Tổngquanvềrongbiểntrênthếgiới
Rongbiểnlàđốitượngnuôitrồngthủysảnquantrọngđượctrồngrộngrãitrênthếgiới.Theot àiliệucủaFAO(2014),rongbiểnđượctrồngở33quốcgiavàlụcđịatrênthếgiới.Cácquốcgiatrồngr ongbiểntrọngđiểmcủathếgiớichủyếutậptrungởchâuÁbaogồmTrungQuốc,Indonesia,Philippi ne,Malaysia,HànQuốc,NhậtBản,TanzaniavàSolomon.ĐặcbiệtlàTrungQuốcvàIndonesialàhai quốcgiatrồngrongbiểnnhiềunhất,chiếm81,4%tổngsảnlượngrongbiểnthếgiới[2].
Sản lượng rong biển nuôi trồng thế giới trên liên tục tăng, đặc biệt là nhữngthập kỷ gần đây Năm 1990, sản lượng rong biển nuôi trồng cả thế giới khoảng 3,76triệu tấn tươi Đến năm 2000, sản lượng này là 9,3 triệu tấn tươi và tăng lên 19 triệutấn vào năm 2010 Như vậy, chỉ trong vòng 2 thập kỷ (1990-2010), sản lượng rongbiển nuôi trồng trên thế giới đã tăng khoảng 5 lần Gần đây, năm
2012, sản lượngrong biển trồng trên thế giới là 23,8 triệu tấn tươi Rong biển khai thác tự nhiên cósản lượng là 1,1 triệu tấn tươi tương đương 4,6% sản lượng rong trồng thương phẩm(FAO, 2014) Trong những năm tới, sản lượng rong biển nuôi trồng dự báo sẽ tiếptụctănglênđểđápứngnhucầunguyênliệuchopháttriểncôngnghiệpsảnxuấthànghóavàcảthiệ nchấtlượngmôitrường[3,4].
Bên cạnh các nước có nghề trồng rong phát triển như Trung Quốc, Nhật Bản,Philippin,Hànquốc,TriềuTiên,Chile,Malaysia,Tanzania,Indonesia,Kiribati,hiệnnay nghề trồng rong đã phát triển tại hơn 20 nước khác Sản lượng rong hàng nămtrên thế giới là hơn 140.000 tấn khô (trong đó rong sụnKappaphycusvà rong câuGracilarialàchủyếu)[5].
Mặc dù rong biển thế giới rất đa dạng (có tới 10.000 loài đã được phân loại(www.algaebase.org), nhưng số rong biển có thể nuôi trồng khá khiêm tốn. TheoTitlyanovvàTitlyanova(2010),có17chirongbiểnđangđượcnuôitrồngtrênthếgiớibao gồm:Agardhiella, Eucheuma, Gelidium, Gigartina, Gracilaria, Hydropuntia,Hypnea,Kappaphycus,Meristotheca,Porphyra(ngànhrongđỏ-
Rhodophyta);Saccharina,Laminaria,Undaria,Cladosiphon(ngànhrongnâu-
Phaeophyta),Monostroma, Ulva,vàCaulerpa(ngành rong lục- Chlorophyta) Trong đó, các chiAgardhiella,Gelidium,Gigartina,Porphyra,Saccharina,Laminaria,Undaria,Mon ostroma,và U l v a đ ư ợ ct rồ ng c h ủ y ế u ở v ù n g ôn đ ớ i,E u c h e u m a , G r ac i l a r i a ,
Hydropuntia,Hypnea,Kappaphycus,Cladosiphon,vàCaulerpađượctrồngchủyếuởvùngn hiệtđớivàánhiệtđới.
TheothốngkêcủaFAO(2014),nămnhómrongbiểntrồngphổbiếnnhấthiệnnay làrongsụnKappaphycusalvareziivàEucheumaspp.,rongbẹNhậtBản(Laminariajaponic a),rongcâu(Gracillariaspp.),rongbẹUdariapinatifidavàrongmứt (Porphyraspp.) Trong các nhóm này, nhóm rong sụn có sản lượng trồng nhiềunhất (khoảng 8,2 triệu tấn tươi chiếm 34,5% tổng sản lượng rong biển toàn cầu) sauđó là rong bẹ Nhật Bản và rong câu với sản lượng lần lượt
Tình hìnhrongbiểnở Việtnam
Với chiều dài hơn 3.260 km, diện tích hơn một triệu km2, vùng biển nước tađược đánh giá là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học cao của thế giới Vì vậy,công tác điều tra, nghiên cứu môi trường và tài nguyên sinh vật biển là vấn đề cầnđượcquan tâm nhiều.
ViệtNamcólợithếvàtiềmnăngtolớn(gần100loàirongkinhtếphânbốvàdiện tích trồng rong tiềm năng khoảng 900.000 ha) để phát triển rong biển thànhngànhsảnxuấtchủlựctrongtươnglai.Hiệnnay,07loàirongkinhtế(Rongn ho
Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản năm 2022, hiện diện tích tiềm năng trồngrong sụn cả nước khoảng 900 nghìn ha (tương đương 600 - 700 nghìn tấn rongkhô/năm).Trongsốhơn800loàirongbiển,90loàicógiátrịkinhtế.Năm2020,diệntíchtrồngro ngbiểnđạtkhoảng15.000ha,sảnlượng135.000tấn.Trongđó,lợinhuậnrongnhokhoảng150triệu/ havàrongsụn khoảng 60triệu/ha.
Rong biển được nuôi trồng tập trung ở các vùng ven biển gồm Bắc Bộ gần6.600 ha, Bắc Trung Bộ hơn 2.000, Nam Trung Bộ 1.400ha, Đồng bằng sôngCửuLong100ha.TạiViệtNamđãxácđịnhđược833loàirongbiểnvớitrữlượngtựnhiên80 - 100 tỷ tấn,thuộc 4 ngành, gồm ngành rong Đỏ (415 loài và biến loài), ngànhrong Nâu (147 loài và biến loài), ngành rong Lục (183 loài và biến loài) và ngànhrongLam(88loàivàbiếnloài)[9].
GiớithiệuvềRongSụn
RongSụntênthươngmạilàCottonii,baogồmhailoàichínhlà:KappaphycusalvareziivàKa ppaphycusstriatum,nguyênliệuchínhchochếbiếnkappa-carrageenan được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực kinh tế như chế biến thựcphẩm,ydược,mỹphẩm,đệtmay, [10]. Đặcđiểmsinhhọc của RongSụn
Rong Sụn là loại rong biển nhiệt đới có một số đặc điểm sinh học chính nhưSau:HìnhtháicấutạoRongSụncóthândạngtrụtrònđườngkínhcóthểđạt20mm,nhiều trục chính, mọc lên từ bàn bám dạng đĩa Những trục chính mới có thể mọc từcùnggốcvớitrụcchínhbanđầuhayngaytừtrêntrụcchính,ởdướiphầngốccủatrụcchínhbanđầu.Nh ánhdạngtrụtrònhìnhthànhngaygầngốcthân,lúcđầuchiakhôngquy luật hoặc một bên, sau đó mọc và uốn cong theo hướng ánh sáng và thân chianhánhpháttriểnthành bụirậm,thểchấttrơnnhớtkeosụn,cómàunâuxanh[ 1 1 ]
Rongthô,đònnhưsụn.Thânronghìnhtrụ,cómàuxanhđếnmàunâuđỏ,mọcđứng,cao20- 60cm, vớiđường kínhcủathânchính và n hán h1 -
10cm.Nhánhchóthơicong,dài5-15cm, thondầnvềngọn.Khimọcởvùngnướccóđòngchảytốtcây rongpháttriểndàicóthểtới2m/cáthê, trọnglượngcáthẻtừ20-56kg/cáthể Nhá nhthườngcóđường kính lớn (trung bình 2,5mm), thon dần về phía đỉnh nhánh Thường không cóhoặc ít nhánh thú cấp Nhánh cong, phình rộng, thon dần và kéo dài (hình 1A) [11].LoàiKappaphycusstriatum.
Rongthô,sằnsùi,cao20-25cm,màunâuđenđếnnâuđỏ.Phânnhánhdày,thekiêu đối nhau, mọc vòng, chạc hai không đều Khoảng cách giữa hai lần phân nhắnngắn từ 1-3cm, nhánh chót ngắn, đầu cùn hoặc tròn (hình 1B) Nhìn trên bề mặt cắtngang thân: Kích thước tế bào từ lớp vỏ vào lớp lõi tăng Lớp vỏ bao gồm 2-3 lớp tếbàochứasắctố,hìnhbầudục,đườngkính7- 10um.Lớpnhumôngoàigồm7-10lớptếbàohìnhbầudụchoặchìnhcầuđườngkính
124250um,váchdày10-15uùm.Lớpnhụ mô lõi bao gồm những tế bào lớn xen kế với những sợi trục, đường kính 25-30um,vớiváchdày10-15pnm[11].
TrongtựnhiênRongsụnmọcbámtrêncácvậtbámcứngcóchấtvôi(trênrạnsanhôchếtho ặctrênđá),phânbốchủyếuởphầntrêncủavùngdướitriều(ngaybêndướicủamực chiềuthấp),nơinướcchảynhẹđếnvừaphải.
Phân bố:RongSụn làloạirongbiển nhiệtđới,trong tựnhiênnó phânbốchủyếuởvùngbiểnnhiệtđớitrongkhuvựcChâuÁvàTây TháiBìnhDương,đặcbiệtphôbiếnởvùngbiênmộtsốnướcĐôngNamÁ(Philippines,Indonesi a,Maylaysia )Làloạironghẹpmuối,chỉsinhtrưởngvàpháttriểntốtởđộmặn28-
34 o C. Độ mặn dưới 20 ‰ kéo dài nhiều ngày, rong ngừng phát triển và chết Độ mặn cao35-40‰sinhtrưởngcủa rong bịứcchế.
