chođếnngày thứ5sauk h i g â y n h i ễ m , TCID50được xác định theo thường quy phòng thí nghiệm, sử dụng phương phápReedMuench.

- f:là log10củakhoảngcáchgiữa 2nồngđộphaloãngliềugần nhau.

PhươngphápcấytruyềnvirusPRRS

Tiến hành nhân virus trên tế bào Marc 145 khi tế bào được nuôi cấy trongchain u ô i T 2 5 c ó đ ộ c h e p h ủ đ á y bình6 0 -

7 0 % L o ạ i b ỏ m ô i t r ư ờ n g n u ô i c ấ y cũvàr ử a t ế b à o 2 l ầ n b ằ n g P B S 1 X B ổ s u n g 0 , 5 m l v i r u s g ố c / T 2 5 Ủ v i r u s v à t ế bào trong 1h ở 37 o C Sau khi ủ, loại bỏ dịch ủ và bổ sung 5ml môi trường duy trìMEM2 % F B S N u ô i v i r u s t r o n g t ủ ấ m 3 7 oC,5 % C O 2 ,q u a n s á t b i ế n đ ổ i b ệ n h tíchtếbào Marc1 45 dưới kí nh hi ển vi soing ượ c sau2 4giờ,48giờ,6 0giờ, 72 giờ.T h u v i r u s k h i b ệ n h t í c h t ế b à o đ ạ t 8 0 % , đ ô n g t a n v i r u s 3 l ầ n đ ể c ấ y truyềntiế pđờisau(Thường quy phòngthínghiệmTrungtâmn g h i ê n c ứ u s i n h p h ẩ m dượcthúyHanvet).

Phươngpháp xácđịnhquyluậtsinhtrưởngcủavirus

Tế bàoMarc 145được chuẩn bị vào đĩa 6g i ế n g ( 2 × 1 0 5 tếb à o / g i ế n g ) v à đượcnuôi nhưmô tảởtrên.

Virus PRRS được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0,1 (Suradhatet al., 2003).Saum ộ t g i ờ ủ , đ ể v i r u s b á m v à o t ế b à o , h u y ễ n d ị c h c h ứ a v i r u s đ ư ợ c h ú t b ỏ v à môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch một lần với 0,5ml PBS Sau đó, dung dịchnuụidưỡngthiếtyếuđượcbổsungvàomụitrườngnuụicấy100àl/giếng.

Virus được thu từ dịch nổi và phần tế bào ở các thời điểm 24 giờ, 48 giờ,60giờ,72giờ,84giờ,96giờsaugâynhiễm virus.

Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus.Đường biểu diễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log10 của TCID50tại mỗithờiđiểmthu virus.

2.2.11 Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanhphaloãng)

- HỗndịchtếbàoMarc145cómậtđộ5x10 4 tếbào/ mltrongmôitrườngnuôicấytếbàoMEM,2%FBS.

- Nuôitrongtủấm37oC,5%CO 2 từ1-2ngàyđểtếbàopháttriểnthànhmộtlớp.Bước2:

- ThêmvàocácốnghuyếtthanhđãphamộtlượngtươngứnghỗndịchvirusPRRS( chủngcường độcViệtNamVN07196)cóhàmlượngvirus 102TCID50/ml

- Lắcđềuvà ủhỗndịchtrunghòaởđiều kiện37oC,5%CO 2 trong 1giờ

- Thờm100àlhỗndịchtrunghũaởcỏcđộpha loónghuyết thanhvàomỗi giếng,mỗiđộphaloãnggâynhiễmcho 5giếngtếbàoMarc 145.

- Hấpphụtrongđiềukiện37oC,5%CO 2 trong 90phút

- Bổs u n g v à o m ỗ i g i ế n g 1 0 0 à l m ụ i t r ư ờ n g M E M , 2 % F B S N u ụ i t ế b à o trongtủấm37oC,5%CO 2 từ 48-72giờ

- Quansátđĩat ế bàodướikínhhiểnvisoi ngượcđểkiểmtra bệnht í c h tế bào(CPE).

- Phản ứng trung hòa âm tính khi khi ở độ pha loãng huyết thanh thấy xuấthiệnbệnhtích tếbàoMarc145trêngiếng(Viruskhông đượctrunghòa).

- Phản ứng trung hòa dương tính khi ở độ pha loãng huyết thanh mà khôngthấy xuấthiệnbệnhtíchtếbàoMarc145trêngiếng( V i r u s đ ư ợ c t r u n g h ò a )

Từ ARN của virus PRRS được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất(Qiagen) Tiến hành chuẩn bị hỗn hợp phản ứng Realtime RT-PCR theo các thànhphần như sau: Dw (Nước) 4,3àl, 2x Reaction buffer 7,5àl, Primer forward 0,3àl,Primer reverse 0,3àl, Probe 0,3àl, Enzyme mix 0,3àl, RNA mẫu 2àl Tổng thể tớchhỗnhợpphảnứnglà15àl.

Virus Primer/Probe Trìnhtự(5 ’ -3 ’ ) Dye huỳnhquang

Mồingược(FAO) AATCCAGAGGCTCATCCTGGT Đặt hỗn hợp phản ứng vào máy Realtime PCR, chọn dye phù hợp và chạytheochukỳnhiệtnhưsau:50 o C/15phút,95 o C/2phútthựchiện1chukỳvà95 o C /10giây,60 o C/40giâythựchiện40chukỳ. Đọckếtquả:

- Mẫu là âm tính khi mẫu RNA không cho giá trị

Thiếtkế cáccặpmồi khuếchđạitoànbộhệ gencủachủngvirusPRRS02HYvàHanvet1.vnbằngRT -

P CR dựatrên t r ì n h t ự hệ gencủacácchủng v i r u s PRRS genotype Bắc Mỹ lưu hành ở Việt Nam và khu vực với các số đăng ký FJ393456,FJ393457, FJ393458, FJ393459, FJ394029 và chủng vaccine nhược độc RespPRRSsố đăng ký AF066183 Sử dụng phần mềm GenDoc so sánh các trình tự hệ gen toànphần của virus PRRS lưu hành ở Việt

Nam với trình tự hệ gen toàn phần của chủngvirusPRRS02HY.Dựa vàonhữngvùng bảothủtronghệgenđểthiết kế15cặ pmồikhuếchđại15đoạn(mỗiđoạnkhoảng1 kb)toànbộhệgen(Bảng2.1).

Bảng 2.1 Các cặp mồi dùng trong khuếch đại 15 đoạn gen củahệ gen chủngvirusPRRS02HYvàHanvet1.vn

TT Tênmồi Trìnhtự(5’-3’) Độ dài(Nucleoti de)

ARN tổng số được tách chiết từdịch tế bào Marc 145 chứa virus bằngphương pháp Trizol Nồng độ ARN được xác định bằng máy NanoDrop ARN đượcchuyểnsangcADNbằngenzymephiênmãngượcSuperScript TM IIReversetranscriptase (Fermentas) ở nhiệt độ 50 o C trong 30 phút và tiền biến tính ở nhiệt độ94 o Ctrong2phút.Tổnghợp ADN sợi képbằngenzymePlatinumTaqDNApolymerase dựa trên sợi khuôn là cADN Phản ứng PCR được tiến hành để khuếchđại các phân đoạn khác nhau của hệ gen virus PRRS với mỗi cặp mồi tương ứng vàchu kỳ nhiệt thích hợp là 94 o C/3 phút (94 o C /15 giây, 50 o C /50 giây, 72 o C /1 phút 30giây),lặplại30chukỳnhưtrên,72 o C/8phút,4 o C-.

Sản phẩm PCR được tạo dòng bằng cách gắn trực tiếp vàovectơ tách dòngpCR2.1 với việc sử dụng bộ TA cloning Kit của hãng Invitrogen theo hướng dẫncủa nhà sản xuất Sau đó, sản phẩm gắn được biến nạp vào tế bàoE colichủngTop10F ‘ bằng phương pháp sốc nhiệt Plasmid chứa các phân đoạn gen được tách chiếttừ các khuẩn lạc trắng và kiểm tra các đoạn gen chèn bằng cắt với enzyme hạn chếEcoRI Tinh sạch plasmid tái tổ hợp để phục vụ cho việc giải trình tự gen được thựchiện bằng bộ KIT S.N.A.PMiniprep Kit của hãng Fermentase Phản ứng xác địnhtrình tự được thực hiện nhờ bộ kit BigDye™Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitcủa hãng Applied Biosystems, sử dụng hai mồi xuôi và ngược M13F vàM13R Xácđịnh trình tự tự động trên hệ thống ABI 3100, phân tích trình tự bằng phần mềmBioEditvàDNAStar.

Trình tự nucleotide và protein vùng ORF5 mã hóa kháng nguyên GP5 củavirus PRRS 02HY cường độc và Hanvet1.vn nhược độc, các chủng virus PRRS lưuhành ở các tỉnh thànhtrong nước và khu vực được thu nhận từNgân Hàng genNCBI( đ ư ợ c t h ố n g k ê t r o n g b ả n g p h ầ n P h ụ l ụ c ) T r ì n h t ự n u c l e o t i d e v à p r o t e i n được so sánh bằng chương trình phần mềm BioEdit sau đó xây dựng cây phả hệbằngphầnmềmMEGA6sửdụngthuậttoánNeighbor-Joining.

Chuẩn bị bản gel bằng dung dịch đệm TAE 1X hòa tan với 1,5 gam agaroseđặt trong lò vi sóng ở 100 o C trong 5 phút, đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn đểtạo bản gel có các giếng tra mẫu Khi bản gel đã đông đặt bản gel vào bể điện di vàđổdungdịch đệmTAEngậpbảngelkhoảng3- 5mm.

Thêm 2l loading dye vào 8l sản phẩm RT-PCR, trộn đều hỗn dịch bằngpipetv à c h u y ể n v à o c á c g i ế n g t r o n g b ả n g e l Đ i ệ n d i đ ồ n g t h ờ i c ả t h a n g c h u ẩ n ADN(marker),thườngsử dụng4-6lADNmarker.

Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA,thờigianchạyđiệnditrong30phút.

Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide trong khoảng5 đến 7 phút Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sátkếtquảđiệndi Vịtrícác đoạnADNđượcpháthiện bằngnhững vệtsángtươn gứngcủathuốcnhuộm,chụpảnhvàlưukếtquả.

- Dung dịch C: Dung dịch pha loãng mẫu, gồm PBS với 1% Tween 80 và 5%sữagầy.

- DungdịchE : D u n g dị chA EC , g ồm 1m ld un gd ịc h AEC n g u y ê n c h ấ t v à 14mldungdịchđệmaxetat0,1M(pH5,2)sauđúthờm15àlH 2 O230%.

Bước1:Chuẩnbịt ế bàoMarc 14 5m ột lớpt r ê n đĩa96 giếngvớin ồ n g độ5x10 4 tế bào/ml.

Bước2:Nhiễmvirus PRRSchuẩnvớiliều500TCID50/ml,100àl/ giếng.Ủđĩatừ 1-2ngàytrongtủấm37oC,5%CO2.

+ Đổ bỏ dung dịch A, rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch

Bước5 : G ắ n k h á n g k h á n g t h ể P R R S c ó g ắ n e n z y m e ( c o n j u g a t e + pero xidase)(khángthểnàyđược chếtrênthỏ)

+ Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch

+ Nếu quan sát thấy thảm tế bào trong giếng có những đám tế bào bắt màu đỏđậmthìmẫuhuyếtthanhchovàogiếngđó dươngtínhvớikháng thểPRRS.

+ Nếu quan sát thấy toàn bộ thảm tếbào trong giếng cóm à u h ồ n g n h ạ t l à màu của môi trường MEM thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó âm tính với khángthểPRRS(TCVN8400-21:2014).

Sử dụng buồng đếm Newbauer cải tiến, chuẩn bị buồng đếm tế bào. Hỳt100àlhuyễndịchtếbàotrộnđềuvới100àlthuốcnhuộmtếbàoTrepanbluenh ỏvàob u ồ n g đ ế m Đ ế m t ổ n g s ố t ế b à o ở 4 g ó c v à t í n h s ố l ư ợ n g t ế b à o t r o n g 1 m l h uyễndịch.Côngthức:[Tổngsốtếbàođếmđượcở4góc/4]*2*10 4

+ Kiểm tra vô trùng (TCVN 8684-

Tiến hành cấy mẫu giống gốc Hanvet1.vn trên 2 ống môi trường kiểm tra sauđây: Môi trường Thioglycollat, môi trường Trypticaza đậu tương, 2 đĩa môi trườngThạchmáu,lượngmẫucấytừ1%đến2% (phầnthểtích)sovớimôitrườngkiểmtra. Ủmôitrườngđãcấytrongtủ37 o C,theodõitừ7ngàyđến10ngày.

Mẫu giống gốc đạt tiêu chuẩn khi không có vi sinh vật mọc trên môi trườngkiểmtratrongthờigiantheodõi.

Mẫu giống gốc Hanvet1.vn được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud.Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20 o C đến 25 o C) Mẫu đạt tiêu chuẩn khikhôngcónấmmốctrênmôitrườngkiểmtratrongthời giantheodõi.

Sử dụng kỹ thuật PCR/RT PCR phát hiện các loại virus Porcine epidemicdiarrhea virus (PEDV), Transmissible gastroenteritis virus (TGEV), Classical swinefevervirus(CSFV), Porcine circovirus type 2 (PCV2), Porcineparvoviru s (PPV), sau đó điện di sản phẩm để kiểm tra so sánh với đối chứng dương chuẩn, đối chứngâmvàmarkerDNA/cDNAđểxácđịnhkếtquả.

Tiêm bắp sau vành tai cho 04 lợn 5 tuần tuổi với liều 106TCID50giống gốcHanvet1.vn nhược độc, sau 7 ngày lấy máu 04 lợn, mỗi con 1ml tiêm truyền tiếpsang 04 lợn khác Quá trình tiếp truyền được tiến hành lặp lại liên tục 5 đời lợn (đời01 đến đời 05) Theo dõi lợn trong suốt quá trình thí nghiệm, nếu tất cả lợn sốngkhỏe mạnh, không có bất cứ phản ứng cục bộ hay toàn thân nào (lợn có thể có phảnứngsốtnhẹ,tăng0,5 o C)thìgiốnggốcvaccineđạtchỉtiêuan toàn.

