Nghiên cứu tạo chủng virus prrs (porcine reproductive and respiratory syndrome) nhược độc và đánh giá khả năng làm giống phục vụ sản xuất vaccine

VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM VIỆNCÔNGNGHỆSINHHỌC NGUYỄNTHỊNGA NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS PRRS (PORCINEREPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME)NHƯỢC ĐỘC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÀM GIỐNGPHỤCVỤSẢNXUẤTVACCINE LUẬNÁN TIẾNSĨSINH HỌC HÀNỘI -2022 NGUYỄNTHỊNGA NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS PRRS (PORCINEREPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME)NHƯỢC ĐỘC VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÀM GIỐNGPHỤCVỤSẢNXUẤTVACCINE Chuyên ngành: Hóa sinh họcMãsố:9420116 LUẬNÁN TIẾNSĨSINH HỌC Ngườihướngdẫnkhoahọc:1.PGS.TS.ĐinhDuyKháng Viện Cơngnghệsinh học 2.PGS.TS.TơLongThành TrungtâmChẩn đốnThúYT r u n g ương HÀNỘI -2022 LỜICAMĐOAN Tôixincamđoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cáccộngsự khác; Các kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, kháchquan, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với sựđồngývàchophépcủa đồngtácgiả; Phầncịnlạichưađượcaicơngbốtrongbấtkỳcơngtrìnhnàokhác Tơi cam đoan thơng tin trích dẫn luận án rõnguồngốc HàNội,ngày tháng0 năm2022 Tácgiả luận án NguyễnThịNga LỜICẢMƠN Để hoàn thành luận án, cố gắng thân, tơi nhận sựgiúp đỡ tận tình tạo điều kiện nhiều cá nhân tập thể giúp đỡ tơi trongsuốtqtrìnhnghiêncứu,học tập Cho phép tơi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Đinh Duy Khángnguyên Trưởng phịng Vi sinh phân tử, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâmKhoa học vàCông nghệViệt Nam.Thầy trực tiếp hướng dẫnk h o a h ọ c đ ã t â m huyết, tận tình, hướng dẫn tơi, định hướng, động viên tơi suốt q trình nghiêncứuvàhồnthànhluậnán Tơix i n b y t ỏ l ò n g b i ế t n s â u s ắ c đ ế n P G S T S T ô L o n g T h n h n g u y ê n GiámđốcTrungtâmChẩnđốnThúyTrungương,CụcThúy.Thầyđồnghướngdẫn khoa học tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, bảo động viên tơitrongsuốtthờigianhọc tập,nghiêncứuvàhồnthànhluậnán Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán phịng Vi sinh phân tử,ViệnCơngnghệsinhhọc,ViệnHànlâmKhoahọcvàCơngnghệViệtNamvàtậpthểcánbộTrungtâ mChẩnđốnThúyTrungương,CụcThúyđãtạomọiđiềukiệnthuậnlợi,giúpđỡtơitrongqtrình họctập,nghiêncứuthựchiệnđềtàikhoahọc Tơi xin gửilời cảm ơn chân thành tớiBanLãnh đạo,tập