Nghiên cứu tạo interferon ChIFN α biểu hiện trên hệ thống tế bào nấm men pichia pastoris và thử nghiệm trên các virus gây bệnh ở gà TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Mã ngành: 62420201 NGUYỄN THỊ THANH GIANG NGHIÊN CỨU TẠO INTERFERON ChIFN-α BIỂU HIỆN TRÊN HỆ THỐNG TẾ BÀO NẤM MEN Pichia pastoris VÀ THỬ NGHIỆM TRÊN CÁC VIRUS GÂY BỆNH Ở GÀ Cần Thơ, 2020 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Hồ Quảng Đồ Người hướng dẫn phụ: TS Nguyễn Đăng Quân Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:……………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Đăng Quân, Hồ Quảng Đồ, 2020 Hiệu ức chế virus gây bệnh Gumboro intereron gà thực nghiệm Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, số (62): 48-53 Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Đăng Quân, Hồ Quảng Đồ, 2020 Xây dựng quy trình xác định hoạt tính sinh học interferon alpha gà (ChIFN-α) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 2(111): 103107 Nguyễn Thị Thanh Giang, Nguyễn Đăng Quân, Hồ Quảng Đồ, 2020 Khả ức chế virus gây bệnh gumboro gà tuần tuổi interferon alpha gà Tạp chí Khoa học Đại học Mở, sơ 15 (7): 3-13 Chương MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết luận án Trong năm gần, bệnh virus gia cầm ngày nguy hiểm, có nhiều loại virus ảnh hưởng đến sức khỏe suất gia cầm cúm gà, Gumboro, Newcastle Việc sử dụng cytokines tác nhân hỗ trợ nhằm tăng cường hiệu phòng ngừa điều trị bệnh virus gia cầm quan tâm ngày khả thi nhờ hỗ trợ kỹ thuật di truyền Trong đó, ChIFN-α cytokine có tiềm ứng dụng lớn công nghiệp chăn nuôi gia cầm ChIFN-α phần hệ miễn dịch khơng đặc hiệu, yếu tố kích hoạt miễn dịch thường sử dụng liều thấp kèm với vaccine nhằm tăng cường hiệu vaccine Các gene mã hóa cho ChIFN-α tạo dòng, biểu cho hoạt tính thử nghiệm in vitro in vivo từ năm 1994 Thêm nữa, việc sản xuất ChIFN-α với số lượng lớn sử dụng hệ thống Pichia pastoris lựa chọn tốt hoàn toàn phù hợp tiêu chí: hiệu cao; giá thành thấp; đơn giản tiện lợi sử dụng Đây lý hướng đến "nghiên cứu tạo ChIFN-α biểu hệ thống tế bào nấm men Pichia pastoris nhằm sử dụng điều trị bệnh virus gà" 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung: Tạo ChIFN-α tái tổ hợp, có khả kháng lại virus gây bệnh gà, hướng đến sử dụng thuốc điều trị bệnh Đồng thời, xây dựng quy trình xác định đơn vị hoạt tính sinh học ChIFN-α tái tổ hợp 1.2.2 Nội dung nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành với nội dung: (1) Tạo chủng nấm men Pichia pastoris mang gene mã hóa cho ChIFN-α có khả biểu hệ thống lên men tự động BioFlo®/Cellien® 115 (New Brunswick) dung tích 5L với hàm lượng cao (>500µg/L) ổn định (2) Đánh giá hoạt tính kháng virus ChIFN-α tái tổ hợp (rChIFN-α) biểu nấm men Pichia pastoris điều kiện in vitro, in ovo in vivo (3) Xây dựng quy trình xác định đơn vị hoạt tính (IU/mg) rChIFN-α 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu protein interferon alpha gà tái tổ hợp (rChIFN-α) thu nhận từ dịch nuôi