Lợn con 4 tuần tuổi, đồng đều về giống, tình trạng sức khoẻ, điều kiện chănnuôi và vệ sinh thú y Phân chia ngẫu nhiên số lợn trên vào các nhóm, sử dụngvaccine Hanvet1.vn được chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn nhược độc cho các nhómvới liều tiêm bắp như nhau Theo dõi và xác định hiệu giá kháng thể sau khi tiêmvaccine.Đ á n h g i á s ự h ì n h thànhđ á p ứngm i ễ n dịchv à đ ộ d à i m i ễ n dị ch sa u k h i tiêmvaccinebằnglấymáulợntạicácthờiđiểmsautiêmvaccine1,2,3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12 tuần để xác định hiệu giá kháng thể bằng IPMA và lấy máu lợn tạicác thời điểm sau tiêm vaccine 2, 3, 4, 5, 6 tháng để xác định hiệu giá kháng thểtrung hòa Đểđánhgiá khả năng bảo hộcủa vaccinevới chủngvirus cườngđ ộ c , tiêm vaccine cho 12 lợn 4 tuần tuổi có huyết thanh âm tính với kháng thể PRRS Sautiêm 28 ngày, lấy máu 12 lợn được miễn dịch (lô thí nghiệm) và 4 lợn không tiêmvaccine(lôđ ố i chứng)đ ể k iể m trah i ệ u giákháng thểbằ ng phảnứng I P M A vàp h ả n ứng trung hòa trên tế bào Sau đó lợn thí nghiệm và đối chứng được thử thách vớichủng virus PRRS cường độc VN07196 Việt Nam với liều 106TCID50 Sau khi côngcường độc, theo dõi các biểu hiện lâm sàng, thân nhiệt, khả năng tăng trọng, đồngthời lấy máu lợn ở các thời điểm 3, 5, 7, 10, 14, 21 ngày sau khi công cường độc đểphânlập,xácđịnh virushuyếtvàmổkhámxácđịnhbệnhtích(Yuet al,.2015).

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).Xác định sự tương đồng về nucleotide của phânđoạn gen thu được trong nghiêncứu bằngphầnmềm Bioeditversion 7.2.5.X á c định nguồngốc phát sinh chủng loại trên cơsở trình tựg e n c ủ a c h ủ n g v i r u s t h u nhận được bằng phần mềm MEGA version 6.0 Các số liệu được xử lý trên phầnmềmExcel2010,sửdụngphương phápthốngkêsinhhọc,Minitab 16.

PhươngphápRealtimeRT-PCR

Từ ARN của virus PRRS được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất(Qiagen) Tiến hành chuẩn bị hỗn hợp phản ứng Realtime RT-PCR theo các thànhphần như sau: Dw (Nước) 4,3àl, 2x Reaction buffer 7,5àl, Primer forward 0,3àl,Primer reverse 0,3àl, Probe 0,3àl, Enzyme mix 0,3àl, RNA mẫu 2àl Tổng thể tớchhỗnhợpphảnứnglà15àl.

Virus Primer/Probe Trìnhtự(5 ’ -3 ’ ) Dye huỳnhquang

Mồingược(FAO) AATCCAGAGGCTCATCCTGGT Đặt hỗn hợp phản ứng vào máy Realtime PCR, chọn dye phù hợp và chạytheochukỳnhiệtnhưsau:50 o C/15phút,95 o C/2phútthựchiện1chukỳvà95 o C /10giây,60 o C/40giâythựchiện40chukỳ. Đọckếtquả:

- Mẫu là âm tính khi mẫu RNA không cho giá trị

Phươngphápthiếtkếmồi

Thiếtkế cáccặpmồi khuếchđạitoànbộhệ gencủachủngvirusPRRS02HYvàHanvet1.vnbằngRT -

P CR dựatrên t r ì n h t ự hệ gencủacácchủng v i r u s PRRS genotype Bắc Mỹ lưu hành ở Việt Nam và khu vực với các số đăng ký FJ393456,FJ393457, FJ393458, FJ393459, FJ394029 và chủng vaccine nhược độc RespPRRSsố đăng ký AF066183 Sử dụng phần mềm GenDoc so sánh các trình tự hệ gen toànphần của virus PRRS lưu hành ở Việt

Nam với trình tự hệ gen toàn phần của chủngvirusPRRS02HY.Dựa vàonhữngvùng bảothủtronghệgenđểthiết kế15cặ pmồikhuếchđại15đoạn(mỗiđoạnkhoảng1 kb)toànbộhệgen(Bảng2.1).

Bảng 2.1 Các cặp mồi dùng trong khuếch đại 15 đoạn gen củahệ gen chủngvirusPRRS02HYvàHanvet1.vn

TT Tênmồi Trìnhtự(5’-3’) Độ dài(Nucleoti de)

Phươngpháp RT-PCR

ARN tổng số được tách chiết từdịch tế bào Marc 145 chứa virus bằngphương pháp Trizol Nồng độ ARN được xác định bằng máy NanoDrop ARN đượcchuyểnsangcADNbằngenzymephiênmãngượcSuperScript TM IIReversetranscriptase(Fermentas) ở nhiệt độ 50 o C trong 30 phút và tiền biến tính ở nhiệt độ94 o Ctrong2phút.Tổnghợp ADN sợi képbằngenzymePlatinumTaqDNApolymerase dựa trên sợi khuôn là cADN Phản ứng PCR được tiến hành để khuếchđại các phân đoạn khác nhau của hệ gen virus PRRS với mỗi cặp mồi tương ứng vàchu kỳ nhiệt thích hợp là 94 o C/3 phút (94 o C /15 giây, 50 o C /50 giây, 72 o C /1 phút30giây),lặplại30chukỳnhưtrên,72 o C/8phút,4 o C-.

Phươngpháptáchdòngvàgiảitrìnhtựgen

Sản phẩm PCR được tạo dòng bằng cách gắn trực tiếp vàovectơ tách dòngpCR2.1 với việc sử dụng bộ TA cloning Kit của hãng Invitrogen theo hướng dẫncủa nhà sản xuất Sau đó, sản phẩm gắn được biến nạp vào tế bàoE colichủngTop10F ‘ bằng phương pháp sốc nhiệt Plasmid chứa các phân đoạn gen được tách chiếttừ các khuẩn lạc trắng và kiểm tra các đoạn gen chèn bằng cắt với enzyme hạn chếEcoRI Tinh sạch plasmid tái tổ hợp để phục vụ cho việc giải trình tự gen được thựchiện bằng bộ KIT S.N.A.PMiniprep Kit của hãng Fermentase Phản ứng xác địnhtrình tự được thực hiện nhờ bộ kit BigDye™Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitcủa hãng Applied Biosystems, sử dụng hai mồi xuôi và ngược M13F vàM13R Xácđịnh trình tự tự động trên hệ thống ABI 3100, phân tích trình tự bằng phần mềmBioEditvàDNAStar.

Phươngphápsosánhtrìnhtự genvàtạocâyphảhệ

Trình tự nucleotide và protein vùng ORF5 mã hóa kháng nguyên GP5 củavirus PRRS 02HY cường độc và Hanvet1.vn nhược độc, các chủng virus PRRS lưuhành ở các tỉnh thànhtrong nước và khu vực được thu nhận từNgân Hàng genNCBI( đ ư ợ c t h ố n g k ê t r o n g b ả n g p h ầ n P h ụ l ụ c ) T r ì n h t ự n u c l e o t i d e v à p r o t e i n được so sánh bằng chương trình phần mềm BioEdit sau đó xây dựng cây phả hệbằngphầnmềmMEGA6sửdụngthuậttoánNeighbor-Joining.

Phươngpháp điệndi

Chuẩn bị bản gel bằng dung dịch đệm TAE 1X hòa tan với 1,5 gam agaroseđặt trong lò vi sóng ở 100 o C trong 5 phút, đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn đểtạo bản gel có các giếng tra mẫu Khi bản gel đã đông đặt bản gel vào bể điện di vàđổdungdịch đệmTAEngậpbảngelkhoảng3- 5mm.

Thêm 2l loading dye vào 8l sản phẩm RT-PCR, trộn đều hỗn dịch bằngpipetv à c h u y ể n v à o c á c g i ế n g t r o n g b ả n g e l Đ i ệ n d i đ ồ n g t h ờ i c ả t h a n g c h u ẩ n ADN(marker),thườngsử dụng4-6lADNmarker.

Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA,thờigianchạyđiệnditrong30phút.

Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide trong khoảng5 đến 7 phút Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sátkếtquảđiệndi Vịtrícác đoạnADNđượcpháthiện bằngnhững vệtsángtươn gứngcủathuốcnhuộm,chụpảnhvàlưukếtquả.

PhươngphápIPMA xácđịnhhiệu giákhángthể

- Dung dịch C: Dung dịch pha loãng mẫu, gồm PBS với 1% Tween 80 và 5%sữagầy.

- DungdịchE : D u n g dị chA EC , g ồm 1m ld un gd ịc h AEC n g u y ê n c h ấ t v à 14mldungdịchđệmaxetat0,1M(pH5,2)sauđúthờm15àlH 2 O230%.

Bước1:Chuẩnbịt ế bàoMarc 14 5m ột lớpt r ê n đĩa96 giếngvớin ồ n g độ5x10 4 tế bào/ml.

Bước2:Nhiễmvirus PRRSchuẩnvớiliều500TCID50/ml,100àl/ giếng.Ủđĩatừ 1-2ngàytrongtủấm37oC,5%CO2.

+ Đổ bỏ dung dịch A, rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch

Bước5 : G ắ n k h á n g k h á n g t h ể P R R S c ó g ắ n e n z y m e ( c o n j u g a t e + pero xidase)(khángthểnàyđược chếtrênthỏ)

+ Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch

+ Nếu quan sát thấy thảm tế bào trong giếng có những đám tế bào bắt màu đỏđậmthìmẫuhuyếtthanhchovàogiếngđó dươngtínhvớikháng thểPRRS.

+ Nếu quan sát thấy toàn bộ thảm tếbào trong giếng cóm à u h ồ n g n h ạ t l à màu của môi trường MEM thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó âm tính với khángthểPRRS(TCVN8400-21:2014).

Phươngpháp đếmtếbàoMarc145

Sử dụng buồng đếm Newbauer cải tiến, chuẩn bị buồng đếm tế bào. Hỳt100àlhuyễndịchtếbàotrộnđềuvới100àlthuốcnhuộmtếbàoTrepanbluenh ỏvàob u ồ n g đ ế m Đ ế m t ổ n g s ố t ế b à o ở 4 g ó c v à t í n h s ố l ư ợ n g t ế b à o t r o n g 1 m l h uyễndịch.Côngthức:[Tổngsốtếbàođếmđượcở4góc/4]*2*10 4

Phươngphápkiểmtravôtrùngthuầnkhiếtvàantoàncủavirusgiốnggốc

+ Kiểm tra vô trùng (TCVN 8684-

Tiến hành cấy mẫu giống gốc Hanvet1.vn trên 2 ống môi trường kiểm tra sauđây: Môi trường Thioglycollat, môi trường Trypticaza đậu tương, 2 đĩa môi trườngThạchmáu,lượngmẫucấytừ1%đến2% (phầnthểtích)sovớimôitrườngkiểmtra. Ủmôitrườngđãcấytrongtủ37 o C,theodõitừ7ngàyđến10ngày.

Mẫu giống gốc đạt tiêu chuẩn khi không có vi sinh vật mọc trên môi trườngkiểmtratrongthờigiantheodõi.

Mẫu giống gốc Hanvet1.vn được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud.Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20 o C đến 25 o C) Mẫu đạt tiêu chuẩn khikhôngcónấmmốctrênmôitrườngkiểmtratrongthời giantheodõi.

Sử dụng kỹ thuật PCR/RT PCR phát hiện các loại virus Porcine epidemicdiarrhea virus (PEDV), Transmissible gastroenteritis virus (TGEV), Classical swinefevervirus(CSFV), Porcine circovirus type 2 (PCV2), Porcineparvoviru s (PPV), sau đó điện di sản phẩm để kiểm tra so sánh với đối chứng dương chuẩn, đối chứngâmvàmarkerDNA/cDNAđểxácđịnhkếtquả.

Tiêm bắp sau vành tai cho 04 lợn 5 tuần tuổi với liều 106TCID50giống gốcHanvet1.vn nhược độc, sau 7 ngày lấy máu 04 lợn, mỗi con 1ml tiêm truyền tiếpsang 04 lợn khác Quá trình tiếp truyền được tiến hành lặp lại liên tục 5 đời lợn (đời01 đến đời 05) Theo dõi lợn trong suốt quá trình thí nghiệm, nếu tất cả lợn sốngkhỏe mạnh, không có bất cứ phản ứng cục bộ hay toàn thân nào (lợn có thể có phảnứngsốtnhẹ,tăng0,5 o C)thìgiốnggốcvaccineđạtchỉtiêuan toàn.

Lợn con 4 tuần tuổi, đồng đều về giống, tình trạng sức khoẻ, điều kiện chănnuôi và vệ sinh thú y Phân chia ngẫu nhiên số lợn trên vào các nhóm, sử dụngvaccine Hanvet1.vn được chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn nhược độc cho các nhómvới liều tiêm bắp như nhau Theo dõi và xác định hiệu giá kháng thể sau khi tiêmvaccine.Đ á n h g i á s ự h ì n h thànhđ á p ứngm i ễ n dịchv à đ ộ d à i m i ễ n dị ch sa u k h i tiêmvaccinebằnglấymáulợntạicácthờiđiểmsautiêmvaccine1,2,3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12 tuần để xác định hiệu giá kháng thể bằng IPMA và lấy máu lợn tạicác thời điểm sau tiêm vaccine 2, 3, 4, 5, 6 tháng để xác định hiệu giá kháng thểtrung hòa Đểđánhgiá khả năng bảo hộcủa vaccinevới chủngvirus cườngđ ộ c , tiêm vaccine cho 12 lợn 4 tuần tuổi có huyết thanh âm tính với kháng thể PRRS Sautiêm 28 ngày, lấy máu 12 lợn được miễn dịch (lô thí nghiệm) và 4 lợn không tiêmvaccine(lôđ ố i chứng)đ ể k iể m trah i ệ u giákháng thểbằ ng phảnứng I P M A vàp h ả n ứng trung hòa trên tế bào Sau đó lợn thí nghiệm và đối chứng được thử thách vớichủng virus PRRS cường độc VN07196 Việt Nam với liều 106TCID50 Sau khi côngcường độc, theo dõi các biểu hiện lâm sàng, thân nhiệt, khả năng tăng trọng, đồngthời lấy máu lợn ở các thời điểm 3, 5, 7, 10, 14, 21 ngày sau khi công cường độc đểphânlập,xácđịnh virushuyếtvàmổkhámxácđịnhbệnhtích(Yuet al,.2015).