thểcánb ộ T r u n g tâm Nghiên cứu sản xuất sinh phẩm dược thú y Hanvet tạo điều kiệnthuậnlợi,giúpđỡtơitrongsuốtqtrìnhnghiêncứuhồnthànhluậnán Tơixinđượccảmơn: - Ban Lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học côngnghệViệtNamđãtạođiềukiệnchotôiđượchọc tậpvànghiêncứu - Ban Lãnh đạo Viện Khoa học Công nghệ, Bộ Công an đồngnghiệp quan, nơi công tác tạo điều kiện cho q trìnhthựchiệnnhiệmvụhọctập Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới gia đình tơi bạn bè đãchia sẻ khó khăn, động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi, giúp tơi hồn thành qtrìnhhọc tậpvànghiêncứu Nội,ngày tháng năm2022 Tácgiảluậnán NguyễnThịNga MỤCLỤC Trang MỞĐẦU CHƯƠNG1:TỔNGQUANTÀILIỆU 1.1 Hộichứngrốiloạnsinhsảnvàhôhấpở lợn .5 1.1.1 Lịchsửxuấthiệnhộichứngrốiloạnsinhsảnvàhơhấpởlợn(PRRS) .5 1.1.2 TìnhhìnhPRRStrênthế giới vàở ViệtNam 1.1.3 Triệuchứnglâmsàng củalợn mắcPRRS .9 1.1.4 BệnhtíchPRRS 11 1.1.5 Tácnhân gâybệnhvàconđườngtruyềnlâyPRRS 11 1.1.6 Cơchếbệnhsinh 12 1.2 Virusgâyhộichứngrốiloạnsinhsảnvàhôhấpởlợn 13 1.2.1 Nguồngốc,phânloạivirus PRRS 13 1.2.2 Cấutrúc,chứcnănghệgenvirusPRRS 15 1.2.3 ĐadạngditruyềnhệgenvirusPRRS .18 1.2.4 Cácproteinkhángnguyên quantrọngcủavirusPRRS 19 1.2.5 Đápứngmiễn dịch củalợnkhivirusPRRSxâmnhiễm 21 1.2.6 SứcđềkhángcủavirusPRRS .23 1.2.7 ĐặcđiểmnuôicấyvirusPRRS .23 1.3 NghiêncứutạovaccinePRRS .24 1.3.1 Kháiniệm 24 1.3.2 CácloạivaccineđượcnghiêncứuphòngPRRS .25 1.3.3 Mộtsố nghiêncứuvềvaccinePRRS ởViệtNam 29 1.3.4 Nghiêncứutạovaccinenhược độcphòngPRRS 31 1.3.5 Giốnggốctrongsảnxuấtvaccine 32 1.3.6 Yêucầucủagiốnggốc 32 1.3.7 MộtsốphươngphápbảoquảngiốnggốcvirusPRRS 33 CHƯƠNG2:ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU .35 2.1 Đốitượng,vậtliệunghiêncứu 35 2.2 Phươngphápnghiêncứu .36 2.2.1 Phươngphápmổkhám .36 2.2.2 Lấymẫuxétnghiệmkhángnguyên .36 2.2.3 Lấymẫuxétnghiệmkhángthể .36 2.2.4 Xửlýbệnhphẩm 37 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 2.2.9 2.2.10 2.2.11 Phươngpháp làmtiêu bảnvithể 37 Phươngpháp nuôicấytếbào 38 PhươngphápnhânvirusPRRS .39 Phươngpháp xácđịnh hiệugiávirus 39 PhươngphápcấytruyềnvirusPRRS .40 Phươngpháp xácđịnhquyluậtsinhtrưởngcủavirus 40 Phươngpháptrunghòavirus( p h n g p h p v i r u s c ố đ ị n h v h u y ế t thanhphaloãng) 41 2.2.12 PhươngphápRealtimeRT-PCR 42 2.2.13 Phươngphápthiếtkếmồi 42 2.2.14 Phươngpháp RT-PCR .44 2.2.15 Phươngpháptáchdịngvàgiảitrìnhtựgen .44 2.2.16 Phươngphápsosánhtrìnhtự genvàtạocâyphảhệ 45 