Thông tin tài liệu
BỘGIÁODỤCVÀĐÀO TẠO VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀCƠ NGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCƠNG NGHỆ ………………………………… NGUYỄNĐÌNHLUYỆN NGHIÊNCỨUĐẶCĐIỂMVÀHOẠTTÍNHSINHHỌCCỦAM ỘTSỐCHỦNGVI SINHVẬTLIÊN KẾTVỚIRONG SỤNKAPPAPHYCUS ALVAREZIIỞ VÙNG BIỂN NHA TRANG,KHÁNH HÒA,ĐỊNHHƯỚNGSỬDỤNGTRONG Y DƯỢCHỌC LUẬNÁNTIẾNSĨ CƠNGNGHỆSINHHỌC Hà Nội-2022 BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌC VÀ CƠNGNGHỆVIỆTNAM NGUYỄNĐÌNHLUYỆN NGHIÊNCỨUĐẶCĐIỂMVÀHOẠTTÍNHSINHHỌCCỦAM ỘTSỐCHỦNGVISINHVẬTLIÊN KẾTVỚIRONG SỤNKAPPAPHYCUS ALVAREZIIỞ VÙNG BIỂN NHA TRANG,KHÁNH HỊA,ĐỊNHHƯỚNGSỬDỤNGTRONG YDƯỢCHỌC Chun ngành: Cơng nghệ sinh họcMãsố:9.42.02.01 LUẬNÁNTIẾNSĨ CƠNGNGHỆSINHHỌC NGƯỜIHƯỚNGDẪNKHOAHỌC: GS.TS.LêMaiHương PGS.TS.Phan VănKiệm Hà Nội-2022 LỜICAMĐOAN Tôixincamđoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học củaGS.TS Lê Mai HươngvàPGS.TS Phan Văn Kiệm Các số liệu kết thuđược luận án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơngtrìnhnàokhác Tácgiảluậnán LỜICẢMƠN Lời Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc trân trọng củamìnhđếnGS.TS.LêMaiHươngViệnhóahọccáchợpchấtThiênnhiênvàPGS.TS.Phan VănKiệmViện Hóa sinh biển- người Thầy ln tận tình giúp đỡ,hướng dẫn khoa học định hướng nghiên cứu suốt trình tơi thực vàhồnthànhluậnán Luận án hồn thành Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, với hỗ trợ kinh phí đề tàiNĐT11.GER/16 EmxinchânthànhcảmơnBanlãnhđạoViệnhóahọc cácHợpchấtThiênnhiê n,cùngcácđồngnghiệpvàcácanhchịphịngsinhhọcthựcnghiệmđãlnủnghộvàtạomọiđiềuk iệnthuậnlợiđểemtậptrungnghiêncứuvàhồnthànhluậnán.Emxingửilờicảmơnchânthà nhđếnBanlãnhđạoHọcViệnKhoahọcvà Cơng nghệ Thầy, Cơ anh, chị chuyên viên Học Viện tận tìnhhướngdẫnvàgiúpđỡtạonhữngđiềukiệntốtnhấtchoemtrongthờigianhọctậpvànghiêncứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cơ Viện Cơng nghệ sinhhọcđãgiảngdạy,cungcấpcáckiếnthứcmớiđểemhồnthànhcáchọcphầnvàcácchunđềt rongchươngtrìnhđàotạo Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè quan tâm,hỗ trợ động viên suốt thời gian qua để em hồn thành tốt nhiệm vụhọctậpvàcơngtácchunmơn Emxintrântrọng cảm ơn! Nghiêncứusinh MỤCLỤC LỜICAMĐOAN .i LỜICẢM ƠN ii MỤCLỤC iii MỞĐẦU 1.1 Tổngquanvềrongbiểntrênthếgiới 1.2 Tình hìnhrongbiểnở Việtnam 1.3GiớithiệuvềRongSụn 2.1 Visinhvậtbiểncộngsinhvàcácchấtcóhoạttínhsinhhọc 2.2 Visinhvậtcộngsinhvớirong 10 2.3 Khoa họcmetagenomicstrongnghiêncứukhuhệVSVliênkết 13 2.4 Sựđadạngvisinhvậtcộngsinhvớirongbiển 18 2.5 Cácchấtcóhoạttínhtừvisinhvậtliênkếtvớirongbiển 22 2.5.1 Cácchấtcóhoạt tínhtừ vikhuẩncộngsinhtrênrong 22 2.5.2 Các chấtcó hoạttínhsinhhọctừvinấm cộngsinhtrênrong 27 2.6 