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).Xác định sự tương đồng về nucleotide của phânđoạn gen thu được trong nghiêncứu bằngphầnmềm Bioeditversion 7.2.5.X á c định nguồngốc phát sinh chủng loại trên cơsở trình tựg e n c ủ a c h ủ n g v i r u s t h u nhận được bằng phần mềm MEGA version 6.0 Các số liệu được xử lý trên phầnmềmExcel2010,sửdụngphương phápthốngkêsinhhọc,Minitab 16.

Nghiêncứuđánhgiáđộclựcvàđặctínhsinhh ọ c 2 c h ủ n g v i r u s PRRS02 HYvà 05TB

KiểmtrađặctínhnhânlêncủavirusPRRS02HYtrêntếbàoMarc145

Tiêu chí quan trọng để lựa chọn chủng làm ứng viên để sản xuất vaccine làkhả năng phát triển thích ứng và nhân lên của virus PRRS trên môi trường nuôi cấytế bào dòng Marc 145 Thông qua đánh giá độ biến động về trị số TCID50từ đó xácđịnh được thời điểm thu virus thích hợp là thời điểm có hiệu giá virus cao nhất vàxây dựng đồ thị sinh trưởng của virus Chủng virus 02HY được gây nhiễm trên môitrường tế bào Marc

145 một lớp với liều 0,1MOI, ủ ở 37 o C, 5% CO2 Sau đó, tạimỗi thời điểm: 24, 48, 60,

72, 84, 96, 108, 120 giờ sau khi gây nhiễm tiến hành thuvirus, xác định hiệu giá virus (TCID50) thu được và dựng đồ thị sinh trưởng củavirus, đường biểu diễn sự nhân lên của virus dựa trên biến là Log10 TCID50/ml củavirusởmỗithờiđiểnthu viruskhácnhau.

Chú thích:TB làhiệugiávirus trungbình

Từ số liệuhiệu giá virus trung bìnhBảng 3.6 xây dựng đường cong sinhtrưởngcủa chủngvirusPRRS 02HYđộc lực,Hình3.3.

Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng của chủng virus 02HY độc lực(Hiệugiá virustrungbình)

Bảng số liệu 3.6 và đồ thị sinh trưởng Hình 3.3 của chủng virus PRRS 02HYđộclựccóthểnhậnthấy:Sựnhânlêncủavirustrongmôitrườngnuôicấylàmộtquátrình liên tục, sau gây nhiễm 24 giờ virus bắt đầu quá trình sinh trưởng, hàm lượngvirus phát triển tăng dần theo thời gian nhiễm và đạt cao nhất vào khoảng thời điểmtừ80-

96giờsaugâynhiễmlà106.43TCID50/mlđến106.63TCID50/ml.Sauthờiđiểm96giờ,hiệugiávir usgiảmnhanhchóng.Đếnthờiđiểm120giờsaugâynhiễmhiệugiávirus chỉ còn 101.90TCID 50 /ml.

Từ đó rút ra kết luận: Thời điểm thu hoạch virus tốtnhất là 80-96 giờ sau gây nhiễm.Tại thời điểm này hàm lượng virus đạt cao nhất106.63TCID 50 /ml và hiệu giá virus ổn định nhất Với mục tiêu nghiên cứu, tạo đượcchủng virus PRRS nhược độc từ chủng virus độc lực cao ở Việt Nam làm giống gốcvaccine PRRS, qua các kết quả nghiên cứu trên chủng virus PRRS02HY cho thấy:Chủng virus 02HY độc lực đảm bảo các tiêu chí làm ứng viên để tạo giống gốc chosản xuất vaccine PRRS nhược độc, chủng 02HY được tiếp tục cấy truyền nhiều đờitrêntếbàodòngMarc145đểtạochủngPRRSnhượcđộc.

Nghiên cứutạo chủngvirus PRRSnhượcđộcbằng cấytruyền liên tiếp80đờitrênmôitrườngtếbào Marc145

ĐánhgiáđặctínhnhânlêncủachủngvirusPRRS02HYquacácđời cấytruyềntrêntếbàoMarc145

Trong quá trình cấy truyền liên tiếp chủng virus PRRS 02HY trên tế bàoMarc145,saumỗi10đờicấytruyềnsẽtiếnhànhchuẩnđộhiệugiávirusmộtlầnđể kiểm trađộ ổnđịnh đặc tính nhân lên của virus,đánhgiáthông quac h ỉ s ố TCID 50 qua chuẩn độ dịch virus thu được từ các chai nuôi Kết quả chuẩn độ virusPRRS02HY thểhiệndướiBảng3.7vàHình3.4.

Bảng 3.7 Hiệu giá virus PRRS 02HY sau mỗi 10 đờicấytruyềntrênmôitrường tế bàoMarc 145 Đời cấytruyền Chai nuôi Hiệu giá virus(10XTCID

Hiệu giá virus trungbình(10XTCID 5

P50 Chai1 6,5 6,5±0,00 Đời cấytruyền Chai nuôi Hiệu giá virus(10XTCID

Hiệu giá virus trungbình(10XTCID 5

Hình3.4.Hiệugiávirus trungbìnhcủaPRRS02HYsaumỗi 10 đời cấy truyền(P1-P80)

Sauquátrìnhcấytruyềnliêntiếptrêntếbào,chủngvirus02HYthíchnghitrênmôitrườngtếbào Marc145thểhiệnquasựtănghiệugiávirusquacácđờicấytruyền,từhiệugiábanđầuđạt104.9TCI

D50/mlsau80đờicấytruyềnhiệugiávirustrungbìnhđạt106,7TCID50/ ml.Từkhoảngđời50,chỉsốnhânlêncủavirusdườngnhưtăngrấtchậmhoặckhôngtăng,đạtgiátrịcaon hấtvàổnđịnh.Virusđời80đượcnhânlênvàbảoquảnở-

3.2.2 KhảnăngkíchthíchsinhkhángthểởlợncủachủngvirusPRRS02HYquacácđờicấyt ruyền

Kết hợp với chuẩn độ hiệu giá virus, từ đời cấy truyền thứ 50, tiến hành kiểmtrakhảnăngtạođápứngmiễndịchcủa chủngvirusPRRS02HY trênlợn.

1lô),lợnthínghiệmở5tuầntuổi,liềugâynhiễmchủngvirusPRRS02HYởcácđờicấytruyền P50,P60,P70,P80trên5lôlợnlà1ml105TCID 50 /lợn.Sau28ngàygâynhiễmtiếnhànhlấymáulợn,th uhuyếtthanhđểkiểmtrahàmlượngkhángthểbằngphảnứngIPMA.Kếtquảkiểmtrahiệugiákhángthể khángvirusPRRScótronghuyếtthanhlợnthínghiệmđượcthểhiệnởBảng3.8.

Bảng 3.8 Hiệu giá kháng thể kháng virus PRRS trên lợn sau gây nhiễmvirus02HYở cácđờicấytruyền Đời virus cấytruyền Lợnthínghiệm Hiệu giá kháng thể(X -1 )

Kết quả nghiên cứu cho thấy đặc tính kháng nguyên của chủng virus nhượcđộc PRRS 02HY ổn định khi được cấy truyền liên tục qua các đời cấy trên tế bàoMarc 145 (Bảng 3.8),chủng virus nhược độc PRRS 02HY từ đờic ấ y t r u y ề n P 5 0 đến P80 kích thích tạo kháng thể miễn dịch ổn định trên lợn Hiệu giá kháng thểmiễn dịch trên lợn ở các đời cấy truyền P50-P80 đạt trong khoảng từ 1/2.560,000đến1/3.620,386.

Chủngvirus02HYquacácđờicấytruyềnvẫngiữ đượctínhkhángnguyênổn định, tạo đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể cao trên lợn và đạt giá trị tươngđươngnhaukhi gâynhiễmvirusởcác đờicấytruyềnP50,P60,P70,P80.

3.2.3 KiểmtrađộclựccủachủngvirusPRRS02HY quacác đờicấytruyền Để đánh giá hiệu quả của quá trình nhược độc hóa chủng virus PRRS 02HY,tiến hành gây bệnh thực nghiệm trên lợn bằng virus các đời cấy truyền: P1, P50,P60, P70, P80 để phân tích, so sánh Mỗi đời cấy truyền virus được thử nghiệm trên05 lợn Sau khi gây nhiễm virus, lợn được theo dõi các chỉ tiêu: Thân nhiệt, triệuchứnglâmsàng,chỉtiêu virushuyết.

Bảng 3.9 Thân nhiệt và triệu chứng lâm sàng của lợn gây nhiễm virus PRRS

02HYởcác đờicấy truyềnP1,P50, P60,P70,P80 Đời virus cấytr uyền

Lợn sốt cao, thân nhiệt cao hơn bình thường 1- 1,5 o C.Lợnbỏăn,mắtsưngcónhử,mímắttímbầm (lợn đeo kính), thở khó, 2/5 lợn có triệuchứngtiêuchảy,3/5lợncóhiệntượngtímtaivào ngàythứ4-5saugâynhiễmvirus

Kết quảsau khi thửđộc lực củavirus đời cấy truyềnvirus:P1,P 5 0 ,

Về thân nhiệt: Sau khi gây nhiễm virus, tiến hành đo thân nhiệt của lợn trong7 ngày liên tục, mỗi ngày đo 2 lần sáng chiều Theo dõi cho thấy khi lợn được gâynhiễm với virus đời P1 với liều tiêm 105TCID50thấp hơn so với liều tiêm các lô cònlại nhưng lợn có biểu hiện sốt cao kéo dài 2-3 ngày liên tục, thân nhiệt lợn sốt caohơn bình thường 1-1,5 o C, 2/5 lợn cótriệu chứng tiêuchảy, 3/5 lợncóh i ệ n t ư ợ n g tím tai vào ngày thứ 4-5 sau khi tiêm virus Trong khi các lợn được gây nhiễm virusở các đời cấy truyền P50 và P60 liều tiêm 106TCID50cao hơn nhưng lợn chỉ có biểuhiện sốt nhẹ(cao hơn thân nhiệt bình thường 0,5 o C), không có biểu hiện lâm sàngbấtlợi.VớinhữnglợngâynhiễmvirusởđờicấytruyềnP70vàP80khôngquansát được hiện tượng lợn sốt Điều này chứng tỏ độc lực của virus đời P1 rất cao, sau khicấytruyềnliêntiếpvirustrênmôitrườngtếbàoMarc145đếnđờicấytruyềnP50và P60 virus đã giảm độc lực rất nhiều chỉ còn gây sốt nhẹ cho lợn, và đến đời cấytruyền P70 và P80v i r u s đ ã g i ả m đ ộ c l ự c h o à n t o à n g ầ n n h ư k h ô n g c ó h i ệ n t ư ợ n g lợnsốtvàkhônggâybiểuhiệnbệnhlýPRRStrênlợn.

Về chỉ tiêu virus huyết: Sau khi gây nhiễm virus, tất cả các lợn được lấy máuở các thời điểm 3, 6, 9, 12, 15 ngày để phân lập virus huyết Kết quả phân lập virushuyếtđược thểhiệnquaBảng3.10 vàHình3.5 nhưsau:

Bảng 3.10.Phânlậpvirustừhuyết thanhlợnđãgây nhiễmvirus ởcácđờicấy truyền

Chú thích:Nlà kíhiệu củaNgày

Hình 3.5 Phân lập virus từ huyết thanh lợn đã gây nhiễm với virusởcác đờicấy truyềnP1,P50,P60,P70,P80

Khả năng kíchthíchsinhkhángthểởlợncủachủngvirusPRRS02HY quacácđờicấytruyền

Lợn được gây nhiễm virus đời P1 với liều tiêm 105TCID50thấp hơn so vớiliều tiêm các lô còn lại nhưng kiểm tra virus huyết trên lợn từ sau gây nhiễm đếnngàythứ12sốlợncóvirushuyếtlà100%,đếnngàythứ15sốlợncóvirushuyếtcòncaochiếm60% tổngsốlợnlôthínghiệm.Trongkhiđólợnđượctiêmvirusởcácđờicấy truyền P50 và P60 liều tiêm

106TCID50cao hơn đời P1 nhưng lợn chỉ kéo dàivirushuyếtđếnngày12ởđờicấytruyềnP50vớitỉlệthấp20%,đếnngày9ởđờicấytruyền P60 với tỉ lệ 40%. Với những lợn tiêm virus ở đời cấy truyền P70 và P80 đếnngàythứ6sốlợncóvirushuyếtđãgiảmvớitỉlệ40%vàchỉkéodàivirushuyếtđếnngày 9 với tỉ lệ thấp 20%, ngày thứ 12 không còn virus huyết Điều này chứng tỏvirus PRRS đời P1 có độc tính cao, còn nguyên độc tính của chủng virus PRRS độclực, sau khi cấy truyền liên tiếp virus trên môi trường tế bào Marc 145 đến đời cấytruyền P50 và P60 virus đã giảm độc lực và đến đời cấy truyền P70 và P80 virus đãnhượcđộchoàntoànkhôngcònhiệntượngvirushuyếtkéodài.

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các đặc tính sinh học như đánh giá đặc tínhnhân lên, tính sinh miễn dịch, khả năng giảm độc lực sau các giai đoạn cấy truyền.Kết quả kiểm tra thân nhiệt, triệu chứng lâm sàng, virus huyết khi gây nhiễm chủngvirus PRRS 02HY sau từng giai đoạn cấy truyền cho thấy: Chủng virus 02HY đãhoànthànhquátrìnhcấytruyền80đờitrêntếbàoMarc145đểnhượcđộchóa,ởđời

80 virus đã nhược độc hoàn toàn và đảm bảo yêu cầu làm giống gốc cho chế tạovaccine PRRS Tại đời cấy truyền virus thứ 80, chủng PRRS02HY nhược độc sẽđược kiểm tra đặc tính sinh học phân tử, biến đổi về hệ gen và tính vô trùng, thuầnkhiết, an toàn để làm giống gốc chế tạo vaccine PRRS Chủng virus PRRS tạo đượctừ quá trình nhược độc hóa chủng 02HY cường độc được ký hiệu là chủng virusPRRSHanvet1.vnnhược độc.