2.2.17 Phươngpháp điệndi 45 2.2.18 PhươngphápIPMA xácđịnhhiệu giákhángthể 45 2.2.19 Phươngpháp đếmtếbàoMarc145 .47 2.2.20 Phươngphápkiểmtravơtrùngthuầnkhiếtvàantồncủavirusgiốnggốc 47 CHƯƠNG3:KẾTQUẢNGHIÊNCỨU 50 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.2 3.2.1 3.2.2 Nghiêncứuđánhgiáđộclựcvàđặctínhsinhh ọ c c h ủ n g v i r u s PRRS02 HYvà 05TB 50 Biểuhiệntriệuchứnglâmsàngởl ợ n g â y n h i ễ m c h ủ n g v i r u s P R R S 02HYvà05TB 50 Khảnăngtăngtrọngcủa lợnthínghiệm 52 Kếtquảkiểmtrabệnhtíchởlợnthínghiệm .53 Kiểmtravirushuyếtở lợnthínghiệm 55 Khảnăngkíchthíchsinhkhángthểởl ợ n c ủ a c h ủ n g v i r u s P R R S 02H Yvà05TB 57 KiểmtrađặctínhnhânlêncủavirusPRRS02HYtrêntếbàoMarc145 59 Nghiên cứutạo chủngvirus PRRSnhượcđộcbằng cấytruyền liên tiếp80đờitrênmôitrườngtếbào Marc145 60 ĐánhgiáđặctínhnhânlêncủachủngvirusPRRS02HYquacácđời cấytruyềntrêntếbàoMarc145 .61 Khả kíchthíchsinhkhángthểởlợncủachủngvirusPRRS02HY quacácđờicấytruyền 62 3.2.3 KiểmtrađộclựccủachủngvirusPRRS02HYquacácđờicấytruyền ởcác đờicấytruyềnP1,P50,P60,P70,P80 64 3.3 NghiêncứuđặctínhsinhhọcphântửcủachủngvirusHanvet1.vnnhượcđộc vàchủng02HYcường độc 66 3.3.1 KhuếchđạicácđoạngenthuộchệgenvirusPRRS 66 3.3.2 Táchdòngcác đoạn genkhuếch đại 67 3.3.3 Kếtquảgiảimã,phântíchhệg e n c h ủ n g H a n v e t v n n h ợ c đ ộ c v 02HYcường độc 68 3.3.4 Phântíchsosánhg e n c h ủ n g H a n v e t v n n h ợ c đ ộ c v i c c c h ủ n g virusPRRSlưuhành ởViệtNamvàthếgiới .73 3.4 ĐánhgiáđặctínhgiốnggốcchủngvirusPRRSHanvet1.vnnhượcđộc 76 3.4.1 Kiểmtrathuầnkhiết 77 3.4.2 KếtquảkiểmtratínhantồncủagiốnggốcHanvet1.vntrênlợn 78 3.4.3 KhảnăngkíchthíchsinhkhángthểcủagiốnggốcHanvet1.vnnhượcđộc .79 3.4.4 Đánhgiáđặc tínhổnđịnhcủagiốnggốcvirus PRRSHanvet1.vn 83 3.4.5 Nghiêncứuđiềukiệnbảoquảngiốnggốc(Masterseed) 92 3.4.6 Đápứngmiễndịchvàđộdàimiễndịchở l ợ n s a u k h i t i ê m v a c c i n e ợcđộcđượcchếtạotừgiốnggốcHanvet1.vn 94 CHƯƠNG4:BÀNLUẬNKẾTQUẢ 100 4.1 Vềnghiê n c ứ u đánh gi độc l ực c hủng v ir us PR R S 02 HY cườ n gđộcV i ệ t N a m c h ọ n l m c h ủ n g ứ n g v i ê n đ ể t o v i r u s g i ố n ggốc PRRSnhượcđộc 100 4.2 VềnghiêncứutạochủngvirusPRRSnhượcđộcbằngcấytruyền liêntiếptrên môi trườngtếbào Marc145 102 4.3 Vềđ n h g i g i ố n g g ố c H a n v e t v n n h ợ c đ ộ c s d ụ n g c h o c h ế tạovaccinePRRS 107 KẾTLUẬNVÀ KIẾNNGHỊ 112 NHỮNGCƠNGTRÌNHCỦAT Á C G I Ả Đ Ã C Ô N G B Ố L I Ê N Q U A N Đ ẾNĐỀ TÀI 113 THESISSUMMARY 114 TÀILIỆUTHAMKHẢO .121 