Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh care trên chó đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus care phân lập được tại một số tỉnh phía bắc việt nam luận án tiến sĩ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN VĂN NÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Lan PGS TS Nguyễn Văn Thanh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Trần Văn Nên i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận án, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS TS Nguyễn Thị Lan PGS TS Nguyễn Văn Thanh tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Bệnh viện thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học thú y phịng thí nghiệm môn bệnh lý giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận án./ Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Trần Văn Nên ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngồi nước 2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care nước 2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Care nước 2.2 Một số thông tin virut Care 2.2.1 Phân loại virus gây bệnh Care 2.2.2 Hình thái virus Care 2.2.3 Cấu trúc virus Care 2.2.4 Sức đề kháng virus Care 2.2.5 Cơ chế sinh bệnh 2.2.6 Đặc tính sinh học virus Care 11 2.2.7 Đặc tính sinh học phân tử virus Care 13 2.3 Một số thông tin bệnh Care 18 iii 2.3.1 Đặc điểm dịch tễ bệnh Care 18 2.3.2 Triệu chứng bệnh tích 20 2.3.3 Chẩn đoán bệnh Care 22 2.3.4 Phòng điều trị bệnh 27 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 31 3.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.2 Thời gian nghiên cứu 31 3.3 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 31 3.4 Nội dung nghiên cứu 33 3.4.1 Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu chó mắc bệnh Care 33 3.4.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng virus Care phân lập 33 3.4.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử chủng virus Care phân lập 34 3.5 Phương pháp nghiên cứu 34 3.5.1 Phương pháp khám lâm sàng 34 3.5.2 Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể 34 3.5.3 Phương pháp làm tiêu vi thể quan sát bệnh tích tiêu 35 3.5.4 Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch 38 3.5.5 Phương pháp xét nghiệm tiêu máu 39 3.5.6 Phương pháp nuôi cấy tế bào 40 3.5.7 Phương pháp phân lập virus Care môi trường tế bào Vero-DST 41 3.5.8 Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) 41 3.5.9 Phương pháp xác định đường biểu biễn nhân lên virus 42 3.5.10 Phương pháp xác định tính kháng nguyên virus Care 42 3.5.11 Phương pháp ELISA 43 3.5.12 Phương pháp RT-PCR PCR 44 3.5.13 Phương pháp giải trình tự gene xử lý liệu giải trình tự gene 46 3.5.14 Xử lý số liệu 49 Phần Kết thảo luận 50 4.1 Kết nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu chó mắc bệnh Care 50 4.1.1 Kết chẩn đốn chó mắc bệnh Care phương pháp RT-PCR 50 4.1.2 Triệu chứng lâm sàng chó mắc bệnh Care 51 iv 4.1.3 Kết nghiên cứu số tiêu lâm sàng giống chó mắc bệnh Care 53 4.1.4 Kết nghiên cứu thay đổi tiêu máu giống chó mắc bệnh Care 56 4.1.5 Biến đổi bệnh lý đại thể chó mắc bệnh Care 61 4.1.6 Biến đổi bệnh tích vi thể chó mắc bệnh Care 64 4.1.7 Kết ứng dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch để xác định phân bố virus Care quan tổ chức chó bệnh 67 4.2 Kết nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng virus Care phân lập 70 4.2.1 Thông tin chủng virus Care phân lập sử dụng nghiên cứu 70 4.2.2 Khả gây bệnh tích tế bào (CPE) chủng virus Care phân lập 70 4.2.3 Hiệu giá chủng virus Care phân lập 73 4.2.4 Nghiên cứu xác định biểu đồ tăng trưởng chủng virus Care phân lập 74 4.2.5 Nghiên cứu tính kháng nguyên chủng virus Care phân lập 79 4.3 Kết nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử chủng virus Care phân lập 84 4.3.1 Kết giải trình tự gene chủng virus nghiên cứu 84 4.3.2 Kết so sánh trình tự nucleotide chủng virus nghiên cứu 85 4.3.3 Kết so sánh trình tự amino acid chủng virus nghiên cứu 90 4.3.4 So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide chủng virus nghiên cứu 98 4.3.5 So sánh mức độ tương đồng trình tự amino acid chủng virus nghiên cứu 99 4.3.6 Kết xây dựng sinh học phân tử 101 Phần Kết luận kiến nghị 106 5.1 Kết luận 106 5.2 Kiến nghị 107 Danh mục cơng trình cơng bố liên quan đến luận án 108 Tài liệu tham khảo 109 Phụ lục 117 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt CDV Canine distemper virus (Virus gây bệnh Care chó) CPE Cytophathogenic Effect (Khả gây bệnh tích tế bào) Canine Parvovirus (Virus Parvo gây bệnh viêm ruột truyền CPV DAB DNA EDTA ELISA FBS FCS LD50 MOI PBS PCR RNA RT-PCR SLAM SLS TCID50 vi Nghĩa tiếng Việt nhiễm chó) 3,3-diaminobenzidine Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic) Ethylene diamine tetra acetic acid (axít etylen diamin tetraaxetic) Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Phương pháp miễn dịch gắn enzyme) Fetal Bovine Serum (Huyết thai bò) Fetal Calf Serum (Huyết thai bê) Lethal Dose fifty percent (Liều gây chết trung bình) Multiplicity Of Infection (Bội số gây nhiễm) Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phosphat) Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) Ribonucleic acid (Axít ribonucleic) Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngược) Signaling lymphocyte activation molecules (Phân tử tín hiệu kích hoạt tế bào lympho) Sample loading solution (Dung dịch pha mẫu) Tissue Culture Infective fifty percent Dose (Liều gây nhiễm 50% môi trường nuôi cấy mô) DANH MỤC BẢNG TT 2.1 Tên bảng Trang Các virus thuộc giống Morbillivirus bệnh chúng gây 2.2 Danh sách loại vắc-xin phòng bệnh Care lưu hành Việt Nam 29 3.1 Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR giải trình tự gene P H 33 3.2 Chó mắc bệnh Care theo giống chó khác 31 3.3 Chó mắc bệnh Care theo địa phương nghiên cứu khác 32 3.4 Các chủng tham chiếu sử dụng để xây dựng sinh học phân tử 48 4.1 Kết chẩn đoán phương pháp RT-PCR PCR 50 4.2 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu chó mắc bệnh Care 51 4.3 Các tiêu lâm sàng giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care 53 4.4 Các tiêu lâm sàng giống chó H’Mơng Cộc mắc bệnh Care 54 4.5 Các tiêu lâm sàng giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care 54 4.6 Các tiêu lâm sàng giống chó lai Becgie mắc bệnh Care 54 4.7 Các tiêu lâm sàng giống chó Fox mắc bệnh Care 54 4.8 Các tiêu lâm sàng giống chó Rottweiler mắc bệnh Care 54 4.9 Một số tiêu máu giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care 56 4.10 Một số tiêu máu giống chó H’Mơng Cộc mắc bệnh Care 56 4.11 Một số tiêu máu giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care 57 4.12 Một số tiêu máu giống chó lai Becgie mắc bệnh Care 57 4.13 Một số tiêu máu giống chó Fox mắc bệnh Care 58 4.14 Một số tiêu máu giống chó Rottweiler mắc bệnh Care 58 4.15 Các tổn thương đại thể chó mắc Care 61 4.16 Biến đổi vi thể số quan chó mắc bệnh Care 64 4.17 Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch 68 4.18 Thông tin chủng virus Care sử dụng nghiên cứu 70 4.19 Kết nghiên cứu khả gây bệnh tích tế bào chủng virus Care chủng virus vắc-xin Onderstepoort 71 4.20 Hiệu giá chủng virus Care sử dụng nghiên cứu 73 4.21 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể chó thí nghiệm trước tiêm vắc-xin Care vô hoạt 80 vii 4.22 Các triệu chứng lâm sàng chó thí nghiệm sau công cường độc 83 4.23 Kết phân lập virus CDV lơ chó thí nghiệm 84 4.24 Các vị trí sai khác nucleotide gene P chủng virus nghiên cứu với chủng virus vắc-xin 88 4.25 Các vị trí sai khác nucleotide gene H chủng virus nghiên cứu với chủng virus vắc-xin 88 4.26 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene H chủng virus Care nghiên cứu chủng virus vắc-xin 97 4.27 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene P chủng virus Care nghiên cứu chủng virus vắc-xin 97 4.28 Sự tương đồng trình tự nucleotide gene H chủng virus Care nghiên cứu với mẫu virus vắc-xin Ond-VX (%) 99 4.29 Sự tương đồng trình tự nucleotide gene P chủng virus Care nghiên cứu với mẫu virus vắc-xin Ond-VX (%) 99 4.30 Sự tương đồng amino acid mã hóa từ gene H chủng virus Care nghiên cứu với chủng virus vắc-xin (%) 100 4.31 Sự tương đồng amino acid mã hóa từ gene P chủng virus Care nghiên cứu với chủng virus vắc-xin (%) 101 viii ... mắc bệnh Care Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng virus Care phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử chủng virus Care phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam Các chó. .. điểm bệnh lý chủ yếu chó mắc bệnh Care Xác định đặc điểm sinh học sinh học phân tử virus Care phân lập chó số tỉnh phía Bắc Việt Nam Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu chó. .. H chủng virus Care nghiên cứu 103 x TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Trần Văn Nên Tên Luận án: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu bệnh Care chó, đặc điểm sinh học sinh học phân tử virus