NghiêncứuđặctínhsinhhọcphântửcủachủngvirusHanvet1.vnnhượcđộc vàchủng02HYcường độc

KhuếchđạicácđoạngenthuộchệgenvirusPRRS

SaukhitáchchiếtARNtổngsốtừdịchnuôicấyvirustrêntếbàoMarc145,ARN đượcchuyểnsangcADN.SửdụngcADNlàmsợikhuônđểkhuếchđạicácđoạngencủa virus PRRS bằng PCR với 15 cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế sao cho các đoạn genđượckhuếchđạicóvùngchồnglênnhauđểdễdàngnốilạithànhhệgenhoànchỉnhcủachủngHa nvet1.vnnhượcđộccũngnhưchủng02HYcườngđộc.Kếtquảkhuếchđại15đoạnthuộchệgench ủngHanvet1.vnnhượcđộcđượcminhhọaởHình3.6.

Hình 3.6 Khuếch đại 15 đoạn gen thuộc hệ gen của chủngvirusPRRSHanvet1.vn nhược độc

Chú thích:M:Marker DNA(DNAladderFermentase) Cácđườngchạy1-15: SảnphẩmPCR vớicáccặp mồi từ1đến15khuếchđạicácđoạngenthuộchệgenchủnghanve t1 vn nhượcđộc.Kíchthướcđoạngentrêncácđường chạy:Đoạngen1:1124bp;Đoạngen2:1244bp;Đoạngen3:1217bp;Đoạngen4:1105bp;Đoạngen5:1031bp; Đoạngen6:1041bp;Đoạngen 7:896bp;Đoạngen8:1238bp;Đoạngen9:1093 bp;Đoạngen10:1189 bp;Đoạngen 11:1115bp;Đoạn gen 12: 1164bp; Đoạn gen13:955bp;Đoạn gen 14:1267bp; Đoạn gen15:1472 bp

Nghiên cứu cho thấy, các đoạn gen được khuếch đại đặc hiệu, trên điện di đồchỉ xuất hiện một băng duy nhất tương ứng với mỗi đoạn gen được khuếch đại, cókíchthướcphùhợpvớidự tínhtheolýthuyết.

Táchdòngcác đoạn genkhuếch đại

Để dễ dàng cho việc lưu giữ và giải trình tự gen, sau khi tinh sạch, sản phẩmPCR được gắn vào vector tách dòng pCR2.1, biến nạp vào tế bàoE.colichủng TopF ’ CácplasmidtáitổhợpmangcácđoạngenkhuếchđạitừhệgenchủngHanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc được sàng lọc và kiểm tra bằng cắt vớienzyme hạn chếEcoRI Đoạn gen từ plasmid tái tổ hợp sẽ được tách ra khỏi vectorvới kích thước tương đương sản phẩm PCR đã được gắn vào vector tách dòng Kếtquả kiểm tra cácplasmidmangcácđoạngen táitổ hợpc ủ a c h ủ n g

Chú thích: M: Marker DNA (DNA ladder Fermentase) Kích thước vector: 3.900 bp Các đường chạy:

1:Plasmid gắn đoạn gen 1; 2-3: Plasmid gắn đoạn gen 2( k í c h t h ư ớ c đ o ạ n g e n l ầ n l ư ợ t : 6 8 0 b p v à

5 6 4 b p ) ; 4 - 5 : P l a s m i d gắn đoạn gen 3; 6: Plasmid gắn đoạn gen 4; 7: Plasmid gắn đoạn gen 5; 8-9: Plasmid gắn đoạn gen 6; 10: Plasmid gắnđoạn gen 7; 11: Plasmid gắn đoạn gen 8 (kích thước đoạn gen lần lượt: 687 bp và 551 bp); 12: Plasmid gắn đoạn gen 9;13:Plasmidgắnđoạngen10;14-15:Plasmidgắnđoạngen11;16- 17:Plasmidgắnđoạngen12;18:Plasmidgắnđoạn gen13;19:Plasmidgắn đoạngen14; 20-21:Plasmidgắn đoạn gen15

KếtquảtrênHình3.7chothấy,cácdòngplasmidđềumangđoạngenngoạilai,thể hiện trên bản điện di tạo thành 2 băng rõ rệt, có kích thước tương ứng kích thướccủavectorvàđoạngenđượcchènvào.Tuynhiên,plasmidởđườngchạy2,3và11lạitạo thành 3 đoạn, 1 đoạn có kích thước của vector, 2 đoạn có kích thước khác nhaukhông tương ứng với kích thước của đoạn gen chèn vào Điều này có thể giải thíchtrongđoạngenchènvàocóvịtrícắtcủaenzymeEcoRI,vìvậyđoạngenbịcắtthànhhaimảnhnh ỏ.Điềunàysẽđượckiểmchứngsaukhigiảitrìnhtựvàphântíchgen.

Kếtquảgiảimã,phântíchhệg e n c h ủ n g H a n v e t 1 v n n h ư ợ c đ ộ c v à 02HYcường độc

Các dòng ADN plasmid được tinh sạch và giải trình tự bằng máy giải trình tựgen tự động (ABI 3100) Dữ liệu kết quả được xử lý và phân tích bằng phần mềmBioEdit, PC/Gene vàG e n D o c

S a u k h i g i ả i m ã , l ắ p r á p v à p h â n t í c h , t h u đ ư ợ c h ệ gen của chủng Hanvet1.vn nhược độc có kích thước 15.276 bp, với 3306 A, 4036 C,3995Gvà3939 T,tỷlệA+Tchiếm47,42%,G+Cchiếm52,68%.

Phần không dịch mã đầu 5’ có độ dài 185 nucleotide (1-185), phần khôngdịch mã đầu 3’ có độ dài 110 nucleotide (15167-15276) Trình tự gen được đăng kýtrênngânhàngGenbankvớimãsốKU842720(BảngPL 3.1).

Sau khi dịch mã, toàn bộ hệ gen chủng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc có8khungđọc,mãhóacho8protein:

Khung đọc ORF1a có độ dài 7422 nucleotide (186-7607) mã hóa cho proteinkhôngcấutrúcNSP1avớiđộdài 2473axitamin.

Khung đọc ORF1b có độ dài 4380 nucleotide (7598-11977) mã hóa choproteinkhôngcấutrúcNSP1bcóđộdài1459axitamin.

TươngtựnhưởchủngHanvet1.vnnhượcđộc,hệgenchủng02HYcườngđộccũng được giải mã, lắp ráp và phân tích nhằm so sánh sự biến đổi của các gen trongtoànbộhệgencủachủngnhượcđộcsovớichủngcườngđộc.Saukhigiảimã,lắprápvàphântích,th uđượchệgencủachủng02HYcườngđộccókíchthước15.262bp,với3.314A,4.033C,3.988Gv à3.927T,tỷlệA+Tchiếm47,45%,G+Cchiếm52,55%.

Phầnkhôngdịchmãđầu5’cóđộdài129nucleotide(1-129),phầnkhôngdịchmã đầu 3’ có độ dài

152 nucleotide (15.111-15.262) Trình tự gen đã được gửi đăngkýtrênngânhàngGenbankvớisốgửiđăngSubmission2490633(BảngPL3.2).

Sau khi dịch mã, toàn bộ hệ gen chủng 02HY cường độc cũng có 8 khungđọc,mãhóacho8protein:

Khung đọc ORF1b có độ dài 4.380 nucleotide (7542-11921) mã hóa choproteinkhôngcấutrúcNSP1bcóđộdài 1.459axitamin.

Như vậy, độ dài của các khung đọc mở từ ORF1a đến ORF7 mã hóa cho 8protein khác nhau của chủng Hanvet1.vn nhược độc là không đổi so với chủng02HYcường độc Điều đócho thấy khôngcó đột biến thêm đoạn vàm ấ t đ o ạ n (Indel) trong các khung đọc này Câu hỏi đặt ra: Có các đột biến điểm xảy ra trongcác khung đọc mở của chủng nhược độc so với chủng cường độc sau quá trình cấytruyềnl i ê n t i ế p 8 0 đ ờ i t r ê n m ô i t r ư ờ n g t ế b à o M a r c 1 4 5 h a y k h ô n g ? Đ ể t r ả l ờ i choc â u h ỏ i n à y v i ệ c p h â n t í c h , s o s á n h t r ì n h t ự n u c l e o t i d e c ủ a c á c g e n O

R F v à trình tựaxit amincủa các protein được dịch mã từ các gen ORFđ ã đ ư ợ c t i ế p t ụ c tiến hành Kết quả được tổng hợp ở Bảng 3.11 và Phụ lục Bảng PL3.2; PL3.3;PL3.4;PL3.5;PL3.6;PL3.7;PL3.8;PL3.9.

Bảng 3.11 Mức độ tương đồng trình tự nucleotide và axit amin chủng virus

PRRSHanvet1.vnnhược độcsovớichủngvirusPRRS02HYcường độc

ORF1a ORF1b ORF2 ORF3 ORF4 ORF5 ORF6 ORF7

Tương đồngaxit amin giữa2chủng(

NSP1a NSP1b GP2 GP3 GP4 GP5 MP MP

Khung đọc ORF1a mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1a có tỉ lệ tươngđồng giữa 2 chủng về nucleotide là 99,39% có sai khác 45 nucleotide, về axit aminlà98,99%có saikhác25 axitamin.

Khung đọc ORF1b mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1b có tỉ lệ tươngđồng giữa 2 chủng về nucleotide là 99,47% có sai khác 23 nucleotide, vềaxit aminlà99,25%,có saikhác11axitamin.

Khung đọc ORF2 mã hóa cho protein GP2 có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủngvề nucleotide là 98,83 % có sai khác 9 nucleotide, về axit amin là 97,66%, có saikhác6 axitamin.

Khung đọc ORF3 mã hóa cho protein GP3 có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủngvề nucleotide là 99,48% có sai khác 4 nucleotide, về axit amin là 98,82%, có saikhác3 axitamin.

Khung đọc ORF4 mã hóa cho protein GP4 có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủngvề nucleotide là 99,26% có sai khác 4 nucleotide, về axit amin là 97,75%, có saikhác4axitamin.

Khung đọc ORF5 mã hóa cho protein GP5 có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủngvền u c l e o t i d e l à 9 9 , 6 7 % c ó s a i k h á c 2 n u c l e o t i d e v ề a x i t a m i n l à 9 9 , 5 0

Khung đọc ORF7mã hóacho proteinNP cótỉlệtương đồnggiữa2chủngvềnucleotidelà99,46%cósaikhác2nucleotide,vềaxitaminlà99,19%,cósaikhác1axitamin.ChủngHanvet1.vnnhượcđộccó89độtbiếnnucleotidevà51độtbiếnaxitaminnằmrảiráctr ong7genORFmãhóacho7proteintươngứng,trongđóproteinNPdogenORF6mãhóakhôngcósựbi ếnđổiaxitamin.KếtquảnghiêncứunàycósựkhácbiệtvềvịtrívàsốlượngđộtbiếnvềnucleotidegenORF5vàaxitamincủaproteinGP5khisovớiLengetal,.2012vàYuetal,.2015,TrịnhĐìnhThâuvà cs,2018.

Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 chủng Hanvet1.vn nhược độcvớichủng 02HYcường độc

ChủngHanvet1.vnxuấthiện 2độtbiếnđiểmtạivị trí471 và587

Hình 3.9 So sánh trình tự axit amin của protein GP5 chủng Hanvet1.vnnhượcđộc vớicủa chủng02HYcường độc Đột biến câm ở vị trí nucleotide 471 không làm thay đổi axit amin Serin Đột biến sai khác ở vị trí nucleotide 587 khiếnGlutamine(Q) biến đổi thành Leucine(L),tuynhiên axit amin nàynằmngoàivùngepitopekhángnguyên Đã có sự biến đổi trong hệ gen làm cho chủng Hanvet1.vn trở thành nhượcđộcnhưnggenmãhóaproteinkhángnguyênG P 5 k í c h t h í c h s i n h k h á n g t h ể trungh ò a ở l ợ n c h ỉ b i ế n đ ổ i h a i n u c l e o t i d e ở v ị t r í 4 7 1 ( A -

(Q)biếnthànhLeucine(L).Tuy nhiên,biếnđổinày khôngthuộcc á c e p i t o p e khángnguyênGP5.Kếtquảnghiêncứuchothấy,saukhic ấytruyền80đời,mặcdùcácgencủachủngHanvet1.vncóbiếnđổisovớichủngđộcl ực02HYlàmnótrởt h à n h c h ủ n g n h ư ợ c đ ộ c n h ư n g g e n m ã h ó a p r o t e i n k h á n g n g u y ê n G P 5 k í c h thíchsinhkhángthểtrunghòatrênlợnkhôngthayđổitínhk h á n g nguyên.

3.3.4 Phân tích so sánh gen chủng Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virusPRRSlưuhànhởViệt Namvàthếgiới Đểphân tíchcácb i ế n đ ổ i d i t r u y ề n h ệ g e n c h ủ n g H a n v e t 1 v n n h ư ợ c đ ộ c sovớimộtsốchủngcườngđộclưuhànhởViệtNam( 0 7 Q N ) , T r u n g Q u ố c (07NM) và chủngvirusP R R S t y p e B ắ c M ỹ c h u ẩ n q u ố c t ế ( V R 2 3 3 2 ) t h e o c ô n g bố của (Feng Yet al., 2008), 3 chủng được chọnđể so sánh trình tựa x i t a m i n c ủ a tấtcả8khungđọc.

Bảng 3.12 Mức độ tương đồng trình tự axit amin các protein chủng virus PRRS

Tỉ lệ (%) tương đồng axit amin cácprotein chủng PRRSV Hanvet1.vnnhượcđộcso với3chủng

Kết quả Bảng 3.12 cho thấy, chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc cóprotein GP5 tương đồng 100% so với chủng độc lực phân lập ở Quảng Nam ViệtNam07QNvà 98 %s o vớichủngv i r u s PR RS TrungQuốc 07NM Th eo cô ng b ố của (Popescuet al., 2017) thì protein GP5 đóng vai trò quan trọng trong kích thíchđáp ứng miễn dịch tạo kháng thể trung hòa virus PRRS Chính vì vậy sự tương đồng100% về trình tự axit amin của protein GP5 chủng Hanvet1.vn nhược độc so vớichủngđ ạ i d i ệ n l ư u h à n h ở V i ệ t N a m 0 7 Q N l à t h ô n g t i n q u a n t r ọ n g v ề s ự t ư ơ n g đồng kháng nguyên tạo kháng thể trung hòa chống lại chủng virus PRRS lưu hành ởViệt Nam Tuy nhiên, protein GP5 này có độ tương đồng khá thấp so với chủngVR2332, chỉ đạt 87% Các protein MP và NP có tính bảo thủ cao so với các chủngđộc lực lưu hành ở Việt Nam và Trung Quốc, đều đạt 99-100% Các protein còn lạiđều có sự thay đổi so với chủng độcl ự c , d a o đ ộ n g t ừ 1 , 2 % ở N P 1 a đ ế n 3 , 9 % ở GP2 Tuy nhiên, sự tương đồng về trình tự axit amin của tất cả các protein chủngHanvet1.vn nhược độc đều thấp hơn nhiều nếu so sánh với chủng chuẩn virus PRRStypeII(chủngBắcMỹVR2332), daođộngtừ86,25%đến97,7%. Để đánhgiásựtươngđồngvềtrìnhtựnucleotidevàproteingenmãhóakhángnguyênGP5(ORF5)củach ủngHanvet1.vnnhượcđộcsovớicácchủngvirusPRRSlưuhànhởViệtNam.Tiếptụcsosánhtrìnhtựn ucleotidevàproteingenORF5củachủngHanvet1.vnnhượcđộcvớitrìnhtựORF5trênGenBankcủ acácchủngvirusPRRSthunhậntừcáctỉnhthànhkhácnhaucủaViệtNam.Sosánhtrìnhtựgenvàpro teinđượcthựchiệnbằngchươngtrìnhphầnmềmBioEdit,sauđósửdụngchươngtrìnhphầnmềmM EGA6đểxâydựngcâyphảhệdựatrênthuậttoánNeighbor-Joining.

Kết quả trong Hình 3.10 và Bảng phụ lục (PL3.10; PL3.12) phản ánh sựtương đồng về trình tự nucleotide gen mã hóa kháng nguyên GP5 cao nhất là 99%đều thuộc về các chủng virus PRRS lưu hành ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng nhưHưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Nam Định, Thái Bình Độ tương đồng vềtrình tự nucleotide gen mã hóa kháng nguyên GP5 thấp nhất là 94-96% là các chủngvirusPRRS thunhậntừ YênBáivàNghệAn.

Sự tương đồng về trình tự axit amin của protein kháng nguyên GP5 chủngchủngHanvet1.vnnhượcđộccaonhấtlàcácchủngthunhậntừHưngYên,HảiPhòngvà Hà Nội (đạt 99%); thấp hơn một chút là ở các chủng thu nhận từ Bắc Ninh, NamĐịnh,BắcGiang(chủngKTYdohọcViệnNôngnghiệpViệtNamphânlập)vàSơnLa(đạt98

Hình 3.10 Cây phả hệ phản ánh mối quan hệ họ hàng của chủng Hanvet1.vn nhược độc vớicácchủngvirusPRRS lưu hànhở cáctỉnhthành khác nhau của Việt Nam dựatrêntrìnhtựnucleotide genORF5

Mốiquanhệhọhàngtrêncâyphátsinhchủngloạidựatrêntrìnhtựnucleotide genORF5 mã hóa kháng nguyên GP5 trên Hình 3.10 và cây phát sinhchủng loài dựa trên trình tự axit amin protein GP5 trên Hình 3.11 và Phụ lục(PL3.11; PL3.13) cho thấy:Chủng Hanvet1.vn nhược độc có quan hệ gần gũi nhấtvớicácchủngvirusPRRS thuộckhuvực đồng bằngSôngHồng.

Phântíchsosánhg e n c h ủ n g H a n v e t 1 v n n h ư ợ c đ ộ c v ớ i c á c c

Hanvet1.vnnhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở các tỉnh thành khác nhau của

ĐánhgiáđặctínhgiốnggốcchủngvirusPRRSHanvet1.vnnhượcđộc

Kiểmtrathuầnkhiết

Bamẫutừlôgiống,mỗimẫutiếnhànhthínghiệmnuôicấytrên2ống.Kếtquảpháthiệnvikhuẩn vànấmmốcthểhiệntrênBảng3.13

Bảng 3.13.Kiểmtra vô trùng giốnggốc virusPRRSHanvet1.vn MT

Thioglycollat Trypticaza đậutương Thạchmáu Sabouraud

Kếtluận Ống1 Ống2 Ống1 Ống2 Ống1 Ống2 Ống1 Ống2

Kết quả thí nghiệm cho thấy: Các ống môi trường nuôi cấy không xuất hiệncác hiện tượng môi trường vẩn đục hay lắng cặn, trên bề mặt thạch không xuất hiệnnấm, khuẩn lạc mọc lên Như vậy, giống gốc Hanvet1.vn nhược độc không bị tạpnhiễmvikhuẩn,nấmmốc,giống gốcđạt chỉtiêuvôtrùng.

Giống gốc được kiểm tra xác định có hay không sự tạp nhiễm với một sốvirus,v i k h u ẩ n g â y b ệ n h ở l ợ n t h ư ờ n g c ó t r i ệ u c h ứ n g v à b ệ n h t í c h t ư ơ n g t ự , d ễ nhầm lẫn với PRRS là: Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), Transmissiblegastroenteritisvirus(TGEV),Classicalswinefevervirus(CSFV),P o r c i n e circo virustype 2 (PCV2), Porcineparvovirus (PPV).

Hình3.12.Điệndi kiểm tragiốngHanvet1.vntạpnhiễmvới mộtsốloại virus

Chú thích:Hình(A,B): (-)đối chứngâmcủaphảnứngPCR/RTPCR, M: Marker.

Cácđườngchạy:(a,b,c,d,e)lần lượtlà cDNAdươngchuẩn(PEDV; TGEV;CSFV); DNAdươngchuẩn (PCV2;PPV).

Kết quả Hình 3.12, ở các mẫu đối chứng dương đều cho vạch đặc hiệu cókích thước như thiết kế (PEDV: 654 bp, TGEV: 858 bp, CSFV: 774 bp, PCV2: 354bp, PPV:

267 bp), mẫu đối chứng âm của phản ứng PCR/RT PCR không xuất hiệnvạch sản phẩm Kết quả kiểm tra đối với 2 lô giống gốc đều không xuất hiện vạchđặchiệuvớicả5cặpmồikiểmtra.Dovậy,2lôgiốnggốcđượcxácđịnhkhôngtạp nhiễmvới5loạivirus(PEDV,TGEV,CSFV,PCV2,PPV)

Bảng3.14.Kếtquảkiểmtra thuầnkhiết giống gốcHanvet1.vn

Như vậy, giống gốc Hanvet1.vn không tạp nhiễm Porcine epidemic diarrheavirus(PEDV),Transmissiblegastroenteritisvirus(TGEV),Classicalswinefeverviru s(CSFV),Porcinecircovirustype2(PCV2),Porcineparvovirus(PPV),đâylàcácloạivirusthườnggâybệ nhvàtriệuchứng,bệnhtíchởlợntươngtựvớiPRRS.GiốnggốcHanvet1.vnchỉcóduynhấtvirusPR RS,khôngtạpnhiễmvirusngoạilaikhác.

Từ các kết quả nghiên cứu kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc và virusngoại lai cho thấy giống gốc Hanvet1.vn đạt tiêu chuẩn vô trùng, thuần khiết chonhângiốngsảnxuấtvaccinePRRS.

3.4.2 KếtquảkiểmtratínhantoàncủagiốnggốcHanvet1.vntrênlợn Đánh giá độ an toàn của giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc trên lợn 5tuần tuổi Tiêm bắp cho lợn lần lượt với các liều: 1x105TCID50, 10x105TCID50,20x105TCID50, mỗi liều tiêm cho 04 lợn, lợn đối chứng không tiêm, theo dõi trong14ngày.Kết quảnhư sau:

Bảng3.15 Mức độ antoàn của giốnggốcHanvet1.vn trênlợn

Khối lượng trướckhi thí nghiệm (kg)

KếtquảkiểmtrađộantoàncủagiốnggốcvirusPRRSHanvet1.vnnhượcđộcBảng3.15và3. 16đãchothấy:GiốnggốcHanvet1.vnkhônggâycácbiểuhiệnbệnhlýcủalợnmắcPRRS,rấtantoà nđốivớilợn,khảnăngtăngtrọngtrungbìnhcủalợnsau khi tiêm giữa các lô thí nghiệm và lô đối chứng không tiêm lợn đều phát triểnbìnhthường,mứctăngtrọngtươngđươngnhaugiữacáclôtừ4,125đến4,250kg(kểcảkhiđượctiê mvớiliềuviruscaogấp20lầnliềusửdụngthôngthườngđốivớiliềuvaccinePRRSnhượcđộctheotiê uchuẩn).

3.4.3 KhảnăngkíchthíchsinhkhángthểcủagiốnggốcHanvet1.vnnhượcđộc

TiếptụcđánhgiátínhkíchthíchtạođápứngmiễndịchcủachủngHanvet1.vn nhược độc, đây là một trong những chỉ tiêu cơ bản của giống virus phụcvụchosảnxuấtvaccine,thínghiệmđượctiếnhànhnhư sau:

Sử dụng 24 lợn 5 tuần tuổi khỏe mạnh, chia làm 6 nhóm để gây miễn dịchbằngvirusPRRSHanvet1.vn nhượcđộcởcácliều viruskhácnhau.

Sau khi tiêm miễn dịch 28 ngày, tất cả lợn của 6 nhóm được lấy máu để kiểmtrah i ệ u g i á k h á n g t h ể b ằ n g p h ư ơ n g p h á p I P M A L ợ n đ ư ợ c t h ử t h á c h v ớ i l i ề u

106TCID50chủng virus PRRS VN07196 độc lực phân lập tại Việt Nam Sau khicông cường độc tiến hành theo dõi các biểu hiện lâm sàng, thân nhiệt, khả năng tăngtrọng của lợn và lấy máu lợn ở các thời điểm 3,

5, 7, 10, 14, 21 ngày sau khi côngcườngđộcđểphânlậpvàxácđịnhvirushuyết bằngkỹthuậtrRT-PCR.

3.4.3.1 Hiệugiákháng thể củalợnđượcmiễn dịchvớigiống gốc Hanvet1.vn

Bảng 3.17 Hiệu giá kháng thể của lợn ở các liều miễn dịch vớivirusgiống gốcPRRSHanvet1.vn nhượcđộc

Nhóm lợn Lợnsố Liềumiễn dịch

Hiệu giá kháng thểtrungbình Đối chứng

Kết quả hiệu giá kháng thể của lợn miễn dịch với giống gốc virus PRRSHanvet1.vn nhược độc, có thể nhận thấy ở liều miễn dịch 103TCID 50 và 104TCID50mỗi lô có 1/4 lợn có hiệu giá kháng thể thấp 1/1.280, hiệu giá kháng thể trung bìnhthấp nhất lần lượt là

105TCID50đến2x106TCID50c h ohiệugiákhángthểcaonhấtvớicả3lôlợn,hiệugiátừtrungbìn h đạttừ1/3.620,386đến1/4.305,389,khôngcólợnnàocóhiệugiákhángthểthấpdưới1/2.560 Như vậy, ở liều miễn dịch 105TCID50/lợn, giống virus PRRS

Kết quả phân lập virustừmául ợ n s a u k h i c ô n g c ư ờ n g đ ộ c :

M ộ t đ ặ c t r ư n g của hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là virus huyết. Virus huyết có thểxác định bằng phân lập, có giá trị về bệnh sinh và truyền nhiễm, ngoài ra có thể xácđịnh bằng phương pháp sinh học phân tử rRT- PCR, có giá trị xác định sự hiện diệncủa virus, thậm chí là dấu vết của virus còn tồn dư Kiểm tra theo hai cách để đánhgiá virus huyết, là cơ sở cho nhận xét về tính bảo hộ của vaccine chế tạo từ chủngvirusPRRS Hanvet1.vn nhượcđộcsaunày.

Phân lập được virus PRRS từ huyết thanh của các lợn thí nghiệm tại các thờiđiểm 3, 6, 10, 14, 21 ngày sau khi công cường độc Lô lợn đối chứng có virus huyếtcao và hiệu giá virus trong máu giảm dần bắt đầu từ ngày thứ 10, đến thời điểm 21ngày sau khi công cường độc không còn phân lập được virus nhưng giám định virusbằngrRT-PCRtừhuyết thanhvẫncòn2/4lợn Các lôlợng â y m i ễ n d ị c h b ằ n g chủng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc không phân lập được virus nhưng kết quảgiám định virus bằng rRT-PCR vẫn có rải rác ở 1 vài lợn ở 4 lô lợn đến ngày thứ 7saucôngcườngđộc.KếtquảthểhiệnởBảng3.18.

Bảng 3.18 Kiểm tra virus huyết bằng rRT-PCR và phân lập tại cácthờiđiểmsaucôngcườngđộc

Kếtquảthínghiệmtrênlợn chothấy:GiốnggốcvirusPRRSHanvet1.vngâyđápứngmiễndịchtốtcholợn,hiệugiákhángthểtr ungbìnhcủalợnđạt1/1.522,185ởliềugâymiễndịch103TCID 50 , vàcao nhấtởliềumiễndịch105TCID50hiệugiátừ trung bìnhđạtđến1/4.305,389đãgiúplợnchốngđượccácbiểuhiệnbệnhtíchcủaPRRSnhưsốt,triệuchứn glâmsàng,mứcđộnhiễmvirushuyết.

3.4.4 Đánhgiá đặctínhổnđịnhcủagiốnggốcvirusPRRS Hanvet1.vn Đểk i ể m t r a đ ặ c t í n h ổ n đ ị n h c ủ a g i ố n g virusP R R S H a n v e t 1 v n n h ư ợ c độc, tiến hànhgây nhiễm giốngvirusPRRSH a n v e t 1 v n n h ư ợ c đ ộ c l ê n t ế b à o Marc 145, theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) và thu dịch nuôi cấy của từng đời cấytruyềnđ ể c h u ẩ n đ ộ x á c đ ị n h h i ệ u g i á v i r u s , m ỗ i đ ờ i n u ô i c ấ y t r ê n 3 c h a i T 2 5 Gâynhiễmvà c ấ y truyềnl i ê n t ụ c g i ố n g v i r u s P R R S H a n v e t 1 v n q u a 1 0 đ ờ i t r ê n tếbàoMarc145(từP1đếnP10).

Chuẩn độ dịch virus thu được từ các chai nuôi cấy của 10 đời cấy truyền, kếtquảthuđượcBảng3.19 vàHình3.13.

Qua các đời nuôi cấy virus, quá trình phát triển và xuất hiện bệnh tích tế bào(CPE) đều ổn định, thời gian thu dịch virus dao động từ 96 giờ đến 120 giờ. Nguyêndịch virus thu được qua các đời nuôi cấy luôn ổn định, dao động từ 106,33TCID 50 /mlđến106,70TCID50/ml.

Bảng3.19.HiệugiágiốnggốcHanvet1.vnqua10đờicấytruyền Đờicấytruyền Chainuôi Hiệu giá virus10XTCI

Hiệugiávirustr ung bình 10XTCID 50 /ml

Chai3 6,5 Đờicấytruyền Chainuôi Hiệu giá virus10XTCI

Hiệugiávirustr ung bình 10XTCID 50 /ml

3.4.4.2 Kếtquảđánhgiáđộổnđịnhvềantoàngiốnggốc Hanvet1.vnnhượcđộck hitiếpđời liên tục trên lợn

Giốngg ố c H a n v e t 1 v n n h ư ợ c đ ộ c c ó đ ả m b ả o a n t o à n đ ố i v ớ i l ợ n v à c ó nguycơcườngđộctrởlạihaykhông?Thínghiệmđượctiếnhànhđểkiểmtrađộ ổnđ ị n h v ề a n t o à n củ a g i ố n g k h i t i ế p t r u y ề n g i ố n g l i ê n t ụ c q u a 5 đ ờ i l ợ n : T i ê m bắp sau vành tai cho 04 lợn 5 tuần tuổi với liều 106TCID50giống gốc Hanvet1.vnnhược độc, sau 7 ngày lấy máu 04 lợn, mỗi con 1ml tiêm truyền tiếp sang 04 lợnkhác Quá trình tiếp truyền được tiến hành lặp lại liên tục 5 đời lợn (đời 01 đến đời05).KếtquảthểhiệnởBảng 3.20.

Bảng 3.20 Độ an toàn của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc với lợnkhi tiếptruyềnliên tục trên 5 đờilợn Đời lợn tiếptruyền Đườngtiêm Số lượng( con)

Biểu hiện bệnh lý lợnmắcPRRS Kếtluận Đời01 Bắpthịt 4 0/4 Không Đạtantoàn Đời02 Bắpthịt 4 0/4 Không Đạtantoàn Đời03 Bắpthịt 4 0/4 Không Đạtantoàn Đời04 Bắpthịt 4 0/4 Không Đạtantoàn Đời05 Bắpthịt 4 0/4 Không Đạtantoàn

Bảng3.21 Nhiệtđộcủalợn ở cácđờitiếp truyềngiống gốcHanvet1.vntrong7 ngày Đờilợn Lợnsố N0

KếtquảtheodõiquátrìnhtiếptruyềnthểhiệntrênBảng3.20và3.21chothấy:Toàn bộ lợn được tiếp truyền qua các đời đều khỏe mạnh, phát triển bình thường,khôngốm,bỏăn,khôngcónhữngbiểuhiệnbệnhlýcủalợnmắcPRRS,theodõithânnhiệt của lợn ở các lô thí nghiệm trong khoảng từ 39 o C đến 39,8 o C, lợn có tăng thânnhiệt nhẹ (thân nhiệt bình thường khoảng 39 o C).

3.4.4.3 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào và sự phát triển củagiốnggốcHanvet1.vn Để lựa chọn loại môi trường nuôi cấy tối ưu nhất cho sự phát triển của của tếbào cũng như sự nhân lên của virus, thử nghiệm nuôi cấy tế bào Marc 145 được tiếnhành trên

3 loại môi trường khác nhau là MEM, DMEM, M199, theo dõi sự pháttriểncủa tếbàovà đánhgiácácchỉtiêu:

Đápứngmiễndịchvàđộdàimiễndịchở l ợ n s a u k h i t i ê m v a c c i n e như ợcđộcđượcchếtạotừgiốnggốcHanvet1.vn

Đề tài luận án đã thực hiện thành công các nội dung nghiên cứu, đáp ứng cácmục tiêu đề ra Luận án đã xây dựng, hoàn thành và cung cấp cáck ế t q u ả n g h i ê n cứu khoa học đạt được, trong đó có một số điểm nổi bật chúng tôi cho rằng đã gópphần vào nghiên cứu về virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Tạođượcgiốnggốcđápứngyêucầuchochếtạovaccinenhượcđộcphònghộichứngr ối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam đạt hiệu quả bảo hộ Kết quả đề tàikhôngchỉmangýnghĩakhoahọcmà cònđemlạigiátrịthựctiễncao,bướcđầuứng dụng chế tạo thành công vaccine PRRS nội địa từ chủng virus lưu hành tại ViệtNam Việc chủ động nguồn cung và hạ giá thành vaccine sẽ mang lại thuận lợi hơnchocôngtácphòngchống PRRS,giúpngành chănnuôilợnđạthiệuquảkinht ế,góp phần đảm bảo an sinh xã hội Chúng tôi xin có một vài bàn luận cụ thể về cáckếtquảđềtàinghiêncứunhư sau:

Vềnghiêncứuđánhgiáđộclực chủngvirusPRRS02HY cườn gđộcV i ệ t N a m c h ọ n l à m c h ủ n g ứ n g v i ê n đ ể t ạ o v i r u s g i ố n

NghiêncứutạođượcchủngvirusPRRSnhượcđộcsửdụnglàmgiốnggốcchếtạo vaccine PRRS đạt hiệu quả bảo hộ thì việc chọn chủng virus độc lực cao là nộidungcôngviệcđầutiêncầntiếnhànhnghiêncứuđểđápứngcácyêucầu:

- Virus PRRS độc lực có nguồn gốc được phân lập từ lợn mắc PRRS ổ dịchViệtNam, k h i thử độc l ự c của v i r u s t rê n lợng â y triệut r ứ n g l â m sàngrõ r ệ t, t h ể hiện qua bệnh tích đại thể, vi thể điển hình, đặc trưng của lợn nhiễm PRRS, có hiệntượngv i r u s h u y ế t k é o d à i , k h ả n ă n g k í c h t h í c h m i ễ n d ị c h s i n h k h á n g t h ể ở l ợ n khángPRRS cao.

- Virus PRRS thích ứng và phát triển ổn định trên môi trường tế bào dòngMarc145 khiphân lậpvànuôicấy, đạthiệugiáviruscao.

HaichủngvirusPRRS05TBvà02HYđộclựccónguồngốcđượcphânlậptừ lợnmắcPRRSổdịchtạiTháiBìnhvàHưngYênViệtNamđãđượcnghiêncứuđánhgiáđộclựcvàcácđ ặctínhsinhhọcbằngcáchgâynhiễm02chủngtrênlợn,theodõicáctriệuchứnglâmsàngđặctrưngcủa hộichứngrốiloạnsinhsảnvàhôhấp:ốm,sốtcao,bỏăn,gầnnhưkhôngtăngcântrong14ngàyđầusau gâynhiễm(Bảng3.1).Bệnhtíchtổnthươngđạithể,vithểbiểuhiệnrõởmộtsốcơquannhư: bệnhtíchphổbiến,tim,gan,lách,thận,hạchmàngtreoruộtbệnhtíchnặng(Bảng3.3;Hình3.1;3.2).So sánh các tổn thương, bệnh tích cũng tương tự kết quả nghiên cứu của (Lê Văn Năm,2007; Tiêu Quang An và cs 2011; Doneet al., 1996; Fenget al., 2007; Trịnh ĐìnhThâu và cs, 2017) Đây là các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và vi thể điểnhìnhthểhiệnđộclựccủacácchủngvirusPRRStrênlợn.

Tuy nhiên, một tiêu chí quan trọng nữa được sử dụng trong các đánh giá vềđộc lực virus và hiệu lực vaccine trong nghiên cứu là tình trạng virus huyết Kết quảnghiên cứu cho thấy, hiện tượng virus trong máu lợn xuất hiện kéo dài đến 21 ngàyvà chiếm tỉ lệ 100% số lợn thí nghiệm khi gây nhiễm lợn bằng chủng virus PRRS02HY, tỉ lệ lợn có virus huyết kéo dài đến

21 ngày cao gấp 3 lần chủng virus PRRS05TB, virus trong máu lợn xuất hiện đến 21 ngày chiếm tỉ lệ 33,3% số lợn thínghiệm (Bảng 3.4) Như vậy, có thể nói, nếu dựa trên tiêu chí virus huyết thì chủng02HY là chủng có ưu thế hơn trong việc tuyển chọn làm chủng khởi đầu cho việcnghiêncứutạochủngvaccinePRRSnhượcđộc.

Ngoài ra, tính sinh miễn dịch bảo hộ là một trong những đặc tính quan trọngnhất của chủng virus vaccine Nghiên cứu thực nghiệm kiểm tra khả năng kích thíchsinh miễn dịch tạo kháng thể chống lại virus PRRS bằng phản ứng IPMA đã xácđịnh được chủng virus 02HY có khả năng gây miễn dịch tạo kháng thể kháng virusPRRS trên lợn cao hơn nhiều so với chủng 05TB, hiệu giá kháng thể trung bìnhchủng 02HY là 1/3.620,386, chủng 05TB là 1/735,17 với liều gây nhiễm như nhau1ml 104TCID 50 /lợn (Bảng 3.5) Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng virus 02HY cótính kháng nguyên cao nên khả năng kích thích sinh miễn dịch ở lợn cao hơn nhiềuso với chủng virus 05TB Đây là tiêu chí rất quan trọng để lựa chọn chủng virusPRRSlàmchủngđộclựcđểtạogiốnggốc.

Trongsảnxuấtvaccinethìngoàinhữngtiêu chímangtínhchấtchìakhóalà tạo ra được vaccine có tính an toàn và hiệu lực cao thì tiêu chí về năng suất củachủng virus vaccine được tạo ra trong một môi trường nuôi cấy tế bào có ý nghĩaquan trọng đối với giá thành vaccine Do đó, tiêu chí lựa chọn khả năng thích nghivà nhân lên của virus trên tế bào Marc 145 cũng rất quan trọng, đánh giá thông quađộ biến động về trị số TCID50, cũng từ đó xác định được thời điểm thu virus thíchhợp nhất là thời điểm virus có hiệu giá virus cao nhất Kết quả (Bảng 3.6; Hình 3.3)nghiêncứukhảnăngsi n h trưởng, p há t triểncủ achủngv i ru s PR R S 02HYc ư ờ n g độc sau gây nhiễm 24 giờ virus bắt đầu quá trình sinh trưởng, hàm lượng virus pháttriển tăng dần theo thời gian nhiễm và đạt cao nhất từ 80-96 giờ sau nhiễm là106.43TCID 50 /ml đến 106.63TCID50/ ml Đây là thời điểm thu hoạch virus tốt nhất vàhiệu giá virus ổn định nhất Kết quả này tương đương với kết quả nghiên cứu của(Fenget al., 2007; Nguyễn Bá Hiên và cs 2013; Lê Thị Toan và cs 2016; Phạm VănSơnvàcs2017).

Từ những kết quả nghiên cứu nêu trên có thể thấy chủng virus PRRS 02HYcườngđộccóđầyđủcácđặctínhnổitrộiđápứngcácyêucầunghiêncứutiếptheođểpháttriểnthàn hchủngvirusvaccinePRRS,gồm:

1) Là chủng virus lưu hành tại Việt Nam, gây bệnh thực nghiệm trên lợn đặctrưngvớitriệuchứnglâmsàng,bệnhtíchđạithể,vithểđiểnhình,virushuyếtkéodài;

2) Tínhkhángnguyên cao, kíchthích miễn dịchsinhkhángthểcaotrênlợn;

Như vậy, có thể kết luận: Chủng virus 02HY cường độc đảm bảo các tiêu chílàmứngviênđểtạogiốnggốc nhượcđộcchochếtạovaccinePRRS.

VềnghiêncứutạochủngvirusPRRSnhượcđộcbằngcấytruyền liêntiếptrên môi trườngtếbào Marc145

Mộtsố loạiv a c c i n e n h ư ợ c đ ộ c đ ã đ ư ợ c s ả n x u ấ t t h à n h c ô n g t r ê n t h ế g i ớ i vàc h o t h ấ y hiệuq u ả c a o t r o n g p h ò n g c h ố n g d ị c h b ệ n h P R R S x ả y r a n g o à i t h ự c địa Về nguyên lý chung, để tạo chủng virus PRRS nhược độc làm giống gốc sảnxuấtv a c c i n e , c h ủ n g v i r u s P R R S c ư ờ n g đ ộ c đ ư ợ c c ấ y t r u y ề n ( p a s s a g e ) n h i ề u đ ờ i liên tiếptrênmôi trường tế bàoMarc145để tạo thành chủng virus PRRSn h ư ợ c độc,hãngBoehringerIngelheimCorpđãcấytruyền37đời(Allende etal.,2000), hãng Hippra Corp đã cấy truyền 20 đời (Burchet al., 1999), Hanet al., 2009 đã cấytruyền 80 đời, Tianet al., 2007 đã cấy truyền 112 đời, Lenget al., 2012 đã cấytruyền 92 đời, Yuet al, 2015 cấy truyền 82 đời, Trịnh Đình Thâu và cs, 2018 cấytruyền 90 đời Sau đó giống sẽ được kiểm tra đặc tính nhân lên, đặc tính sinh miễndịch,đặcđiểm gen,độclựccủavirustrên tếb à o d ò n g M a r c 1 4 5 v à t r ê n b ả n độngvậtđểkhẳngđịnhgiốngnhượcđộchoàntoànv àantoàntrênlợn. Áp dụng nguyên lý trên, chủng virus PRRS 02HY cường độc được tiến hànhcấy truyền liên tiếp trên tế bào Marc 145, cách 10 đời cấy truyền tiến hành chuẩn độhiệu giá virus một lần Từ đời cấy truyền thứ 50 trở đi, cách 10 đời cấy truyền tiếnhành kiểm tra tính sinh miễn dịch của chủng 02HY trên lợn thông qua đánh giá hàmlượng kháng thể có trong máu lợn được gây nhiễm, đồng thời kiểm tra độc lực củavirus trên lợn Sau quá trình cấy truyền trên tế bào, chủng virus PRRS 02HY thíchnghitrênmôitrườngtếbàoMarc145thểhiệnquasựtănghiệugiávirus,từhiệu giábanđầuđạt104.9TCID50/mlsau80đờihiệugiávirustrungbìnhđạt106,7TCID50/ml Từ khoảng đời 50, chỉ số nhân lên của virus dường như tăng rấtchậm hoặc không tăng, đạt giá trị cao nhất và ổn định (Bảng 3.7; Hình 3.4). Cácvirust i ế p đ ờ i 8 0 đ ư ợ c n h â n l ê n v à b ả o q u ả n ở -

8 0 o Cđ ể g i á m đ ị n h c á c đ ặ c t í n h giống virus vaccine nhược độc, kết quả phù hợp với (Hanetal.,2009)đ ã c ấ y truyềnvirusPRRS80đời.