Tiềmnăngvàtriểnvọngtừvisinhvậtliênkếtvớirong .32 PHẦNII VẬTLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU .35 2.1.Vậtliệuvàmôitrườngnghiêncứu 35 2.1.1Thu thậpmẫu,cácchủng visinh vậtkiểmđịnhvàcácdòngtếbào 35 2.1.2.Môitrườngnghiêncứu 35 2.1.3Hóachấtvàthiếtbịnghiêncứu 36 2.2 Phương phápnghiêncứu 37 2.2.1 Phươngphápthuthậpmẫu 37 2.2.2 Phânlậpvikhuẩnvànấmliênkếtvớirongbiển 37 2.2.3 Địnhdanhcácchủngvikhuẩnvàvinấmtiêubiểu 38 2.2.3.1 Địnhdanhcácchủngvikhuẩndựavàotrìnhtựgen16SrARN 38 2.2.3.2 Địnhdanh cácchủngnấmdựavàotrìnhtựgenvùngITS/28S rDNA 39 2.2.4 Phântíchsựđadạngcủavikhuẩnvà vinấm .40 2.2.4.1 TáchchiếtDNAtổngsố 40 2.2.4.2 Phântích meta(taxo)genomicđốivớiquầnthểvikhuẩn 40 2.2.4.3 Phântíchmeta(taxo)genomicđốivới quầnthểNấm 41 2.2.5 Hoạttính đốikháng VSVKĐcủacácchủngvikhuẩn vànấmphânlập 42 2.2.6 Lênmen,thunhậncaochiếtdịchlên mentừcácchủnglựa chọn 43 2.2.6.1Thửhoạttínhđốikhángvisinhvậttrênphiếnvilượng96giếng 43 2.2.6.2 Hoạttính gâyđộctếbào 45 2.2.6.3 Hoạttínhchốngoxyhố 47 2.2.7 Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất khángsinhcủachủng Aspergillusmicronesiensis 48 2.2.7.1 Khảosát động họccủathờigianlên men 48 2.2.7.2 Khảosát động học củanồngđộmuối 49 2.2.7.3 Khảosát động họccủapH môitrường .49 2.2.8 Quyhoạchthựcnghiệmvàtốiưuhóaqtrìnhlênmen 50 2.2.9 Phânlậpvàxácđịnhcấutrúchóahọccáchợpchấthữucơ 51 2.2.9.1 Phươngpháp phânlậpcáchợpchất 51 2.2.9.2 Phươngphápxácđịnhcấu trúchóahọccác hợpchất 52 PHẦNIII.KẾT QUẢVÀTHẢOLUẬN 54 3.1 Phân lậpcácchủngvikhuẩnvà vinấm 54 3.1.1 Phânlậpcác chủngvikhuẩn .54 3.1.2 Phânlậpcácchủngvinấm 55 3.2 SànglọchoạttínhđốikhángVSVcủacácchủngphânlập 56 3.2.1 Hoạttính đốikháng VSVcủacác chủngvikhuẩn 56 3.2.2 Hoạttính đốikháng VSVKĐcủacácchủngvi nấm 58 3.2.3 Đặcđiểmhìnhtháicủacácchủngvikhuẩnvàvinấmtuyểnchọn 61 3.2.3.1 Đặcđiểmhìnhtháicủacácchủngvikhuẩn 61 3.2.3.2.Hìnhthái củachủngvinấmlựachọn 64 3.2.4 Phân loại chủng vi khuẩn vi nấm lựa chọn dựa kỹ thuật sinhhọcphân tử 65 3.2.5 Đánh giá đa dạng cấu trúc quần thể vi sinh vật rong sụnKappaphycusalvarezii 68 3.2.5.1 Quầnthểvikhuẩn 68 3.2.5.2 Quầnthểnấm .72 3.2.6 Hoạttính sinhhọctừcặnchiếtthơcủacácchủng 75 3.2.6.1 HoạttínhđốikhángVSVcủacáccặnchiếtethylacetate .75 3.2.6.2 Hoạttínhchốngoxyhóacủacủacáccặnchiếtethylacetate 80 3.2.6.3.Hoạttính gâyđộctếbào ungthưcủa cáccặnchiết ethylaxetat 81 3.2.7 Nghiêncứuđiềukiện ni tối ưucho hoạt tínhkhángVSVKĐ củachủngvinấmAspergillusmicronesiensis 84 3.2.7.1 Ảnhhưởngcủathờigianlên men .85 3.2.7.2 Ảnhhưởngcủanồngđộmuối 86 3.2.7.3.