Nghiên cứu tạo interferon chifn α biểu hiện trên hệ thống tế bào nấm men pichia pastoris và thử nghiệm trên các virus gây bệnh ở gà

BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠIHỌCCẦNTHƠ TĨMTẮTLUẬNÁNTIẾN SĨ Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh HọcMãngành:62420201 NGUYỄNTHỊTHANHGIANG NGHIÊN CỨU TẠO INTERFERON ChIFNαBIỂUHIỆNTRÊNHỆTHỐNG TẾBÀO NẤMMENPichiapastorisVÀTHỬNGHIỆMTRÊ NCÁC VIRUS GÂYBỆNH ỞGÀ CầnThơ,2020 CƠNGTR ÌN H Đ ƯỢ C H O À N TH À N H TẠ I T R Ư Ờ N G ĐẠIHỌCCẦNTHƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Hồ Quảng ĐồNgườihướngdẫnphụ:TS.NguyễnĐăngQuân Luậnánđượcbảovệtrướchộiđồngchấmluậnántiếnsĩcấptrư ờng Họptạ i: ……………………………, Trườ ng Đ i học C ầ n Thơ Vàolúc… giờ… ngày… tháng… năm… Phảnbiện1: Phảnbiện2: Phảnbiện3: Cóthểtìmhiểuluậnántạithư viện: TrungtâmHọcliệu, TrườngĐạihọcCầnThơ ThưviệnQuốcgia ViệtNam DANHMỤCCÁCCƠNGTRÌNHĐÃCƠNGBỐ Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Đăng Quân, HồQuảng Đồ,2020 Hiệu ức chế virus gây bệnh Gumborocủa intereron gà thực nghiệm Tạp chí Khoa học vàCơngnghệViệtNam,số5 (62):48-53 Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Đăng Quân, HồQuảng Đồ,2020 Xây dựng quy trình xác định hoạt tínhsinh học interferon alpha gà (ChIFN-α) Tạp chí) Tạp chí Khoahọc Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 2(111): 103-107 Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Đăng Quân, HồQuảng Đồ,2020.Khả ức chế virus gây bệnh gumborotrên gà tuần tuổi interferon alpha gà Tạp chí KhoahọcĐạihọcMở,sơ15 (7):3-13 Chương 1MỞĐẦU 1.1 Tính cấpthiếtcủaluậnán Trong năm gần, bệnh virus gia cầmngày nguy hiểm, có nhiều loại virus ảnh hưởng đếnsức khỏe suất gia cầm cúm gà, Gumboro,Newcastle.Việcsử dụngcytokinesnhưtácnhânhỗtrợnhằm tăng cường hiệu phòng ngừa điều trị bệnh dovirusởgiacầmđượcquantâmvàngàycàngkhảthinhờsựhỗtrợcủac áckỹthuậtditruyền.Trongđó,ChIFN-α) Tạp chílàmộtcytokine cótiềm ứngdụnglớn trongcơngnghiệpchănni gia cầm ChIFN-α) Tạp chí phần hệ miễn dịch khơngđặc hiệu, yếu tố kích hoạt miễn dịch thường sử dụngliều thấp kèm với vaccine nhằm tăng cường hiệu củavaccine Các gene mã hóa cho ChIFN-α) Tạp chí đượctạodịng,biểuhiệnvàchohoạttínhkhithửnghiệminvitrovà cảin vivotừ năm 1994 Thêm nữa, việc sản xuấtChIFNα) Tạp chívớisốlượnglớnsửdụnghệthốngPichiapastorislàlựachọntốtnhất.hồntồn phùhợptiêuchí:hiệuquảcao; giá thành thấp; đơn giản tiện lợi sử dụng Đâycũng lý hướng đến "nghiên cứu tạoChIFN-α) Tạp chí biểu hệ thống tế bào nấm menPichiapastorisnhằmsửdụngtrongđiềutrịcácbệnhdovirusởgà " 1.2 Mụctiêuvànộidungnghiêncứu 1.2.1 Mục tiêuchung: Tạo ChIFN-α) Tạp chí tái tổ hợp, có khả kháng lạicác virus gây bệnh gà, hướng đến sử dụng thuốcđiều trị bệnh Đồng thời, xây dựng quy trình xácđịnhđơn vịhoạttínhsinhhọccủaChIFN-α) Tạp chí táitổhợp 1.2.2 Nộidungnghiêncứu: Nghiêncứuđược tiếnhànhvới3nộidung: (1) Tạo