Tính sinhmiễndịchcủa chủngvirusdùngtrong sản xuất vaccinelàm ộ t trong hai tính chất quan trọng nhất của chủng dự truyển vaccine Do đó, tính chấtnày của chủng PRRS 02HY đã được kiểm tra liên tục qua các đời cấy truyền khácnhau.Kếtq uả c h o thấy,c h ủ n g v i r u s P RR S0 2 H Y tuycóth ay đổivề m ộ t s ố tí nhchất như khả năng nhân lên trên môi trường tế bào Marc 145, độc lực giảm dầnnhưngvẫngiữ đượctínhkhángnguyênổnđịnh,kíchthíchtạođápứngmiễndịchtốt trên các lợn từ 1/2.560 đến 1/3.620,386, từ đời P70, P80 hiệu giá kháng thể ổnđịnh,đạtcaonhất1/3.620,386(Bảng3.8).

Một đặc tính quan trọng nữa của chủng virus nhược độc dự tuyểns ử d ụ n g chếtạovaccinelàđộclực củachủngvirusđó.Virusnhượcđộctạođượcph ảicóđộclựcthấp,khônggâybệnhcholợnvàcótínhổnđịnhcao.Việckiểmtrađộclực của chủng giống được tiến hành trên các đời cấy truyền virus: P1, P50, P60, P70,P80, trong khi các lợn được tiêm virus ở các đời cấy truyền P50 và P60 liều tiêm106,0TCID 50 cao hơn đời P1 nhưng lợn chỉ có biểu hiện sốt nhẹ (cao hơn thân nhiệtbình thường 0,5 o C), không có biểu hiện bệnh lý của lợn mắc PRRS Với những lợntiêm virus ở đời cấy truyền P70 và P80 không quan sát được hiện tượng lợn sốt.Điều này chứng tỏ độc lực của virusđời P1rất cao, saukhic ấ y t r u y ề n l i ê n t i ế p virus trên môi trường tế bào Marc 145 đến đời cấy truyền P50 và P60 virus đã giảmđộclựcnhiềuchỉcòngâysốtnhẹcholợn,vàđếnđờicấytruyềnP70vàP80virusđã giảm độc lực hoàn toàn gần như không có hiện tượng lợn sốt và không gây cácbiểu hiện bệnh lý (Bảng 3.9), hiệu quả làm giảm độc lực tương đương với nghiêncứucủaTrịnhĐìnhThâuvàcs2018khicấytruyềnvirusKTY-PRRS-

Một tiêu chí rất quan trọng đối với vaccine nhược độc là khả năng tạo đápứngm i ễ n d ị c h s ạ c h ( s t e r i l e i m m u n i t y ) , c ó n g h ĩ a l à v i r u s p h ả i đ ư ợ c l o ạ i b ỏ h o à n toàn sau khi gây miễn dịch và không bài thải ra môi trường Chỉ tiêu về virus huyếtlàyếu tố quan trọng để đánh giá đápứng miễn dịch sạch củam ộ t v a c c i n e n h ư ợ c độc Kết quả khảo sát virus huyết của chủng virus PRRS 02HY cho thấy, ở đời cấytruyền P70 và P80 sau khi gây nhiễm trên lợn đến ngày thứ 6 số lợn có virus huyếtđã giảm với tỉ lệ 40% và chỉ kéo dài virus huyết đến ngày 9 với tỉ lệ thấp, ngày thứ12khôngcòn vi ru s huyết Đ iề u nàychứngtỏvirus PRRSđờ iP1tínhcườngđ ộc còn nguyên của chủngđộc lực, virus huyếtkéo dài, sau khic ấ y t r u y ề n l i ê n t i ế p virus trên môi trường tế bào Marc 145 đến đời cấy truyền P50 và P60 virus đã giảmđộc lực và đến đời cấy truyền P70 và P80 virus đã giảm độc lực hoàn toàn khôngcònhiệntượng virushuyếtkéo dài(Bảng3.10;Hình3.5).

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu kiểm tra các đặc tính sinh học, chủng virusPRRS 02HY nhược độc hóa được tiếp tục nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử vềhệ gen, tính thuần khiết, vô trùng an toàn, hiệu lực để ứng dụng chế tạo vaccinePRRSnhượcđộcTCVN8685-12:2014vàđượcđặttênlàHanvet1.vn.

3.306 A, 4.036 C, 3.995 G và 3.939 T, tỷ lệ A+T chiếm 47,42%, G+C chiếm52,68%, có 8 khung đọc, mã hóa cho 8 protein, hệ gen được đăng ký trên Genbankvới mã số KU842720 (Hình 3.7; Bảng PL3.1) Đây là cơ sở dữ liệu quan trọng đểtheo dõi sự biến đổi di truyền liên quan tới giá trị bảo hộ của vaccine trong quá trìnhchếtạo, sử dụng vaccine.

Phân tích các biến đổi di truyền chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc sovới chủng virus PRRS 02HY cường độc ban đầu (Bảng 3.11 và Phụ lục Bảng:PL3.2;P L 3 3 ; P L 3 4 ; P L 3 5 ; P L 3 6 ; P L 3 7 ; P L 3 8 ; P

Hanvet1.vn nhược độc có 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin nằm rảirác trong 7 gen mã hóa cho 7 protein tương ứng NSP1a, NSP1b, GP2, GP3, GP4,GP5,

MP, protein NP do gen ORF6 mã hóa không có sự biến đổi axit amin Kết quảnghiên cứu này có sự khác biệt so vớiL e n get al, 2012 khi nghiên cứu chủngcường độc TJ cấy truyền 92 đời để tạo chủng virus TJM nhược độc làm vaccine đãcó sự mất đoạn 120 axit amin. Yuet al, 2015 khi nghiên cứu chủng cường độcJXA1 cấy truyền 82 đời để tạovirus nhược độc làm vaccine đãc ó s ự b i ế n đ ổ i

4 7 axitamin.Cácbiếnđổiaxitamintrênproteincủachủng02HYnhượcđộcđều làđột biến điểm từ 1 đến 3 axit amin liên tiếp dạng đột biến thay thế, không có độtbiến mất axit amin, trong đó 2 protein không cấu trúc NSP1a và NSP1b do genORF1a và ORF1b mã hóa có biến đổi nhiều axit amin nhất lần lượt là 25 và 11 axitamin Biến đổi này có thể liên quan đến thay đổi độcl ự c c ủ a v i r u s P R R S k h i s o sánh với Tianet al., 2007 và Fenget al., 2007 trong nghiên cứu trên hệ gen củachủng virus PRRS độc lực cao từ Trung Quốc lây lan sang Việt Nam năm 2006.Nghiên cứu Tianet al., 2007 và Fenget al., 2007 đã ghi nhận thay đổi 30 axit amintrên vùng NSP2 thuộc protein không cấu trúc do ORF1a phiên mã có liên quan đếnthay đổi độclực của virus Hơnnữa, đột biến thay thếaxit aminL e u c i n e ( L ) t r ê n các protein là đột biến quan trọng có thể liên quan đến thay đổi độc lực của virus(Tian etal.,2007 và Feng etal.,2007) Ngoài ra các đột biến thay thế các axit aminProline (P), Asparagine (N) và Phenylalanine (F) trên các protein là những đột biếnquan trọng vì protein Proline (P), Leucine (L) là 2 trong 10 axit amin sinh proteinthườngnằmởcấutrúctrungtâmcủavòngxoắnvà độtbiếnthaythếCystein(C) bằng Arginine (R) cũng là đột biến quan trọng ảnh hưởng tới liên kết S-S trong cấutrúcbậc 3vàbậc4củaprotein(NguyễnNgọcHảivàcs,2015).

Protein GP5 do gen ORF5 mã hóa nằm trên bề mặt hạt virus và đóng vai tròquan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào vật chủ, chứa vùng mangkháng nguyên quan trọng có liên quan đến khả năng trung hòa virus của kháng thể(Deaet al., 2000) Gen ORF5 có sự đột biến thay thế2 n u c l e o t i d e v à 1 a x i t a m i n của protein GP5 giữa chủng virus PRRS Hanvet1.vn so với chủng gốc 02HY cườngđộc ban đầu Kết quả có sự khác biệt về vị trí và số lượng nucleotide và axit aminkhi so sánh với nghiên cứu của Trịnh Đình Thâu và cs 2018 khi cấy truyền virusKTY-PRRS-06 Nam Định sau 90 đờic ấ y t r u y ề n t r ê n t ế b à o M a r c 1 4 5 c ó s ự đ ộ t biến thay thế 13 nucleotide và 8 axit amin Lenget al., 2012 sau cấy truyền 92 đờivirus TJ có sự đột biến thay thế 4a x i t a m i n ở p r o t e i n G P 5 T u y n h i ê n , b i ế n đ ổ i 1 axit amin ở vị trí không thuộc các epitope của kháng nguyên GP5 Kết quả nghiêncứu cho thấy, sau khi cấy truyền 80 đời, mặc dù các gen của chủng Hanvet1.vn cóbiến đổi so với chủng độc lực 02HY làm nó trở thành chủng nhược độc nhưng genmã hóa protein kháng nguyên GP5 kích thích sinh kháng thể trung hòa trên lợnkhôngthayđổitínhkhángnguyên.

Hệg e n v i r u s P R R S H a n v e t 1 v n n h ư ợ c đ ộ c đ ư ợ c s o s á n h v ớ i 3 c h ủ n g đ ạ i diện cho Việt Nam (07QN), Trung Quốc (07NM) và chủng virus PRRS type BắcMỹ chuẩn quốc tế (VR2332) theo công bố của (Feng Yet al., 2008) để so sánh trìnhtự axit amin của tất cả 8 khung đọc Kết quả cho thấy sự tương đồng 100% về trìnhtựaxitamincủaproteinGP5chủngHanvet1.vn nhượcđộcsovớichủngđạidi ệnlưuhànhởViệtNam07QN(Bảng 3.12).

Với mục tiêu tạo giống gốc cho sản xuất vaccine PRRS nhược độc nội địa từvirus PRRS thu thập từ lợn bệnh tại ổ dịch bùng phát ở một số tỉnh ở Việt Namnhằm tạo vaccine có tính tương đồng cao về kháng nguyên so với các chủng độc lựcđang lưu hành tại Việt Nam Tiếp tục so sánh trình tự nucleotide gen ORF5 mã hóakháng nguyên GP5 (là kháng nguyên vỏ phổ biến và quan trọng nhất có vai trò kíchthích miễn dịch tạo kháng thể trung hòa virus PRRS) với protein kháng nguyên

GP5của26chủngPRRSđộclựclưuhànhởcáctỉnhcủaViệtNam.Kếtquảsựtươn g đồng về trình tự nucleotide gen ORF5 cao nhất là 99% so với các chủng virus PRRSlưu hành ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng như Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng, HàNội, Nam Định, Thái Bình và thấp nhất là 94-96% so với các chủng virus PRRS thunhậnt ừ Y ê n B á i v à N g h ệ A n ( H ì n h 3 1 0 ; P h ụ l ụ c ( P L 3 1 0 ; P L 3 1 3 ) ) S ự t ư ơ n g đồng về trình tự axit amin của protein kháng nguyên GP5 chủng Hanvet1.vn nhượcđộc cao nhất so với các chủng thu nhận từ Hưng Yên, Hải Phòng và Hà Nội (đạt99%); thấp hơn sau đó là các chủng thu nhận từ Bắc Ninh, Nam Định, Bắc Giang(chủng KTY do học Viện Nông nghiệp

Việt Nam phân lập) và Sơn La (đạt 98%)(Hình3.11;Phụlục(PL3.10;PL3.13)).

Các kết quả phân tích so sánh trên giữa chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhượcđộcvớicácchủngvirusPRRSđộc lựcphânlậpởViệtNamcómốiquanhệgầ ngũiv ớ i n h a u , t í n h t ư ơ n g đ ồ n g g e n v à k h á n g n g u y ê n c a o , n h ấ t l à v ớ i c á c c h ủ n g virus PRRS thuộc khu vực đồng bằng Sông Hồng đến 99% là thông tin quan trọngvề sự tương đồng kháng nguyên tạo kháng thể trung hòa chống lại chủng virusPRRS lưu hành ở Việt Nam.Điều này cho thấy chủng virus Hanvet1.vn nhược độchoàn toàn đã đáp ứng được yêu cầu về tính kháng nguyên làm giống gốc virusvaccinePRRS.

Vềđ á n h g i á g i ố n g g ố c H a n v e t 1 v n n h ư ợ c đ ộ c s ử d ụ n g c h o c h ế tạovaccinePRRS

Virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc sau quá trình nghiên cứu kiểm tra đảmbảo yêu cầu giống gốc về tính kháng nguyên cao, tính tương đồng gen, khángnguyên với virus gây bệnh đang lưu hành, tính ổn định, phát triển thích nghi trêntrên tế bào dòng Marc 145 Tiếp tục nghiên cứu đánh giá virus giống gốc về tínhthuần khiết (không nhiễm vi khuẩn, nấm mốc, virus ngoại lai khác ngoài virusPRRS), an toàn khi gây nhiễm virus PRRS cường độc cho ít nhất 5 đời lợn liên tiếp.Theo đó, nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy, liều gây nhiễm virus trên tế bàoMarc 145, thời gian thu hoạch virus để có năng suất cao khi nhân giống chế tạovaccinePRRSvàđiềukiệnbảoquảngiốnggốc.

Giống gốc Hanvet1.vn cũng được đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch bảohột r ê n l ợ n t h ô n g q u a k h ả o n g h i ệ m đ á n h g i á h i ệ u l ự c v a c c i n e H a n v e t 1 v n n h ư ợ c độc (Vaccine được chế tạo từgiống gốc virus PRRS Hanvet1.vn) tiêm phòng PRRStrên lợn nuôi tại một số trang trại tại Hưng Yên, Bắc Ninh và Hòa Bình Một số kếtquảđạtđượcnhư sau:

Về chỉ tiêu thuần khiết (Bảng 3.13; Hình 3.12) cho thấy giống virus PRRSnhược độc không bị tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc, đạt chỉ tiêu vô trùng Kết quảkiểm tra virus ngoại lai để xác định sự tạp nhiễm với một số virus, vi khuẩn gâybệnh ở lợn thường có triệu chứng và bệnh tích tương tự, dễ nhầm lẫn với PRRS là:Porcineepidemicdiarrheavirus(PEDV),Transmissiblegastroenteritisvirus(TGEV), Classical swine fever virus (CSFV), Porcine circovirus type 2 (PCV2),Porcine parvovirus (PPV) Kết quả nghiên cứu giống gốc Hanvet1.vn không tạpnhiễm virus ngoại lai, chỉ tiêu về tính thuần khiết của giống đạt yêu cầu giống gốctheotiêuchuẩnTCVN8684:2011. Đánh giá độ an toàn của giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc trên lợn(Bảng 3.15; Bảng 3.16) cho thấy giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc không gâycáctriệuchứnglâmsàng,rấtantoànđốivớilợn, khảnăngtăngtrọngtrung bìnhcủalợnsaukhitiêmgiữa cáclôthínghiệm và lôđốichứng khôngtiêm, lợ nđềuphát triển bình thường Mức tăng trọng tương đương nhau từ 4,125 kg đến 4,250 kg(Kểcảkhiđượctiêmvớiliềuviruscaogấp20lầnliềusửdụngthôngthườngđối với liều vaccine PRRS nhược độc theo tiêu chuẩn TCVN 8685-12:2014) và phù hợpvới kết quả của Yuet al.,

2015 khi tạo vaccine nhược độc JXA1 từ chủng độc lựccaoởTrungquốcsau82đờicấytruyền(passage). ĐánhgiátínhkíchthíchtạođápứngmiễndịchởlợncủagiốnggốcHanvet1.vn nhược độc, đây là một trong những chỉ tiêu cơ bản của giống virus chochế tạo vaccine Khả năng sinh kháng thể (Bảng 3.17) có thể nhận thấy ở liều miễndịch 103TCID 50 và104TCID50hiệu giá kháng thể trung bình thấp, ở liều miễn dịch105TCID50đến2x106TCID50chohiệugiákhángthểcao,trungbìnhđạttừ1/3.620,386 đến1/4.305,389 Như vậy ở liều miễn dịch 105TCID50/lợn, kháng thểmiễn dịch tạo ra ở mức cao và ổn định, lợn không có biểu hiện bệnh lý mắc PRRSvề triệu chứng lâm sàng và mức độ nhiễm virus huyết Kết quả nghiên cứu có sựtương đồng với nghiên cứu của Lenget al., 2012 và Yuet al., 2015 khi nghiên cứuvềvirusvaccinePRRSnhược độc.

Một đặc trưng của hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là virus huyết.Virus huyết có thể xác định bằng phân lập có giá trị về bệnh sinh và truyền nhiễm,cũngcóthểxácđịnhbằngphươngphápsinhhọcphântửrRT-PCRcógiátrịxácđịnhsự hiện diện của virus, thậm chí là dấu vết của virus còn tồn dư Theo dõi cả hai chỉtiêu để đánh giá virus huyết, là cơ sở cho nhận xét về tính bảo hộ của vaccine nhượcđộcchếtạotừgiốnggốcvirusHanvet1.vnnhượcđộc.Cáclôlợngâymiễndịchbằnggiống gốc Hanvet1.vnnhược độc (Bảng 3.18) không phân lập được virus, kết quảgiámđịnhvirusbằngrRT-PCRcònrảirácdấuvếtvirus.Trongkhiđólợnđốichứngcó virus huyết cao đến thời điểm 21 ngày sau khi công cường độc, kết quả có sựtươngđồngvớinghiêncứucủaLengetal.,2012vàYuetal.,2015.

Kiểmtrat í n h ổn đị nh, t h í c h ứ ng c ủ a g iố ng v i r u s PRRSH a n v e t 1 v n n h ư ợ c độc trên tế bào dòng Marc 145 Kết quả (Bảng 3.19; Hình 3.13), các đời cấy truyềnvirus, quá trình phát triển và gây bệnh tích tế bào (CPE) đều ổn định, thời gian thudịchvirusở96giờ,hiệugiáđạt106,33TCID 50 /mlđến106,70TCID50/ml.

5đờilợn(Bảng3.20và3.21).Kếtquảchothấytoànbộlợnđượctiếptruyềnquacácđời đều khỏe mạnh, phát triển bình thường, không ốm, không có những triệu chứngbệnh lý của mắc PRRS Như vậy, giống gốc Hanvet1.vn nhược độc đảm bảo an toànđốivớilợnvàkhôngcónguycơcườngđộctrởlại. Để lựachọnloạimôitrườngnuôicấytốiưunhấtchosựpháttriểncủathảmtếbàoMarc145cũngnhưmôitr ườngduytrìsựsinhtrưởngổnđịnhtạođiềukiệntốiưucho quá trình gây nhiễm và nhân lên của virus để đạt hiệu giá virus cao nhất khi thuhoạch.Nghiêncứutốiưucácđiềukiện(Bảng3.22;3.23;3.24;3.25)chothấyđãlựachọnđiềuki ệntốiưumôitrườngnuôicấytếbàolàmôitrườngMEMcóbổsungthêm0,03%Glutamine,0,3%TP Bvới5%huyếtthanhbàothaibê(FBS).MôitrườngduytrìtếbàokhigâynhiễmlàmôitrườngME Mcóbổsungthêm0,03%Glutamine,0,3%TPBvàbổsung1%huyếtthanhbàothaibêởmứcpH7,2- 7,4làthíchhợpnhất(Alanetal,.1999),hiệugiávirusthuđượcđạtcaonhất106,7TCID50/ml. Đồthịsinhtrưởngvàpháttriểncủavirus(Bảng3.26;3.27,Hình3.14;3.15;

316)chothấyliềugâynhiễmthíchhợpgiốnggốcvirusPRRSHanvet1.vnnhược độc là 0,1MOI (1TCID50/10 tế bào) và thời điểm thu hoạch virus tốt nhất 96 giờ saugâynhiễm,hiệugiávirusđạt106,5TCID50/ml.

Vớimụctiêubảoquảnđểgiữ giống trongthờigiandàivẫnđảmbảođược các đặc tính của giống Nghiên cứu thử nghiệm hai phương pháp bảo quản ở dạngtươi trong điều kiện nhiệt độ lạnh -80 o C và đông khô để giữ giống Kết quả (Bảng3.28; 3.29) điều kiện bảo quản giống gốc (Master seed) thích hợp nhất là ở dạngđôngkhô2 o C -8 o Csẽổnđịnh giốngtrongthờigiandài24tháng.

QuakhảonghiệmhiệuquảvaccinenhượcđộcchếtạotừgiốnggốcHanvet1.vn tiêm phòng cho lợn tại một số trang trại, đánh giá về sự hình thành đápứng miễn dịch và độ dài miễn dịch thông qua xác định hiệu giá kháng thể IPMA vàphản ứng trung hòa trên tế bào (Bảng 3.30; Hình 3.17) Có khác biệt về thời điểmxuất hiện kháng thể xác định bằng IPMA và kháng thể trung hòa virus sau khi tiêmvaccine Kháng thể đặc hiệu được xác định bằng phản ứng IPMA xuất hiện từ rấtsớm, từ tuần đầu tiên và đạt đỉnh ở tuần thứ 5 (1/3.880,23) Trong khi đó, sự xuấthiện của kháng thể trung hòa muộn hơn ở tuần thứ 4 và đạt hiệu giá cao nhất tuầnthứ11ởngưỡng1/21,11vàbảohộlợntrong6tháng. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vaccine khi thử thách với virus VN07196cường độc cho thấy: Sau khi công cường độc, 100% lợn ở lô đối chứng không tiêmphòng đều xuất hiện các triệu chứng của lợn mắc PRRS, lô được tiêm phòng lợnkhỏe mạnh, bình thường (Hình 3.18) Ở lợn đối chứng, hiện tượng virus huyết ở lợnxảy ra 100% (Bảng 3.31) Virus huyết xuất hiện sớm, đạt 104TCID50/ml tại 5 ngàysauc ô n g c ư ờ n g đ ộ c r ồ i g i ả m d ầ n v à đ ế n n g à y t h ứ 1 4 k h ô n g c ò n p h â n l ậ p đ ư ợ c virus Ở lợn tiêm vaccine không phân lập được virus huyết Kết quả trên đã khẳngđịnh thêm về khả năng ngăn chặn hiện tượng virus huyết của vaccine PRRS nhượcđộcsảnxuấttừ chủngHanvet1.vn.

Theo Lopezet al., 2004, hiệu giá kháng thể trung hòa trong máu lợn phải đạtmức 1/8 mới có khả năng ngăn cản hiện tượng virus huyết khi công cường độc cholợn Tuy nhiên trongn g h i ê n c ứ u n à y , c h ỉ v ớ i h i ệ u g i á k h á n g t h ể t r u n g h ò a t r u n g bình ở mức 1/1,19, tất cả lợn đã tiêm vaccine được bảo hộ và không bị virus huyết.Kếtquảtươngđồng vớinghiêncứucủa(Yuetal.,2015)vềtínhantoànvàhi ệu quả của chủng virus vaccine nhược độc JXA1-R, nhưng lại có sự khác biệt vớinghiêncứucủa(LopezvàOsorio,2004; Lopezet al.,2007).

Về trọng lượng lợn được tiêm và không tiêm vaccine sau khi công cường độc(Bảng 3.16) cho thấy có sự khác biệt rõ rệt sau công cường độc 21 ngày, lợn tiêmvaccine được bảo hộ hoàn toàn với virus cường độc nên vẫn khỏe mạnh, không bịvirushuyết,tăngcânbìnhthường,khốilượngsovớibanđầuđạt72,23%.Lợnkhôngtiêmcócácbiểu hiệnbệnhlýrấttrầmtrọngnhưsốtcaokéodàiliêntiếp3ngày,ủrũ,bỏăn,xuấthuyếtdưới da,virushuyếtxuấthiệnvàkéodàiđến14ngàysaukhicôngcường độc Các biểu hiện bệnh lý này làm cho lợn sinh trưởng rất kém, thậm chí cólợncònbịgiảmcânsau21ngàytheodõi.Bệnhtíchphổiđặctrưngmàuđỏxám,mặtcắt lồi và khô, hạch lympho phổi xuất huyết (Hình 3.19) Kết quả nghiên cứu có sựtươngđồngvớinghiêncứucủaLengetal.,2012;Yuetal.,2015khinghiêncứutínhantoànvàhiệu quảcủavirusvaccinePRRSnhượcđộcTJMvàJXA1-R.Tuynhiên,về thời gian bảo hộ trên lợn của vaccinePRRS nhược độc TJM chỉ đạt 4 tháng thấphơnsovớivaccineHanvet1.vnnhượcđộcđạt6tháng.

1 Đã nghiên cứu đánh giá độc lực và chọn được chủng virus PRRS 02HYcường độc gây triệu trứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, vi thể, virus huyết kéo dài,điển hình, đặc trưng của lợn mắc PRRS do PRRSV Virus 02HY thích ứng, pháttriển ổn định trên môi trường tế bào dòng Marc 145, hiệu giá virus là 106,63TCID50,khả năng kích thích miễn dịch sinh kháng thể ở lợn cao đạt

2 Giốngg ố c H a n v e t 1 v n n h ư ợ c đ ộ c t ạ o đ ư ợ c s a u 8 0 đ ờ i c ấ y t r u y ề n t i ế p virus 02HY trên tế bào Marc 15 được phân tích, đánh giá về các đặc tính sinh học,sinh học phân tử đáp ứng chỉ tiêu giống gốc cho chế tạo vaccine PRRS Hệ gen củaHanvet1.vn nhược độc (mã số trên Genbank KU842720) khi phân tích so sánh vớichủng 02HY cường độc ban đầu (số đăng Genbank Submission 2490633) có 89 độtbiến nucleotide và 51 đột biến axit amin nằm rải rác trong 7 gen và 7 protein tươngứng Cácgen có biếnđổi làm chủngHanvet1.vn thànhnhược độc nhưng genm ã hóa protein kháng nguyênq u a n t r ọ n g G P 5 k í c h t h í c h m i ễ n d ị c h s i n h k h á n g t h ể trung hòa không thay đổi tính kháng nguyên Trình tự gen ORF5 và protein GP5chủng Hanvet1.vn nhược độc có tương đồng cao từ 94% - 99% so với 29 chủngvirus PRRS thu nhận từ hơn 20 tỉnh thành trong nước và khu vực, điều này có ýnghĩaquantrọngvềtínhtươngđồng kháng nguyênvà hiệuquảbảohộcủavaccine.

3 Giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc đạt tiêu chuẩn về tính thuầnkhiết, an toàn, tính kháng nguyên cao kích thích tạo đáp ứng miễn dịch trên lợn ởliều miễn dịch 105TCID 50 , hiệu giá kháng thể đạt đến 1/4.305,389, tối ưu các điềukiệnnuôicấy,liềunhiễmvirustrêntếbàoMarc145vàthờigianthuhoạchvi rusđạt năng suất cao, hoạt lực ổn định đạt 106,5TCID 50 , điều kiện bảo quản giống gốcđông khô ở nhiệt độ 2-8 o C, ổn định giống trong 24 tháng, vaccine PRRS chế tạo từgiốnggốcHanvet1.vncóđộdàimiễndịchbảohộtrênlợnđến 6tháng.

Tiếp tục thu thập các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam và so sánh vớichủng gốc để đánh giá biến đổi di truyền của virus PRRS làm cơ sở đánh giá hiệulựcvaccine.

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG

1 Nguyễn Thị Nga, Tô Long Thành, Đỗ Thị Hoa, Ngô Thị Thùy Vân

(2015),Ứng dụng kỹ thuật IPMA chẩn đoán kháng thể kháng virus PRRS,Tạp chíKhoa học Đại học Quốc gia Hà Nộị: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ,31(4S):238-245.

2 Nguyễn Thị Nga,Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Vũ Thị Hiền, Trần Thị

Định dạng
Số trang	183
Dung lượng	2,24 MB