Ảnhhưởngcủa pHmôitrường 87 3.2.8 Quyhoạchthựcnghiệmvàtốiưuhóaqtrìnhlênmen 88 3.2.8.1 Phầnthựcnghiệm 88 3.2.8.2 Thiếtkếmatrậnkếhoạchthựcnghiệm 88 3.2.8.3 Xâydựngmơhìnhkếhoạchthựcnghiệmvàtốiưuhóaquytrình 89 3.2.8.4 Tốiưuhóacácthơngsốcơngnghệqtrình .92 3.3 Phân lậpvàxácđịnhcấutrúchóa họccáchợpchấttừchủng nấm Aspergillusmicronesiensis 94 3.3.1 Phântách cáchợpchấttừchủng Aspergillusmicronesiensis 94 3.3.2 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân tách từ chủngAspergillusmicronesiensisVPN1.11 96 3.3.2.1 HợpchấtAM8A1:AspersiensisA(hợpchấtmới) .96 3.3.2.2 HợpchấtAM8B1:AspersiensisB(hợpchấtmới) .96 3.3.2.3 HợpchấtAM8B2:AspersiensisC(hợpchấtmới) .96 EpicocconeB(5,6,7-trihydroxy-4-methyl-1(3H)isobenzofuranone) 97 epicoccolidesB 97 epicoccolide A 97 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ chủngAspergillusmicronesiensis 98 3.4.1 Hợp chấtAM8A1:Aspersiensis A(hợp chấtmới) 98 3.4.2.Hợp chấtAM8B1:Aspersiensis B(hợp chấtmới) 104 3.4.3Hợp chấtAM8B2:Aspersiensis C(hợp chấtmới) 110 3.4.4 Hợp chấtAM3A1:4-hydroxybenzaldehyde 117 3.4.5 Hợp chất AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien-α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien3β-ol) 118 3.4.6 Hợp chấtAM4F1:2-O-methylbutyrolactoneII .122 3.4.7 HợpchấtAM6E1:1,3-dihydro-4,5,6-trihydroxy-7methylisobenzofuran 124 3.4.9 Hợpchất AM7H:epicoccolidesB .127 3.4.10 Hợpchất AM8D:epicoccolideA 129 3.5.1 Kếtquảthử hoạttínhkhángvi sinhvậtkiểmđịnhcáchợpchất 132 3.5.2.Kếtquảxácđịnhhoạttínhchốngoxihóacủacáchợpchất .136 3.5.3 Hoạt tính gâyđộc tếbàocủacáchợpchấtphân lập 138 KẾTLUẬNVÀ KIẾNNGHỊ 141 KẾTLUẬN 141 KIẾNNGHỊ 143 CÁCCƠNGTRÌNH ĐÃCƠNGBỐLIÊN QUANĐẾNLUẬNÁN 144 DANHMỤCCÁCKÝHIỆUVÀCHỮVIẾTTẮT Kýhiệu Tiếnganh VSVKĐ RYE Diễngiải Visinhvật kiểmđịnh Riceyeastextract medium Môitrườnggạovàdịch chiếtnấmmen ADN Aciddeoxyribonucleic Axitdeoxyribonucleic ITS Internaltranscribedspacer Vùngđượcphiên mã nộibộ ATCC AmericanTypeCulture Bảotànggiốngchuẩn Hoa Collection Kỳ CFU MIC Colonyformingunits Minimuminhibitory concentration Đơnvịhìnhthànhkhuẩn lạc Nồngđộứcchếtối thiểu rDNA RibosomalDNA ANDribosom CC Chromatographycolumn Sắckýcộtthường COSY Correlationspectroscopy Phổtươngtác haichiều đồnghạtnhân DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 13 13C-Nuclearmagnetic Phổcộnghưởngtừhạt nhân resonancespectroscopy carbon13 C-NRM Hep-G2 Humanhepatocellular carcinoma Ungthưgan LU-1 Humanlungadenocarcinoma Ungthưbiểu môphổi Vero Verocell Tếbàobiểu môthậnkhỉ MEME Mininealessentialmediumwith Eagle’ssalts Môitrườngnuôicấytế bào MCF-7 Humanbreastcarcinomacell Tếbàoungthư vúở người FBS Fetalbovineserum Huyếtthanhbị DMEM Dullbecco’s modified MinimumEssentialMedium Mơitrườngnicấytế bào H-NRM HPLC 1H-Nuclearmagnetic Phổcộnghưởngtừhạt nhân resonancespectroscopy proton Highperformanceliquid chromatography