chủng nấm menPichia pastorismang genemã hóa cho ChIFN-α) Tạp chí có khả biểu hin h thng lờnmentngBioFlođ/Cellienđ115(NewBrunswick)dungtớc h5Lvihmlngcao(>500àg/L)vn nh (2) ỏnhgiỏhottớnhkhỏngviruscaChIFN-) Tp chớtỏithp (rChIFN-α) Tạp chí) biểu nấm menPichia pastoristrongđiềukiệninvitro,inovovàinvivo (3) Xây dựng quy trình xác định đơn vị hoạt tính(IU/mg)củarChIFN-α) Tạp chí 1.3 Đốitượngvàphạmvinghiêncứu 1.3.1 Đốitượngnghiêncứu Đối tượng nghiên cứu protein interferon alpha gàtái tổ hợp (rChIFN-α) Tạp chí) thu nhận từ dịch nuôi cấy nấmmenPichiapastoris 1.3.2 Phạmvinghiêncứu Interferon alpha gà tái tổ hợp (rChIFN-α) Tạp chí)thu nhận từdịchnicấyđượcđánhgiáhoạttínhkhángvirusgâybệnh Newcastle tế bào UMNS/DF1; đánh giá khảnăngngăncảnsựnhânlêncủavirusCúmtrênphơigàvà đánh giá hiệu phòng điều trị bệnh Gumboro gà3tuầntuổi 1.4 Thờigianvà địađiểmthínghiệm Thực từ tháng 10/2013 đến tháng 8/2017 tạiTrường Đại học Cần Thơ, Trung tâm Công nghệ Sinh họcThành phố Hồ Chí Minh, Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tếNhaTrang 1.5 Ýnghĩakhoahọc thựctiễn vàtínhmớicủaluậnán, Hiệnnay,bệnhdovirustrêngiacầmngàycàngnghiêmtrọng.Córất nhiều loại virus ảnh hưởng đến sứckhỏevànăngsuấtgiacầmnhưcúmgà,Gumboro,Newcastle Do đó, việc tìm phương pháp ngừa vàtrị bệnh gia cầm yêu cầu cấp bách Trong đó,việc sử dụng cytokine nhận nhiều quantâm ChIFN-là cytokine có tiềm ứng dụng lớntrongcơngnghiệpchănnigiacầm.ChIFNlàmộtphầncủahệmiễndịchkhơngđặchiệu,cóđặctínhứcchếsựhoạtđộ ngcủamRNAdẫnđếnsựứcchếqtrìnhnhânlênvirus.ỞViệtNam,cácn ghiêncứuvềChIFN-chưanhiều,cũngnhưchưacónghiêncứusảnxuấtChIFNở quy mơ pilot.NghiêncứunàytạocơsởbanđầuchoviệcsảnxuấtChIFN-táitổhợp,có khả kháng lại bệnh virus gây ratrêngà,cótiềmnăngứngdụngcaotrongchănnigiacầmtrong điều kiện ViệtNam,hướngdẫntạochếphẩmdùngtrong phịng ngừa, điều trị bệnh virus gây giacầm Do vậy, nghiên cứu có ý nghĩa khoa học thực tiễncao Luận án cơng trình nghiên cứu xâydựng quy trình sản xuất ChIFN-α) Tạp chí tái tổ hợp hệthống lên men 5L xác định hiệu kháng virus gâybệnhtrêngà(cúm,Newcastle,Gumboro),từđócóthểứngdụng trongphịngngừavàkhutrúcácởdịchkhicódịchbệnh xảy Ngồi ra, luận án xây dựng quy trìnhthườngquyxácđịnhđơnvịhoạttínhcủaChIFN-α) Tạp chí,dễdàngthực cácphịngthínghiệmcơbản.Kếtquảnghiêncứunàychứathơngtinthamkhảocógiátrịchocác TrungtâmKiểmnghiệmSinhhọc.Hơnnữa,nghiêncứunàyđặcbiệt có ý tính quan Kiểm nghiệmthuốc Thú y chưa kiểm tra chất lượng sản phẩminterferondùngchoThúyđanglưuhànhtrênthịtrường 1.6 Bốcục củaluậnán Luậnándài130trang,gồmcácphầngiớithiệu,tổngquan tài liệu, phương pháp nghiên cứu, kết thảo luận,kếtluậnđềnghịvàtàiliệuthamkhảo.Luậnáncó35bảng,60hìnhv à138 tàiliệuthamkhảo Chương2 TỔNGQUANTÀILIỆU Tổng quan tài liệu gồm nội dung với kiến thứctổng quát Nội dung trình bày sơ lược interferon gà(ChIFN) gồm danh pháp, chi tiết interfron alpha gà(ChIFN-α) Tạp chí) vàứng dụng, hệ thống dùng để biểu hiệnChIFN-α) Tạp chí.Nộidung2trìnhbàyvềmộtsốvirusgâybệnh gà bao gồm virus Newcastle, virus gây bệnh Gumborovà virusCúmA.Nộidụng3,trìnhbàyvềhệthốngbiểuhiện protein,pichia pastoris, bao gồm kiến thức cácchủngpichia pastoris, đường biến dưỡng metanol vàquá trình biến đổi sau dịch mã củapichia pastoris, cácvectorbiểuhiệnvàcơchếhìnhthànhchủngmangnhiềubảnsaog enengoạilaicủapichiapastoris.Nộidung4nóivềcácphươngphápxá cđịnhđơnvịhoạttínhcủaChIFNα) Tạp chí,trongđócótrìnhbàyvềcácchọnchủngvirustươngtứngvớidịngtế bào,vàquytrìnhxácđịnhhiệugiáiterferonalpha2bngười,quyđịnhtro ngdượcđiểnViệtNamV Chương3 PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 3.1Vậtliệuthínghiệm Dịng tế bào UMNSAH/DF1 (ATCC)ChủngE.coliDH5αα(NanogenBiopha rma) Chủng Pichia pastoris SMD1168 (his4) (NanogenBiopharma) VectorbiểuhiệnpPIC9K(Invitrogen) Dịch virus Newcastle, Gumboro (Đại học Cần Thơ)DịchvirusH5N1,phơisạchbệnh10ngàytuổi(viện Vaccine& SinhphẩmYtế NhaTrang) GàgiốnglaigiữagàLươngPhượng,TamHồngvàgàcơ ngnghiệp (TrạigàgiốngVĩnhLong) 3.2 Nộidungvàphươngphápnghiêncứu Luậnánthựchiện3nộidungchính,đượctrìnhbàytheosơ đồthínghiệmtổngqthình3.1 Hình3.1 Sơđồ bố tríthínghiệmtổngthể luậnán 3.2.1 Nội dung 1: biểuhiệnChIFNαtáitáitổhợptrênnấmmenPichiapastoris Nộidungnàythựchiệntheosơđồhình3.2 Chỉ tiêu đánh giá: geneChIFN-ααcó trình tự tươngđồng 100% so với trình tự gene bank; chủngpichiapastoriscómanggeneChIFN-α αmọcđượctrênmơitrườngcó chứa G418 nồng độ 10 mg/L; protein biểu bắt cặpđặchiệuvớikhángthểkhángChIFN-α) Tạp chívàkhinicấybiểu hiệnởđiềukiệnnicấylắc,lênmentrênbồn5Lcólượngproteinmụctiê uchiếm80%proteintổngsố Hình3.2 SơđồthínghiệmbiểuhiệnChIFN-α) Tạp chítáitổhợp 3.2.2 Nội dung 2: đánh giá hoạt tính kháng virus củadịchChIFN-α biểu hiệntrêntếbàoPichiapastoris Hoạt tính kháng virus interferon alpha gà tái tổhợpđượcthửnghiệmởđiềukiệninvitro,inovovàinvivo (1) KhảnăngkhángvirusgâybệnhNewcastle(Newcas tle disease virus, NDV) nhiễm lớp đơn tế bàoUMNSAH/DF1(điềukiệninvitro) Bảng 4.1 Kết sàng lọcPichia pastoristái tổ hợp mangnhiều bảnsaogenemụctiêubằngmôitrườngYPDchứakhángsinhG418 G418(mg/ml) Môitrườngsànglọc 10 Sốkhuẩnlạc 112 48 19 4.1.4 Biểu rChIFN-α quy mô nuôi cấy lắc(shaking flask) Kết cho thấy rChIFN-α) Tạp chí bắt đầu xuất từ 24giờ cảm ứng với methanol (bảng 4.2) Kết điện di trêngel Tricine SDS-PAGE cho thấy vạch có kích thướckhoảng 19 kDa tương ứng với ChIFN-α) Tạp chí vạch đậmnhất Phân tích phần mềm ImageJ cho phép ước lượngrằng protein mục tiêu (ChIFN-α) Tạp chí) chiếm 80% proteintổngsốcủadịchlênmen(hình4.4) Bảng 4.2 Hàm lượng protein tổng số tạo q trìnhbiểuhiện ChIFN-α) Tạp chí ởquymơnicấylắc Thờigiancảmứngbiể uhiện(giờ) Proteintổngsố(g /L) 0giờ 24giờ 48giờ 72giờ 3,67a2,1 92,67b2,0 166,67c51,3 217c30,1 * Các chữ số hàng khác sai khác có ýnghĩathốngkê (P