PHỤLỤC 1PL DANHMỤCCÁCKÝHIỆU, CÁCCHỮVIẾTTẮT Chữviếttắt Viếtđầyđủ AEC 3-amino-9-ethylcarbazole CPE Cytopathogeniceffect DNA Deoxyribonucleicacid DMEM Dulbecco'smodifiedeagle'smedium ELISA Enzyme-linkedimmunosorbentassay FBS Enzyme-linkedimmunosorbentassay HE Haematoxylin-eosin IHC Immunohistochemistry IPMA Immunoperoxidase monolayerassay MARC-145 Meatanimalresearchcenter-145 MDS Mysteryswinedisease MLV Modiffiedlivevaccine MOI Multiplicityofinfection MSD Mysteryswinedisease NSP Nonstructuralprotein OD Opticaldensity OIE OfficeInternationaldesEpizooties ORF Openreadingframe PAM Porcinealveolar macrophage PCR Polymerase chainreaction PCV2 Porcinecircovirustype2 PEARS Porcineendemicabortionandrespiratorysyndrome PRRS Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome PRRSV Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus RNA Ribonucleicacid RT-PCR Reversetranscriptasepolymerasechainreaction rRT-PCR Realtimereversetranscriptasepolymerasechainreaction SP Structuralprotein TCID50 50%Tissuecultureinfectivedose TPB Triptosephosphas broth VNT Virusneutralizationtest 02HY Virulentvirusin HungYen,Vietnam 05TB VirulentvirusinThai Binh,Vietnam DANHMỤCCÁCBẢNG Trang Bảng1.1 Tổnghợpcác ổdịchPRRSxảyra ởViệtNamtừ 2007-2016 .8 Bảng1.2 SosánhđặcđiểmhệgencủacácchủngvirusPRRStrênthếgiới 15 Bảng1.3 Hệ gencủavirusPRRSvàcácthôngtinliênquan 18 Bảng1.4 Pháthiệnk h n g t h ể đ ặ c h i ệ u k h n g v i r u s P R R S q u a c c phươngphápxétnghiệm 21 Bảng1.5 Mộtsốvaccinethếhệmới 26 Bảng2.1 Cáccặpmồidùngtrongk h u ế c h đ i đ o n g e n c ủ a h ệ g e n c hủngvirusPRRS02HYvàHanvet1.vn 43 Bảng3.1 Kếtquảb i ể u h i ệ n l â m s n g c ủ a l ợ n g â y n h i ễ m v i r u s P R R S chủng02 HYvà05TB 50 Bảng3.2 Kếtquảtheodõikhảnăngtăngtrọngcủa lợn 52 Bảng3.3 Bệnhtíchđạithểởlợn gâynhiễmvirusPRRS 53 Bảng3.4 VirusPRRStronghuyếtthanhlợnthínghiệmtạicácthờiđiểm thuhuyếtthanh 55 Bảng3.5 Hàml ợ n g k h n g t h ể t r o n g h u y ế t t h a n h l ợ n đ ợ c g â y n h i ễ m bằngchủngvirus02HYvà05TB 58 Bảng3.6 Hiệugiávirusthu đượctạicácthờiđiểmthu hoạch 59 Bảng3.7 HiệugiávirusPRRS02HYsaumỗi10đờicấytruyềntrênmôitrườngtếbà oMarc145 61 Bảng3.8 HiệugiákhángthểkhángvirusPRRS trênlợnsaugây nhiễm virus02HY ởcácđờicấytruyền 63 Bảng3.9 Thânn h i ệ t v t r i ệ u c h ứ n g l â m s n g c ủ a l ợ n g â y n h i ễ m v i r u s PRRS02HYởcácđời cấytruyền P1,P50,P60,P70,P80 64 Bảng3.10 Phânlậpvirustừhuyếtthanhlợnđãgâynhiễmvirusởcácđời cấytruyền 65 Bảng3.11