HSQC Sắckýlỏngcaoáp Heteronuclearsingle quantum Phổtươngtác haichiềudị coherence hạtnhân MeOH Methanol DMSO Dimethylsulfoxide EtOAc Ethylacetate CS% Cellsurvival Phầntrămsốngsót IC50 Inhibitoryconcentration50% Nồngđộức chế50% TLC Thinlayerchromatography Sắckýlớp mỏng DEPT Distortionless Enhancement byPolarisationTransfer PhổDEPT Spectroscopy HMBC ESI-MS OTU Heteronuclearmultiplebond Phổtươngtác đaliênkết correlation haichiềudịnhân Electronsprayionzation mass Phổkhốilượngphunmù spectroscopy điệntử Operationaltaxonomicunits Đơnvịphânloạiloài Shannon_H’ Diversityindex Chỉsốđa dạngloài Chao-1 Độphong phúcủa lồi Speciesrichness MỤCLỤCBẢNG Bảng1.1Thànhphầnhóahọccủarongsụn[11] Bảng Đường kính vịng kháng khuẩn chủng vi khuẩn vi nấm lựachọn 61 Bảng 2.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng vi khuẩnlựachọn 62 Bảng3.3 Đặc điểmhìnhtháihaichủngnấmlựachọn 64 Bảng Chỉ số đa dạng sinh học số OTU quan sát thơng qua phân tíchmetagenomic 69 Bảng Chỉ số đa dạng sinh học số OTU quan sát thơng qua phân tíchmetagenomic 72 Bảng Hoạt tính đối kháng VSV cặn chiết ethylacetate từ chủng vikhuẩnvàvi nấm 79 Bảng Hoạt tính chống oxy hóa cặn chiết ethylacetate từ chủng vikhuẩnvàvi nấmlựachọn .80 Bảng Hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết ethylacetate từ chủng vi khuẩnvàvinấmlựachọn 82 Bảng3.9 Biến mãhóavàcácmứcthí nghiệm 90 Bảng3.10.Matrậnkếhoạch thựcnghiệm 90 Bảng3.11.Bảng kếtquảphântíchphương saicủamơhình 91 Bảng3.12.Phương trìnhhàmhồi quy .92 Bảng3.13.Giátrịtốiưucủacácyếutốcôngnghệ 93 Bảng3.14.Giátrịdựđốnvàgiátrịthựcnghiệm củahàmmụctiêutạiđiềukiệntốiưu 93 Bảng3.15.Kếtquảtối ưuhóaqtrìnhsửdụngphần mềmdesignexpert7.0 93 Bảng 16 Thông số vật lý liệu hợp chất từ chủng nấmAspergillusmicronesiensis 97 Bảng3.17.Số liệuphổNMRcủaAM8A1vàhợpchấtthamkhảo 100 Bảng3.18.SốliệuphổNMRcủaAM8B1vàhợpchấtthamkhảo 105 Bảng3.19.Số liệuphổNMRcủaAM8B2vàhợpchấtthamkhảo 111 Bảng3.20.SốliệuphổNMRcủaAM3A1 118 Bảng3.21.SốliệuphổNMRcủaAM3Dvàhợpchấtthamkhảo 121 Bảng3.22.SốliệuphổNMRcủaAM4F1vàhợpchấtthamkhảo 123 Bảng3.23.Số liệuphổNMRcủaAM6E1vàhợpchấtthamkhảo 125 Bảng3.24.Số liệuphổNMRcủaAM6E2vàhợpchấtthamkhảo 126 Bảng3.25.SốliệuphổNMRcủaAM7Hvàhợpchấtthamkhảo 129 Bảng3.26.SốliệuphổNMRcủaAM8Dvàhợpchấtthamkhảo 131 Bảng 27 Kết kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất phân lập từchủngAspergillusmicronesiensis .135 Bảng3.28.KếtquảthửhoạttínhchốngoxyhóacủacáchợpchấtphânlậptừchủngAspergil lusmicronesiensis 137 Bảng 29 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập chủngAspergillusmicronesiensis 138 Bảng3.30.KếtquảgiátrịIC 50c ủ a mộtsốhợpchấtcóhoạttínhgâyđộctếbào 139
Ngày đăng: 21/08/2023, 21:30
Xem thêm:
