Tuyến trùng ký sinh gây hại trên cà rốt ở việt nam và thử nghiệm biện pháp sinh học trong phòng trừ chúng

loại dựa trên các đặc điểm hình thái và phân tử sẽ giúp việc chẩn loại nhóm tuyếntrùng này nhanh chóng và chính xác hơn [23, 24, 22].Để phòng trừ tuyến trùng ký sinh gây hại trên cà rốt,

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-NGUYỄN THỊ DUYÊN

TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY HẠI TRÊN CÀ RỐT

Ở VIỆT NAM VÀ THỬ NGHIỆM BIỆN PHÁP SINH HỌC TRONG PHÒNG TRỪ CHÚNG

Chuyên ngành: Tuyến trùng học

Mã số: Thí điểm

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2018

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS Nguyễn Ngọc Châu

2 TS Trịnh Quang Pháp

Hà Nội – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án “TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY HẠI TRÊN

CÀ RỐT Ở VIỆT NAM VÀ THỬ NGHIỆM BIỆN PHÁP SINH HỌC TRONGPHÒNG TRỪ CHÚNG” là công trình nghiên cứu do bản thân tôi thực hiện Cáctrích dẫn tham khảo trong Luận án theo các nguồn công bố đầy đủ, rõ ràng Số liệu,kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa từng công bố hoặc đã công bố trongcác bài báo khoa học mà tác giả là tác giả hoặc đồng tác giả

Tác giả luận án

NCS Nguyễn Thị Duyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới

PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu và TS Trịnh Quang Pháp đã tận tình hướng dẫn và

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn TS Vũ Thị Thanh Tâm, TS Nguyễn Thị Ánh Dương,ThS Lê Thị Mai Linh, ThS Nguyễn Hữu Tiền - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinhvật, PGS.TS Nguyễn Phương Nhuệ - Viện Công nghệ sinh học và TS Phạm ThịHòa - Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng đã hỗ trợ tôi trong quá trình hoànthiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinhvật, phòng Tuyến trùng học, phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, Họcviện Khoa học và Công nghệ cùng các đồng nghiệp, thầy cô trong Viện Sinh thái vàTài nguyên Sinh vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoànthành luận án

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôitrong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR) trong

đề tài mã số: IEBR.ĐT/04/16-17 và Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc giatrong đề tài mã số: 106.12-2012.84 đã hỗ trợ kinh phí để tôi thực hiện các nội dungnghiên cứu

Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, Ngày 8 tháng 1 năm 2019

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Duyên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 7

1.1 Cây cà rốt 7

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, giá trị và đặc điểm sinh trưởng phát triển 7

1.1.2 Tình hình sản xuất cà rốt trên thế giới 8

1.1.3 Tình hình sản xuất cà rốt ở Việt Nam 8

1.2 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng ký sinh gây hại cà rốt trên thế giới 9

1.2.1 Các nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng trên cà rốt 9

1.2.2 Phân loại hình thái và phân tử tuyến trùng thực vật 13

1.2.3 Khả năng phòng trừ sinh học tuyến trùng thực vật bằng nấm đối kháng 17

1.3 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng thực vật ở Việt Nam 22

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 26

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phương pháp điều tra, thu mẫu tuyến trùng 27

2.2.2 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất và mô thực vật 27

2.2.3 Phương pháp nhân nuôi tuyến trùng Meloidogyne spp và Pratylenchus spp 28

2.2.4 Phương pháp xử lý, làm trong và làm tiêu bản tuyến trùng 29

2.2.5 Phương pháp chuẩn bị mẫu chụp ảnh KHV điện tử quét 30

2.2.6 Các chỉ số đo hình thái trong phân loại tuyến trùng 30

2.2.7 Phương pháp phân tích phân tử tuyến trùng 32

2.2.8 Phương pháp thử nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ tuyến trùng của nấm 33 2.2.9 Phân tích số liệu 34

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở Việt Nam 35

3.2 Đặc điểm hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt 39

3.2.1 Giống Tylenchorhynchus Cobb, 1913 39

3.2.2 Giống Helicotylenchus Steiner, 1945 47

3.2.3 Giống Hoplolaimus Von Daday, 1905 53

3.2.4 Giống Rotylenchulus Linford & Oliveira, 1940 56

3.2.5 Giống Hemicriconemoides Chitwood & Birchfield, 1957 61

3.2.6 Giống Mesocriconema Andrássy, 1965 66

3.2.7 Giống Hemicaloosia Ray & Das, 1978 70

3.2.8 Giống Xiphinema Cobb, 1913 74

3.2.9 Giống Meloidogyne Goeldi, 1892 76

3.2.10 Giống Pratylenchus Filipjev, 1936 94

3.3 Các nhóm tuyến trùng kí sinh quan trọng trên cà rốt ở Việt Nam 131

3.3.1 Phương thức gây hại của tuyến trùng ký sinh trên cà rốt 131

3.3.2 Triệu chứng gây hại 132

3.3.3 Mật độ và tần suất xuất hiện của các giống tuyến trùng kí sinh trên cà rốt 136

3.4 Ảnh hưởng của 2 loài nấm đối kháng đến tuyến trùng M incognita và

P penetrans 143

3.4.1 Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm Paecilomyces sp đến tuyến trùng M incognita và P penetrans 143

3.4.2 Ảnh hưởng của dịch nhân nuôi nấm L squarrosulus đến tuyến trùng M incognita và P penetrans 148

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 154

4.1 Kết luận 154

4.2 Kiến nghị 155

TÀI LIỆU THAM KHẢO 156

PHỤ LỤC 180

PHỤ LỤC I: 180

PHỤ LỤC II 181

PHỤ LỤC III 182

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vậtKính hiển vi

Maximum LikelihoodPhụ lục

Hiển vi điện tử quét

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở các vùng điều tra 35

Bảng 3.2 Số đo con cái loài T annulatus ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác

Bảng 3.11 : Số đo con cái loài Hemicaloosia sp ký sinh ở cà rốt 71

Bảng 3.12 Số đo con cái loài X brevicolle ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác

Bảng 3.16 Số đo loài M arenaria ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác 86

Bảng 3.17 Số đo loài M graminicola ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác 90

Bảng 3.18 Số đo loài P coffeae ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác 96

Bảng 3.19 Số đo loài P penetrans ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác 102

Bảng 3.20 Số đo con cái loài P thornei ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác

105

Bảng 3.21 Số đo loài P zeae ký sinh ở cà rốt so với các quần thể khác 108

Bảng 3.22 Số đo loài P haiduongensis ký sinh trên cà rốt 112

Bảng 3.23 Số đo con cái loài Pratylenchus sp 1 ký sinh ở cà rốt 116

Bảng 3.24 Số đo con đực loài Pratylenchus sp 1 ký sinh ở cà rốt 111

Bảng 3.25 Số đo loài Pratylenchus sp 2 ký sinh ở cà rốt 122

Bảng 3.26 Các chỉ số hình thái lượng sử dụng trong phân tích thống kê dựa trên phân tích khác biệt chuẩn 126

Bảng 3.27 Tỷ lệ cà rốt bị các dấu hiệu gây hại do tuyến trùng 134

Bảng 3.28 Mật độ và tần suất xuất hiện (%) của các giống tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở các vùng điều tra 137

Bảng 3.29 Ảnh hưởng của nấm Paecilomyces sp.đến tỷ lệ (%) nở trứng tuyến trùng M incognita 144

Bảng 3.30 Tỷ lệ (%) ấu trùng M incognita chết do nấm Paecilomyces sp 145

Bảng 3.31 Tỷ lệ (%) tuyến trùng P penetrans chết do nấm Paecilomyces sp 146

Bảng 3.32 Ảnh hưởng của nấm L squarrosulus đến tỷ lệ (%) nở trứng tuyến trùng M incognita 149

Bảng 3.33 Tỷ lệ (%) ấu trùng M incognita chết do nấm L squarrosulus 150

Bảng 3.34 Tỷ lệ (%) tuyến trùng P penetrans chết do nấm L squarrosulus 151

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Ảnh chụp KHV con cái loài T annulatus ký sinh ở cà rốt 42

Hình 3.2 Ảnh chụp KHV loài T mashhoodi ký sinh ở cà rốt 45

Hình 3.3 Đặc điểm sai khác giữa 2 loài T annulatus và T mashhoodi ký sinh ở cà rốt 46

Hình 3.4 Ảnh chụp KHV con cái loài H dihystera ký sinh ở cà rốt 49

Hình 3.5 Ảnh chụp KHV con cái loài H indicus ký sinh ở cà rốt 52

Hình 3.6 Đặc điểm sai khác của 2 loài H dihystera và H indicus ký sinh ở cà rốt 53

Hình 3.7 Ảnh chụp KHV con cái loài H chambus ký sinh ở cà rốt 55

Hình 3.8 Ảnh chụp KHV con trưởng thành non loài R reniformis ký sinh ở cà rốt. 60 Hình 3.9 Ảnh chụp KHV con cái loài H strictathecatus ký sinh ở cà rốt 63

Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại dạng ML(mô hình TN93+G) dựa trên vùng gen D2D3 của các loài Hemicriconemoides spp 65

Hình 3.11 Ảnh chụp KHV con cái loài M sphaerocephalum ký sinh ở cà rốt 68

Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại dạng ML (mô hình TN93+G) dựa trên vùng gen D2D3 của các loài Mesocriconema spp 70

Hình 3.13: Ảnh chụp KHV con cái loài Hemicaloosia sp ký sinh ở cà rốt 73

Hình 3.14 Ảnh chụp KHV con cái loài X brevicolle ký sinh ở cà rốt 76

Hình 3.15 Ảnh chụp KHV loài M incognita ký sinh ở cà rốt 83

Hình 3.16 Ảnh chụp KHV loài M arenaria ký sinh ở cà rốt 88

Hình 3.17 Ảnh chụp KHV loài M graminicola ký sinh ở cà rốt 91

Hình 3.18 Đặc điểm sai khác của ba loài tuyến trùng Meloidogyne spp ký sinh trên cà rốt 92

Hình 3.19 Cây phát sinh chủng loại dạng ML (mô hình HKY+G) dựa trên vùng gen D2D3 của các loài Meloidogyne spp 94

Hình 3.20 Ảnh chụp KHV loài P coffeae ký sinh ở cà rốt 98

Hình 3.21 Đa dạng cấu trúc đuôi con cái loài P coffeae ký sinh ở cà rốt 99

Hình 3.22 Ảnh chụp KHV loài P penetrans ký sinh ở cà rốt 104

Hình 3.23 Ảnh chụp KHV con cái loài P thornei ký sinh ở cà rốt 106

Hình 3.24 Ảnh chụp KHV con cái loài P zeae ký sinh ở cà rốt 110

Hình 3.25 Ảnh chụp KHV con cái loài P haiduongensis ký sinh ở cà rốt 113

Hình 3.26 Ảnh chụp KHV điện tử quét (SEM) con cái loài P haiduongensis ký

sinh ở cà rốt 114

Hình 3.27 Ảnh chụp KHV loài Pratylenchus sp 1 ký sinh ở cà rốt 119 Hình 3.28 Các dạng đuôi con cái loài Pratylenchus sp 1 ký sinh ở cà rốt 119 Hình 3.29 Ảnh chụp KHV điện tử quét (SEM) con trưởng thành loài Pratylenchus

sp 1 ký sinh trên cà rốt 120

Hình 3.30 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) vùng môi con cái loài

Pratylenchus sp1 và loài P penetrans 121

Hình 3.31 Ảnh chụp KHV loài Pratylenchus sp 2 ký sinh ở cà rốt 123 Hình 3.32 Ảnh chụp KHV điện tử quét (SEM) con trưởng thành loài Pratylenchus sp 2

Hình 3.37 Cây phát sinh chủng loại dạng ML (mô hình K2+I) dựa trên vùng gen

D2D3 của các loài Pratylenchus spp 130

Hình 3.44 Ảnh chụp KHV trứng tuyến trùng M incognita bị nấm Paecilomyces sp

Hình 3.49 Ảnh chụp KHV tuyến trùng P penetrans chết do nấm L squarrosulus

152

MỞ ĐẦU

Rau, củ, quả nói chung là thực phẩm quan trọng không thể thiếu được trongchế độ ăn hàng ngày của con người Chúng cung cấp không chỉ chất xơ, mà còncung cấp các vi chất dinh dưỡng như khoáng chất, vitamin và các hợp chất chốngoxy hóa như carotenoid, polyphenols [1] Trong rất nhiều loại rau đang được trồng

hiện này thì cà rốt (Daucus carota L Him) là một trong những loại rau ăn củ được

trồng và tiêu thụ rộng rãi nhất trên toàn thế giới nhờ có giá trị dinh dưỡng và giá trịdược lý cao [2, 3]

Củ cà rốt có chứa hàm lượng các chất dinh dưỡng cao như các vitamin: B1,B2, B6, B12, C, nguồn carbonhydrat và các khoáng chất như Ca, P, Fe và Mg [4, 5].Thêm vào đó, cà rốt còn được sử dụng nhiều vì được biết đến như nguồn cung cấpcarotene (α-carotene, β carotene) cao nhất trong các loại thực phẩm của con người[6, 7] Ngoài giá trị dinh dưỡng cao, dược lý của cà rốt đã được chứng minh trongviệc ngăn ngừa một số bệnh như ung thư, béo phì, tiểu đường, tim, thận, gan [2, 8]

Ở Việt Nam, cà rốt được trồng ở nhiều vùng trên cả nước, trong đó ở LâmĐồng và Hải Dương là 2 tỉnh có diện tích trồng tập trung lớn nhất Không chỉ có giátrị dinh dưỡng cao mà cà rốt còn là cây trồng đem lại giá trị kinh tế lớn trong sảnxuất nông nghiệp Nguồn thu nhập từ cà rốt đã giúp đời sống của người dân ở cácvùng trồng cà rốt đã được cải thiện đáng kể Tuy nhiên, cùng với sự gia tăng về diệntích, các vùng trồng chuyên canh cà rốt đã xuất hiện các hiện tượng như: củ bị sầnsùi, củ chia nhánh, củ ngắn, củ bị thối làm giảm năng suất và chất lượng củ, thậmchí không cho thu hoạch khiến diện tích gieo trồng, sản lượng và chất lượng của càrốt bị giảm sút Theo khảo sát năm 2014, của V.Đ Phiên, nguyên nhân chính làmhỏng rễ từ đó dẫn đến hiện tượng củ bị chia nhánh, mất rễ và chết cây con trên càrốt ở tỉnh Hải Dương là do tuyến trùng ký sinh thực vật gây nên [9]

Tuyến trùng ký sinh thực vật là nhóm động vật không xương sống thuộcngành giun tròn, ký sinh gây hại cho cây trồng Tuyến trùng ký sinh có thể gây hạitrên nhiều bộ phận khác nhau của cây trồng như: thân, lá, hoa, quả hoặc rễ Trong

đó, nhóm tuyến trùng gây hại trên rễ là một trong những nhóm nguy hiểm nhất, làmsuy giảm năng suất và chất lượng cây trồng từ đó gián tiếp gây nên nhiều thiệt hại

về kinh tế trên thế giới [10] Các loài tuyến trùng thực vật sử dụng kim hút trong

miệng để xuyên qua vách tế bào thực vật để hút chất dinh dưỡng Ngoài tác độngtrực tiếp của chúng đến cây trồng qua quá trình hút dinh dưỡng từ mô thực vật, làmảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng phát triển của cây trồng, một số giống tuyếntrùng còn gây ra các vết thương trên mô thực vật, làm biến đổi mô thực vật của câychủ, hay có những giống là vectơ mang truyền bệnh [11, 12] Vì vậy, khi bị tuyếntrùng ký sinh, cây cà rốt thường bị còi cọc, kém phát triển, thậm chí gây chết câycon nếu mật độ tuyến trùng ký sinh cao Mặt khác, củ cà rốt cũng chính là rễ chính,

vì thế, các tác động của tuyến trùng thực vật sẽ làm cho củ cà rốt bị chia nhánh, sầnsùi, trên củ hoặc trên các rễ phụ có các nốt sần (chùm hạt), nứt củ, thối củ, củ ngắnhay trên củ có quá nhiều rễ phụ [13, 14, 15, 16, 17] Các tổn thương trên rễ, củ làmảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất, chất lượng và sản lượng của cà rốt [13, 18,

19, 20]

Mặc dù, tuyến trùng đã được xác định là một trong những nguyên nhân chínhgây hai trên cà rốt nhưng vẫn chưa có nhiều nghiên cứu sâu về thành phần loàituyến trùng ký sinh gây hại trên cà rốt Các kết quả phân loại tuyến trùng ký sinhtrên cà rốt trong các tài liệu đã được công bố cho đến nay mới chỉ phân loại đếngiống mà chưa xác định được đến loài, cũng như chưa xác định được nhóm gây hạichính Trong khi đó, việc xác định thành phần loài gây hại trên cà rốt là cơ sở rấtquan trọng để đưa ra biện pháp phòng trừ tuyến trùng có hiệu quả [21]

Các tài liệu trước đây thường phân loại tuyến trùng thực vật bằng phươngpháp truyền thống dựa trên sự sai khác của các đặc điểm hình thái và các chỉ số hìnhthái lượng Với sự hỗ trợ của các thiết bị như kính hiển vi điện tử quét hay kính hiển

vi điện tử xuyên qua đã giúp ích rất nhiều trong việc tìm ra các đặc điểm phân loạicủa nhóm động vật có kích thước hiển vi này Mặc dù vậy, các đặc điểm như: kíchthước nhỏ, cấu tạo đơn giản, có nhiều các đặc điểm hình thái tương đồng hay gầntương tự hoặc sự biến thiên quá lớn giữa các quần thể trong cùng loài gây cản trở rấtlớn cho việc phân loại tuyến trùng bằng hình thái Các phương pháp phân loại tuyếntrùng dựa trên protein, enzyme hay trình tự DNA đã nâng cao sự chính xác trongphân loại tuyến trùng [22] Tuy nhiên, cũng giống như phương pháp phân loại tuyếntrùng dựa trên các đặc điểm hình thái, các phương pháp mới như phân loại dựa trênphân tích trình tự DNA còn hạn chế do thiếu thông tin đầy đủ và chính xác của cáctình tự đã được đăng ký trên Genbank Vì vậy, sự kết hợp giữa phương pháp phân

loại dựa trên các đặc điểm hình thái và phân tử sẽ giúp việc chẩn loại nhóm tuyếntrùng này nhanh chóng và chính xác hơn [23, 24, 22].

Để phòng trừ tuyến trùng ký sinh gây hại trên cà rốt, biện pháp sử dụng thuốchóa học hiện nay vẫn là chủ yếu Tuy nhiên, việc quá lạm dụng thuốc hóa học đã vàđang gây ra những hậu quả tiêu cực đến môi trường sống, gây hại đến sức khỏe conngười và các sinh vật khác [25] Đặc biệt, thuốc hóa học đã tiêu diệt nhiều loài sinhvật có ích làm giảm tính đa dạng trong tự nhiên gây mất cân bằng sinh thái

[26] Bên cạnh đó, củ cà rốt là một trong những nông sản được sử dụng ở dạng tươisống, nên việc sử dụng thuốc hóa học trong phòng trừ sâu bệnh hại cà rốt cần đượchạn chế Trong thời kỳ hội nhập kinh tế thế giới, việc sản xuất các mặt hàng nôngsản nói chung, cũng như việc sản xuất cà rốt nói riêng theo hướng sinh học, không

có dư lượng thuốc trừ sâu theo các tiêu chuẩn như VietGAP hay GlobalGAP thìviệc lựa chọn những sản phẩm sinh học thân thiện với môi trường để phòng trừtuyến trùng là rất cần thiết Một trong những phương pháp hiệu quả trong phòng trừnhóm tuyến trùng ký sinh là biện pháp sinh học dựa trên các loài nấm đối kháng đểtiêu diệt và hạn chế sự phát triển của tuyến trùng [21]

Với mục đích nghiên cứu thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt, xácđịnh thành phần và nhóm tuyến trùng gây hại quan trọng trên cà rốt, đánh giá thửnghiệm biện pháp sinh học trong phòng trừ tuyến trùng tạo cơ sở cho việc quản lýdịch hại tuyến trùng trên cà rốt, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu:

“Tuyến trùng ký sinh gây hại trên cà rốt ở Việt Nam và thử nghiệm biện pháp sinh học trong phòng trừ chúng”

Mục tiêu của luận án

- Xác định được thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở các vùng trồng cà rốt chính ở Việt Nam

- Xác định được nhóm tuyến trùng ký sinh gây hại quan trọng trên cà rốt ở các vùng nghiên cứu

- Đánh giá được khả năng phòng trừ trong phòng thí nghiệm một số loài tuyến trùng ký sinh gây hại quan trọng trên cà rốt bằng các loài nấm đối kháng

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ýnghĩa khoa học:

- Đã xác định được thành phần, phân bố các loài tuyến trùng ký sinh trên càrốt đại diện ở phía Bắc và phía Nam Việt Nam và bổ sung thành phần tuyếntrùng ký sinh trên cây cà rốt đối với thế giới

- Cung cấp và bổ sung dữ liệu hình thái và phân tử của các nhóm tuyến trùng

ký sinh gây hại quan trọng trên cà rốt Đã đăng ký trình tự 19 quần thể tuyếntrùng ký sinh cà rốt ở Việt Nam trên Genbank

- Ghi nhận và công bố 1 loài mới cho khoa học Bổ sung 16 loài tuyến trùng

ký sinh trên cà rốt ở Việt Nam Bổ sung một giống tuyến trùng mới được ghinhận ở Việt Nam

- Xác định các nhóm tuyến trùng ký sinh gây hại quan trọng trên cà rốt ở cácvùng nghiên cứu dựa trên phương thức ký sinh, triệu chứng, mật độ và tầnsuất xuất hiện của chúng

- Bước đầu, đưa ra dẫn chứng khoa học về khả năng ký sinh và gây chết của

nấm đối kháng Paecilomyces sp đối với hai loài tuyến trùng ký sinh gây hại quan trọng trên cà rốt Lần đầu tiên xác định dịch nuôi nấm Lentinus squarrosulus Mont có khả năng ức chế và gây chết đối với tuyến trùng

M incognita và P penetrans trong phòng thí nghiệm.

Ýnghĩa thực tiễn:

- Việc xác định thành phần loài tuyến trùng gây hại chính trên cà rốt là cơ sởcho việc lựa chọn giải pháp phòng trừ, giảm thiểu tác hại của chúng gây rađối với sản xuất cà rốt Mô tả các triệu chứng cụ thể do tuyến trùng gây ra

trên củ cà rốt để có thể chẩn đoán nhanh Xác định được các nhóm tuyếntrùng gây hại chính ảnh hưởng đến phẩm chất và chất lượng của cà rốt trongtrồng trọt cũng như thương phẩm ở Việt Nam.

- Đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng ký sinh gây hại cà rốt của nấm đốikháng làm cơ sở cho việc lựa chọn biện pháp phòng trừ sinh học hữu hiệunhất góp phần giảm lượng thuốc hóa học, phát triển hệ sinh thái nông nghiệpbền vững

- Những dẫn liệu về tuyến trùng ký sinh gây hại trên cà rốt trong luận án có thể

sử dụng làm nguồn tài liệu trong giảng dạy bệnh hại cà rốt, cũng như giúpngười nông dân có thể tham khảo trong quá trình sản xuất cà rốt

Nội dung của luận án

Nội dung 1: Xác định thành phần loài tuyến trùng thực vật ký sinh trên cà rốt

- Xác định thành phần loài tuyến trùng thực vật ký sinh trên cà rốt tại 4 tỉnhnghiên cứu là: Hà Nội (Đông Anh); Hải Dương (Cẩm Giàng và Nam Sách);Hưng Yên (Văn Giang); Lâm Đồng (Đà Lạt, Đức Trọng và Đơn Dương)

- Mô tả đặc điểm hình thái, số liệu hình thái lượng và ảnh chụp của các loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở các địa điểm nghiên cứu

- Một số loài có tính đa dạng về hình thái cao, các chỉ số hình thái lượng đượcphân tích thống kê dựa trên phân tích khác biệt chuẩn CDA và phân tích trình

tự DNA gene nhân D2D3 vùng 28S mở rộng

Nội dung 2: Xác định nhóm tuyến trùng thực vật gây hại quan trọng trên cà rốt ở Việt Nam

- Xác định các nhóm tuyến trùng gây hại đối với cây cà rốt dựa trên phương thức ký sinh và gây hại của tuyến trùng

- Mô tả các triệu chứng bắt gặp biểu hiện trên củ cà rốt

- Xác định mật độ và tần suất xuất hiện của các nhóm tuyến trùng ký sinh trên

cà rốt ở các vùng nghiên cứu

Nội dung 3: Thử nghiệm khả năng phòng trừ của 2 loài nấm đối kháng

Paecilomyces sp và nấm Lentinus squarrosulus Mont đối với nhóm tuyến

trùng gây hại chính trên cà rốt trong phòng thí nghiệm

- Đánh giá khả năng ức chế nở trứng tuyến trùng của dịch bào tử nấm

Paecilomyces sp và dịch nhân nuôi nấm L squarrosulus trong phòng thí

nghiệm

- Đánh giá khả năng gây chết tuyến trùng của dịch bào tử nấm Paecilomyces

sp và dịch nhân nuôi nấm L squarrosulus trong phòng thí nghiệm.

Những đóng góp mới của luận án:

- Lần đầu tiên ghi nhận và đóng góp về thành phần loài tuyến trùng ký sinhtrên cà rốt ở Hà Nội, Hải Dương và Hưng Yên Đã ghi nhận 25 loài tuyếntrùng ký sinh, thuộc 15 giống, 9 họ, 4 bộ ký sinh trên cà rốt ở 4 vùng nghiêncứu Đã mô tả, đánh giá đa dạng và bổ sung dữ liệu hình thái và phân tử củamột số nhóm loài tuyến trùng ký sinh gây hại quan trọng trên cà rốt Đã đăng

ký trình tự 19 quần thể tuyến trùng ký sinh cà rốt ở Việt Nam trên Genbank

- Ghi nhận và công bố một loài mới cho khoa học

- Lần đầu tiên đánh giá và bổ sung 6 nhóm tuyến trùng thực vật chưa từng được ghi nhận là ký sinh trên cà rốt trên thế giới

- Bổ sung thêm 7 loài tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở Lâm Đồng và mộtgiống tuyến trùng mới được ghi nhận ở Việt Nam Ghi nhận thêm 16 loàituyến trùng ký sinh trên cà rốt ở Việt Nam

- Lần đầu tiên trên thế giới cũng như ở Việt Nam ghi nhận loài Meloidogyne graminicola ký sinh trên cà rốt.

- Đã xác định được các nhóm tuyến trùng ký sinh gây hại quan trọng trên cà rốt ở các vùng nghiên cứu

- Đã đánh giá khả năng gây chết và ức chế nở trứng hai loài tuyến trùng

Meloidogyne incognita và Pratylenchus penetrans ký sinh gây hại quan trọng trên cà rốt của 2 loài nấm đối kháng Paecilomyces sp và nấm L squarrosulus trong phòng thí nghiệm làm cơ sở khoa học trong biện pháp

phòng trừ sinh học

- Lần đầu tiên trên thế giới cũng như ở Việt Nam đánh giá khả năng phòng trừ

hai loài tuyến trùng M incognita và P penetrans của nấm L squarrosulus

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Cây cà rốt

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại, giá trị và đặc điểm sinh trưởng phát triển

Cà rốt có tên khoa học là Daucus carota L Him thuộc họ Hoa tán

(Umbellferae), bộ Hoa tán (Umbellales) còn gọi là bộ Sơn thù du (Cornales), thuộcphân lớp Hoa hồng (Rosidae) [27]

Cây cà rốt có nguồn gốc từ Afghanistan, sau đó lan rộng ra các vùng ĐịaTrung Hải, Châu Âu, Châu Á, Châu Phi và Bắc Mỹ, [28] Cà rốt nguyên thủy cómàu tím, vàng hoặc trắng Sau này, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật,ngoài các màu nguyên thủy, cà rốt đã có thêm các màu cam, đỏ, tím đậm [28]

Cà rốt là loại cây thân thảo, sống 2 năm Cây cao từ 30 - 60 cm Lá mọc so

le, không có lá kèm, phiến xẻ lông chim Hoa có 4 cánh, tập hợp thành tán kép, hoa

ở chính giữa không sinh sản, còn các hoa khác có sinh sản Đế hoa khum lõm Láđài nhỏ ba cạnh, cánh tràng, mọc so le Thụ phấn chéo nhờ côn trùng Quả bế, mỗiđôi gồm 2 nửa (phân liệt quả), hình trứng Hạt cà rốt có phôi nhũ sừng, vỏ hóa gỗ vàlông cứng che phủ [27, 28] Củ là rễ trụ và cũng là cơ quan dinh dưỡng chính,thường có dạng hình nón và có chiều dài từ 5 - 50 cm [28] Ở mặt cắt ngang củ càrốt bao gồm lõi xylem bên trong và bao quanh bên ngoài là mô phloem

Cà rốt là một loại rau ăn củ giàu dinh dưỡng Trong 100g trọng lượng củ càrốt có thành phần: 88% nước, 1% protein, 7% carbohydrate, 3% chất xơ, 0.3 mg Fe,5.9 mg vitamin C, 0.07 mg vitamin B1, 0.06 mg vitamin B2, 0.98 mg niacin, 0.66

mg vitamin E, 33 mg Ca, 35 mg P, 320 mg K, 6 mg Na, 12 mg Mg, carotenoid 24

mg Carbohydrate hầu như là các loại đường đơn giản, chủ yếu là sucrose, glucose

và fructose [8] Củ cà rốt có thể chế biến theo nhiều cách khác nhau như: ăn sống(nước ép, trộn với salad - dấm), nấu chín (nấu súp, nấu canh, si-rô, ), làm mứt, sấykhô, cà rốt còn được dùng làm những món chay hoặc thay thế cho các loại thựcphẩm khó tiêu như thịt, chất béo

Cây cà rốt là cây ưa sáng, đặc biệt là giai đoạn cây con cần cường độ ánhsáng mạnh Cà rốt thích hợp với khí hậu mát mẻ, nhiệt độ thích hợp để cây sinhtrưởng, phát triển là từ 16 - 24oC, độ ẩm đất thích hợp là 60 - 70% [29]

1.1.2 Tình hình sản xuất cà rốt trên thế giới

Cà rốt là một trong 10 loại rau ăn củ quan trọng nhất trên thế giới cả về diệntích và giá trị thị trường [30] Năm 2005, sản lượng cà rốt trên thế giới đạt 23 triệutấn trên tổng diện tích canh tác 1,1 triệu hecta, với tổng giá trị thị trường toàn cầuước tính khoảng 100 triệu USD [8] Theo thống kê của tổ chức FAO, trong vòng 10năm từ 1997 đến 2007 sản lượng cà rốt trên thế giới tăng nhanh Năm 2007, tổngsản lượng cà rốt của thế giới là hơn 24 triệu tấn, gấp 1,6 lần so với năm 1997, trong

đó sản lượng của 15 nước đứng đầu thế giới chiếm 18,3 triệu tấn [31] Các nước sảnsuất cà rốt hàng đầu trên thế giới là Trung Quốc, Nga và Hoa Kỳ với gần 50% diệntích canh tác và chiếm khoảng 45% tổng sản lượng cà rốt của thế giới [8, 31]

1.1.3 Tình hình sản xuất cà rốt ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cà rốt là giống cây được nhập nội và trồng thí điểm vào nhữngnăm cuối thế kỷ 19 do người Pháp du nhập Hiện nay, cà rốt được trồng nhiều ở cácvùng có khí hậu mát mẻ như tỉnh Lâm Đồng và một số tỉnh thuộc đồng bằng Bắc

Bộ và Trung Bộ trong vụ chiêm Trong đó, có những vùng chuyên canh lớn như ĐàLạt, Hải Dương và một số vùng luân canh với diện tích lớn như Hà Nội, Vĩnh Phúc,Hưng Yên, Bắc Ninh, Thái Bình, … Ở Lâm Đồng, do điều kiện khí hậu mát mẻ nên

cà rốt có thể được trồng quanh năm Ở những tỉnh miền Bắc và miền Trung, cà rốt

có thể được gieo trồng vào các vụ như: Vụ sớm: gieo trồng vào tháng 8 và 9, thuhoạch vào tháng 10 và 11; Vụ chính: gieo trồng vào tháng 10 và 11, thu hoạch vàotháng 12 và 1 năm sau; Vụ muộn: gieo trồng vào tháng 1 và 2 năm sau, thu hoạchvào tháng 4 và 5 Ở những vùng không chuyên canh như Hà Nội, Hưng Yên thì càrốt chỉ gieo trồng 1 vụ chính là vụ Đông - Xuân, gieo hạt vào tháng 10 thu hoạchvào tháng 12 và tháng 1, 2 năm sau

Hiện nay, các vùng trồng cà rốt ở nước ta đang trồng phổ biến hai loại giống

cà rốt là giống cũ và giống mới Giống cũ là các giống do người Pháp du nhập sang

và được người dân tự để lại giống, các giống này củ có màu đỏ tươi, kích cỡ củkhông đồng đều, lõi to, nhiều xơ, ăn kém ngọt, tuy nhiên lại có khả năng thích ứngđất đai và thời tiết tốt hơn các giống mới Các giống mới gồm có: CR 9, NS, Nans,Tim - Tom, Ti - 103, New Kuroda, Super 44… Các giống mới có ưu thế lớn là năngsuất cao, kích cỡ củ to và đồng đều, ít xơ, ăn ngọt, được thị trường ưa chuộng

Nhờ thay đổi cơ cấu giống cây trồng, tuyển chọn giống cà rốt phù hợp với điềukiện khí hậu và áp dụng tiến bộ kĩ thuật trong canh tác nên đã có sự gia tăng cả về diệntích, sản lượng cũng như chất lượng cà rốt Mỗi năm, cà rốt cho doanh thu hàng chục tỷđồng, giải quyết công ăn việc làm và làm giàu cho hàng nghìn hộ gia đình.

1.2 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng ký sinh gây hại cà rốt trên thế giới

1.2.1 Các nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng trên cà rốt

Tuyến trùng là một trong những nhóm động vật đa bào, đa dạng nhất trên tráiđất Khoảng 28000 loài đã được mô tả [32] Trong đó, đã xác định được khoảng

4105 loài tuyến trùng thực vật [32, 33, 34] Tuyến trùng thực vật là một trong nhữngtác nhân gây hại chính trên nhiều loại cây trồng và phân bố ở nhiều vùng sinh tháikhác nhau [35] Tại nhiều vùng sản xuất nông nghiệp trên thế giới, tuyến trùng thựcvật gây tác hại lớn đối với sản xuất nông nghiệp [10], mức độ tàn phá của chúng đốivới cây trồng là rất lớn Hàng năm, chúng gây thiệt hại hàng tỷ tấn hoa màu trêntoàn thế giới Tổn thất kinh tế nông nghiệp do tuyến trùng thực vật gây ra ước tínhkhoảng 125 tỷ USD mỗi năm trên toàn thế giới [36] Các cây trồng khác nhau vàsinh thái khác nhau có thành phần loài tuyến trùng ký sinh khác nhau Năm 1950,Paul đã nghiên cứu tuyến trùng ký sinh trên cà rốt ở vùng Cedar Valeey, bang Utah,Hoa Kỳ, đã ghi nhận 2 loài thuộc 2 giống tuyến trùng ký sinh trên cà rốt là loài

Ditylenchus sp và Heterodera marionii Trong đó, tuyến trùng bào nang H marionii là loài gây hại chính đã gây thiệt hại cho sản xuất cà rốt ước tính khoảng

15.000 USD [37] Tại Scotland, trong 2 năm 1975 và 1976, Boag đã thu 65 mẫu đất

từ 59 trang trại trồng cà rốt ở trung tâm, phía Bắc và phía Nam Scotland, ông đã ghi

nhận 12 loài thuộc 8 giống tuyến trùng ký sinh trên cà rốt bao gồm: Longidorus, Tylenchorhynchus, Rotylenchus, Helicotylenchus, Trichodorus, Heterodera, Pratylenchus và Paratylenchus [38] Năm 2002, có 14 giống tuyến trùng ký sinh

trên cà rốt đã ghi nhận ở Anh và ghi nhận thêm 6 giống khác so với nghiên cứu ở

Scotland như: Criconemella, Ditylenchus, Hemicycliophora, Meloidogyne, Merlinius và Xiphinema [39] Ở Úc, cũng đã ghi nhận 13 giống tuyến trùng ký sinh

trên cà rốt và bổ sung thêm 3 giống so với nghiên cứu ở Scotland và Anh bao gồm:

Neodolichodorus, Paratrichodorus và Scutellonema [40]. Cho đến nay trên thế giới

đã ghi nhận được 21 giống tuyến trùng ký sinh trên cà rốt: Belonolaimus,

Criconemella, Ditylenchus, Helicotylenchus, Hemicycliophora, Heterodera,

Longidorus, Meloidogyne, Merlinius, Nacobbus, Neodolichodorus, Paratrichodorus, Paratylenchus, Pratylenchus, Radopholus, Rotylenchus, Rotylenchulus, Scutellonema, Trichodorus, Tylenchorhynchus và Xiphinema [38,

41, 42, 43, 44, 39, 40] Như vậy, tuyến trùng ký sinh ở cà rốt trên thế giới đã đượctập trung nghiên cứu từ những năm 50 thế kỷ trước Tuy nhiên, các nghiên cứu chủyếu chỉ xác định nhóm hay giống gây hại chính trên cà rốt, mà ít có công bố vềthành phần cụ thể các loài đã gặp, các nhóm tuyến trùng được đánh giá như: tuyếntrùng sần rễ, tuyến trùng gây tổn thương rễ, tuyến trùng bào nang, tuyến trùng hìnhkim và tuyến trùng thân củ

Tuyến trùng sần rễ (Meloidogyne spp.)

Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp là nhóm tuyến trùng đa thực gây hại

trên nhiều loại cây trồng khác nhau từ cây cỏ đến cây thân gỗ với hơn 5500 loài cây

[45] Thiệt hại toàn cầu do tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp gây ra ước tính khoảng 78 tỷ USD [46] Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp là đối tượng gây hại

lớn nhất ở các vùng canh tác cà rốt trên thế giới, làm giảm cả về sản lượng và chấtlượng [10, 18, 19, 20] Theo công bố của Taylor & Sasser (1987), các loài tuyến

trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne có phổ ký chủ rất rộng và phạm vi phân bố

khá rộng ở nhiều nước trên thế giới [47] Chúng gây hại nghiêm trọng trên nhiềuloại cây trồng khác nhau, đặc biệt là các loại rau quả dẫn đến thiệt hại năng suấtđáng kể ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới [48] Có hơn 90 loài tuyến trùng sần

rễ đã được phân loại, trong số đó một số loài làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến cácsản phẩm nông nghiệp trên các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới cũng như ôn đới [45,

49] Trong số đó chỉ có 7 loài đã được xác định bắt gặp trên cà rốt là Meloidogyne incognita, M javanica, M arenaria, M chitwoodi, M fallax, M hapla và M minor

[10] Đây là những nhóm loài quan trọng, gây thiệt hại lớn trong sản xuất cà rốt Cà

rốt là cây trồng mẫn cảm với tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp và là một trong

những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất trên cà rốt ở trên toàn thế giới, làm giảm

cả về sản lượng và chất lượng [18, 19, 20] Sự xâm nhập của các loài tuyến trùng

sẫn rễ Meloidogyne spp làm cho củ cà rốt bị còi cọc, nứt củ, trên củ có quá nhiều rễ

bên và hình thành các u cục trên rễ phụ và trên củ cà rốt [15, 16, 17] Loài

M javanica là một trong những loài phổ biến nhất được tìm thấy trên các cánh đồng

cà rốt của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [50, 51] Trong khi, loài M hapla là loài

duy nhất ký sinh gây hại trên cà rốt được trồng trên đất hữu cơ ở Canada [52] và ởNew York [53] Theo Sasser et al (1985), tuyến trùng sần rễ là tác nhân gây hại chủyếu trên cà rốt ở tất cả các khu vực sản xuất cà rốt của Mỹ, ảnh hưởng đến cả chấtlượng và sản lượng cà rốt [54]

Cà rốt là một loại rau củ quan trọng ở Úc và có sản lượng tăng lên đều đặntrong những năm gần đây với 258.000 tấn được sản xuất vào năm 1997 [55] Năm

2002, đã tăng lên khoảng 330.000 tấn trên diện tích canh tác là 7.500 ha [55] Tuynhiên, việc sản xuất cà rốt ở Úc cũng gặp phải khó khăn một phần do tuyến trùng

sần rễ Meloidogyne spp gây nên Ở các vùng trồng cà rốt đã bắt gặp các loài M javanica, M hapla, M fallax gây hại trên cà rốt Trong đó, hai loài M javanica, M hapla là những loài gây thiệt hại nặng nhất đối với cà rốt [40] Tại CHLB Đức, loài

M hapla cũng được xem là loài tuyến trùng ký sinh gây hại trên cà rốt, đặc biệt là

trên đất cát pha [56, 20]

Ở Ấn Độ, cà rốt được trồng ở 23 bang với tổng diện tích là 6,8 triệu ha vàsản xuất 10,93 triệu tấn hàng năm Trong đó, Bang Tamil Nadu là nơi sản xuất càrốt lớn nhất với diện tích trồng là 1,3 triệu ha và đạt sản lượng 3.900 tấn [57] Cho

đến nay, loài tuyến trùng sần rễ M hapla được xác định là loài duy nhất gây hại trên

cà rốt trồng ở bang Tamil Nadu [58, 59]

Cà rốt cũng là một loại rau củ quan trọng bên cạnh củ cải và khoai tây ở HànQuốc, với diện tích canh tác là 2.849 ha và tổng sản lượng năm 2011 đạt 93.694 tấn

[60, 61] Bốn loài tuyến trùng giống Meloidogyne là M hapla, M incognita, M arenaria, và M javanica đã được ghi nhận trên cà rốt ở Hàn Quốc, trong đó hai loài

M hapla và M incognita là phổ biến nhất trên các cánh đồng cà rốt ngoài tự nhiên

cũng như trong nhà kính [62]

Như vậy, dù ghi nhận 7 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp ký sinh trên

cà rốt, nhưng đây lại là những nhóm loài quan trọng, gây thiệt hại lớn trong sản xuất

cà rốt ở tất cả các vùng trồng cà rốt trên thế giới, từ vùng có khí hậu ôn đới cho đếnvùng có khí hậu cận nhiệt đới và nhiệt đới

Tuyến trùng gây tổn thương rễ (Pratylenchus spp.)

Trong số các bệnh do tuyến trùng ký sinh gây ra thì tuyến trùng gây tổn

thương rễ thuộc giống Pratylenchus là nhóm gây thiệt hại kinh tế thứ hai sau nhóm tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp [63] Các loài tuyến trùng gây tổn thương rễ Pratylenchus spp có phổ ký chủ rộng và phân bố khắp vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới

và vùng ôn đới trên thế giới Chúng gây ra tổn thương cục bộ trên rễ non và ngănchặn sự phát triển của rễ, làm cho rễ bị thối rữa và gây tổn thất năng suất đáng kể

[63] Các vết thương trên củ cà rốt do tuyến trùng Pratylenchus spp gây ra làm thiệt

hại năng suất đáng kể trong canh tác cà rốt [13, 19] Tuyến trùng gây tổn thương rễ

Pratylenchus spp cũng làm giảm kích thước và gây hiện tượng chia củ [14] Ngoài

ra, chất lượng của củ cà rốt cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng khi bị nhiễm tuyến

trùng Pratylenchus spp do củ bị thối, bị nứt, củ cà rốt phát triển còi cọc và hình

thành quá nhiều rễ bên [13, 14]

Trên thế giới, đã ghi nhận 7 loài tuyến trùng thuộc giống Pratylenchus gây hại trên cà rốt bao gồm: P coffeae, P crenatus, P mediterraneus, P.neglectus, P penetrans, P thornei và P zeae [41, 10] Các loài này đã được báo cáo là gây tổn

thương và gây chết cà rốt ở hầu hết các vùng trồng cà rốt ở Mỹ và Canada [13, 64]

Ở miền Trung Oregon, cà rốt là cây trồng có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên,trong những năm gần đây, nhiều cây cà rốt non đã bị tổn thương nghiêm trọng, hậuquả là năng suất và sản lượng bị giảm sút Sau khi điều tra phân tích mẫu đất trồng

và củ cà rốt, Crowe & Simmons (2006), đã tìm thấy 4 loài Pratylenchus bao gồm:

P crenatus, P.neglectus, P penetrans và P thornei với mật độ từ 0 - 208 cá thể Pratylenchus/100g đất và từ 1 - 528 cá thể Pratylenchus/g trọng lượng củ tươi [65].

Tuyến trùng Pratylenchus spp cũng là một trong những nguyên nhân hạn

chế trong sản xuất cà rốt ở CHLB Đức Một khảo sát về tuyến trùng ký sinh gây hạitrên hệ thống sản xuất rau củ theo phương pháp canh tác hữu cơ ở Đức cho thấy hơn

90% số mẫu kiểm tra bị nhiễm tuyến trùng Pratylenchus spp [66] Một khảo sát

tương tự ở phía Bắc Tasmania nước Úc cho thấy có 28 trong số 33 cây cà rốt

(khoảng 85%) bị nhiễm tuyến trùng Pratylenchus spp [67] Hai loài tuyến trùng P penetrans và P crenatus cũng đã được tìm thấy trong rễ và đất trồng cà rốt ở

Canada với mật độ khá lớn [68]

Cho đến nay, ở khu vực Châu Á chưa có nghiên cứu nào về tuyến trùng

Pratylenchus spp trên cà rốt được ghi nhận, các nghiên cứu chủ yếu tập trung ở khu

vực Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Úc

Tuyến trùng bào nang (Heterodera spp.)

Trong lịch sử, tuyến trùng bào nang Heterodera carotae được xác định là

một trong những nguyên nhân gây dịch bệnh cho cà rốt, những cánh đồng bị nhiễm

tuyến trùng H carotae có sản lượng thấp [69] Loài H carotae được ghi nhận phổ

biến tại các vùng trồng cà rốt ở khu vực châu Âu như: Anh, Ireland, Hà Lan,Scotland, Pháp, Ý, Thụy Sĩ, Đức, Thụy Điển, Ba Lan, Tiệp Khắc và Hungary [70,71] Loài tuyến trùng này cũng đã được ghi nhận ở Ấn Độ [71], ở Michigan (Hoa

Kỳ) nơi có tới 67 % cánh đồng cà rốt bị nhiễm loài này [72] Tuy nhiên, loài H carotae chưa được báo cáo ở các khu vực khác phía Bắc và Nam Mỹ [73].

Tuyến trùng kim (Longidorus spp.)

Một số loài thuộc giống Longidorus đã được báo cáo gây hại trên cà rốt Loài Longidorus elongatus được ghi nhận ở châu Âu bởi Hooper (1973), như một

nguyên nhân gây thiệt hại nghiêm trọng cho sản xuất cà rốt [74] Năm 1975, Saynor

cũng công bố loài L elongatus gây thiệt hại cho cà rốt ở miền đông nước Anh [75] Một loài mới L israelensis được công bố là gây thiệt hại cho cà rốt ở Israel [43] Tuyến trùng Longidorus spp cũng được xác định là tác nhân gây bệnh trên cà rốt ở California [76] Tuyến trùng Longidorus spp cũng được ghi nhận ký sinh trên cà rốt

ở Anh và Úc, nhưng chúng chưa gây thiệt hại nghiêm trọng [39, 40]

Tuyến trùng thân, củ (Ditylenchus spp.)

Loài tuyến trùng Ditylenchus dipsaci đã được báo cáo là gây thiệt hại nghiêm

trọng cho các vùng canh tác cà rốt ở Ý, chúng gây ra các triệu chứng như cây tăng

trưởng thấp, còi cọc, lá đổi màu, héo rũ và phân rã [77, 78] Loài Ditylenchus dipsaci đã được ghi nhận ký sinh và gây bệnh trên cà rốt ở nước Anh và Miền Nam

và Tây nước Úc tuy nhiên, nó không gây thiệt hại nghiêm trọng [39, 40]

1.2.2 Phân loại hình thái và phân tử tuyến trùng thực vật

Đặc điểm hình thái học có vai trò quan trọng trong chẩn loại chính xác đếnloài tuyến trùng [79] Các đặc điểm hình thái, hình thái lượng là các yếu tố không

thể thiếu được trong phân loại tuyến trùng thực vật Một số đặc điểm hình thái được

sử dụng trong phân loại tuyến trùng thực vật như: chiều dài cơ thể, đặc điểm vùngbên, vùng đầu, vùng đuôi, kim hút, cơ quan sinh dục Tuy nhiên, tùy thuộc vào từngnhóm tuyến trùng khác nhau có đặc điểm hình thái phục vụ cho việc phân loại loài

và sắp xếp chúng vào các nhóm loài khác nhau

Đối với các loài tuyến trùng thuộc giống Meloiogyne, đặc điểm vùng perineal

patterns của con cái (vùng perineal patterns của con cái là vùng gồm có các cấutrúc: mút đuôi, phasmids, đường bên, vulva, hậu môn và các đường vân bao quanh[80]) được sử dụng rộng rãi trong phân loại và mô tả các loài từ năm 1949 bởiChiwood khi ông dựa vào các đặc điểm hình thái tấm cutin vùng perineal patterns,kim hút và khoảng cách từ gốc kim hút đến lỗ đổ của tuyến thực quản lưng (DGO)

để mô tả các loài tuyến trùng sần rễ Meloiogyne hapla, M, incognita, M arenaira,

M exigua và M javanica [81] Đây được xem là đặc điểm quan trọng trong phân loại hình thái các loài Meloidogyne spp., bởi sự ổn định trong cấu trúc của tấm cutin

vùng perineal patterns và đặc trưng cho từng loài, không thay đổi nhiều sau một thờigian nhân nuôi [82, 80] Mặt khác, so với con đực và ấu trùng thì con cái thường dễbắt gặp, số lượng nhiều hơn và có kích thước lớn hơn do đó dễ quan sát dưới kínhhiển vi [82] Tuy nhiên, một vài biến đổi của tấm cutin vùng perineal patterns củacác cá thể trong cùng một loài và sự đa dạng giữa các loài gần gũi hay giữa cácquần thể trong cùng 1 loài đã gây ra nhiều khó khăn cho việc phân loại nếu như chỉ

sử dụng đặc điểm này [81, 82, 80, 83] Chẳng hạn như các loài M paranaensis, M konaensis, M izalcoensis và M mayaguensis có đặc điểm hình thái tấm cutin vùng perineal patterns gần giống với loài M incognita [84] Hooper et al (2005) cũng

cho rằng việc phân loại các loài chỉ dựa trên các đặc điểm hình thái, hình thái lượngyêu cầu rất nhiều về kỹ năng và thời gian làm việc đặc biệt là nếu số lượng mẫu lớnhoặc các quần thể hiếm sẽ rất khó khăn [85]

Việc xác định các loài thuộc giống Pratylenchus thường dựa vào các đặc

điểm hình thái và hình thái lượng của con cái để chẩn đoán do con đực trong một sốtrường hợp không bắt gặp hoặc rất hiếm [86] Một số đặc điểm hình thái đã đượcchứng mình là ổn định, đáng tin cậy và hữu ích trong việc chẩn loại đến loài như:chiều dài cơ thể, số vòng đầu, hình dạng của vùng môi, hình dạng gốc kim hút, đặcđiểm vùng bên, chiều dài thực quản tuyến, hình dạng túi chứa tinh, vị trí của vulval,

cấu trúc và chiều dài tử cung sau, hình dạng đuôi, mút đuôi và sự hiện diện hayvắng mặt của con đực [63].

Đối với tuyến trùng thuộc các giống thuộc họ Criconemoidae đặc điểm hìnhthái quan trọng sử dụng trong phân loại là số vòng cutin của cơ thể, chiều dài kimhút và hình dạng đuôi của con cái [87, 88, 89]

Bên cạnh các đặc điểm hình thái, các chỉ số đo hình thái lượng cũng được sử

dụng rộng rãi Đối với tuyến trùng thuộc giống Pratylenchus, chủ yếu sử dụng các

chỉ số đo hình thái lượng của con cái [63] Đối với tuyến trùng thuộc giống

Meloidogyne các chỉ số đo hình thái lượng của ấu trùng tuổi 2 và con đực cũng đã

được chứng minh là hữu ích cho việc nhận biết các loài [90, 81] Hiện nay, phươngpháp hóa sinh và phân tử được sử dụng phổ biến để phân loại tuyến trùng thực vật.Tuy nhiên, các chỉ số đo hình thái vẫn cần thiết và tiên quyết trong mô tả, định loạichính xác các quần thể và phát sinh loài [44]

Cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật, việc sử dụng Kính hiển vi Điện tửquét (SEM) và Kính hiển vi Điện tử xuyên qua đã tái cấu trúc 3D đặc điểm hình tháicủa tuyến trùng mà kính hiển vi thông thường không xác định được [91] Hình ảnh

SEM cho thấy đặc điểm vùng môi của tuyến trùng Pratylenchus spp là một đặc

điểm phân loại hữu ích trong phân loại và tiến hóa loài [92] Hình ảnh SEM cũngcho phép nghiên cứu chi tiết hơn về tấm cuntin vùng perineal patterns và hình dạng

vùng đầu ở tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp [93, 81].

Mặc dù, phân loại vẫn dựa trên hình thái giải phẫu là chủ yếu nhưng phânloại các nhóm tuyến trùng thực vật thường gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng vàchồng lấn về hình thái và hình thái lượng trong loài rất lớn cũng như đối với các loàigần gũi Do đặc tính ký sinh và luôn có xu hướng biến đổi hình thái để thích nghivới từng loại cây chủ khác nhau ở các điều kiện vùng khí hậu khác nhau nên tuyếntrùng ký sinh thực vật không chỉ đa dạng về số lượng loài, mà còn có sự đa dạng vềhình thái giữa các quần thể khác nhau trong cùng một loài [94, 95] Các phươngpháp nghiên cứu trong phân loại cũng ảnh hưởng đến đặc điểm hình thái và hìnhthái lượng như: cố định tuyến trùng, xử lý tuyến trùng có thể làm sai lệch chìa khóa(key) phân loại loài trong các giống tuyến trùng [96] Sự khác nhau giữa các loàigần gũi rất khó phân biệt được qua hình thái nhất là đối với nhóm phức hợp loài

(species complex) thuộc giống Pratylenchus và Meloidogyne [97, 81]; hay như các loài Radopholus gặp ở Việt Nam chỉ phân biệt được sau khi phân tích biệt thức

chuẩn CDA của các chỉ số hình thái lượng và phải dùng các đặc trưng phân tử đểchắc chắn loài đã gặp [98]

Vì vậy, song song với việc sử dụng các đặc điểm hình thái, hình thái lượng,các nhà phân loại học đã áp dụng kỹ thuật phân tích đặc trưng phân tử của các trình

tự đoạn gene DNA khác nhau trong phân loại tuyến trùng, giúp cho việc định loạiđến loài được chính xác hơn Nhiều vùng DNA đã được sử dụng trong phân tích đadạng cũng như chẩn loại các loài tuyến trùng như small subunit (SSU) 18S rDNA[99, 100], D2D3 mở rộng của vùng 28S rDNA [101, 92] hay vùng ITS-rDNA [102]

Phân tích phân tử trong phân loại các loài tuyến trùng thuộc giống

Meloidogyne hiện nay được dùng khá phổ biến khi phân tích các vùng gen và phân

tích mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài gần gũi Một số vùng gen phổbiến được sử dụng trong những năm gần đây là vùng gen nhân ITS, D2D3 và vùnggen ty thể COI, COII [103, 104] Trong số đó, vùng gen mã hóa D2D3 28s rDNAđược ứng dụng phổ biến trong phân loại tuyến trùng, đoạn gene này có tính chất bảothủ và ổn định để có thể được xem là đặc điểm nhận biết các loài [105] Các biếnđổi này cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sự phát sinh chủng loại của các loài

thuộc giống Meloidogyne với các loài tuyến trùng thuộc giống khác [106, 107, 108].

Kỹ thuật phân tử cũng được sử dụng trong phân loại tuyến trùng giống

Pratylenchus từ những năm 90 của thế kỷ trước Đầu tiên là sử dụng phương pháp RAPD-PCR nhân bản ngẫu nhiên để nhận dạng loài P vulnus và P neglectus [109].

Tuy nhiên, nghiên cứu này cho thấy mức độ đa hình cao giữa các quần thể của loài

P vulnus Sau này các phân tích các vùng gen nhân (rDNA) được sử dụng phổ biến trong phân loại tuyến trùng giống Pratylenchus bằng phân tích các vùng 18S, ITS

và 28S [110] Các nghiên cứu cho thấy vùng gen 28S có mức độ bảo thủ và biến đổi

phù hợp để sử dụng trong phân loại các loài Pratylenchus [111, 92, 100] Subbotin

& Moens (2006) và Subbotin et al (2013) cho rằng các dữ liệu phân tử hiện nayphù hợp và chính xác hơn trong phân loại các loài so với phương pháp dựa trên đặcđiểm cấu trúc hình thái [112, 113] Subbotin et al (2008) [92] đã tiến hành phântích phát sinh chủng loại giữa các loài dựa trên vùng gen 28S cho một số loài thuộc

giống Pratylenchus được thu tại các vùng khác nhau để so sánh với phương pháp

dựa trên các đặc điểm cấu trúc về hình thái Kết quả cho thấy theo phương phápphân tích cấu trúc phân tử, các loài cũng được chia ra thành 6 nhánh khác nhau vàhoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu hình thái trước đó

Bên cạnh đó, phân đoạn gene mở rộng D2D3 của vùng 28S rDNA cũng được

sử dụng để phân tích mối quan hệ phát sinh loài trong các giống

Hemicriconemoides và Mesocriconemoides [114, 115].

1.2.3 Khả năng phòng trừ sinh học tuyến trùng thực vật bằng nấm đối kháng

Với những tác hại rõ ràng của tuyến trùng thực vật trên cây trồng, các biệnpháp nhằm làm giảm thiệt hại do tuyến trùng gây ra luôn được quan tâm nghiêncứu Để phòng trừ tuyến trùng thực vật nói chung và tuyến trùng thực vật ký sinh càrốt nói riêng, có rất nhiều biện pháp như: biện pháp hóa học [116], hệ thống luâncanh cây trồng [64], quản lý cỏ dại, sử dụng cây phân xanh [117], lựa chọn thời giantrồng và thu hoạch [19], sử dụng giống kháng và giống chống chịu [118], … Tuynhiên, để đảm bảo phát triển bền vững và không ảnh hưởng đến sức khỏe con ngườicũng như môi trường, các biện pháp sinh học, sử dụng thiên địch tự nhiên để hạnchế sự phát triển gây hại cũng như tiêu diệt tuyến trùng ký sinh thực vật đã và đangrất được quan tâm hiện nay [119, 120]

Kuhn (1877) là người đầu tiên quan sát thấy con cái loài tuyến trùng

Heterodera schachtii bị ký sinh bởi một loại nấm [121] Sau đó, năm 1881, ông đặt tên loại nấm này là Tarichum auxiliare [122] Kể từ đó một số lượng lớn các sinh

vật như: nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng ăn thịt, côn trùng, ve bét và một số độngvật không xương sống, đã được tìm thấy ký sinh hoặc săn mồi tuyến trùng thực vật[123] Trong số các loài sinh vật ký sinh hay săn mồi tuyến trùng, nấm là nhóm visinh vật có nhiều trong đất và một số loài có tiềm năng lớn trong phòng trừ tuyếntrùng như những tác nhân kiểm soát sinh học [124, 123, 125, 126]

Nấm chiếm khoảng 80% tổng số vi sinh vật trong đất [127, 128] Trong đó

có hơn 700 loài đối kháng tuyến trùng đã được ghi nhận [129] Dựa vào cơ chế gâybệnh, các loài nấm có khả năng kiểm soát tuyến trùng được chia làm ba nhóm: (1)nấm bẫy tuyến trùng; (2) nấm ký sinh trứng và ấu trùng; và (3) nấm sản sinh độc tố[126, 130]

Nấm bẫy (ăn thịt) tuyến trùng: Hay còn gọi là nấm ăn thịt, bởi vì chúng có

khả năng bắt giữ và giết chết tuyến trùng, sau khi tuyến trùng chết sẽ trở thànhnguồn dinh dưỡng giàu nitơ cho nấm [123] Để bắt giữ tuyến trùng, từ các sợi nấm

sẽ hình thành các cơ quan có khả năng bắt được tuyến trùng Barron (1977) và Gray(1987) đã mô tả sáu loại bẫy được tìm thấy trong nấm bẫy tuyến trùng bao gồm: (1)tạo ra các chất kết dính; (2) bẫy dạng nhánh thẳng; (3) bẫy mạng lưới; (4) núm dính;(5) bẫy dạng vòng không co thắt; và (6) bẫy dạng vòng co thắt [131, 132]

Khi tiến hành thí nghiệm trong các đĩa nuôi cấy agar, Timper & Brodie

(1993), nhận thấy các loài nấm vòng: Arthrobotrys dactyloides, A oligospora, Monacrosporium ellipsosporum và M cionopagum đã giết chết hầu hết con trưởng thành và ấu trùng loài Pratylenchus penetrans [133] Tương tự như vậy, nấm A arthrobotryoides, A dactyloides, Dactylaria thaumasia và M doedycoides làm giảm đáng kể sự thâm nhập của tuyến trùng P penetrans vào cỏ linh lăng [134].

Tuy nhiên, hầu hết các loại nấm bẫy không có khả năng tạo ra khuẩn lạc nhanh, khảnăng cạnh tranh thấp trong môi trường hoại sinh và không ổn định khi được bổ sungvào trong đất [135]

Nấm ký sinh trứng, ấu trùng và con trưởng thành: Một số loài nấm có khả

năng ký sinh trên trứng, ấu trùng và con cái một số giống tuyến trùng như tuyến

trùng bào nang Heterodera, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne, tuyến trùng gây tổn thương rễ Pratylenchus, Các loài nấm này chủ yếu thuộc các chi Pochonia, Paecilomyces, Lecanicillium và Nematophthora [126] Những loại nấm này tương

đối dễ dàng nuôi cấy và có thể ký sinh ở tất cả các giai đoạn phát triển của tuyếntrùng (trứng, ấu trùng và trưởng thành) Trong số các loài nấm ký sinh trứng và ấu

trùng, nấm Paecilomyces spp là loại nấm hoại sinh trong đất, được quan tâm và

nghiên cứu nhiều nhất, do tiềm năng ký sinh và khả năng kiểm soát quần thể tuyến

trùng thực vật ký sinh tốt [124, 136, 137, 138] Nấm Paecilomyces spp có phổ phân

bố rộng, xuất hiện với tần suất cao ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [139] vàchúng được tìm thấy trong hầu hết hệ sinh thái đất nông nghiệp [138] Cơ chế của

nấm Paecilomyces spp là ký sinh trực tiếp lên trứng, ấu trùng hoặc con trưởng

thành bởi các sợi nấm, đồng thời sản sinh ra các hoạt chất và enzyme như acidacetic, leucinotoxin, chitinase và protease có khả năng phân hủy lớp kitin bên ngoàitrứng và tuyến trùng trưởng thành [140, 137] Các enzyme phân hủy lớp vỏ trứng,

tạo điều kiện thuận lợi cho sợi nấm xâm nhập vào trứng và phá hủy các giai đoạnphát triển phôi thai ở giai đoạn sớm [136, 141].

Lysek (1976) là người đầu tiên quan sát thấy nấm Paecilomyces spp ký sinh trên trứng tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp.[142] Jatala et al (1979) cũng đã quan sát thấy nó ký sinh trên trứng của loài M incognita [143] Kiewnick & Sikora (2006), đã thử nghiệm khả năng kiểm soát tuyến trùng M incognita trên cà chua của nấm P lilacinus 251 Kết quả là nấm P lilacinus 251 đã làm giảm 66% nốt sần trên

rễ, 74% túi trứng và 71% mật độ ấu trùng trong rễ so với mẫu đối chứng [137] Al

Kader (2008) báo cáo hiệu quả gây chết 99% của dịch bào tử nấm Paecilomyces đối với ấu trùng M incognita sau 2 ngày gây nhiễm [144] Tương tự, Pau et al (2012) cũng công bố ba chủng nấm P lilacinus có khả năng làm giảm đáng kể lượng trứng

nở tuyến trùng M incognita trong thời gian 7 ngày tỷ lệ trứng nở là 12

- 11%, trong khi đó ở công thức đối chứng tỷ lệ trứng nở là 74% [145] Al Ajrami

(2016) đã tiến hành thử nghiệm khả năng ức chế nở trứng M incognita của nấm P lilacinus ở các nồng độ 1500 và 3000 bào tử/ml Kết quả, sau 72h tỷ lệ trứng nở ở

nồng độ bào tử nấm 1500 bào tử/ml là 18% và ở nồng độ nấm 3000 bào tử/ml là7%, ở công thức đối chứng là 88% Tỷ lệ ấu trùng chết là 35% ở nồng độ bào tửnấm 1500 bào tử/ml và 57% ở nồng độ bào tử nấm 3000 bào tử/ml [146]. Nấm P lilacinus cũng làm giảm số lượng tuyến trùng Pratylenchus spp ở ngô và P coffeae

ở đậu, đặc biệt số lượng cá thể trong quần thể tuyến trùng giảm đi khi tăng tỷ lệ nấm

được chủng thí nghiệm [147, 148] Tiềm năng sinh học trong việc kiểm soát mật độ

tuyến trùng của loài nấm P lilacinus cũng đã được sử dụng trong phòng trừ tuyến trùng loài M javanica và M incognita trên cây cà chua, rau, chuối và các cây trồng khác [149, 150] Hiện nay, nấm P lilacinus được xem là một trong những tác nhân

kiểm soát sinh học được thử nghiệm rộng rãi nhất trong việc quản lý tuyến trùng kýsinh thực vật [151] và đã được thương mại hóa [152, 153]

Nấm sản sinh độc tố: Nấm sản sinh độc tố là những nấm có khả năng tiết ra

độc tố để gây bất hoạt tuyến trùng (immobilize nematodes), trước khi sợi nấm cóthể xâm nhập qua lớp biểu bì của tuyến trùng [154] Hầu hết, các loài nấm nàythuộc họ Ascomycota và Basidiomycota Hiện nay, có khoảng hơn 270 loài nấm đãđược ghi nhận có khả năng làm bất hoạt tuyến trùng bởi độc tố do nấm tiết ra và 230hoạt chất kháng tuyến trùng đã được phân lập từ nấm [155, 129] Các hợp chất

này bao gồm: alkaloit, peptide, terpenoid, macrolit, heterocycle oxy, benzo, quinon, vàsterol [155, 129] Khả năng đối kháng với tuyến trùng của các nấm sản sinh độc tố đãđược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Xiang et al (2001) đã báo cáo về ảnh

hưởng của nấm Pleurotus ostreatus đến trên tuyến trùng sần rễ đậu phộng M arenaria trong nhà kính Thí nghiệm cho thấy nấm P ostreatus có thể làm giảm đáng kể số lượng ấu trùng M arenaria và bệnh sần rễ đậu phộng do tuyến trùng M arenaria gây

ra cũng giảm từ 87 - 94% [156] Tương tự như vậy, dịch nhân nuôi nấm P eryngii có khả năng gây chết 42% ấu trùng loài M javanica sau 24h gây nhiễm [157] Tiềm năng của một số loài nấm kháng tuyến trùng bào nang Heterodera schachtii ký sinh gây hại

ở củ cải đường đã được Palizi et al (2009) nghiên cứu khi tuyến trùng được chủng vào từng đĩa thạch lỏng có chứa bào tử nấm gồm có các loài: P ostreatus, P sajorcaju, P florida, P flabellatus, P eryngii và Hypsizygus ulmarius kết quả tuyến trùng đã nhanh chóng bị bất hoạt và chết sau khi gây nhiễm, tỷ lệ chết lần lượt đối với các nấm là 96,

72, 55, 52, 20, 23 và 62% [158] Chen et al (2010) đã thử nghiệm khả năng diệt tuyến

trùng M incognita của 22 loài nấm sản sinh độc tố như nấm L similis, Russula sanguinea, Schizophyllum commune, Spongipellis spumeus,… cho thấy tất cả 22 loài nấm đều có khả năng diệt tuyến trùng M incognita Trong đó, chỉ có 2 loài có hiệu lực

thấp với tỷ lệ tuyến trùng chết dưới 50% [159] Tương tự, thử nghiệm của Sufiate et al

(2017) nấm P eryngii làm đã giảm 53% lượng trứng nở của loài M incognita so với

đối chứng [160]

Nấm Lentinus squarrosulus (Mont.) thuộc chi Lentinus, họ Polyporaceae Corda

(1939), bộ Polyporales Gäum (1926) lớp Agaricomycetes [161] Chi Lentinus có

khoảng 40 loài [161], hầu hết các loài nấm thuộc chi Lentinnus đều là nấm có thể ăn được [162] Nấm L squarrosulus là một loài nấm có thể ăn được, giàu dinh dưỡng

[163], phân bố rộng khắp châu Phi, Châu Á, Châu Úc, đặc biệt phổ biển ở các vùngnhiệt đới [164, 165] Chúng có thể tồn tại, sinh trưởng và phát triển trong một phạm vi

nhiệt độ rộng lớn [164] Về mặt phân loại, nấm L squarrosulus đồng danh với nấm Pleurotus squarrosulus (Mont.) nấm L subnudus Berk và nấm L subtriginus Henn [164] Một số loài nấm cùng chi Lentinnus như: L edodes, L lepideus, L similis và một số loài nấm thuộc chi Pleurotus gần gũi với chi Lentinnus như nấm: P ostreatus,

P sajorcaju, P florida, P flabellatus, P eryngi,… ngoài giá trị

dinh dưỡng và dược liệu chúng còn có chứa một số hoạt chất có khả năng ức chế sựhoạt động và phát triển của một số loài tuyến trùng thực vật [166, 159].

Nấm L squarrosulus được báo cáo là có hoạt chất đối kháng chống lại nấm Rigidoporus lignosus, một loài nấm gây hại rễ của nhiều cây trồng ở vùng nhiệt đới, đặc biệt gây thiệt hại lớn đối với cây cao su (Hevea brasiliensis) [167, 168] Hai loại thuốc kháng sinh được sản xuất từ nấm L squarrosulus là Ls1 có tác dụng chống lại

vi khuẩn Bacillus subtilis và Ls2 chống lại nấm R lignosus và Mucor ramanninus [169] Mặc dù chưa có nghiên cứu về khả năng tiêu diệt tuyến trùng của nấm L squarrosulus Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy, trong dịch nhân nuôi nấm L squarrosulus có chứa hàm lượng enzym chitinase [170], hoạt chất 1,2 -

dihydroxymintlactone [171] và hợp chất phenolic [172, 173] Enzyme chitinase đãđược chứng minh là có tác dụng phân hủy lớp vỏ của tuyến trùng và lớp vỏ của

trứng [136, 141], trong khi hợp chất phenolic có tác dụng chống lại tuyến trùng P penetrans [174] Stadler et al (1995) đã xác định hoạt chất 1,2 - dihydroxymintlactone từ dịch nhân nuôi nấm Cheimonophyllum candidissimum có

khả năng kháng tuyến trùng [175] Chỉ số LD50 của hoạt chất 1,2

-dihydroxymintlactone đối với tuyến trùng Caenorhabditis elegans là 25 µm/ml

[175] Sau đó, các nghiên cứu tiếp theo cũng cho thấy hoạt chất này có trong một số

loài nấm như: Chroogomphus rutilus, Clavulinopsis corniculata, Clitocybe sp., C odora (injured), Clitocybula oculus, Collybia acervata, C confluence, C dryophila, Coltricia sp và Coprinus clastophyllus [176, 177, 178, 179, 159] Các loài nấm này cũng đã được thử nghiệm trên một số loài tuyến trùng Caenorhabditis sp., C elegans, B xylopholus, M incognita, H glycines, Aphelenchoides sp và A baseyi

[176, 177, 178, 179, 159]

Mặc dù nấm L squarrosulus có độc tính có thể gây bất hoạt cho tuyến trùng

nhưng lại không có tác dụng đối với động vật bậc cao Một thử nghiệm độc tính quađường tiêu hóa với chuột bạch khi trộn lẫn thức ăn với các tỷ lệ khác nhau của dịch

nhân nuôi nấm L squarrosulus, sau 35 ngày chuột không có biểu hiện triệu chứng

lâm sàng và không bị chết [180] Các quan sát tương tự đã được ghi nhận trongnghiên cứu ảnh hưởng của độc tính trong phúc mạc chuột bạch, khi dịch nhân nuôi

nấm L squarrosulus với các nồng độ khác nhau (60, 90 và 120 g/kg) được tiêm vào

màng bụng của chuột sau 35 ngày chuột không có biểu hiện triệu chứng bệnh,

không chết và thậm chí cơ thể còn tăng cân [180] Các nghiên cứu gần đây cũng đã

ghi nhận nấm L squarrosulus có chứa hàm lượng rất thấp các kim loại nặng như chì

và cadimi [181] Như vậy, nấm L squarrosulus có các hoạt chất đối kháng tuyến

trùng, song cho đến nay chưa có ghi nhận nào gây độc đối với động vật và conngười nên sản phẩm từ nấm này có thể được sử dụng trong phòng trừ sinh học đốivới tuyến trùng

1.3 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng thực vật ở Việt Nam

Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu đầu tiên về tuyến trùng thực vật đượccông bố năm 1970, với hơn 30 loài tuyến trùng thực vật và tuyến trùng tự do trongđất quanh vùng rễ cây trồng do nhà khoa học người Hungary - Tiến sĩ Andrassy[182] Sau đó, được triển khai nghiên cứu ở một số trường đại học và trung tâmnghiên cứu như: Trường Đại học Tổng hợp, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,Học viện Nông nghiệp Việt Nam (Đại học Nông nghiệp I Hà Nội), Đại học Nôngnghiệp thành phố Hồ Chí Minh, Viện Bảo vệ thực vật [182] Các nghiên cứu chủyếu tập trung vào điều tra thành phần loài và phân loại tuyến trùng ký sinh trên cáccây trồng chính như: cây lúa, thuốc lá, cà phê, hồ tiêu, vải, lạc, rau, cây thuốc, Năm 1993, N.N Châu & N.V Thanh đã xác định được 49 loài tuyến trùng ký sinhtrên cây hồ tiêu [183] Năm 1999, V.T.T Tâm và cs ghi nhận 31 loài tuyến trùngthuộc 18 giống ký sinh trên cây thuốc lá ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam [184].Thành phần loài tuyến trùng ký sinh trên cây vải ở Thanh Hà (Hải Dương) và LụcNgạn (Bắc Giang) đã xác định được 15 loài [185] V.A Tú và cs (2014) cũng xácđịnh có 11 giống tuyến trùng thực vật ký sinh trong rễ và đất cà phê tại Easao - TỉnhGia Lai [186] T.T.M Anh và N.N Châu xác định có 11 loài tuyến trùng thuộc 5giống ký sinh trên lạc ở Hưng Yên [187] Trên cây thuốc ở Đông Triều - QuảngNinh, N.H Tiền và cs cũng ghi nhận 13 loài thuộc 8 giống tuyến trùng ký sinh[188] Quá trình điều tra tuyến trùng ký sinh trên cam Cao Phong - Hòa Bình, T.Q.Pháp và cs ghi nhận 9 loài thuộc 8 giống tuyến trùng ký sinh [189] Năm 2016, N.T.Duyên và cs cũng đã công bố 15 loài thuộc 11 giống tuyến trùng ký sinh trên cácloại rau ở vùng trồng rau Xuân Hồng - Nam Định [190]

Bên cạnh các nghiên cứu cơ bản về điều tra, phân loại, các nghiên cứu đánhgiá vai trò gây hại của tuyến trùng đối với các cây trồng cũng đã được nhiều tác giả

triển khai như: nghiên cứu của các tác giả N.B Khương, N.T Xuyên, V.T.T Tâm

và cs đã xác định tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp là tác nhân gây hại chính trên

cây thuốc lá ở miền Bắc và miền Nam [191, 192, 185] Tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne spp cũng được xem là tác nhân gây bệnh chùn rễ trên lúa làm cho cây

còi cọc chậm phát triển và giảm năng suất [193] Một số kết quả nghiên cứu đã xác

định 4 loài tuyến trùng: Meloidogyne incognita, Rotylenchulus reniformis, Xiphinema americanum và Paratrichodorus nanus là nguyên nhân gây bệnh chết

chậm, thối đen rễ, vàng lá, xoăn lá, làm giảm năng suất và có khả năng phá hủy cácvườn hồ tiêu ở Việt Nam [194, 195, 196] Mặc dù, tuyến trùng gây hại trên cà phê

có thành phần loài khá là đa dạng, nhưng các nhóm loài gây hại chính vẫn là nhóm

tuyến trùng gây tổn thương rễ Pratylenchus spp và nhóm tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp [197, 198].

Như vậy, các nghiên cứu trên đây cho thấy sự đa dạng về thành phần loàituyến trùng, cũng như mức độ gây hại của chúng đối với cây trồng ở Việt Nam Đếnnay, đã ghi nhận khoảng 250 loài tuyến trùng ký sinh cây trồng ở Việt Nam [182].Một số giống được xác định là ký sinh gây hại khá phổ biến ở nhiều cây trồng như

giống: Meloidogyne, Pratylenchus, Radopholus, Hirschmanniella, Rotylenchulus, Helicotylenchus, Ditylenchus [135] Nhiều loài tuyến trùng ký sinh quan trọng trên

các cây trồng khác nhau đã được công bố Tuy nhiên, thành phần loài tuyến trùng

ký sinh và gây hại trên cây cà rốt chưa được nghiên cứu nhiều N.N Châu & N.V

Thanh (2000) đã ghi nhận 12 loài tuyến trùng thuộc 4 giống: Pratylenchus, Scutellonema, Helicotylenchus và Aphelenchoides ký sinh trên cà rốt ở Lâm Đồng [182] Ở Hải Dương, V.Đ Phiên (2014) đã xác định ba giống Meloidogyne, Pratylenchus và Radopholus gây hại trên cà rốt, nhưng chưa các định đến loài [9].

Ở Việt Nam, phân loại tuyến trùng chủ yếu sử dụng phương pháp mô tả đặcđiểm hình thái Nhiều loài tuyến trùng đã được phân loại chủ yếu dựa vào các đặcđiểm hình thái và hình thái lượng Tuy nhiên, do đặc thù tuyến trùng thực vật rất đadạng về hình thái và một số loài gần gũi có các chỉ số phân loại chồng lấn với nhau

Vì vậy, những nhầm lẫn trong mô tả hình thái là khó tránh khỏi Trong những nămgần đây, các kỹ thuật phân tử đã được áp dụng trong phân loại tuyến trùng, giúp choviệc định loại đến loài chính xác hơn Cho đến nay, nhiều loài/quần thể thuộc các

giống tuyến trùng khác nhau đã được phân tích DNA như: giống Pratylenchus phân

tích DNA 37 loài/quần thể, giống Xiphinema có 42 loài/quần thể đã được phân tích

DNA [135] Đặc biệt, T.Q Pháp đã áp dụng kỹ thuật phân tử và phân tích thống kêCDA đã giúp định loại chính xác một số chồng lấn trong phân loại hình thái loài

Radopholus similis ở Đắk Lắk Các quần thể tuyến trùng Radopholus spp ký sinh trên sầu riêng và cà phê ở Đắk Lắk, hoàn toàn không phải là loài R similis như chẩn loại ban đầu, mà là hai loài mới là R duriophilus và R arabocoffeae [199] Trên cơ

sở phân tích DNA kết hợp với các đặc điểm hình thái và hình thái lượng, một số

loài mới đã được công bố cho khoa học như: R duriophilus, R arabocoffeae, R daklakensis, Meloidogyne daklakensis,… [199, 98, 200].

Hiện nay, ở Việt Nam, tuyến trùng thực vật đang là mối đe dọa nghiêm trọngtrên một số cây trồng như cà phê, hồ tiêu,… [135] Để giảm thiểu các thiệt hại dotuyến trùng thực vật gây ra, các giải pháp phòng trừ chúng bước đầu cũng đangđược quan tâm Nhằm hạn chế việc sử dụng thuốc hóa học trong phòng trừ tuyếntrùng thực vật, các chế phẩm sinh học đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu.Năm 1995, N.N Châu và N.T Kỳ lần đầu tiên đã sử dụng thuốc thảo mộc chiếtxuất từ cây sầu đâu rừng, cúc vạn thọ và xoan Ấn Độ để phòng trừ tuyến trùng

Meloidogyne spp và Xiphinema spp ký sinh gây hại trên hồ tiêu Kết quả cho thấy,

sau 30 ngày thử nghiệm, chế phẩm có thành phần từ cúc vạn thọ và xoan Ấn Độ cóhiệu lực diệt tuyến trùng là 56%, chế phẩm chiết xuất từ lá và hạt sầu đâu rừng cóhiệu lực diệt tuyến trùng khá cao đạt tới 85 và 92% [201] Năm 2005, N.N Châu vàT.Q Pháp đã thử nghiệm thuốc thảo mộc Sông Lam được chiết xuất từ vỏ mãng cầu

xiêm để phòng trừ loại tuyến trùng ký sinh thực vật, bao gồm Hemicriconemoides spp., Meloidogyne spp., Paratrichodorus spp., Pratylenchus spp., Rotylenchulus reniformis và Tylenchorhynchus spp Kết quả thử nghiệm cho thấy, ở nồng độ 2%

và sau 7 ngày xử lý, tỷ lệ các giống tuyến trùng thử nghiệm chết từ 85 - 98% [202].Nghiên cứu sử dụng thuốc thảo mộc để phòng trừ một số sâu hại cây trồng là mộthướng đi đúng đắn nhằm hạn chế sử dụng thuốc hoá học và tận dụng nguồn nguyênliệu sẵn có của các địa phương Tuy nhiên, thuốc thảo mộc thường có một số nhượcđiểm như: hiệu lực diệt sâu thường thấp, nguồn nguyên liệu hạn chế, công nghệ sảnxuất phức tạp và giá thành cao, ứng dụng trong thực tế còn rất hạn chế [135]

Vì vây, trong những năm gần đây, sử dụng các vi sinh vật đối kháng cónguồn gốc từ đất như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn để hạn chế sự sinh trưởng và phát

triển của tuyến trùng ký sinh thực vật là lựa chọn đúng đắn Các kết quả thử nghiệm

ảnh hưởng của chủng nấm nội sinh rễ không gây bệnh Fusarium oxysporum, đến sự sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng sần rễ M incognita trên cây cà chua và loài M graminicola trên lúa cho thấy: có 6/9 chủng nấm F oxysporum có tác dụng

làm giảm nốt sần và túi trứng do con cái tạo ra trên rễ cây cà chua, với tỷ lệ nốt sầngiảm từ 33,5 - 55% và túi trứng giảm từ 30 - 50% so với cây đối chứng [203]

Tương tự như vậy, có 4/8 chủng nấm F oxysporum có tác dụng làm giảm nốt sần và túi trứng của tuyến trùng M graminicola trên rễ cây lúa, với tỷ lệ nốt sần giảm từ

26,7 - 48% và túi trứng giảm từ 25,5 - 41% so với cây đối chứng có [204] N.V.Dũng và cs (2016) sử dụng 2 chế phẩm K-18 và SH-BV1 (có thành phần là thảomộc, enzyme và các loài nấm đối kháng) để phòng trừ tuyến trùng hại cà rốt ở HảiDương và Lâm Đồng, đã xác hiệu lực diệt tuyến trùng từ 68 - 78% [205] Tuynhiên, công bố này không đề cập đến nhóm tuyến trùng nào ký sinh ở cà rốt mà chỉ

là tuyến trùng trong đất Trong khi đó, tuyến trùng trong đất lại bao gồm nhiềunhóm khác nhau như: tuyến trùng thực vật, tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng

và tuyến trùng sống tự do Vì vậy, số lượng tuyến trùng giảm không rõ là nhómtuyến trùng nào: tuyến trùng thực vật, tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng haytuyến trùng sống tự do? L.T.M Linh và cs (2015) đã thử nghiệm trong điều kiện

phòng thí nghiệm khả năng ức chế trứng nở và giết chết ấu trùng M incognita của nấm Paecilomyces javanicus Kết quả, nấm P javanicus có khả năng ức chế quá trình nở trứng và giết chết ấu trùng M incognita sau 120h, ở các công thức dịch

nấm 5, 10 và 20%; tỷ lệ trứng nở lần lượt là 11,8; 8,9; 3,8% và tỷ lệ ấu trùng chết là52; 55 và 75% [206]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Tuyến trùng ký sinh trên rễ, củ cà rốt và đất xung quanh vùng rễ

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

- Cây ký chủ là cây cà rốt (Daucus carota L Him) thuộc Họ Hoa tán

(Umbellferae), Bộ Hoa tán (Umbellales) còn gọi là Bộ Sơn thù du (Cornales), Phânlớp Hoa hồng (Rosidae)

- Hai loài nấm được sử dụng trong thí nghiệm phòng trừ tuyến trùng là:

chủng nấm ký sinh tuyến trùng Paecilomyces sp và nấm Lentinus squarrosulus Mont 1842 Chủng nấm Paecilomyces sp thuộc Chi Pacelomyces

Samson (1974), họ Trichocomaceae Fish (1987) Dịch bào tử nấm với nồng độ 106

bào tử/ml do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa cung cấp Nấm Paecilomyces sp được

nhân nuôi trong bình tam giác chứa 200ml môi trường lỏng PDB (Potato DextroseBorth) theo phương pháp của Gao et al (1998), ở nhiệt độ 25ºC [207] Sau 7 ngày,dung dịch được lọc qua rây vải thô để loại bỏ sợi nấm, rồi ly tâm ở 5000 vòng/phút

ở nhiệt độ 20ºC trong thời gian 20 phút Thu bào tử nấm là phần lắng đọng ở ống lytâm Sau đó, đếm và điều chỉnh nồng độ bào tử nấm là 106 bào tử/ml Nấm Lentinus squarrosulus Mont 1842 thuộc Chi Lentinus, họ Polyporaceae Corda (1939) là loài

nấm lớn có khả năng tiết độc tố kháng tuyến trùng Dịch nhân nuôi nấm do Viện

Công nghệ sinh học cung cấp Nấm L squarrosulus được nhân nuôi trong bình tam

giác chứa 200ml môi trường lỏng PDB theo phương pháp của Gao et al (1998), vớisinh khối tươi ban đầu là 15 mg/ml, ở nhiệt độ 25ºC [207] Sau 7 ngày, dung panhgắp bỏ sợi nấm, rồi pha toàn bộ dịch nhân nuôi này với nước cất với tỷ lệ là 1:1 rồilọc qua giấy lọc Whatman Sau đó, ly tâm ở 5000 vòng/phút ở nhiệt độ 20ºC trongthời gian 20 phút, để thu dịch nhân nuôi

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Quá trình khảo sát, điều tra tình trạng tuyến trùng ký sinh trên cà rốt tại 4 vùngcanh tác chính thuộc 4 tỉnh: Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên và Lâm Đồng bao gồm:

- Hà Nội: các xã Kim Nỗ, Vân Nội và Vân Trì - huyện Đông Anh (30 mẫu)

- Hải Dương: các xã Đức Chính - huyện Cẩm Giàng và xã Minh Tân - huyện Nam Sách (100 mẫu)

- Hưng Yên: xã Thắng Lợi - huyện Văn Giang (30 mẫu)

- Lâm Đồng: Thị trấn Liên Nghĩa - huyện Đức Trọng; xã Tu Tra và Xuân Thọ

- huyện Đơn Dương; phường 3, phường 6, phường 11 - TP Đà Lạt (80 mẫu).Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Tuyến trùng học và phòng Sinh họcphân tử và Di truyền bảo tồn - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Thời gianthực hiện từ tháng 10/2014 - 10/2018

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều tra, thu mẫu tuyến trùng

Mẫu thu để phục vụ điều tra thành phần loài được thu một cách ngẫu nhiêntheo phương pháp 5 điểm chéo góc [21] Thu mẫu rễ và mẫu đất ở những cây cóbiểu hiện bệnh (như vàng lá, thối rễ, sần rễ…) và cây khỏe mạnh Gạt bỏ lớp đất bềmặt quanh vùng rễ (5cm), đào sâu xuống khoảng 15 - 20cm từ mặt đất và thukhoảng 1kg đất, 10g rễ hoặc củ quanh vùng đất vừa lấy [135]

2.2.2 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất và mô thực vật

Tuyến trùng được tách lọc từ đất theo phương pháp được mô tả của N.N.Châu và N.V Thanh (1993) [208]: Mẫu đất được trộn đều và định lượng 250g, chovào xô có 2 lít nước, bóp vụn và khuấy đều Sau đó, dung dịch đất được chuyển quarây lọc thô để loại bỏ cặn đất và rác bẩn Phần dung dịch đất có chứa tuyến trùngtrong xô được gạn lọc nhiều lần để loại bỏ hết cặn đất và cát nặng, chỉ còn lại dịchtuyến trùng ở dạng huyền phù Dịch tuyến trùng được chuyển qua rây lọc đườngkính lỗ rây 40 µm, rửa bằng nước sạch, tuyến trùng phía trên rây lọc được thu vàomột rây lọc tĩnh có đường kính 85 × 25 mm và kích thước lỗ rây 63 µm Đặt rây lọctĩnh vào đĩa Petri đường kính 90 × 30 mm, điều chỉnh lượng nước cho phù hợp Sau48h, nhấc rây lọc tĩnh ra và thu dung dịch nước có chứa tuyến trùng trong đĩa petri

Mẫu củ và rễ được tách lọc theo phương pháp của N.N Châu và N.V Thanh(1993) [208]: các mẫu rễ cà rốt được rửa sạch, cân mẫu rễ, rồi cắt ra thành đoạn cácđoạn nhỏ 0,5 cm rồi chuyển sang rây có đường kính lỗ rây lọc tĩnh 40 µm, kíchthước 85 × 25 mm Đặt rây lọc tĩnh vào đĩa Petri đường kính 90 × 30 mm, điềuchỉnh lượng nước cho phù hợp Sau 48h, nhấc rây lọc tĩnh ra và thu dịch nước có

chứa tuyến trùng trong đĩa petri Đối với những mẫu thối củ thì cắt phần thối chovào rây lọc tĩnh có đường kính lỗ rây 40 µm, kích thước 85 × 25 mm Đặt rây lọctĩnh vào đĩa Petri đường kính 90 × 30 mm, điều chỉnh lượng nước cho phù hợp Sau48h, nhấc rây lọc tĩnh ra và thu dịch nước có chứa tuyến trùng trong đĩa petri

Riêng đối với những mẫu sần sùi, có nốt sần sẽ được tách trực tiếp dưới kínhhiển vi soi nổi để thu con cái trưởng thành và túi trứng

2.2.3 Phương pháp nhân nuôi tuyến trùng Meloidogyne spp và Pratylenchus spp.

2.2.3.1 Phương pháp nhân nuôi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp.

Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne được nhân nuôi trên cây cà chua theo

mô tả của López-Pérez et al (2011) [209] có hiệu chỉnh:

Hạt cà chua (sử dụng giống mẫn cảm với các loài Meloidogyne spp.) được

khử trùng bề mặt bằng cồn 70o trong 5 phút, vớt ra rửa sạch cho vào dung dịch natrihypochlorite 1% (NaOCl) trong 15 phút để loại trừ các tác nhân gây bệnh nhiễmbên ngoài vỏ hạt Sau đó, các hạt giống cà chua được rửa lại nhiều lần với nước cất

để loại bỏ hết dung dịch natri hypochlorite Các hạt này được gieo trong khay đất đãkhử trùng, khi cây được hai lá thật thì chuyển vào các chậu đất (250 cm3 đất) Saukhi chuyển sang chậu, cà chua bén rễ thì tiến hành chủng tuyến trùng với số lượng

200 ấu trùng/chậu Sau 30 - 60 ngày có thể thu tuyến trùng

Rễ cây cà chua bị nhiễm tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp được rửa sạch

để loại bỏ đất bám xung quanh, sau đó cắt nhỏ thành từng đoạn 1 - 2cm và cho vàodung dịch NaOCl 1,5% Lắc đều trong 5 phút để phá vỡ cấu trúc vỏ gelatin của túitrứng Ấu trùng được thu qua rây lọc có đường kính lỗ rây 40 µm và trứng được thu

ở rây lọc có đường kính lỗ rây 25 µm [210]

2.2.3.1 Phương pháp nhân nuôi tuyến trùng tổn thương rễ Pratylenchus spp Tuyến trùng gây tổn thương rễ thuộc giống Pratylenchus được nhân nuôi trên

các đĩa cà rốt theo phương pháp của Coyne et al (2014) [211], theo các bước sau:

- Chuẩn bị đĩa cà rốt: Chọn củ cà rốt tươi, không bị bệnh, rửa sạch Trong

điều kiện buồng nuôi cấy tiệt trùng, ngâm cà rốt vào cốc có chứa cồn 95ºC khoảng 1

- 2 giây rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng Dùng dao đã khử trùng gọt vỏ vàcắt bỏ hai đầu Cắt củ cà rốt thành các miếng nhỏ dày 0,5 cm Gắp từng miếng cà