Tối ưu điều kiện sinh trưởng và đánh giá khả năng phân hủy cellulose trong phụ phẩm sau thu hoạch quả vải của hai chủng vi khuẩn dv2 1 và em1

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN SINH TRƯỞNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TRONG PHỤ PHẨM SAU THU HOẠCH QUẢ VẢI CỦA HAI CHỦNG VI KHUẨN DV2.1 VÀ EM1” Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN SINH TRƯỞNG VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TRONG PHỤ PHẨM SAU THU HOẠCH QUẢ VẢI CỦA HAI CHỦNG VI KHUẨN DV2.1 VÀ EM1” Sinh viên : Hà Doanh Nghiệp MSV : 637341 Lớp : K63CNSHD Khoa : Công nghệ sinh học Giảng viên HD : Th.S Trịnh Thị Thu Thủy Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận hồn tồn hồn thiện tìm hiểu nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn ThS Trịnh Thị Thu Thủy giảng viên khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Tất số liệu, hình ảnh, kết trình bày khóa luận tốt nghiệp hồn tồn trung thực, khơng chép cơng trình nghiên cứu người khác mà khơng rõ nguồn tham khảo Các tài liệu tham khảo sử dụng khoá luận liệt kê danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước Hội đồng chấm khố luận tốt nghiệp Học viện Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Hà Doanh Nghiệp i năm 2022 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc thầy cô Học viện Nông nghiệp Việt Nam đặc biệt thầy cô Bộ môn SHPT & CNSH Ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học Học viện tạo điều kiện cho em thực tập khoa để có nhiều thời gian cho khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS Trịnh Thị Thu Thủy, giảng viên môn SHPT & CNSH Ứng dụng, khoa Công nghệ Sinh học, tận tình hướng dẫn suốt q trình nghiên cứu, thực hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè ln đồng hành, giúp đỡ, động viên suốt quãng thời gian dài thực tập khóa luận Do kiến thức kinh nghiệm thực tế thân nhiều hạn chế nên báo cáo khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy báo cáo hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Hà Doanh Nghiệp ii năm 2022 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực trạng phế phụ phẩm sau thu hoạch vải 1.1.1 Sản lượng thực trạng phế phụ phẩm nông nghiệp 1.1.2 Sản lượng phụ phẩm sau thu hoạch vải 1.2 Thành phần nguyên liệu có vải 1.2.1 Thành phần Cellulose 1.2.2 Thành phần Lignin 11 1.2.3 Thành phần Hemicellulose 17 1.3 Một số hướng tái sử dụng phụ phẩm nông nghiệp 19 1.4 Ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy tới khả sinh trưởng sinh tổng hợp cellulase 21 1.4.1 Nguồn carbon 21 1.4.2 Nguồn nitơ 22 1.4.3 Nhiệt độ 22 1.4.4 pH môi trường 23 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu, thời gian địa điểm nghiên cứu 24 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 24 iii 2.1.2 Môi trường nghiên cứu 24 2.1.3 Dụng cụ hóa chất thí nghiệm 25 2.1.4 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính, hoạt độ cellulase 26 2.3.2 Xác định điều kiện mơi trường thích hợp cho phát triển hai chủng vi khuẩn 28 2.3.3 Xác định hàm lượng chất khơ, cellulose, lignin có mẫu phế phụ phẩm vải 31 2.3.4 Đánh giá khả phân hủy phế phụ phẩm 34 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết qủa xác định hoạt tính, hoạt độ enzyme cellulase hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 35 3.1.1 Kết xác định hoạt tính enzyme cellulase 35 3.1.2 Kết xác định hoạt độ enzyme Cellulase 36 3.2 Kết xác định điều kiện mơi trường thích hợp cho phát triển hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 37 3.2.1 Kết xác định mơi trường thích hợp cho sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 37 3.2.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 38 3.2.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 40 3.3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng nguồn cacbon tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 41 3.3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng pH tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 43 iv 3.3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 44 3.3.7 Ảnh hưởng tốc độ lắc tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 45 3.3.8 Kết xây dựng đường cong sinh trưởng 46 3.3 Kết đánh giá khả phân hủy phế phụ phẩm sau thu hoạch vải hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 48 3.3.1 Kết xác định thành phần cellulose, lignin có phế phụ phẩm sau thu hoạch vải 48 3.3.2 Đánh giá khả phân hủy cellulose phế phụ phẩm sau thu hoạch vải hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 49 3.3.3 Đánh giá khả phân hủy lignin phế phụ phẩm sau thu hoạch vải hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 Kết luận 54 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 62 v DANH MỤC BẢNG Bảng Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 25 Bảng 2 Đường chuẩn Glucose 27 Bảng Giá trị d theo Va 34 Bảng Hoat tính enzyme cellulase chủng vi khuẩn 35 Bảng Hoạt độ Cellulase chủng vi khuẩn 36 Bảng 3 Ảnh hưởng pH tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 43 Bảng Ảnh hưởng tốc độ lắc tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 45 Bảng Thành phần cellulose, lignin có phụ phẩm vải 48 Bảng Khả phân hủy cellulose hai chủng DV2.1 EM1 51 Bảng Khả phân hủy lignin hai chủng DV2.1 EM1 52 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1 Một số hình ảnh cấu trúc cellulose Hình Quá trình phân giải cellulose enzyme cellulase Hình Cấu trúc phân tử Lignin 12 Hình Cơ chế hoạt động Lignin peroxidase 13 Hình Cơ chế hoạt động Mangan peroxidase 14 Hình Cấu trúc hoạt động Laccase 16 Hình Cấu trúc phân tử Hemicellulose 18 Hình Hoạt tính enzyme cellulase hai chủng vi khuẩn sau ngày nuôi cấy 35 Hình Đồ thị đường chuẩn Glucose 36 Hình 3 Kết khảo sát mơi trường thích hợp cho sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 38 Hình Ảnh hưởng nguồn nitơ tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 39 Hình Ảnh hưởng nguồn cacbon tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 40 Hình Ảnh hưởng hàm lượng saccharose tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 42 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 44 Hình Đường cong sinh trưởng chủng DV2.1 46 Hình Đường cong sinh trưởng chủng EM1 47 Hình 10 Mẫu bột phế phụ phẩm sau thu hoạch vải 48 Hình 11 Diễn biến nhiệt độ đống ủ 50 vii DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt CMC cs Giải nghĩa Carboxymethyl cellulose Cộng DNS 3,5 Dinitrosalicylic acid ĐC Đối chứng LB Luria Bertani Broth LiP Lignin peroxidase MnP Mangan peroxidase SHPT Sinh học phân tử U VP Unit Versatile peroxidase (Peroxidase đa năng) viii KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 qua đánh giá có hoạt tính enzyme cellulase với hoạt độ 76,48 63,87 U/L - Hai chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng tốt mơi trường có thành phần: Saccharose: 10(g/L), Casein: 2(g/L), KH2PO4: 4(g/L), Na2HPO4: 4(g/L), MgSO4.7H2O: 0,2(g/L), CaCl2.2H2O: 0,001(g/L), FeSO4.7H2O : 0,004(g/L) - Điều kiện thích hợp cho hai chủng vi khuẩn phát triển nhiệt độ 45oC, tốc độ lắc 150 vịng/phút, pH thích hợp cho chủng DV2.1 pH 7,5 EM1 pH - Khi ủ hỗn hợp vi khuẩn với phế phụ phẩm sau thu hoạch vải, khả phân hủy cellulose 17,00 % khả phân hủy lignin 19,77 % Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu kéo dài thời gian ủ, nhiệt độ, độ ẩm công thức phối trộn vi sinh vật với chất mang khác để tạo chế phẩm sinh học có khả phân hủy phế phụ phẩm sau thu hoạch vải thành phân bón hữu Tiếp tục tiến hành ni cấy sinh khối với quy mô lớn ứng dụng thử nghiệm vào sản xuất chế phẩm vi sinh phân hủy phế phụ phẩm 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt Cao Cường Nguyễn Đức Lượng (2003) Khảo sát trình cảm ứng enzyme chitinase cellulase Trichoderma harzianum ảnh hưởng hai enzyme lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 321-324 Đào Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Thiên Trang cs (2006) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng xử lý vỏ cà phê làm phân bón cho trồng Viện khoa học kỹ thuật Nông lâm nghiệp Tây Nguyên Đào Thị Lương, Hà Thị Hằng, Dương Văn Hợp (2020) Điều kiện nuôi thích hợp cho sinh trưởng vi khuẩn probiotic Lactobacilus acidophilus VTCC 12257 quy mơ phịng thí ngiệm thiết bị lên men 30l Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam 62(6), 2020, 5864 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzymen NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đinh Hồng Duyên Nguyễn Xuân Thành (2010) Phân lập tuyển chọn vi sinh vật để xử lý phế thải đồng ruộng Tạp chí Khoa học, 34: 68-73 Đinh Hồng Duyên, Nguyễn Thế Bình Vũ Thanh Hải (2015) Tuyển chọn đánh giá khả sử dụng xạ khuẩn để xử lý phụ phẩm sau thu hoạch vải Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn,15: 42-48 Đinh Văn Hùng, Trần Văn Chiến (2007) Giáo trình Hóa học hữu Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Hồ Sỹ Tráng (2006) Cơ sở hóa gỗ cellulose tập NXB Khoa học Kỹ thuật: trang 714 Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp Dương Ngọc Thúy (2017) Phân lập, nhận diện vi khuẩn phân hủy cellulose từ sùng (Holotrichia parallela) trùn đất (Lubricus terrestris) Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ, Tập 50, Phần B (2017): 81-90 10 Nguyễn Lan Hương Hồng Đình Hịa (2003) Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột, protein, cellulose dầu ô liu trình phân hủy chất thải hữu Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, 288-291 11 Nguyễn Lân Dũng (2014) Giáo trình vi sinh vật học Nhà xuất Hà Nội 55 12 Nguyễn Ngọc Ẩn, Nguyễn Lê Hiền Hòa, Trần Nguyễn Diễm Linh, Bùi Thịluyến, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Thịdiệu Hạnh, Phạm Tấn Việt (2021) Khảo Sát Các Điều Kiện Sinh Tổng Hợp Cellulase từ Bacillus amyloliquefaciens D19 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 49,2021 13 Nguyễn Ngọc Hà (2014) Bước đầu chế tạo đánh giá hoạt tính enzyme Laccase phức hệ Nano Chitosan Đại học Dược Hà Nội 14 Nguyễn Ngơ Yến Ngọc, Lương Bảo Un, Bùi Minh Trí (2014) Phân lập, đánh giá tối ưu hóa điều kiện ni cấy số chủng vi sinh vật có khả phân hủy đồng thời lignin cellulose Tạp chí sinh học 2014, 36(1se): 34-41 15 Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Vũ Việt Linh, Nguyễn Ngọc Kim Tuyến, Phạm Ngọc Sinh, Nguyễn Anh Thư (2019) Giải pháp hữu ích quy trình xác định hàm lượng lignin sợi xơ dừa Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh 16 Nguyễn Thị Minh Lê Anh Tùng (2005) Nghiên cứu, phân lập tuyển chọn chủng giống vi sinh vật có khả phân giải chất thải hữu mạnh để làm chế phẩm vi sinh vật xử lý rác thải hữu sinh học phế thải nông nghiệp thành phân hữu sinh học Báo cáo kết nghiên cứu khoa học công nghệ, Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội 17 Nguyễn Thị Thu Thủy, Trần Thị Xuân Phương, Cao Thị Dung, Lê Thị Xuân Hương, Trương Thị Hồng Hải (2017) Phân lập tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose bước đầu ứng dụng xử lý phế phụ phẩm nông nghệp làm phân hữu vi sinh Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp, tập 159-168 18 Nguyễn Thị Thuý Nga, Phạm Quang Nam, Lê Xuân Phúc, Phạm Quang Thu Chí, Nguyễn Minh (2015) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân giải xenlulose sản xuất phân hữu sinh học Tạp chí Khoa học Lâm Nghiệp, 2: 3841-3850 19 Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Tồn (2003) Giáo trình cơng nghệ vi sinh vật nông nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 105 trang 20 Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999) Tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose từ mùn rác Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, 177-182 21 Phan Thị Phẩm Lê Thị Thu Hương (2017) Sự chuyển đối sinh khối Lignocellulose: từ phế thải đến nguyên liệu tiềm cho sản xuất ethanol sinh học hệ thứ hai Việt Nam Tạp chí Khoa học Lạc Hồng, 159-164 56 22 Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999) Nghiên cứu sản xuất cellulase số chủng vi sinh vật ưa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải Báo cáo khoa học, Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, 790-797 23 Tô Lan Anh, Nguyễn Khánh Hồnh Việt, Nguyễn Văn Hồng, Tơ Văn Thiệp, Nguyễn Thị Nhung (2017) Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme ngoại bào cellulase từ chủng vi khuẩn ưa mặn Bacillus sp X2 Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, số 14,143-153 24 Tổng cục Thống kê, Cục Chăn nuôi (2020) Sử dụng hiệu tài nguyên phụ phẩm nông nghiệp Báo Quân đội Nhân dân 25/06/2022 https://www.qdnd.vn/kinh-te/cac-van-de/desu-dung-hieu-qua-tai-nguyen-phu-pham-nong-nghiep-689187 25 Trần Anh Tuấn (2010) Nghiên cứu quy trình thu hồi Lignin nước thải dịch đen công nghiệp sản xuất giấy Trường Đại học Hàng Hải 26 Trần Thạnh Phong (2004) Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme cellulase từ T reesei A niger môi trường lên men bán rắn Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM 24-36 27 Trần Văn Lương (2020) Nghiên cứu tổng hợp ứng dụng xác tác cacbon hóa từ nguồn lignin phế thải Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 28 Triệu Quốc Dương (2021) Hiện trạng nông, lâm, thủy sản đề xuất giải pháp cho vùng Nam Bộ Truy cập ngày 21/09/2021 29 Võ Văn Phước Quệ vàCao Ngọc Điệp (2011) Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ 2011, 18a 177-184 30 Vũ Thị Dinh (2017) Luận văn thạc sĩ khoa học Phân lập, tuyển chọn đặc tính chủng vi khuẩn có khả chịu n hiệt, chịu pH sinh tổng hợp cellulase xử lý nước thải nhà máy giấy Đại học Khoa học tự nhiên-Đại học Quốc gia Hà Nội 31 Vũ Văn Long Trần Văn Dũng (2021) Phân lập đánh giá khả phân hủy mía dịng vi khuẩn đất phèn trồng mía Đồng sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 63(3): 24-27 Tài liệu tham khảo tiếng anh Abou-Taleb, K A., Mashhoor, W A., Nasr, S A., Sharaf, M S., & Abdel-Azeem, H H (2009) Nutritional and environmental factors affecting cellulase production by two strains of cellulolytic Bacilli Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(3): 2429-2436 Acharya, P., Acharya, D., Modi, H (2008) Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate African journal of biotechnology, 7(22): 57 4147-4152 Awais, M., Tariq, M., Ali, A., Ali, Q., Khan, A., Tabassum, B & Husnain, T (2017) Isolation, characterization and inter-relationship of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of sugarcane and rice Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 11: 312321 Bárcena, J B., Siđeriz, F., González de Llano, D., Rodríguez, A., & Srez, J E (1998) Chemostat production of plantaricin C by Lactobacillus plantarum LL441 Applied and Environmental Microbiology, 64(9): 3512-3514 Béguin, P., & Aubert, J P (1994) The biological degradation of cellulose FEMS microbiology reviews, 13(1): 25-58 Béguin, P., Millet, J., & Aubert, J P (1992) Cellulose degradation by Clostridium thermocellum: from manure to molecular biology FEMS microbiology letters, 100(1-3): 523-528 Camarero, S., Sarkar, S., Ruiz-Dueñas, F J., Martı́nez, M J., & Martı́nez, A T (1999) Description of a versatile peroxidase involved in the natural degradation of lignin that has both manganese peroxidase and lignin peroxidase substrate interaction sites Journal of Biological Chemistry, 274(15): 10324-10330 Dantur, I.K., Enrique,R., Welin, B and Castagnaro, P.A (2015) Isolation of cellulolytic bacteria from the intestine of Diatraea saccharalis larvae and evaluation of their capacity to degrade sugarcane biomass AMB Express (2015) 5:15 Duarte, E B., Bruna, S., Andrade, F K., Brígida, A I., Borges, M F., Muniz, C R., Filho, M M S., Morais, J P S., Feitosa, J P A., & Rosa, M F (2015).Production of hydroxyapatite–bacterial cellulose nanocomposites from agroindustrial wastes Cellulose 22, 3177-3187 DOI: 10.1007/s10570-015-0734-8 10 El-Hadi, A A., El-Nour, S A., Hammad, A., Kamel, Z., & Anwar, M (2014) Optimization of cultural and nutritional conditions for carboxymethylcellulase production by Aspergillus hortai Journal of radiation research and Applied Sciences, 7(1): 23-28 11 Francesca, GM., Lanzalunga, O., Lapi, A., Piparo, MGL., Mancinelli, S (2001) Isotopeeffect profiles in the oxidative N-Demethylation of N,N-Dimethylanilines catalysed by lignin peroxidase and a chemical model Isotope-effect profiles in the oxidative N-Dem Eur J Org Chem 2001: 2305-10 12 Hammel, K E., & Cullen, D (2008) Role of fungal peroxidases in biological ligninolysis Current opinion in plant biology, 11(3): 349-355 58 13 Harkin, J M., & Obst, J R (1973) Syringaldazine, an effective reagent for detecting laccase and peroxidase in fungi Experientia, 29(4): 381-387 14 Henrissat, B (1994) Cellulases and their interaction with cellulose Cellulose, 1(3): 169196 15 Immanuel, G., Dhanusha, R., Prema, P., & Palavesam, A J I J (2006) Effect of different growth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated from coir retting effluents of estuarine environment International Journal of Environmental Science & Technology, 3(1): 25-34 16 Jayasinghe, P A., Hettiaratchi, J P A., Mehrotra, A K., & Kumar, S (2011) Effect of enzyme additions on methane production and lignin degradation of landfilled sample of municipal solid waste Bioresource technology, 102(7): 4633-4637 17 Kaczmarek, M B., Kwiatos, N., Szczęsna-Antczak, M., & Bielecki S., (2017) Laccases– enzymes with an unlimited potential Biotechnology and Food Science, 81(1) 18 Khan, F A B A., & Husaini, A A S A (2006) Enhancing a-amylase and cellulase in vivo enzyme expressions on sago pith residue using Bacilllus amyloliquefaciens UMAS 1002 Biotechnology, 5(3): 391-403 19 Laurent, P., Buchon, L., Guespin-Michel, J F., & Orange, N (2000) Production of pectate lyases and cellulases by Chryseomonas luteola strain MFCL0 depends on the growth temperature and the nature of the culture medium: evidence for two critical temperatures Applied and environmental microbiology, 66(4): 1538-1543 20 Martı́nez, A T (2002) Molecular biology and structure-function of lignin-degrading heme peroxidases Enzyme and microbial technology, 30(4): 425-444 21 Miller, G L (1959) Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar Analytical Chemistry, 31(3): 426-428 22 Miller, G L (1959) Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar Analytical Chemistry, 31(3): 426-428 23 Narasimha, G., Sridevi, A., Buddolla, V., Subhosh, C M., & Rajasekhar, R B (2006) Nutrient effects on production of cellulolytic enzymes by Aspergillus niger African journal of biotechnology, 5(5): 472-476 59 24 Naz, S., Devtare, S., Satapathy, S., & Gupta, S (2015) Study of ligninolytic bacteria isolation and characterization from Dhamdha agro field of Bhilai-Durg region International Journal of Research in Engineering and Technology, 4: 258-262 25 Nurdin M., Abimanyu H., Naufalsar M., Maulidiyah M., Arifin Z., Wibowo D & Salim L O A.(2021) Examination the Hydrolysis Feasibility of OPEFB Biomass Using Aspergillus niger as Cellulase Enzyme-producing Fungus Journal of Oleo Science 70 26 Ojumu, T., Solomon, B., Betiku, E., Layokun, S., and Amigun, B (2003) Cellulase production by Asoergillus flavus Linn isolate NSPR 101 fermented in sawdust, bagasse and corncob African journal of biotechnology, 2(6): 150-152 27 Park, S U., Lee, B K., Kim, M S., Park, K K., Sung, W J., Kim, H Y., et al (2014) The possibility of microbial cellulose for dressing and scaffold materials Int Wound J 11, 35– 43 doi: 10.1111/j.1742-481X.2012.01035.x 28 Pramanik, S K., Mahmud, S., Paul, G K., Jabin, T., Naher, K., Uddin, M S., and Saleh, M A (2021) Fermentation optimization of cellulase production from sugarcane bagasse by Bacillus pseudomycoides and molecular modeling study of cellulase Current research in microbial sciences, 2: 100013 29 Prod, Sigma Sigma quality control test procedure No P-6782 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Sigma/Enzyme_Assay/p678 2enz.pdf 30 Ramlucken, U., Ramchuran, S O., Moonsamy, G., Lalloo, R., Thantsha, M S., & Rensburg, C J V (2020) A novel Bacillus based multi-strain probiotic improves growth performance and intestinal properties of Clostridium perfringens challenged broilers Poultry science, 99(1): 331-341 31 Ray A.K., Bairagi A., Sarkar Ghosh K., Sen S.K (2007) Optimization of fermentation conditions for cellulase production by Bacillus subtilis CY5 and Bacillus circulans TP3 isolated from fish gut Acta Ichthyologica et Piscatoria, 37 (1): 47–53 32 Ruiz-Duenas, F J., Morales, M., García, E., Miki, Y., Martínez, M J., & Martínez, A T (2009) Substrate oxidation sites in versatile peroxidase and other basidiomycete peroxidases Journal of experimental botany, 60(2): 441-452 33 Schwarz, W (2001) The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria Applied microbiology and biotechnology, 56(5): 634-649 34 Shabeb, M S., Younis, M A., Hezayen, F F., & Nour-Eldein, M A (2010) Production of cellulase in low-cost medium by Bacillus subtilis KO strain World applied sciences 60 journal, 8(1): 35-42 35 Sirisena, D M., & Manamendra, T P (1995) Isolation and characterization of cellulolytic bacteria from decomposing rice straw Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka, 23(1) 36 T Dinh Man, N Kim Thoa, N Thi Da, and N Quoc Viet (2017).Biological characteristics and classification of the thermophilic bacteria BML07 strain producing both thermostable amylase and cellulase isolated from my lam hot spring Vietnam J Sci Technol., vol 50, no 3, pp 275–283 37 Taherzadeh, M J., & Karimi, K (2008) Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review International journal of molecular sciences, 9(9): 1621-1651 38 Walkowiak-Tomczak, D., Idaszewska, N., Bieńczak, K., & Kómoch, W (2020) The effect of mechanical actions occurring during transport on physicochemical changes in Agaricus bisporus mushrooms Sustainability, 12(12): 4993 39 Williams, G J., Nelson, A S., & Berry, A (2004) Directed evolution of enzymes for biocatalysis and the life sciences Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 61(24): 3034-3046 40 Wilson, D B (2011) Microbial diversity of cellulose hydrolysis Current opinion in microbiology, 14(3): 259-263 41 Wilson, K (2001) Preparation of Genomic DNA from Bacteria Current Protocols in Molecular Biology, 56(1): 2.4.1-2.4.5 42 Youngs, H L., Sollewijn Gelpke, M D., Li, D., Sundaramoorthy, M., & Gold, M H (2001) The role of Glu39 in MnII binding and oxidation by manganese peroxidase from Phanerochaete chrysoporium Biochemistry, 40(7): 2243-2250 43 Yuan, J M., Li, H., Xiao, L P., Wang, T P., Ren, W F., Lu, Q., & Sun, R C (2022) Valorization of lignin into phenolic compounds via fast pyrolysis: Impact of lignin structure Fuel, 319, 123758 61 PHỤ LỤC Phụ lục Xây dựng đường chuẩn Glucose Bố trí thí nghiệm Thành phần ĐC 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Dung dịch DNS 1% (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Nước cất (ml) 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Dung dịch glucose 0,1% (ml) Lắc ống nghiệm, đun sôi 100C 10 phút, làm nguội đến t phòng Bổ sung nước cất (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Tổng thể tích (ml) 10 10 10 10 10 10 0,05 0,1 Nồng độ glucose ống nghiệm (mg/ml) 10 0,15 0,2 0,25 0,3 Kết Ống nghiệm Nồng độ Glucose 0.1% OD 540nm 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,0348 0,0571 0,0858 0,1173 0,1582 0,1898 62 Ta có phương trình sau : y = 0,6342x – 0,0038 (R² = 0.9921) Trong đó: x: Nồng độ glucose 0.1%, y (OD540) Phụ lục Ảnh hưởng hàm lượng carbon đến sinh trưởng hai chủng DV2.1 EM1 * Chủng DV2.1 Giá trị OD600 Nguồn C OD600 Sai số Lần Lần Lần trung bình CMC 1,74 1,72 1,75 1,74 0,01 Rỉ đường 0,45 0,46 0,46 0,46 0,01 D-Glucose 1,55 1,54 1,54 1,54 0,01 Saccharose 1,77 1,77 1,79 1,78 0,01 Tinh bột tan 0,23 0,24 0,23 0,24 0,01 Bột đậu tương 0,04 0,04 0,04 0,04 0,00 Bột gạo 0,43 0,43 0,43 0,43 0,00 Fructose 1,14 1,14 1,14 1,14 0,00 Maltose 0,94 0,94 0,95 0,94 0,00 63 *Chủng EM1 Giá trị OD600 OD600 Lần Lần Lần trung bình CMC 1,52 1,54 1,52 1,53 0,01 Rỉ đường 0,45 0,44 0,44 0,44 0,01 D-Glucose 1,36 1,38 1,37 1,37 0,02 Saccharose 1,56 1,56 1,56 1,56 0,00 Tinh bột tan 0,28 0,31 0,30 0,30 0,01 Bột đậu tương 0,05 0,05 0,05 0,05 0,00 Bột gạo 0,58 0,58 0,58 0,58 0,00 Fructose 1,17 1,16 1,16 1,16 0,01 Maltose 0,79 0,82 0,81 0,81 0,02 Nguồn C Sai số Phụ lục Ảnh hưởng hàm lượng saccharose đến sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 *Chủng DV2.1 Hàm lượng Giá trị OD600 OD600 Saccharose Sai số (%) Lần Lần Lần trung bình 0,40 0,75 0,74 0,75 0,75 0,00 0,60 0,98 0,97 0,98 0,98 0,00 0,80 1,36 1,36 1,36 1,36 0,00 1,00 1,80 1,78 1,79 1,79 0,01 1,20 1,76 1,76 1,78 1,77 0,01 1,40 1,77 1,76 1,77 1,77 0,01 1,60 1,78 1,78 1,77 1,78 0,01 64 *Chủng EM1: Hàm lượng Giá trị OD600 OD600 Saccharose Sai số (%) Lần Lần Lần trung bình 0,40 0,76 0,79 0,77 0,77 0,01 0,60 1,10 1,13 1,11 1,11 0,01 0,80 1,40 1,40 1,40 1,40 0,00 1,00 1,57 1,55 1,55 1,56 0,01 1,20 1,56 1,54 1,53 1,55 0,02 1,40 1,53 1,55 1,56 1,55 0,01 1,60 1,56 1,57 1,56 1,56 0,01 Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ tới sinh trưởng hai chủng vi khuẩn DV2.1 EM1 * Chủng DV2.1 Nhiệt độ Giá trị OD600 OD600 Sai số (oC) Lần Lần Lần trung bình 37 1,83 1,83 1,83 1,83 0,00 40 1,87 1,87 1,88 1,88 0,00 45 1,98 1,99 1,97 1,98 0,01 50 1,88 1,88 1,89 1,88 0,01 55 1,24 1,23 1,25 1,24 0,01 60 0,06 0,06 0,07 0,06 0,00 65 *Chủng EM1 Giá trị OD600 Nhiệt độ (oC) OD600 trung bình Sai số Lần Lần Lần 37 1,62 1,64 1,65 1,64 0,01 40 1,78 1,80 1,80 1,79 0,01 45 1,94 1,94 1,95 1,94 0,01 50 55 60 1,78 0,97 0,04 1,79 0,99 0,05 1,78 0,97 0,05 1,78 0,97 0,05 0,00 0,01 0,00 Phụ lục Thông số đường cong sinh trưởng hia chủng DV2.1 EM1 * Chủng DV2.1 Thời gian (giờ) OD600 0,05 0,15 0,27 0,42 0,74 1,28 1,54 1,65 1,93 1,95 1,96 1,95 1,97 Thời gian (giờ) 26 OD600 1,98 1,88 1,85 1,84 1,78 1,71 1,68 1,64 1,52 1,46 1,45 1,42 28 30 32 34 10 36 12 38 14 40 16 42 18 44 20 46 22 24 48 *Chủng EM1 Thời gian (giờ) 10 12 14 16 18 20 22 24 OD600 0,13 0,21 0,38 0,65 1,16 1,43 1,62 1,89 1,94 1,96 1,96 1,97 1,93 Thời gian (giờ) 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 OD600 1,87 1,79 1,75 1,76 1,59 1,62 1,42 1,35 1,23 1,12 1,10 1,02 66 1,00 Phụ lục Hình ảnh đống ủ phế phụ phẩm trước ủ sau ủ 28 ngày * Trước ủ Đối chứng DV 2.1 +EM1 Chế phẩm sumitri Chế phẩm SPS * Sau ủ Đối chứng DV 2.1 +EM1 67 Chế phẩm sumitri Chế phẩm SPS 68