Nhiệt độ nước thích hợp nhất cho rong sinh trưởng và phát triển là 25-30 °C.Khinhiệtđộnướccaohơn31 o C,rongsẽtăngtrưởngchậm,ởnhiệtđộthấphơn15 °Crong sẽbịchết[11].
Kể từ khi du nhập vào Việt Nam năm 1993, rong sụnKappaphycus alvareziithích hợp với khí hậu nhiệt đới Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh miền
Trung và hiệnnayđượcnuôitrồngtạiĐàNẵng,QuangNam,NinhBinh,PhúYên,KhanhHòaKiênGiang…
Thành phần hoá học của Rong Sụn luôn thay đôi phụ thuộc trạng thái sinh lý,thịgiansinhtrưởng,điềukiệnsống(cườngđộbứcxạ,thànhphầnhoáhọccủamôi trường) Trong Rong Sụn hàm lượng nước chiếm 77-91% còn lại vài phần trăm chấtkhô Trong chất khô chứa chủ yếu là gluxit, protein, chất khoáng, lipit, sắc tố, cácenzyme [12,13].
Rong Sụn được ứng dụng để sản xuất một số sản phẩm trong lĩnh vực thựcphẩm.CarrageenantựnhiênđượctáchchiếttừRongSụncóbốnđặcđiểmchínhnhư:là một chất đông đặc; là một chất nhũ tương để giúp cho các dung địch ở trạng tháihỗnhợpđồngnhấtvớinhaumàkhôngbịtáchriêngrẽ;mộtchấtlàmthayđôikếtcầucủa sản phẩm bởi việc tạo ra các chất đông đặc hoặc dai; một chất giúp làm ồn địnhcáctinh thểđểngănchặnđườnghoặcnướcđákhỏikếttỉnhlại.Dovậy màcarrageenan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, dượcphẩm, công nghệ sữa, y dược học, trong xử lý môi trường nuôi tôm cá và trong mộtsốngànhcôngnghiệpthực phẩmkhác [15,16, 17,18,19,20].
Visinhvậtbiểncộngsinhvàcácchấtcóhoạttínhsinhhọc
Nghiêncứuvềcácvisinhvậtcộngsinhlàmộtlĩnhvựcpháttriểnnhanhchóngnhư theo một số báo cáo gần đây cho thấy rằng, một số chất chuyển hóa thu được từrong,sanhô,bọtbiểnvàđộngvậtkhôngxươngsốngcóthểđượcsản xuấtbởicácvisinh vật cộng sinh với chúng [21, 22, 23] Các vi khuẩn cộng sinh được biết đến vớirất nhiều các hoạt tính sinh học đa dạng bao gồm cả những yếu tố chức năng [23].Gần đây, Baker và cộng sự (2009) đã thực hiện một nghiên cứu nhằm phân lập vàxác định sự đa dạng của chủng nấm từ loài bọt biểnH simulans Họ đã sử dụng kếthợpphươngphápnuôicấytruyềnthốngvàkỹthuậthiệnđạiđểđịnhdanhvàxácđịnhcác hoạt tính kháng sinh, kết quả họ đã được phân lập được 19 kiểu gen khác nhauthuộcvềcácchiAgaricomycotina,Mucoromycotina,Saccharomycotina,vàPezizomycoti na;mộtsốchủngnàychothấysựứcchếmộtsốvikhuẩnlàEscherichiacoli,Bacillussp,Staphylococc usaureus,vàCandidaglabrata[24].Vikhuẩnliênkết vớibọtbiểnlàmộthìnhthứctươngtáchóahọcvàlànguồntàinguyênsinhtháitiềmnăng cung cấp các hợp chất tự nhiên một cách bền vững để phát triển nguồn dượcphẩmmới[25,26].
TheođánhgiáRatebvàcộngsự(2011),cácchấtthứcấptừnấmbiểncónguồngốc rong/tảo biển là chiếm đa số (21%), tiếp sau là bọt biển (19%), cây đước biển(16%)v.v… Chínhvìvậy,nguồnchấtcóhoạttínhsinhhọctừcácvisinhvậtcóliênquan tới rong/tảo biển được cho là rất có tiềm năng Trong đầm nuôi rong sụnKappaphylus alvareziibị nhiễm bệnh Theo như Masuda (1997a; 1998) thấy rằng loàitảo đỏ sống cộng sinhLaurencia majusculevẫn phát triển tốt bởi chúng sản sinh 4chất kháng sinh chống lại vi sinh vật gây bệnh trắng nhũn ở rong Các kháng sinh làelatol( 1 ) , i s o - o b t u s o l ( 2 ) , 1 0 , 1 5 - d i b r o m o - 9 - h y d r o x y - c h a m i g r a - 1 , 3 ( 1 5 ) , 7 ( 1 4 ) - t r i e n e
(3)và(E)-10-15-dibromo-9-hydroxy-chamigra-1,3(15),7(14)-triene(4)[27].
(2003).Kếtquảlà,đãphânlậpđượcmộtDiketopiperazinemớitừchiếtxuấtmôitrườnglênmenc ủachúngnấm[28].Mộtnghiêncứunăm2004,báocáochỉrabằngcáchchiếtxuấtbutanolictừdịc hnuôicấychủngPseudoalteromonasissachenkoniiliênkếttrênmộtsốloàirongbiểnchohoạttí nhtanhuyếtvàứcchếsựpháttriểncủanấmCandidaalbicans.Phântíchhóahọcsâuhơnvớichiế txuấtetylaxetatchothấycấutrúchóahọcchohoạttínhkhángnấmlàIsatin(indole-2,3-dione) [28].
Ngoàigiátrịsinhtháilớntừmôitrườngsống,cácrạnsanhôlàmôitrườngcưtrú cho nhiều loài nhất trong các đại dương, chứa một lượng lớn các loài vi sinh vậtvàlàmộtnguồngiàuhợpchấtsinhhọcmớichưađượckhámphá[28].Vikhuẩnliênkết với các loài san hô biển cũng được biết đến với rất nhiều hoạt tính sinh học tiềmnăng [30] Hơn 20 năm trước, Tapiolas và đồng nghiệp (1991) đã phân lập và phântíchđặctínhhaihợpchấtmớiđólàOctalactinAvàBtừStreptomycesspởbi ển, được phân lập từ bề mặt của một loài san hô sừng không xác định thuộc chiPacifigorgia Báo cáo của họ cho thấy hợp chất Octalactin – cho kết quả gây độc tếbào mạnh đối với u ác tính B-16-FlO và các dòng tế bào khối u HCT-116 có giá trịIC50là 0,0072và0,5àg/mLtươngứng[31].
TheomộtsốnghiêncứugầnđâyđãbáocáotừcanhtrườngnuôicấycủachủngBacillus amyloliquefaciensSCSIO 00856 cộng sinh với loài san hô sừng từ miềnNamTrungQuốccóbiểuhiệnhoạttínhkhángkhuẩnmạnhđốivớiEscherichiacoli,Bacillu s subtilis, vàStaphyloccocus aureusvà hoạt tính kháng ấu trùng bryozoanBugula neritina Họ đã xác định được cấu trúc của hợp chất mới 24 vòng lacton làMacrolactinVtừmôitrườngnuôicấy[32].
Mộtsốloàivikhuẩnbiểnđượcbiếtđếnnhưlàloàidicưcủacácsinhvậtbiểncũngđãđượcbáocáo cótiềmnăngkhángkhuẩn.Trongmộtbáocáo,42chủngvikhuẩnbiểnphânlậpchothấyhoạttính khángkhuẩnởcácchiAlteromonas,Pseudomonas,BacillusvàFlavobacterium[33].Mộtnghiê ncứutiếnhànhtạiHoaKỳvàonăm2002đãcôngbố5hợpchấttựnhiênmới,PhomadecalinsA,B, CvàD,vàPhomapentenoneA,đượcphânlậptừdịchchiếtmôitrườngcủachủngPhomasp. (NRRL25697)làmộtloạinấmdạngbàotửđượcphânlậptừHypoxylonsp.Cáchợpchấtnàycóc ấutrúcđặctrưngvàbốnhợpchất(phomadecalinsA–
D)đượctìmthấycóhoạttínhchốnglạivikhuẩnGramdương,Bacillussubtilis(ATCC6051)vàSt aphylococcusaureus(ATCC29213)[34].
Visinhvậtcộngsinhvớirong
Mốiquanhệmậtthiếtgiữavikhuẩnvàrongbiểntrongđórongbiểncungcấpchấtdinhdưỡ ng,trongkhicộngđồngvikhuẩnthúcđẩysựpháttriểncủarongvàbảovệ vật chủ chống lại mầm bệnh, mối quan hệ này đã được xây dựng và chứng minhhơn 20 năm qua Hình 2.1 mô tả sự tương tác và chuyển hóa các chất hóa học, trongđóbaogồmmốiquanhệcólợi,bấtlợitồntạigiữarongvàvisinhvậtsốngcộngsinh.Sựđadạn gvàbảnchấthóahọccủasựtươngtácđãđượcGoeckevàđồngnghiệp chứngminh[35].
Từvậtchủlàrongcácnghiêncứucũngđãchỉrasựtươngtácgiữavikhuẩnvàrong biển có mối quan hệ mật thiết Bề mặt Rong biển cung cấp rất nhiều chất dinhdưỡnghữucơchocácloàivikhuẩncơhộivànólàđiểmnóngcủasựcanhtranhvisinhvậtcộn gsinhtrênrong.Tronghầuhếtcácnghiêncứuởmứcđộphântửđãchứngminhbềmặtrongthuhú trấtnhiềuvikhuẩncótínhđặchiệurấtcao.Trongkhithànhphầncủakhuhệvisinhvậtnàycóthểt hayđổitheomùa,theotuổicủacácbộphậnkhácnhautrêncâychủ,nguyênnhâncóthểdoyếutốs inhhọcvàphisinhhọc[36].Rongbiểnthườngliênkếtvớimộtcộngđồngvisinhvậtmangtínhđ ặchiệuvớitừngloạirongkhácnhauvàkhácbiệtsovớihệvisinhvậttrongnướcbiển.
Gần đây, dựa vào kỹ thuật phân tử sàng lọc 16S rRNA, Burke và cộng sự(2011b), đã phát hiện được trên cùng một loài rongUlva australistại một vùng,cónhững thành phần loài vi khuẩn rất khác nhau Bên cạnh đó bằng cách sử dụng kỹthuật metagenomic các nhà khoa học đã chỉ ra rằng thành phần quần xã vi sinh vậttrên loài rongUlva australisđược điều khiển bởi các gen chức năng hơn là chỉ dựavào thành phần phân loại hoặc phát sinh loài [36] Điều đó cho thấy rằng nhóm chứcnăngcủavisinhvậtcộngsinhvớirongbiểnkhôngnhấtthiếtliênquanđếnphátsinhloài Thành phần trên cá thể rong biển có ảnh hưởng đến những gen chức năng củahệ vi sinh vật cộng sinh với rong đó và cũng cho chúng ta biết dựa vào đặc tính sinhlý sinh hóa của vật chủ rong họ cũng xác định được phần nào đó thành phần của cácquầnxãvisinhvậtcộngsinhvớinó[36].
Rongbiểncũngcónhữnghợpchấtcóhoạttínhkhángvisinhvật,giúpbảovệbềmặtrongk hỏicácvikhuẩngâybệnh,vàngăncảnquátrìnhtíchtụcủacácvisinhvậttrênbề mặtrongdướidạng màngsinhhọc [37].Ngoàiracácchấtcóhoạttínhtừrong biển có thể kiểm soát quần xã vi khuẩn bằng cách can thiệp vào hệ thống liênlạcgiữa các tếbàovikhuẩnQs(Quorumsensing).
Nhiều vi khuẩn sinh trưởng phát triển trên bề mặt rong biển có thể sử dụngenzymeđểphânhủythànhtếbàocủarongđó làmộttrongnhữngyếutốchínhtrongquátrìnhchuyểnhóadinhdưỡngtrongđạidương.Vikhuẩ nliênkếttrênrongcóthểhoạt hóa các chất hữu cơ của rong và sau đó cung cấp cacbon dioxide, khoáng chất,vitamin và các yếu tố tăng trưởng khác [35, 38] Một số nghiên cứu cũng công bốrằng vi khuẩn liên kết với rong biển là nguồn cung cấp nitơ cố định và một số hợpchấtcókhảnăngkhử độc quan trọng[35].
Bên cạnh việc chuyển hóa cung cấp dinh dưỡng và tác dụng thúc đẩy tăngtrưởng,vikhuẩncóthểđịnhhìnhhìnhtháivàảnhhưởngđếnvòngđờicủarongbiển.Matsuo 2005; Goecke 2010 và cộng sự đã báo rằng các chất chuyển hóa từ vi khuẩnbao gồm cả phân tử (QS) cũng đóng một vai trò trong vòng đời của rong biển như làquátrìnhgiảiphóngvànảymầmbàotử rong[35].
Hơn nữa các hợp chất ức chế (QS) và các hợp chất kháng khuẩn được tạo rabởi nhiều vi khuẩn kết hợp cùng với các chất chuyển hóa có hoạt tính từ rong biển,giúpbảovệrongkhỏi mầmbệnh,độngvậtăn cỏvàcácsinhvậtbámkhác.
Vi khuẩn gây bệnh có thể tác động vào màng tế bào của rong biển, làm chorong bị chết gây hậu quả rất lớn đối với ngành nuôi trồng rong và hệ sinh thái rong[35] Ngoài ra màng sinh học cũng là mối đe dọa thường trực đối với các loại rongbiển, tăng sự tác động của ái lực lên rong, tăng sự gắn kết của sinh vật bám và cácđộngvậtăncỏkhác.Màngsinhhọc,cạnhtranhchấtdinhdưỡng,ứcchếtraođổikhí,cảnánhsá ngchoquátrìnhquanghợpcủarong.
Do đó các hợp chất có hoạt tính sinh học của vi khuẩn và rong đều là nhữnghợp chất thiết yếu trong mối quan hệ vi khuẩn và rong, chúng giúp kiểm soát thànhphần và cấu trúc màng sinh học, do đó bảo vệ bề mặt rong chống lại quá trình tạomàng sinh học [35] Ngoài ra các hợp chất có hoạt tính từ vi khuẩn này có thể lànguồncungcấpcácchấtcóhoạttínhhứahẹnhơn,dễxửlývàcónhữngứngdụng rộngdãihơnsovớicáchợpchấtcónguồngốctừrong[39].
Bêncạnhcácvikhuẩnliênkếtbênngoàirong,mộtsốvikhuẩncũngsốngbêntrong lớp tế bào của rong, nó có khả năng phân hủy thành tế bào, tạo ra các khoảngtrống cho vi khuẩn cơ hội và gây bệnh cho rong, những vi khuẩn này trở lên bất lợinếuxâmnhậpđượcvàomôcủarong,gâybệnhchorongvàlàmchếtrong.
Tuynhiênnhữngvikhuẩnnộisinhcónhữngmốiquanhệtíchcựcvớisựhìnhthành và phát triển của một số loại rong Như rong biển đỏPrionitis, vi khuẩn nộisinh đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và sản sinh ra một sốphytohormone indole-3-acetic acid (IAA)
[35] Singh và cộng sự 2011b thì vi khuẩnnội sinh trong loài rong biểnGracilaria duracó khả năng tăng cường khả năng nảychồi,bằngcáchsảnxuấtraIAAvàkhảnăngcốđịnhnitơ,mộtvàicôngbốkháccũngđượcbáocá ovikhuẩnnộisinhnàyliênquanđếnchứcnănggiảiđộc,cốđịnhnitơvàquang hợp trên một số loại rong biển xanh [40] Bên cạnh đó có rất nhiều những lợiíchmàvikhuẩnnộisinhcótươngtácđốivớirongbiểnnhưngchưađượcnghiêncứucụthểvàhiể urõ hơn[41].
Khoa họcmetagenomicstrongnghiêncứukhuhệVSVliênkết
Metagenomicslàngànhkhoahọcnghiêncứuvềđahệgen(metagenome)củatấtcảcác mẫuvisinhvậtthunhậntrựctiếptừmôitrườngtựnhiên[42].Metagenomicslàthuậtngữđược sửdụngđểmôtảmộtlĩnhvựcnghiêncứukhoahọcvà các kỹ thuật cho phép phân tích toàn thể vi sinh vật sống trong bất kỳ môi trườngtựnhiênnào.Metagenomicsnổilênnhưmộtvũkhímạnhmẽđượcsửdụngđểnghiêncứu cộng đồng vi sinh vật bất kể chúng có thể nuôi cấy được hay không trong điềukiệnphòngthínghiệmvàcũngcungcấpcơhộiđểmôtảsựđadạngvisinhvậttrongmôi trường vì rất nhiều loài hiện chưa nuôi cấy được Metagenomics dựa vào việctách DNA từ một cộng đồng vi sinh vật và như vậy tất cả genome của vi sinh vậttrong cộng đồng đó đều được gộp lại Chính vì thế mà chúng ta có thể thu nhận vàphân tích được tất cả hệ gen của vi sinh vật rất là phong phú và đa dạng, đặc biệt làvisinhvậtkhôngthôngquanuôicấychiếm99%màmetagenomicsđãtrởthànhcôngcụ giúp các nhà nghiên cứu khai thác nguồn gen và phát hiện ra các gen mới trongcộngđồngvisinhvậtđó.
Nhiều VSV môi trường không nuôicấyđược do:
Phân tích bộ gen của mọi VSVtrongmôitrườngkhôngquanu ôicấy Phát hiện những VSV/ genhoàntoànmới.
Nghiên cứu từng đối tượng riêng rẽtrong điều kiện phòng thí nghiệm.Khôngnhìntổng thểmứcđộphức tạpvềphânloàitrongcộngđồng.
Nghiên cứu các VSV trong chínhmôi trường sống bình thường củachúng,nhậndiệnnhữngđặctínhtự nhiêncủacácVSVđó
Không nhận diện được các tươngtác phức tạp giữa các thành viêntrongcộngđồng.
Phân tích các con đường chuyển hóatế bào và tương tác qua lại giữa cácthànhviên trongcộng đồngsống.
Kỹ thuật metagenomics là sự kết hợp giữa sinh học phân tử với tin sinh họcđể nghiên cứu một cách có hệ thống quần xã vi sinh vật cũng như toàn bộ vật liệu ditruyền có trong mẫu môi trường nghiên cứu Bằng các công cụ tin sinh học chuyêndụng,sựđadạngvisinhvậttớimứcloài,đadạnghệgenchứcnăngthamgiavàocácquá trình trao đổi chất và các con đường trao đổi chất giả định đã được làm sáng tỏ[147] Công cụ chủ chốt của metagenomics là công nghệ giải trình tự gen DNA thếhệ mới NGS kết hợp với các phân tích tin sinh học Hai cách tiếp cận chính củametagenomicslàmetabarcodingvàshotgunmetagenomics[147].
Kỹ thuật metagenomics bao gồm những bước cơ bản sau: (1) Táchtinh sạchAND tổng số; (2): Xây dựng thư viện gen; (3) giải trình tự AND ; (4) sử dụng phầnmềmchuyêndụngvàcơsởdữliệuchủngđểxácđịnhOTUsvà(5)phântíchđadạngtheocácta xonvàsosánhmứcđộđadạnggiữacácmẫukhácnhau.Dựavàoquytrìnhphântíchcácdữliệuthuđ ược,sauđócáctrìnhtựđượcsosánhvớitrìnhtựđãcó trong cơ sở dữ liệu để xác định loài dựa trên đơn vị phân loại (OTU) Cuối cùng làcácbước phân tích dữ liệuthứ cấpdựatrêncácOTU[43]. Đơn vị phân loài OTU và các phân tích dựa trên đơn vị phân loài OTU(Operational Taxonomic Unit): là đơn vị phân loài, thông thường các trình tự có độtương đồng với nhau từ 97% trở lên sẽ được phân loại vào cùng 1 loài (species), cáctrình tự có độ tương đồng nhau từ 95% sẽ được xếp vào cùng 1 chi (genus) và cáctrình tự có độ tương đồng 90% sẽ được xếp vào cùng một họ (family) OTU là dữliệu đầu ra cho hầu hết các quy trình phân tích dữ liệu với phần mềm QIIME hoặcMothur và là dữ liệu cho bước phân tích các chỉ số đa dạng sinh học tiếp theo Dựatrên các OTU, phân tích thành phần loài sẽ được hiển thị dưới 29 dạng biểu đồ nhiệtvà biểu đồ dạng bar, và các phân tích thống kê khác Trong phân tích thống kê, tínhđa dạng có thể được tính theo hai chỉ số: Các chỉ số đa dạng alpha (alpha- diversity):cácchỉsốnàyđánhgiácácmẫuthutại1địađiểmvớinhau.BaogồmcácchỉsốnhưShan non,Simpson,Chao-1vàbiểuđồtươngquangiữasốlượngtrìnhtựvàsốlượngOTU Trong đó, chỉ số Simpson… Các chỉ số Shannon và Simpson phản ánh sự đadạng của OTU trong các mẫu Các chỉ số này dùng để xem xét số loài và mức độđồng đều của các loài cũng như khả năng xuất hiện những loài độc đáo Khi chỉ sốShannon càng lớn hoặc chỉ số Simpson càng nhỏ thì độ đa dạng của cộng đồng visinhvậtcàngcao.ChỉsốChao1phảnánhsựphongphúcủaOTUtrongcácmẫu.Chỉsố Chao1 hoặc ACE càng lớn thì mức độ phong phú loài dự kiến của khu hệ vi sinhvậtcàngcao.Cácchỉsốđadạngbeta(betadiversity):cácchỉsốnàysosánhmứcđộđa dạng giữa các địa điểm thu mẫu khác nhau và mức độ tương đồng về thành phầnloài giữa các địa điểm thu mẫu Việc phân lập gen từ metagenome được thực hiệntươngtự như cácnghiêncứuphânlậpgentrong mộthệgen(genome).
Mục tiêu của metagenomics là để tìm hiểu thành phần và hoạt động của tậpđoànvisinhvậtphứctạptrongcácmẫumôitrườngthôngquaphântíchtrìnhtựDNAcủachúng[4 5].Mặtkhác,khicósốliệuvềđahệgen,chúngtacóthểthựchiệnhàngloạt dự án phân lập gen tùy theo mục đích nghiên cứu Số liệu đó được sử dụng đểtheo dõi và dự đoán các biến đổi môi trường; xác định gen hay operon mã hóa chocácenzymecầnthiết,cóđặctínhmới(nhưcellulases,chitinases,lipases,thuốckhángsinh,cácsảnp hẩmtựnhiênkhác…).Nhữngenzymenàycóthểđượcứngdụngtrong khunấmmụctrắngphânhủygỗvàsuốinướcnóngBìnhChâuvàthuđượcbộdữliệu của4725khungđọcmở(ORFs)đượcướcđoánmãhóaenzymethamgiathủyphân lignocellulose Ngoàigen mãhóa lignocellulasera,có rấtnhiều genmãhóa chocác enzymecógiátrịtronglàmsạchmôitrường,trongcôngnghiệpđãđượcnhìnthấy nhưngchưađượckhaithác.ĐâylànghiêncứuđầutiênởViệtNamvàtrênthếgiới đãđánhgiáđượcvaitròcủavikhuẩndạcỏdêchănthảcủaViệtNamtrongviệc chuyểnhóalignocellulosetrongđókhẳngđịnhvaitròcủaBacteroidetes:Firmicutes công nghiệp hoặc dược phẩm; xác định biến thể hoặc đa dạng trong gen cho cácenzymequantrọngvàthiếtkếtốiưucácđiều kiệnxúctáccủaenzyme;xácđịnhcáccơ chế điều hòa và truyền tín hiệu của các gen quan tâm; xác định vi khuẩn hoặc cáctrình tự plasmid, đánh giá ảnh hưởng của chúng đến cấu trúc và sự đa dạng của cáccộngđồngvisinhvật.
Năm 2012 Viện Công nghệ sinh học thực hiện Nghị định Thư của Bộ khoahọc và công nghệ với Nhật bản vàPGS TS Đỗ Thị Huyền chủ nhiệm để tài nghiêncứu: “Phân lập hệ gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose từ khu hệ vi sinh vậtruột mối Việt Nam bằng kỹ thuật metagenomics” Đề tài đã ứng dụng thành côngcông cụ metagenomics trong đánh giá đa dạng và khai thác nguồn gen mã hóa cácenzymethủyphânlignocellulosetừhệvikhuẩntrongruộtmốiViệtNam.Kếtquảlàđánh giá được sự đa dạng vi sinh vật và đa đạng gene cellulase của vi khuẩn sốngtrongruộtmốiC.gestroi.Đâylàcôngtrìnhđầutiênứngdụngcôngnghệmetagenomics để khai thác các gen quí từ vi sinh vật không thông qua nuôi cấy vàtrongnăm2014,PGS.
TS.ĐỗThịHuyền,TrầnthanhThủyvàcộngsự,thựchiệnđềtài:“Nghiêncứumetagenomecủa mộtsốhệsinhtháiminitiềmnăngnhằmkhaithác cácgenmớimãhóahệenzymechuyểnhóahiệuquảlignocellulose”,đềtàiđãthực hiệnđượcgiảitrìnhtựDNAmetgenomecủavikhuẩntrongdạcỏdê,đấtxungquanh trong việc chuyển hóa hemicellulose và tiền xử lý sinh khối Bên cạnh đó,đã xâydựng được bộ dữ liệu DNA metagenome của vi khuẩn và cổ khuẩn suối nước nóngBình Châu với kích thước 9,4 Gb độ bao phủ trên 60% Qua phân tích đã xác địnhđược đa dạng vi sinh vật và gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose, lựa chọn đượchai gen mới (có độ tương đồng thấp 50,35% và 53,94%) mã hóa cho hai enzymetươngứnglàendoglucanasevàbeta-glucosidase.
Năm 2014-2018GS.TS Lê Mai Hương cùng nhóm nghiên cứu tại Viện hóahọc các hợp chất thiên nhiên đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu metagenome của visinh vật đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam: Cây thuốc có củ (cây nghệ), câycông nghiệp (cà phê) nhằm tăng năng suất và chất lượng cây trồng”.Từ dữ liệumetagenome của VSV đất vùng rễ cây cà phê đã được xác định được sự có mặt của155loàitrongđócómộtsốloàidựđoáncóthểthamgiavàoquátrìnhchuyểnhóatựnhiên của nhiều hợp chất trong đất, sản sinh kháng sinh như một số loài thuộc chiStreptomyces,Sphingomonas,Bacillus,vàTrichoderma.Đềtàiđãxácđịnh6loàicóthể gây bệnh trên cà phê nhưMycobacterium celatum, Ralstonia solanacearum,Pseudomonasgarcae,RhizoctoniasolanivàFusariumoxysporum.Đãxácđịn hđượcmột số loài tiềm năng có thể liên quan đến khả năng chuyển hóa dinh dưỡng nitơtrong đất vùng rễ cây nghệ, bao gồmGlomus cubense, Rhizophagus sp., Nitrospirasp., Candidatus
Nitrososphaera gargensis và Candidatus Nitrosopumilus sediminis.Cũng trong năm 2014-
2018, PGS.TS.Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện Hóa sinh Biển đãtiếnhànhthựchiệnđềtài:“NghiêncứuMetagenomecủavisinhvậtliênkếthảimiêntạibiểnmiề nTrungViệtNamnhằmpháthiệnvàsànglọccácchấthoạttínhsinhhọcmới” Đã xác định được sự đa dạng của vi sinh vật liên kết hải miên thu thập từ ĐàNẵng, Nha Trang và Quảng Trị dựa trên phân tích trình tự vùng siêu biến V4 gene16S rRNA Đã phát hiện được ngành đặc hiệu cho hải miên DN9 là Cyanobacteriavà NT16 là các ngành Fimicutes, Planctomycetes và Verrucomicrobia Đã xác địnhđược 8 gen đại diện có hoạt tính sinh học mới (so với ở Việt Nam) và 10 OTU phânloại vi sinh vật mới Xây dựng được cơ sở dữ liệu metagenome cho 3 mẫu hải miên.Tổng kích thước hệ gen của mẫu DN9 là 321 Mb; NT16 là 311 Mb và QT2 là 418Mb.Pháthiệncácgenmãhóachocácsảnphẩmtựnhiêncóhoạttínhsinhhọcvàtìmhiểukhảnăng khaitháccácgennày,đồngthờithunhậnmộtsốhợpchấtcóhoạttínhsinhhọcvàxácđịnhtínhchất củachúng kết quảthuđượcrấtkhảquan.
Gầnđâynhấtnăm2021,PGS.TS.ChuHoàngHàvàCộngsựViệncôngnghệsinhhọc,đãti ếnhànhthựchiệnđềtài:“Nghiêncứumetagenomecủavisinhvậttrongcác đầm nuôi tôm, góp phần tạo cơ sở khoa học để phát triển nghề nuôi tôm ở ViệtNam”, với mục tiêu chính là ứng dụng công nghệ metagenomics để nghiên cứu mộtcách tổng thể nguồn tài nguyên, vật liệu di truyền của vi sinh vật trong các đầm nuôitôm,kýsinhtrêntôm(đặcbiệtlàcácvisinhvậtchưađượcnuôicấy)vàkhaithác nguồn vật liệu di truyền phục vụ cho việc phát triển nuôi tôm bền vững Đề tài đãđánh giá được sự đa dạng vi sinh vật trong các đầm nuôi tôm và xác định được mốiliên quan giữa mức độ đa dạng vi sinh vật ở mức độ gen với năng suất, chất lượngnuôitômsúvàtômthẻchântrắng.XácđịnhđượcdanhmụccácOTUmộtsốvisinhvậtthu ộccácnhómActinomycetales,Fusobacteriales,Ricketsiales,Sphingobacteriales, và
Vibrionalescó khả năng gây bệnh cho tôm từ cơ sở dữ liệu16S rRNA metagenome và Xây dựng sữ liệu metagenome của vi sinh vật trong cácđầm nuôi tôm ồm 12 bộ cơ sở dữ liệu giải trình tự 16S rRNA, 3 bộ cơ sở dữ liệushotgunDNA metagenome,3bộcơsởdữliệu shotgun RNA metagenome. Ứng dụng của metagenomics là có thể cung cấp một nguồn tài nguyên khônggiớihạnchosự pháttriểncácgenmới,enzyme,các sảnphẩmtựnhiên,cáchợpchấthoạt tính sinh học và các chế phẩm sinh học có thể ảnh hưởng đáng kể đến các ứngdụng công nghiệp và công nghệ sinh học [44] Ngoài ra, một số nhà khoa học cũngchorằngcóthểkhaitháccácchấtkhángsinhmớinhờứngdụngkỹthuậtmetagenomics.
Sựđadạngvisinhvậtcộngsinhvớirongbiển
Rong biển (tảo lớn) gồm nhóm các thực vật đa dạng, phổ biến và có khả năngquang hợp và đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái dưới nước Hệ sinh thái nàygópphầnquantrọngđốivớiquátrìnhsảnxuấtsơcấp(làquátrìnhchuyểnhóavôcơgồm CO 2 và
H2O thành hữu cơ C, H, O, N) trên toàn cầu và sự tạo thành môi trườngsống trên các bờ đá tại vùng nhiệt ôn đới, cung cấp thức ăn và nơi trú cho sinh vậtbiển Giống như các sinh vật nhân chuẩn khác, rong biển chứa đựng sự đa dạng vềcác vi sinh vật cộng sinh trong chúng, có liên quan tới sức khỏe của rong và hệ sinhthái.Cụthể,cộngđồngvikhuẩnbámđượccholàgópphầntạonênsựpháttriểnbìnhthường của rong chủ, và vi khuẩn với đặc tính chống thối sẽ bảo vệ vật chủ khỏi cácđedọabởicácvisinhvậtvàtảobámkhác.Mốiquanhệchặtchẽnàygiữarongvàvikhuẩn là một thực thể thống nhất chức năng hoặc sự cộng sinh, giống như mối quanhệmiêutảtrướcđâyvớisanhô[48].
Như ta đã biết rong biển là nơi cư trú của nhiều loài vi sinh vật như vi khuẩn,nấm, vi tảo, ấu trùng giáp xác, virus, trong đó vi khuẩn chiếm chủ yếu là từ 10 2 -10 7 CFU/cm2,Armstrong và cộng sự
2001, đã đưa ra báo cáo đó là,tùy thuộc vào loàirongbiểnkhácnhau,cácvịtríkhácnhautrêncùngmộtloàirong,biếnđộngtheocác mùatrongnămmàmật độtếbàovisinh vậtbiếnđổikhácnhau [38,48].
Ngay từ những năm 1970, các nghiên cứu dựa trên nuôi cấy và kết hợp vớidùng kính hiển vi soi, đã chỉ ra sự khác biệt rõ ràng giữa thành phần vi sinh vật cóliên kết với rong biển và thành phần nước biển xung quanh Những điểm đặc trưngcủa vật chủ là rong biển cũng như sự biến đổi theo thời gian, không gian đã đượchoàn thiện bởi những nghiên cứu, gần đây các nhà khoa học đã tìm ra phương phápđánhgiásựđadạngcủacộngđồngvisinhvậtsốngliênkếtvớirongkhôngphụthuộcquá trình nuôi cấy Tính đặc hiệu của vật chủ dẫn đến sự xuất hiện của một tập hợpcácvisinhvậtliênkếtvớirongkhácbiệtvớicácvậtchủkháctrongmôitrườngbiển.Đểnghiênc ứutínhđặchiệucủacộngđồngvisinhvậtnàycácnhàkhoahọcsửdụngkỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như16S rDNA, T-RFLP,điện di biến tính DGGE…
Burkevàcộngsự2011bchorằng,sựkhácbiệtvềtínhđặchiệucủacáccộngđồngvisinh vật trên các loài rong biển chủ khác nhau có thể do đặc điểm môi trường sốnghơn là do sự phát sinh từ loài Tuy nhiên, hiện tại các phương pháp phân tử như16SrDNA,T-
RFLP,điệndibiếntínhDGGE,địnhlượngPCRvàlaihuỳnhquangtạichỗcũngcónhữnghạnchết rongviệcđánhgiátoànbộsựđadạngcủamộtcộngđồngvisinh vật, ngay cả trong cùng một mẫu, bởi chúng chỉ có giá trị trong thời gian nhấtđịnh, và chỉ phát hiện cộng đồng vi sinh vật ở thời điểm đó chiến ưu thế Thông quaviệc xác định trình tự metagenome của cộng đồng vi sinh vật, người ta có thể xácđịnh được các gen chức năng quy định cũng như những đặc điểm khác biết trongcộngđồngvisinhvật[41].
Vi sinhvậttrongmôitrườngbiển làrấtđadạng.Tuynhiên, chỉ0,1- 2%trongsốchúngcóthểđượcphânlập,nuôicấymụcđíchnghiêncứucácđặctínhlýhóahọcvàđặ ctínhsinhhọcv.v TheoFernandes vàcộngsự(2011),thìcácvisinhvậtphânlậpchưaphảnánhđượcsựđadạng,cấutrúcvisinh vậttrongmộtmôitrườngnhấtđịnh,khinghiêncứuvềbệnhởrongD.pulchra,tácgiảFernandes
(2011)sửdụngkỹthuậtT-RFLP,PCR- DGGEvàgiảitrìnhtựthưviện16SrDNA,tácgiảthấyrằngởrongk h ỏ e m ạ n h c ó s ự p h â n b ố c á c n h ó m v i k h u ẩ n chiP a r v u l c u l a v à Haliscomenobactervàtrong họRhodobacteracea.Trongkhiđó,ởrongbịbệnhmấtmầu,thìcácvikhuẩntrênítđi,vàtha yvàođólàcácvikhuẩnthuộcchiThalassomonas,Cellulophaga,ColwelliaceaevàPseudor uegeria.Tácgiảchorằng,các vi khuẩn mới xuất hiện ở rong bệnh bạc mầu là do các vi khuẩn này có khả năngtiết enzyme phân hủy thành tế bào rong (agar, alginate, carrageenan, fucoidan) [49].Vìvậy,việcnghiêncứuquầnthểvisinhvậtởrongbiểnkhôngquanuôicấy, sửdụngkỹthuậtsinhhọcphântửlàrấtquantrọngvàhữuhiệu.Đólàviệcứngdụngkỹthuậttrong nghiêncứusinhhọcphântửnhưPCR-DGGE,T-RFLP,pyrosequencing và giải trình tự gen thế hệ mới (next generation sequencing – NGS) [47].TrongmộtnghiêncứuvikhuẩnởrongDeliseapulchra,Fernandesvàcs.
(2012)sửdụngphươngphápsinhhọcphântử(thưviện16SrDNA)đểmôtảsựthayđổithànhphần vi sinh vật ở rong bệnh và rong khỏe Tác giả thấy rằng có sự thay đổi ở taxaColwelliaceae,Rhodobacteraceae,Thalassomonas, vàParvularcula Số lượngcácOTU vikhuẩnởrongbệnhlà364,nhiềuhơnsovớiởrongkhỏe133.Cótới19họ/ chiđượcpháthiệnvớihàngtrămOTUkhácnhau,chứngtỏsựđadạngvisinhvậttrênronglàrấtcao
[44] Ở rong lụcUlva australis, các nhóm vi khuẩnAlphaproteobacteriavàBacteroideteschiếm ưu thế, đặc biệt là các họRhodobacteriaceae,Sphingomonadaceae,Flavobacteriaceaeand,Sapropiraceae[51].
Các nhóm vi khuẩn khác nhau sẽ thực hiệncácquátrìnhtraođổichấttươngtựnhưngvớichứcnăngkhácvàchúngsẽcạnhtranhvớinhauđ ểsốngtrênbềmặtronglục.RongđỏDeliseapulchramọcởbờbiểnSydneycũngcócácvikhuẩnt huộcAlphaproteobacteria,Gammaproteobacteria,PlanctomycetiavàBacteroidetes,đ ặcbiệtthuộccáchọRhodobacteriaceae,SphingomonadaceaeFlavobacteriaceaevàP l a n c t o m y c e t a c e a e [52].
Các nghiên cứu về quần thể vi sinh vật ở rong cho thấy mỗi loài rong đều cónhữngloạivisinhvậtnhấtđịnh(visinhđặchiệu),đặchiệucholoàirongđó,vàcóthểkhôngthấyxu ấthiệntrongmôitrườngbiển.VídụởloàitảobẹLaminariahyperborea,mộtđơnvịloài(OTU)đư ợcpháthiệnở78%cácmẫutảotrongtấtcảcácmùa.Cácvisinhvậtcóthểđặchiệunàycóthểthayđổith eothờigianhoặcvịtríđịalývùngrongbiển.Thànhphầnvisinhvậtlàkhácnhauởcácloàirongkh ácnhau,dùrongsốngcùngtrongmộtmôitrường.Trongkhiđó,cùngmộtloàirongsẽchứathàn hphầnvisinhvậttươngđốigiốngnhau,chodùrongsốngởcácvùngđịalýkhácnhau[53].
Sự liên quan về sinh thái học giữa cộng đồng vi sinh vật sống trên rong hiệnnayvẫnchưađượchiểuchitiết.Trướcđây,nghiêncứumốitươngtácgiũavikhuẩn- ronggặpkhókhăntrongvấnđềphânlập,nuôicấyvàxácđịnhmốiquanhệ[47,52].Việcpháttriểncá ckỹthuậtsinhhọcphântửnhưphươngphápnhậndạngvisinhquagiảimãgen16SrRNA,kỹthuậtfin gerprintingDNA,baogồmđiệndibiếntínhDNA(PCR-DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis), đa dạng chiều dài đoạn gencắt(T-
RFLP,terminalrestrictionfragmenlengthpolymorphism),pyrosequencingđãgiúpviệc phân tích phân loại và sự đa dạng các vi sinh vật sống trên rong [ 52, 53,54]. Đáng chú ý, gần đây Bùi Đình Lãm và cộng sự (2011) đã thực hiện
Icedisease) Ở rong sụn (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striaum) bị bệnh ở ViệtNam”.Đãphânlậpđược119chủngvikhuẩnkhácnhautừcácmẫurongbịbệnh,đãphânloại bằngkitchuẩnsinhhóaAPIđượcxếpvào19loàithuộc7chilà
Burkholderia,Vibrio,Pasteurella,Shewanella.Aeromonas,Ochorobactrumvàbacillus
Trong đó xác định được hai loài xuất hiện phổ biến nhất trên rong sun làVibrioparahaemolyticusvàBurkholderiacepaciavớitầnsuấtxuấthiệntươngứnglà21,7%và1 7,4%.
Theo TS Lê Hữu Cường và cộng sự (2021) đã tiến hành nghiên cứu về đadạng vi sinh vật trên cây rong sụn và nguyên nhân gây ra bệnh thối nhũn. Phươngpháp mà nhóm sử dụng là giải trình tự gen thế hệ mới (NGS), rDNA amplicon kếthợpvớiphươngphápsinhhọcphântửtruyềnthốngtạothưviệngen,DGGE(điệndibiếntínhD NA)–đểphântíchDNAhệgencủatấtcảcácvisinhvậttừrongsụnkhỏemạnh và rong bệnh thu mẫu tại các 3 vịnh ở Khánh Hoà cũng như một số vùng ởNinh Thuận Đã đưa ra những dữ liệu về đa dạng vi sinh vật sống trên rong Sụn vàHồng vân tại vùng biển Khánh Hòa Bằng việc giải trình tự gen, các vi sinh vật sốngtrênrongthuộcchủyếuchiCobetia,Pseudoalteromonas,Alteromonas,nhómFlavob acterium, Vibrio Vi khuẩn sống trong nước biển đa dạng hơn và đồng đềuhơn so với vi khuẩn sống trên rong Năm 2010 TS Đào Thị Lương đã sử dụnggenrRNA16Sđểnghiêncứuphátsinhchủngloại,phânloạivikhuẩnvàtừđóphântíchmố i quan hệ họ hàng trên cây phả hệ của 43 chủng vi khuẩn phân lập từ rong sunKappaphycusalvareziiởViệtNam.
Cácchấtcóhoạttínhtừvisinhvậtliênkếtvớirongbiển
Các chấtcó hoạttínhsinhhọctừvinấm cộngsinhtrênrong
salicorniaecộngsinhvớirongUlva.Hợpchấtnàybiểuhiệnhoạttínhhoạttínhkhángplasm odium falciparumK1 (IC50736 μM)thug /mL) và NF 54 (IC50378 μM)thug /mL) Nó cũngcho thấy có hoạt tính kháng lại chủngBacillus megaterium(5 mm),Mycotypha(4mm), vàMicrobotryum violaceum(2 mm) ở nồng độ 50 μM)thug trên một đĩa thạch và cókhả năng ức chế tyrosine kinase p56lck đến 70% nó ở nồng độ 40μM)thug/mL và 23% ởnồng độ 200 μM)thug/mL[101] Wang và cộng sự, đã xác định được 1 dẫn xuất 2H-benzopyran mới,chaetopyraninbiểuhiệnhoạttínhchốngoxyhóatrênhệDPPHvớigiá trị (IC 50 35 μM)thug/mL) và biểu hiện hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thưngườilàmicrovascular,HMEC(IC5015.4μM)thug/mL),tếbàoungthưganSMMC7221(IC50 28,5 μM)thug/mL), tế bào biểu mô phổi người A549 (IC50 39.1 μM)thug/mL) Hợp chấtnày được phân lập từ chủngChaetomium globosum,cộng sinh từ rongPolysiphoniaurceolata.[102].
Theo TS Lê Hữu Cường và Lê Thị Hồng Nhung (2021), phân lập được 169chủng nấm từ 30 mẫu rong, tiến hành lên men, đánh giá hoạt tính sinh học (KhángVSVKĐ,gây độctếbào,oxihóavàhoạttínhứcchếenzyme- glucosidase,aceycholineeserase,Fuicodan.Kếtquảthuđược:Caochiếtcủa9chủngnấmcóho ạttớnh đối khỏng từ 1-5 VSVKĐ với giỏ trị MIC là 50 -200 àg/mL, và gõy độc tế bàoung thư trờn cỏc dũng HepG2 (ung thư gan); LU-1 (ung thư phổi), RD (ung thư môliên kết) Kết quả ở 164 cao chiết nấm có 14 cao chiết gây độc lên ít nhất 1 dòng tếbàoungthưv ớ i giỏtrịIC50≤40àg/mL,9caochiếtnàycũngcúbiểuhiệnhoạttớnhchống oxi húa ở nồng độ ban đầu là 100 àg/mL, đối với khả năng ức chế enzyme-glucosidase cú 5 cao chiết từ chủng nấm cú hoạt tớnh ức chế>50% hoạt tính enzymeglucosidaseởnồngđộthửnghiệmđầutiên(100g/ml),trongđócóchủngHN22ứcchế 92,72% hoạt tính enzyme glucosidase và giá trị IC50 thấp 32,11g/mL Với tỷlệ % ức chế acetycholine esterase ở nồng độ 100 àg/mL cú 3 cao chiết cú hoạt tínhtrongđóđángchúýcó nấm HN15hoạttính mạ nh vớigiá trịIC50 t hấ plà11, 29
Tiềmnăngvàtriểnvọngtừvisinhvậtliênkếtvớirong
Ta biết rằng 99% số vi sinh vật có trong môi trường tự nhiên là không có khảnăng nuôi cấy [103, 104] Do vậy số lượng vi sinh vật được thu thập để phân tích vềchứcnăngvàphântíchcácloàitheophươngphápnuôicấytruyềnthốnglàvôcùng hạn chế cả về số lượng và chất lượng Gần đây những tiến bộ trong việc phân tíchdựa trên kỹ thuật sinh học phân tử là phân tích axit nucleic và kỹ thuật giải trình tựgen, đã giúp cho việc xác đinh được sự đa dạng và chức năng của vi sinh vật trongcộngđồngvisinhvật,màkhôngcầnsửdụngkỹthuậtnuôicấyvàphântíchhìnhtháitruyềnthố ng.Nhữngtiếnbộnàyđãmanglạinhữngkếtquảnổibậttrongnghiêncứusựđadạng,mốitươngq uanvàxácđịnhcáchợpchấtcóhoạttínhdượchọcmộtcáchnhanh chóng, ví dụ như việc xác định một số enzyme mới từ cộng đồng vi khuẩncộng sinh với tảoU australis, vàcác chất kháng sinh như terragine, acyltyrosines,turbomycin AvàB[105,106].
Ngàynayvớiviệcpháttriểncáckỹthuậtmớitrongcôngnghệsinhhọcđãgópphần đáng kể vào việc khám phá, phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học cao.Metagenomic (bao gồm chức năng metagenomics) được phát triển và ứng dụng đểkhảosáthoạttínhsinhhọccáchợpchấtvisinhvậtcộngsinhnóichungvàtrênvùngnuôitrồngc ũngnhưtrêncâyrongbiểnvẫncònởgiaiđoạnmới,tỷlệthấpvàsựbiểuhiện gen không tương đồng trong loài. Những phương pháp tiếp cận di truyền hiệnđại mới chắc chắn sẽ giúp xác định các chất chuyển hóa mới từ vi sinh vật cộng sinhrongbiểnkhôngthôngquaquátrìnhnuôi.Cácvikhuẩncộngsinhvớirongbiểncungcấpcácchất chuyểnhóađộcđáovàmớilạvớinhữngcấutrúcchưatừngcó,vớihoạttính kháng khuẩn, kháng nấm, thuốc kháng vi-rút, kháng kí sinh trùng sốt rét,chốngviêm,chốngungthư Vìvậy,cáchợpchấtcóhoạttínhsinhhọcnàycóthểcungcấpcác hợp chất có chất lượng cao cho ứng dụng dược phẩm, cũng như nông nghiệp vàứng dụng công nghiệp Vì vậy, việc khám phá vi khuẩn cộng sinh rong biển sử dụngcác công cụ và kỹ thuật mới, chẳng hạn như các mô hình gen di truyền cao và cáctiếpcậnmetagenomic,sẽkhámpháthêmcácsảnphẩmtựnhiêncóhoạttínhsinhhọcmớitrong tươnglai,vàsẽgiúpkhaitháctiềmnăngcôngnghệ sinhhọccủachúng.
Mục đích cuối cùng của việc nghiên cứu các chất hóa học theo định hướnghoạttínhsinhhọctừcácsinhvậtbiểnlàtạoranhữngloạithuốcmớihơnvàhiệuquảhơn trong việc điều trị bệnh ở người Mặc dù có sự đa dạng rộng lớn của các cộngđồng vi sinh vật dưới đáy đại dương và rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh họcmà chúng tạo ra, và có rất ít loại vi khuẩn có nguồn gốc từ môi trường biển trên lĩnhvực thị trường sản xuất dược phẩm Với tích hợp phương pháp tiếp cận vi sinh, sànglọcvàhóahọccácsảnphẩmtựnhiên,cácchấtchuyểnhóavisinhvậtbiểnhiệnđang tiếnlênđểtrởthànhứngcửviêndượcphẩmquantrọng.Vớisựtăngcườngtậptrungnghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học biển, các hợp chất có hoạt tính sinhhọc mới và tiềm năng được phát hiện từ đại dương, với tốc độ nhanh Hiệu quả nhấtvà các chất hoạt tính sinh học sẽ tiếp tục đủ điều kiện cho các thử nghiệm lâm sàngđể trở thành ứng viên thuốc thành công trong tương lai Cho đến nay, hàng trăm cáchợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, nhiều hợp chất có cấu trúchóahọcmớivàlýthú,nhiềuhợpchấtcóhoạttínhgâyđộctếbào,khángviêm,khángvisinhvậtki ểmđịnh[107].Nhữngkếtquảnghiêncứunàyđãđượccôngbốtrêncáctạp quốc tế về hướng các hoạt chất thiên nhiên biển, đồng thời nhiều hoạt chất đã vàđangđượcpháttriển,mộtsốloàisinhvậtbiểnđãđượclựachọnthànhcácsảnphẩmcógiátrịydượcvàsớmđượcđưarat hịtrườngphụcvụviệcchămsócsứckhỏecộngđồng[108,109].
Vậtliệuvàmôitrườngnghiêncứu
Thu thậpmẫu,cácchủng visinh vậtkiểmđịnhvàcácdòngtếbào
Thu thập mẫu: Các mẫu rong sụnKappaphycus alvareziiđược thu thập ở
2địađiểmtươngứngvới03mẫurongvớikýhiệuVP1,VP2,VP3tươngứngvớitừngvịtrísau:
1- Haimẫurongkýhiệu VP1vàVP2đ ư ợ c thutạiCổCò-VịnhVânPhong
2- MẫurongVP3 đượcthutạiVũng Ké- Vịnh VânPhong- huyệnVạn Ninh -KhánhHòa,tọađộN: 12.66025 E:109.34620.
Các chủng visinh vật kiểm định (VSVKĐ):
Các dòng tế bào :Được cung cấp từ phòng Sinh học thực nghiệm- Viện Hoá họccáchợpchấtthiênnhiên,gồm:
Dòng Hep- G2:Hepatocellular carcinoma- ung thư ganDòngLu: Lungcancer-ungthưphổi.
Môitrườngnghiêncứu
Nướccất50%;nướcbiểnvôtrùng50%;glucose–1;caonấmmen–1;pepton–
5;MgSO4.7H2O–0.05;caothịt–0.5;KH2PO4–0.2;agar–18;pH7,5–7,8.
Nước cất 50%; nước biển vô trùng 50%; glucose – 1; cao nấm men – 0.2; caothịt–3;pepton–5;MgCl 2– 1.2;KCl–0.25;KH2PO4–1;NH4NO3–2;agar–18; pH7.8–8.0.
Môi trường thạch Sabouraud có bổ sung kháng sinh gồm 10 g pepton, 20 gglucose,18-
20gagar,1000mLnướcbiểntựnhiên,1,5gpenicillin,1,5gstreptomycin,pH6,0-7,0.
Nướccất50%;nướcbiểnvôtrùng50%;glucose–1;caonấmmen–1;pepton
Môi trường lên men rắn (RYE):Môi trường gạo được chuẩn bị trong các bìnhErlenmeyer 1000 mL gồm 50 g gạo, 0.05 g dịch chiết nấm men, 0.02 g KH 2 PO4và50 mLnướcbiển[110].
Môi trường Hansen với nấm men:glucose: 50 g, pepton: 10 g, KH2PO4: 3g,MgSO4.7H2O:2g,nước:1000ml,thạch: 15-20g,(pH=5-6)
Môi trường Czapeck-Dox cho nấm mốc:Saccharose: 30 g, NaNO3: 3 g,K2HO4:1g,MgSO4:0,5g,KCl:0,5g,FeSO4: 0,1 g,Nước: 1000ml,(pH=5-5,5).
MôitrườngJCM(012)g/lít:pepton–5g;caothịtbò–3g;NaCl–5g;agar
Môi trường NA (Nutrient Agar – 014) g/lít: pepton – 5 g; cao thịt – 2; NaCl – 1g;agar –18g;pH7,0.
Môi trường YM (021)g/lít: pepton–5g;glucose–10g; caonấmmen–3g;caomalt– 3g;agar–18g;pH6,2.
MôitrườngYMA(022)g/lít;caonấmmen–4g;caomalt–10g;glucose–4g;agar –18g;pH7,3.
Hóachấtvàthiếtbịnghiêncứu
Các hóa chất có nguồn gốc từ Mỹ, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam nhưpepton,dịchchiếtnấmmen(ẤnĐộ),glucose,muốibiển,agar(ViệtNam);KH2PO4,K2S2O8(Sigma,Mỹ);ethylacetate,n-hexan,methanol,glycerol,dimethylsulfoxide, acetonenitrile(Labscan,TháiLan);DPPH,ABTS(Sigma,Steinheim,Đức);amoxcillin,cefotaxi me, streptomycin, penicillin (Sigma, Đức); sulforhodamine B, MTT (3- (4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma, Mỹ) và một số hóachấtphân tíchkhác.
Các thiết bị trong phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chấtthiên nhiên, bao gồm: Cân điện tử AL – 300, nồi hấp khử trùng Hiclave HV –
85, tủcấy vi sinh - Box laminar PH (Đức), tủ ấm (DaiHan, Hàn Quốc), máy lắc ổn nhiệt(DaiHan,HànQuốc),máysụckhíOxi(DaeKwang,HànQuốc),máylitâm(Hettichrotofix 32A, Đức), máy đo mật độ quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ), kính hiểnviquanghọcAxio(Olympus,Nhật).
Các máy dùng xác định cấu trúc hóa học: Máy đo HR-ESI-MS: AGILENT6530 Accurate Mass QTOF LC/MS, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân NMR: BrukerAM500 FT-NMR, máy đo phổ lưỡng sắc tròn (CD): hirascanTM CD spectrometer(Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK) và độ quay cực được đo trên máy JASCOP-2000Polarimeter
(Merck1,05715),RP18F254S(Merck),sắckýcột(CC)là(150mFujiSilysiaChemicalLtd.)và nhựatraođổiionDiaionHP-
20(MitsubishiChem.Ind.Co.,Ltd.,).Ngoàiracònsựdụngmộtsốhóachất,thiếtbịkhác.
Phương phápnghiêncứu
Phươngphápthuthậpmẫu
Rongđượcthuthậpdướimặtnước.Mộtmẩurong(thânhoặclá)đượccắtkhỏicây rong (thao tác trên mặt nước hoặc dưới mặt nước tùy thuộc vào đối tượng rong)và cho vào túi nilon đã khử trùng, đưa lên mặt nước, và rửa lại 3 lần bằng nước biểnvôtrùng.Mẫuđượcbảoquảnvôtrùngvàđưangayvềphòngthínghiệmvàbảoquảnởnhiệtđộ4-8 o C.
Phânlậpvikhuẩnvànấmliênkếtvớirongbiển
Vi khuẩn : Cắt ngẫu nhiên các đoạn rong dài 1 cm bao gồm cả phần gốc, thânvà ngọn rong để nghiên cứu độ đa dạng tương đối của vi khuẩn Mẫu được rửa
3 lầnvới nước biển vô trùng sau đó nhúng vào trong các bình tam giác 250 ml chứa 100ml môi trường phân lập vi khuẩn biển, lắc nhẹ và để yên trong 30 phút Pha loãngmẫuthànhdãynồngđộtừ10 -
2–10 -6 Dựngpipethỳt100àlởmỗinồngđộkhỏc nhau và trải trên đĩa thạch có bổ sung kháng sinh kháng nấm là nystatin 50 mg/l sauđó cho vào trong tủ ổn nhiệt trong 24 giờ tại 30 o C Mỗi nồng độ pha loãng được lặplại3lần.Sauđócấyriacáckhuẩnlạcđểthuđượcchủngthuần(lặplại03lầnthucácchủng sạch) Các khuẩn lạc được chọn, dựa vào kích thước, màu sắc, hình dáng đặcđiểmhìnhtháikhác.
Mỗi chủng thuần được cấy gạt trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa môitrườnggiữgiốngvikhuẩnbiển,sauđóbảoquảntrongtủlạnh4 o C.Cấychuyểnđịnhkỳmỗith ángmộtlần.
Vi nấm:Mẫu được xử lý như đối với vi khuẩn Mỗi nồng độ pha loãng mẫuđược trải lên đĩa các môi trường thạch Sabouraud chứa hỗn hợp chất kháng khuẩn(ampicillin, chloramphenicol…) Đĩa được ủ 28 o C trong 5-10 ngày cho tới khi sợinấm xuất hiện Khuẩn lạc nấm được lựa chọn và tinh sạch dựa vào màu sắc, kíchthước,hìnhdáng.Cácchủngvinấmbiểnthuầnđượclưugiữthờigianngắntrongcácống thạch nghiêng chứa môi trường Sabouraud ở 4°C và lưu giữ lâu dài trong môitrườngcanhSabouraudcóbổsung40%glycerolở-80 o C.
Nguyên tắc: Nhuộm Gram là phương pháp phổ biến nhất hiện nay trong việcphânloạivikhuẩn.TrongquátrìnhnhuộmGram,tếbàobướcđầuđượcxửlývớitímkếttinh(th uốcnhuộmfucshin)vàlugolnêncósựtạothànhphứcchấtiottímkếttinhbên trong tế bào Khi tẩy màu bằng cồn, lipit lớp màng ngoài của vi khuẩn gram âmbịhoàtanlàmtăngtínhthấmcủamàngdẫnđếnsựrửatrôiphứcchấttím–iotvàlàmmất màu vi khuẩn Khi nhuộm safarin bổ sung chúng sẽ bắt màu hồng Ở vi khuẩnGramdương,cồnlàmchocáclỗtrongpeptidoglycancolạidođóphứcchấttím–iotbịgiữ lạibêntrongtếbàonênkhôngbắtmàuthuốc nhuộmbổsung.
Địnhdanhcácchủngvikhuẩnvàvinấmtiêubiểu
Sau khi tuyển chọn, các chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh được nuôi trongống Eppendorf 1.5 mL trong 24 h để tách DNA tổng số chúng tôi sử dụng bộ kitExgene TM Cell SV mini-kit (GeneAll Biotechology, Republic of Korea) theo hướngdẫn của nhà sản xuất Để khuyết đại cùng gen 16S chúng tôi sử dụng phương phápPCR với 4 cặp mồi là: 27F, 1492R, 518F, 800R sản phẩm PCR sau khi được tinhsạchvàđượcgửiđisequencingtạicôngtyGenotech(Daejeon,RepublicofKorea).
Kết quả giải trình tự gen được phân tích sử dụng phần mềm SeqMean version 4.1(DNASTARInc.)vàphầnmềmBioEdit(Hall etal.,1999).
Vùnggen16SrRNAcủacácchủngvikhuẩnsaukhiđượcphântíchcóđộdài,tiếp theo xác định mối quan hệ thân thuộc với các chủng vi khuẩn phân lập được.Tiến hành đối chiếu kết quả trình tự nucleotide của chúng với các loài trên
GenbankbằngcôngcụBlasttrựctuyếnvàtrênEzTaxon-eserver(http://www.ezbiocloud.net )[111]. Để xây dựng cây phân loài: trình tự 16s rRNA của các chủng phân lập đượctừmẫurongKappaphycusalvarezivớicácchủnggầngũicótỉlệgiốngnhautừ99,5
%đến99,7%vớichủngVP02.3,từ99,5%đến99,8%vớichủngVP02.11,từ98,3
% đến 100 % với chủng VP03.6, và từ 97,3 % đến 98,9 % với chủng VP03.12 trênNCBI.PhântíchsequencesửdụngphầnmềmCLUSTALX( T h o m p s o n etal.1997).Câ y phát sinh loài được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining (Saitou andNei 1987) sử dụng phần mềm MEGA5 Program (Tamura et al 2011), với giá trịBootstrap1000lần.[112,113,114].
Saukhituyểnchọn,cácchủngnấmcóhoạttínhmạnhđượcnuôithusinhkhốitrong môi trường PDA có bổ sung NaCl (24 g/l) ở 30 o C trong 5 ngày để tách DNAtổngsố.Dịchnuôiđượclytâmở5000rpm,10phút,sinhkhốithunhậnđượchòatantrong0,5 mlđệmlysisbuffercúbổsung3μM)thulproteaseK(20àg/ml)ởnhiệtđộphũngtrong 10 phỳt Hỗn hợp sau đú được ủ ở 60 o C trong 15 phút, siêu âm trong 4 phút,bổ sung 0,15 ml CH 3 COOK và ly tâm 10000 rpm Dịch trong sau ly tâm được thunhận và hòa với isopropanol tỉ lệ 1:1 sau đó ly tâm ở 13000 rpm trong 10 phút ở 4 o C.DNA tủa tổng số thu nhận được được rửa bằng EtOH 70%, làm khô và hòa tan lạivới50μM)thulH 2 OMiliQ.
Phản ứng PCR 20 àlđược thực hiện trờn DNA thu nhận được với thành phầnbao gồm 1 àl AND khuụn, 2 àl đệm 10X, 1,5 àl dNTP 2,5mM và 0,3 àlTaqpolymerase Đoạn gen mó húa vựng ITS sẽ được khuếch đại sử dụng cặp mồi
TCCTCCGCTTATTGATATGC3'[96].PhảnứngPCRđượcthựchiệnvớichutrìnhnhiệt như sau:biến tính chu kì đầu 95 o C: 5 phút; các chu kì sau biến tính 95 o C:45giây;bắtcặpmồi:59 o C:1phút;kéodài72 o C:90giây35chukỳ;chukìcuối72 o C:
5phút.DNAtổngsốvàsảnphẩmPCRkhuếchđạisẽđượckiểmtrabằngđiệnditrêngel agarose Các đoạn trình tự khuếch đại được tinh sạch và giải trình tự bởi First- base,Malaysia.TrìnhtựnucleotideđượckiểmtravàsosánhvớidữliệucósẵntrongGenBank bằng cách sử dụng BLAST (BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nih.gov) Để xây dựng cây phân loài: trình tự ITS của các chủng chúng tôi phân lậpđượctừmẫurongKappaphycusalvareziivàcácchủnggầngũicótỉlệgiốngnhautừ96,3 % đến 99,1 % với chủng VPN15 và từ 95,2 % đến 100,0 % với chủng VPN111được thu thập trên ngân hàng gen NCBI Phân tích sequence sử dụng phần mêmCLUSTAL X [112] Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining [113] sử dụng phần mềm MEGA5 Program với giá trị Bootstrap 1000 lần[114].
Phântíchsựđadạngcủavikhuẩnvà vinấm
DNA tổng số sẽ được tách chiết từ các mẫu rong thu nhận được với 3 lần lặplại bằng bằng kit PowerSoil® DNA isolation (MoBio Laboratories, Qiagen, Đức) vàtinh sạch trên cột mini S-400-HR (Pharmacia, St Quentin Yvelines, Pháp) theo quytrìnhcủanhàsảnxuất.DNAtổngsốtáchchiếtđượcđiệnditrêngelagarose0.8%sửdụngthuốc nhuộmethidiumbromidevàkiểmtrahìnhảnhtrênthiếtbịGelDoc1000.Nồng độ DNA tổng số được phân tích trên máy NanoDrop® ND-1000 ở bước sóng260nm.
2.2.4.2 Phântíchmeta(taxo)genomicđối vớiquầnthểvikhuẩn Để phân tích đa dạng quần thể vi khuẩn của các mẫu rong biển, 16S rRNAđượckhuếchđạisửdụngcặpmồiđặchiệuvớitrìnhtựnhưsau:8F:5’AGAGTTTGA
3’TACGGYTACCTTGTTACGACTT5 [104] Chu trình nhiệt gồm các giai đoạn:Biến tính chu kỳ đầu 94 o C trong 3 phút, các chu kỳ sau biến tính trong 30 giây; bắtcặpmồiở55 o Ctrong1phút;kéodàiở72 o Ctrong1phút;chukỳcuốiở72 o Ctrong5phút;kếtth úcphảnứnghạnhiệtđộxuống4 o C.Cácđoạntrìnhtựkhuếchđạiđượctinhsạchvà giảitrìnhtựtạiFirstbase,MalaysiabởihệthốngMiseq(Illumina).
Phântíchmeta(taxo)genomicđượctiếnhànhtheoquytrìnhchuẩncủaMOTHUR v1.35.1 [105, 106] Các cặp trình tự đoạn ngắn (paired-end reads) đượclắprápthànhcáccontig(đoạntrìnhtựdài)tạobằnglệnhmake.contigsvà 245.
982 trìnhtựvớiđộdàitrungbìnhlà457bpđãđượctạora.Cáctrìnhtựkhôngrõràngvànhững trình tự dài hơn550 bphoặc ngắn hơn 400 bp được loại bỏ bằng lệnhscreen.seqsvà thu được tổngcộng 38.298trình tự với độ dài trung bình là448 bpcho mỗi trình tự Các trình tự duy nhất được thu thập bằng cách sử dụng lệnh unique.seqsvà lệnhalign.seqssau đó được vận hành để bắt cặp trình tự và so sánhdữ liệu thu được và tham chiếu SILVA 16S reference alignment của vi khuẩn(https://www.arb- silva.de/)[107].Saukhisànglọccáctrìnhtựduynhất,các trìnhtựcòn lại sau đó được phân nhóm trước để loại bỏ các trình tự xấu trong mỗi mẫu vàcác trình tự ảo (chimeric) được loại bỏ bằng lệnhchimeric.uchime[108] Cuối cùng,từ4458đến6753trình tự với số lượng trung bình là5688trình tự trên mỗi mẫu vàsauđólấymẫucon(subsample)là4.458trìnhtự.Mỗitrìnhtựsauđóđượcphânloạidựa trên tập RDP 16S rRNA v9 bằng cách sử dụng bộ phân loại nạve Bayesian, ởmức độ tin cậy 80% [109] Các trình tự được tập hợp lại thành các đơn vị phân loạihoạtđộng(OTU)vớingưỡngkhácbiệt3%bằngcáchsửdụnglệnhcluster.split.Cấutrúc cộng đồng vi khuẩn, tỉ lệ tương đối của các vi sinh vật trong mỗi mẫu ở mức độngành (phylum) và chi (genera), chỉ số Chao1 ước lượng độ phong phú và chỉ số đadạng NpShannon sẽ được tính toán và so sánh dựa trên phân tích
TukeyHonestSignificantDifference(HSD)posthoc(p