cấy nấm men Pichia pastoris 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Interferon alpha gà tái tổ hợp (rChIFN-α)thu nhận từ dịch ni cấy đánh giá hoạt tính kháng virus gây bệnh Newcastle tế bào UMNS/DF1; đánh giá khả ngăn cản nhân lên virus Cúm phôi gà đánh giá hiệu phòng điều trị bệnh Gumboro gà tuần tuổi 1.4 Thời gian địa điểm thí nghiệm Thực từ tháng 10/2013 đến tháng 8/2017 Trường Đại học Cần Thơ, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn tính luận án, Hiện nay, bệnh virus gia cầm ngày nghiêm trọng Có nhiều loại virus ảnh hưởng đến sức khỏe suất gia cầm cúm gà, Gumboro, Newcastle Do đó, việc tìm phương pháp ngừa trị bệnh gia cầm yêu cầu cấp bách Trong đó, việc sử dụng cytokine nhận nhiều quan tâm ChIFN- cytokine có tiềm ứng dụng lớn công nghiệp chăn nuôi gia cầm ChIFN- phần hệ miễn dịch không đặc hiệu, có đặc tính ức chế hoạt động mRNA dẫn đến ức chế trình nhân lên virus Ở Việt Nam, nghiên cứu ChIFN- chưa nhiều, chưa có nghiên cứu sản xuất ChIFN- quy mô pilot Nghiên cứu tạo sở ban đầu cho việc sản xuất ChIFN- tái tổ hợp, có khả kháng lại bệnh virus gây gà, có tiềm ứng dụng cao chăn nuôi gia cầm điều kiện Việt Nam, hướng dẫn tạo chế phẩm dùng phòng ngừa, điều trị bệnh virus gây gia cầm Do vậy, nghiên cứu có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao Luận án cơng trình nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất ChIFN-α tái tổ hợp hệ thống lên men 5L xác định hiệu kháng virus gây bệnh gà (cúm, Newcastle, Gumboro), từ ứng dụng phòng ngừa khu trú dịch có dịch bệnh xảy Ngồi ra, luận án xây dựng quy trình thường quy xác định đơn vị hoạt tính ChIFN-α, dễ dàng thực phịng thí nghiệm Kết nghiên cứu chứa thơng tin tham khảo có giá trị cho Trung tâm Kiểm nghiệm Sinh học Hơn nữa, nghiên cứu đặc biệt có ý tính quan Kiểm nghiệm thuốc Thú y chưa kiểm tra chất lượng sản phẩm interferon dùng cho Thú y lưu hành thị trường 1.6 Bố cục luận án Luận án dài 130 trang, gồm phần giới thiệu, tổng quan tài liệu, phương pháp nghiên cứu, kết thảo luận, kết luận đề nghị tài liệu tham khảo Luận án có 35 bảng, 60 hình 138 tài liệu tham khảo Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan tài liệu gồm nội dung với kiến thức tổng quát Nội dung trình bày sơ lược interferon gà (ChIFN) gồm danh pháp, chi tiết interfron alpha gà (ChIFN-α) ứng dụng, hệ thống dùng để biểu ChIFN-α Nội dung trình bày số virus gây bệnh gà bao gồm virus Newcastle, virus gây bệnh Gumboro virus Cúm A Nội dụng 3, trình bày hệ thống biểu protein, pichia pastoris, bao gồm kiến thức chủng pichia pastoris, đường biến dưỡng metanol trình biến đổi sau dịch mã pichia pastoris, vector biểu chế hình thành chủng mang nhiều gene ngoại lai pichia pastoris Nội dung nói phương pháp xác định đơn vị hoạt tính ChIFN-α, có trình bày chọn chủng virus tương tứng với dịng tế bào, quy trình xác định hiệu giá iterferon alpha 2b người, quy định dược điển Việt Nam V Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu thí nghiệm Dịng tế bào UMNSAH/DF1 (ATCC) Chủng E coli DH5α (Nanogen Biopharma) Chủng Pichia pastoris SMD1168 (his4) (Nanogen Biopharma) Vector biểu pPIC9K (Invitrogen) Dịch virus Newcastle, Gumboro (Đại học Cần Thơ) Dịch virus H5N1, phôi bệnh 10 ngày tuổi (viện Vaccine & Sinh phẩm Y tế Nha Trang) Gà giống lai gà Lương Phượng, Tam Hồng gà cơng nghiệp (Trại gà giống Vĩnh Long) 3.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu Luận án thực nội dung chính, trình bày theo sơ đồ thí nghiệm tổng qt hình 3.1 Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể luận án 3.2.1 Nội dung 1: biểu ChIFN-α tái tổ hợp nấm men Pichia pastoris Nội dung thực theo sơ đồ hình 3.2 Chỉ tiêu đánh giá: gene ChIFN-α có trình tự tương đồng 100% so với trình tự gene bank; chủng pichia pastoris có mang gene ChIFN-α mọc mơi trường có chứa G418 nồng độ 10 mg/L; protein biểu bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng ChIFN-α nuôi cấy biểu điều kiện ni cấy lắc, lên men bồn 5L có lượng protein mục tiêu chiếm 80% protein tổng số Hình 3.2 Sơ đồ thí nghiệm biểu ChIFN-α tái tổ hợp 3.2.2 Nội dung 2: đánh giá hoạt tính kháng virus dịch ChIFN-α biểu tế bào Pichia pastoris Hoạt tính kháng virus interferon alpha gà tái tổ hợp thử nghiệm điều kiện in vitro, in ovo in vivo (1) Khả kháng virus gây bệnh Newcastle (Newcastle disease virus, NDV) nhiễm lớp đơn tế bào UMNSAH/DF1 (điều kiện in vitro) biến nạp vào Ecoli, chọn lọc 04 khuẩn lạc plasmid mang gene Hình 4.2 Phản ứng cắt giới hạn EcoR I Not I kiểm tra diện ChIFN-α rpPIC9K M: thang DNA; Ở giếng 2, 3, xuất vạch vị trí 500 bp tương ứng với kích thước ChIFN-α chứng tỏ chủng có chứa plasmid mang gene Kết giải trình tự plasmid pPIC9K tái tổ hợp cho thấy gene ChIFN-α có trình tự hồn tồn với trình tự lý thuyết 4.1.3 Tạo dịng tế bào Pichia pastoris mang nhiều gene mã hóa cho ChIFN-α Nấm men Pichia pastoris có mang gene ChIFN-α mọc mơi trường MD khơng có histidine Quá trình sàng lọc chủng mang nhiều gene mục tiêu thực môi trường YPD, chứa kháng sinh G418 (geneticin, loại kháng sinh chuyên dùng cho sàng lọc dòng Pichia pastoris chèn nhiều gene mục tiêu) với nồng độ tăng dần 2, 4, 6, 8, 10 mg/ml để sàng lọc dòng tế bào nấm men có mang nhiều gene mục tiêu 13 Bảng 4.1 Kết sàng lọc Pichia pastoris tái tổ hợp mang nhiều gene mục tiêu môi trường YPD chứa kháng sinh G418 G418 (mg/ml) Môi trường sàng lọc 10 Số khuẩn lạc 112 48 19 4.1.4 Biểu rChIFN-α quy mô nuôi cấy lắc (shaking flask) Kết cho thấy rChIFN-α bắt đầu xuất từ 24 cảm ứng với methanol (bảng 4.2) Kết điện di gel Tricine SDS-PAGE cho thấy vạch có kích thước khoảng 19 kDa tương ứng với ChIFN-α vạch đậm Phân tích phần mềm ImageJ cho phép ước lượng protein mục tiêu (ChIFN-α) chiếm 80% protein tổng số dịch lên men (hình 4.4) Bảng 4.2 Hàm lượng protein tổng số tạo q trình biểu ChIFN-α quy mơ ni cấy lắc Thời gian cảm ứng biểu (giờ) 24 48 72 Protein tổng số (g/L) 3,67a2,1 92,67b2,0 166,67c51,3 217c30,1 * Các chữ số hàng khác sai khác có ý nghĩa thống kê (P