Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)

Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TRẦN VĂN NÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC

TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

HÀ NỘI – 2017

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Trần Văn Nên

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC

TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

Mã số: 62.64.01.02

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS NGUYỄN THỊ LAN PGS TS NGUYỄN VĂN THANH

HÀ NỘI, NĂM 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày… tháng… năm…

Tác giả luận án

Trần Văn Nên

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS TS Nguyễn Thị Lan và PGS TS Nguyễn Văn Thanh đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Bệnh lý thú y, Bệnh viện thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý

đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./

Hà Nội, ngày tháng năm 20

Tác giả luận án

Trần Văn Nên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN xi

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 2

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI 3

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 3

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 4

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước 4

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nước 5

2.2 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUT CARE 7

2.2.1 Phân loại virus gây bệnh Care 7

2.2.2 Hình thái của virus Care 8

2.2.3 Cấu trúc của virus Care 8

2.2.4 Sức đề kháng của virus Care 9

2.2.5 Cơ chế sinh bệnh 9

2.2.6 Đặc tính sinh học của virus Care 11

2.2.7 Đặc tính sinh học phân tử của virus Care 13

2.3 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE 18

2.3.1 Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care 18

2.3.2 Triệu chứng bệnh tích 20

2.3.3 Chẩn đoán bệnh Care 22

2.3.4 Phòng và điều trị bệnh 27

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 31

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 31

3.3 ĐỐI TƯỢNG VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 33

3.4.1 Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care 33

3.4.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của những chủng virus Care phân lập được 33

3.4.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của những chủng virus Care phân lập được 34

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

3.5.1 Phương pháp khám lâm sàng 34

3.5.2 Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể 34

3.5.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản 35

3.5.4 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch 38

3.5.5 Phương pháp xét nghiệm các chỉ tiêu máu 39

3.5.6 Phương pháp nuôi cấy tế bào 39

3.5.7 Phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST 40

3.5.8 Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) 41

3.5.9 Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus 41

3.5.10 Phương pháp xác định tính kháng nguyên của virus Care 41

3.5.11 Phương pháp ELISA 42

3.5.12 Phương pháp RT-PCR và PCR 42

3.5.13 Phương pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene 45

3.5.14 Xử lý số liệu 48

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49

4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE 49

4.1.1 Kết quả chẩn đoán chó mắc bệnh Care bằng phương pháp RT-PCR 49

4.1.2 Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care 50

4.1.3 Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu lâm sàng của các giống chó mắc bệnh Care 52 4.1.4 Kết quả nghiên cứu sự thay đổi về chỉ tiêu máu của các giống chó mắc bệnh Care 55

4.1.5 Biến đổi bệnh lý đại thể của chó mắc bệnh Care 60

4.1.6 Biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care 62

4.1.7 Kết quả ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để xác định sự phân bố virus Care trên các cơ quan tổ chức của chó bệnh 67

4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC 70

4.2.1 Thông tin của những chủng virus Care phân lập được sử dụng trong nghiên cứu 70

4.2.2 Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của những chủng virus Care phân lập được 70

4.2.3 Hiệu giá của những chủng virus Care phân lập được 73

4.2.4 Nghiên cứu xác định biểu đồ tăng trưởng của những chủng virus Care phân lập được 74 4.2.5 Nghiên cứu về tính kháng nguyên của chủng virus Care phân lập được 79

4.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA NHỮNG CHỦNG VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC 84

4.3.1 Kết quả giải trình tự gene của những chủng virus nghiên cứu 84

4.3.2 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng virus nghiên cứu 85

4.3.3 Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng virus nghiên cứu 90

4.3.4 So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa những chủng virus nghiên cứu 98 4.3.5 So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa những chủng virus nghiên cứu 99

4.3.6 Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử 101

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 106

5.1 KẾT LUẬN 106

5.2 KIẾN NGHỊ 107

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO 109

PHỤ LỤC 119

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CDV Canine distemper virus (Virus gây bệnh Care ở chó)

CPE Cytophathogenic Effect (khả năng gây bệnh tích tế bào)

CPV Canine Parvovirus (Virus gây bệnh Parvo ở chó)

RNA Ribonucleic acid (Axít ribonucleic)

DAB 3,3-diaminobenzidine

DNA Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic)

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid (axít etylen diamin

tetraaxetic)ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Phương pháp miễn

dịch gắn enzyme) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò)

FCS Fetal Calf Serum (Huyết thanh thai bê)

MOI Multiplicity Of Infection (Bội số gây nhiễm)

PBS Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phosphat)PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase)

RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng

tổng hợp chuỗi phiên mã ngược) SLS Sample loading solution (Dung dịch pha mẫu)

TCID50 Tissue Culture Infective fifty percent Dose (Liều gây nhiễm

50% trên môi trường nuôi cấy mô)

DANH MỤC BẢNG

2.1 Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra 7

2.2 Danh sách các loại vacxin phòng bệnh Care được lưu hành ở Việt Nam 29

3.1 Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P và H 33

3.2 Chó mắc bệnh Care theo giống chó khác nhau 31

3.3 Chó mắc bệnh Care theo các địa phương nghiên cứu khác nhau 32

3.4 Các chủng tham chiếu sử dụng để xây dựng cây sinh học phân tử 46

4.1 Kết quả chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR và PCR 49

4.2 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care 50

4.3 Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care 52

4.4 Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó H’Mông Cộc mắc bệnh Care 53

4.5 Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care 53

4.6 Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó lai Becgie mắc bệnh Care 53

4.7 Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Fox mắc bệnh Care 53

4.8 Các chỉ tiêu lâm sàng của giống chó Rottweiler mắc bệnh Care 53

4.9 Một số chỉ tiêu máu của giống chó Phú Quốc mắc bệnh Care 55

4.10 Một số chỉ tiêu máu của giống chó H’Mông Cộc mắc bệnh Care 55

4.11 Một số chỉ tiêu máu của giống chó Bắc Hà mắc bệnh Care 56

4.12 Một số chỉ tiêu máu của giống chó lai Becgie mắc bệnh Care 56

4.13 Một số chỉ tiêu máu của giống chó Fox mắc bệnh Care 57

4.14 Một số chỉ tiêu máu của giống chó Rottweiler mắc bệnh Care 57

4.15 Các tổn thương đại thể ở chó mắc Care 60

4.16 Biến đổi vi thể ở một số cơ quan của chó mắc bệnh Care 63

4.17 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch 67

4.18 Thông tin của các chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu 70

4.19 Kết quả nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào của 5 chủng virus Care và chủng virus vacxin Onderstepoort 71

4.20 Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu 73

4.21 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của 6 chó thí nghiệm trước khi tiêm vacxin Care vô hoạt 80

4.22 Các triệu chứng lâm sàng của các chó thí nghiệm sau khi công cường độc 83 4.23 Kết quả phân lập virus CDV ở các lô chó thí nghiệm 84 4.24 Các vị trí sai khác nucleotide của gene P giữa những chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin 87 4.25 Các vị trí sai khác nucleotide của gene H giữa những chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin 88 4.26 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene H giữa các chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin 97 4.27 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene P giữa các chủng virus Care nghiên cứu và chủng virus vacxin 97 4.28 Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene H giữa những chủng virus Care nghiên cứu với mẫu virus vacxin Ond-VX (%) 99 4.29 Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene P giữa những chủng virus Care nghiên cứu với mẫu virus vacxin Ond-VX (%) 99 4.30 Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene H giữa những chủng virus Care nghiên cứu với chủng virus vacxin (%) 100 4.31 Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene P giữa những chủng virus Care nghiên cứu với chủng virus vacxin (%) 101

DANH MỤC HÌNH

2.1 Cấu trúc của virus Care 8

2.2 Cơ chế sinh bệnh của bệnh Care 10

2.3 Bệnh tích tế bào do chủng virus CDV4-H và Onderstepoort gây ra sau 36 và 48 giờ gây nhiễm trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST 12

2.4 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus vacxin Onderstepoort và chủng 007Lm 13

2.5 Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene H của virus Care 16

2.6 Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene P của virus Care 17

2.7 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch trên tiêu bản phổi, hạch lympho, não và dạ dày (IHC 10X) 25

4.1 Chó tiêu chảy, phân màu cà phê 52

4.2 Chó có biểu hiện thần kinh 52

4.3 Chó mắc bệnh Care có các nốt sài ở vùng da mỏng 52

4.4 Chó mắc bệnh Care có gan bàn chân sưng, cứng 52

4.5 Xuất huyết ở phổi 62

4.6 Ruột bị sung huyết 62

4.7 Hạch dưới hàm sưng to 62

4.8 Hạch màng treo ruột sưng to 62

4.9 Viêm phế quản phổi (HE 10X) 66

4.10 Lông nhung ruột đứt nát (HE 10X) 66

4.11 Ruột chó xuất huyết và thoái hóa tế bào ruột (HE 40X) 66

4.12 Nang lympho teo (HE 10X) 66

4.13 Hóa miễn dịch dương tính ở phổi (IHC 10X) 69

4.14 Hóa miễn dịch dương tính tại ruột (IHC 10X) 69

4.15 Hóa miễn dịch dương tính tại phổi (IHC 40X) 69

4.16 Hóa miễn dịch dương tính tại hạch lympho (IHC 10X) 69

4.17 CPE do CDV-VNUA-768 gây ra sau 24 giờ gây nhiễm (10X) 73

4.18 CPE do Onderstepoort (virus vacxin) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X) 73

4.19 CPE do CDV-VNUA-768 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X) 73

4.20 Tế bào Vero-DST bình thường (10X) 73 4.21 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-VNUA-768 và chủng virus vacxin Onderstepoort 77 4.22 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-02H và chủng virus vacxin Onderstepoort 77 4.23 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-03R và chủng virus vacxin Onderstepoort 78 4.24 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-04H và chủng virus vacxin Onderstepoort 78

4.25 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus CDV-HUA-05P và chủng virus

vacxin Onderstepoort 79 4.26 Biến động dương tính huyết thanh học ở chó được tiêm vacxin Care vô hoạt so với

lô đối chứng không tiêm vacxin 80 4.27 So sánh giá trị OD giữa hai lô chó thí nghiệm sau khi công cường độc 82 4.28 So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene H của các chủng virus Care nghiên cứu 94 4.29 So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene P của các chủng virus Care nghiên cứu 96 4.30 Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene P của những chủng virus Care nghiên cứu 102 4.31 Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene H của những chủng virus Care nghiên cứu 103

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Trần Văn Nên

Tên Luận án: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care, đặc điểm

sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Xác định được một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care Xác định được đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một

số tỉnh phía Bắc Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam Các chó mắc bệnh Care và mẫu virus Care phân lập được từ các chó mắc bệnh được thu thập từ 5 tỉnh ở phía Bắc Việt Nam gồm: Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định Bể ổn nhiệt, máy đúc chuyển mẫu tự động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khô tiêu bản, kính hiển vi quang học, máy xét nghiệm huyết học tự động CELL-DYN 3700, tủ ấm nuôi cấy tế bào (5% CO2), kính hiển vi soi nổi, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR, máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000 Formol 10%, parafin, xylen, thuốc nhuộm Hematoxilin – Eosin, dòng tế bào Vero-DST; DMEM, 10% FBS, dung dịch đệm EDTA, kháng sinh; kit tách chiết RNA tổng số, cặp mồi gene H và P, kit phản ứng RT-PCR và PCR, đệm TBE hoặc TAE, agarose, hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR sequence và kit chạy giải trình tự gene Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care bằng các phương pháp thường quy như: phương pháp khám lâm sàng; phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể; phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản; phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch; phương pháp xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý máu Số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phương pháp thống kê phân tích phương sai (ANOVA/One Way) với phương pháp Tukey Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng virus Care phân lập được bằng phương pháp nuôi cấy tế bào Vero-DST, phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST; phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) (Lan et al., 2005a); phương pháp xác định đường

biểu diễn sự nhân lên của virus; phương pháp xác định tính kháng nguyên của virus Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus Care phân lập được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR; phương pháp giải trình tự gene Cây sinh học phân tử thể hiện nguồn gốc phát sinh của các chủng virus nghiên cứu được xây dựng bằng phần mềm MEGA6.0 Sử dụng phương pháp test Maximum likehood với giá trị bootstrap là

1000 đơn vị

Kết quả chính và kết luận

68 chó ở độ tuổi 3-6 tháng mắc bệnh Care thuộc 6 giống khác nhau được thu thập

từ 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam gồm Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang và Nam Định có biểu hiện bệnh lý điển hình của bệnh Triệu chứng lâm sàng: sốt (100,0%), biếng ăn, ủ rũ (100,0%), có dử mắt (100,0%), nôn mửa (97,06%), dử mũi (79,41%), ho (79,41%), tiêu chảy phân màu cà phê (76,47%), sừng hóa gan bàn chân (41,18%), có các nốt sài ở vùng da mỏng (32,35%) và xuất hiện các triệu chứng thần kinh (11,76%) Các chỉ tiêu cận lâm sàng: thân nhiệt (40,230

C – 40,590C), tần số hô hấp (71,83 – 78,94 lần/phút), tần số tim (118,88 – 130,75 lần/phút) tăng so với chó khỏe Xét nghiệm máu

ở chó mắc bệnh Care: số lượng hồng cầu (3,80 – 4,26 x 106/µl), hàm lượng huyết sắc tố (110,81 – 123,81 g/l), tỷ khối hồng cầu (32,59% - 34,18%), thể tích trung bình hồng cầu (46,20 – 47,74 fl), lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (17,88 – 18,65 pg), số lượng bạch cầu (4,67 – 4,87 x 103/ml) Công thức bạch cầu có sự thay đổi, trong đó tỷ lệ bạch cầu đa nhân trung tính (62,65% - 63,29%) tăng so với chó khỏe Bệnh tích ở phổi: phổi xuất huyết (85,29%), viêm phổi thùy (79,41%), viêm phế quản phổi (79,41%) Bệnh tích

ở ruột: ruột viêm, xuất huyết (91,18%) và sung huyết ở ruột non (88,24%) Hạch lympho vùng đầu, cổ, dưới hàm, màng treo ruột sưng to, rìa tù, xuất huyết (100%) Bệnh tích vi thể ở phổi, ruột, hạch lympho là sung huyết, xuất huyết, hoại tử tế bào, thoái hóa tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch chỉ ra virus tập trung nhiều tại phổi, ruột và hạch lympho

Một số đặc tính sinh học của 5 chủng virus Care phân lập được từ chó mắc bệnh Care là virus phân lập được thích ứng tốt trên môi trường tế bào Vero-DST Virus phá hủy tế bào Vero-DST từ 24 giờ đến 48 giờ sau khi gây nhiễm và phá hủy hoàn toàn tế bào sau 60 giờ đến 72 giờ Hiệu giá virus biến động cao từ 3,16 x 104

tới 6,25 x 105(TCID50/25µl) Ở các thời điểm thu hoạch virus khác nhau thì lượng virus tập trung trong tế bào luôn cao hơn so với lượng virus ở ngoài tế bào Chủng virus Care CDV-VNUA-768 phân lập được, dùng sản xuất vacxin Care vô hoạt có tính kháng nguyên cao, khi tiêm chó thí nghiệm có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tốt, bảo hộ được chó trước sự tấn công của virus công cường độc Có thể sử dụng chủng virus này nghiên cứu vacxin phòng bệnh

Đặc tính sinh học phân tử của 5 chủng virus Care phân lập được dựa trên kết quả giải trình tự gene H và P Đoạn gene H và P có độ dài lần lượt là 1824 bp và 402 bp Mức độ tương đồng về nucleotide ở gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu đạt tỷ lệ lần lượt là 90,05%-99,61% và 94,81%-99,75% Mức độ tương đồng về nucleotide về nucleotide ở gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin đạt tỷ lệ lần lượt là 89,99%-99,34% và 94,81%-99,50% Mức độ tương đồng về amino acid mã hóa từ gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu đạt tỷ lệ lần lượt là 89,38%-99,5% và 92,47%-100,0% Mức độ tương đồng về amino acid mã hóa từ gene H và gene P giữa 5 chủng virus nghiên cứu với chủng virus vacxin đạt tỷ lệ lần lượt là 89,39%-99,17% và 92,47%-100,0% 5 chủng virus Care phân lập được nằm trong 3 nhánh phát sinh khác nhau thuộc 3 genotype lần lượt là Asia 1, Asia 2 và Classic

THESIS ABSTRACT

Author: Tran Van Nen

Thesis Title: Study on mainly pathological characteristics of dogs infected with Canine

Distemper virus, biological and molecular characteristics of the Canine Distemper virus

isolated in some Northern provinces in Vietnam

Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 62.64.01.02

Training Institution: Vietnam National University of Agriculture

Research purposes

To identify some mainly pathological features of dogs infected with Canine

Distemper virus (CDV) To determine biological and molecular characteristics of the

CDV isolated in some Northern provinces in Vietnam

Research Methods

This study was conducted to identify some mainly pathological features of CDV infection in dogs Biological characteristics of the CDV strains isolated in some northern provinces in Vietnam were investigated Molecular biological characteristics

of the CDV strains isolated in some northern provinces in Vietnam were investigated Dogs infected with CDV and samples of CDV isolated from infected dogs were collected from 5 northern provinces in Vietnam include Hanoi, Hung Yen, Thai Binh, Bac Giang, and Nam Dinh To realize this study, the following materials were used: waterbath, automatic paraffin dispenser embedding, automatic microtome, slide dryer, microscopes, CELL-DYN 3700 automatic hematology analyzer, cell-culture incubator (5% CO2), stereoscopic microscopes, centrifuges, PCR machines, Beckman Coulter Formol 8000 automatic sequencing machine, 10% formalin, paraffin, xylene, Haematoxylin - Eosin dyes, Vero-DST cell line; DMEM, 10% FBS, EDTA buffer, antibiotics; total RNA extraction Kit, primers of H and P gene, RT-PCR and PCR Kit, TBE or TAE buffer, agarose, chemical for purification and Kit for sequencing of PCR products Main pathological features of dogs infected with CDV were studied using routine methods: clinical examination; post-mortem necropsy, macroscopic lesions observation; prepare microscopic slides and examination of microscopic lesions; immunohistochemistry staining; assays of physiological indicators of blood Data was analyzed using statistical analysis of variance (ANOVA/One Way), and Tukey method Research on biological characteristics of the CDV strains isolated was carried out using Vero-DST cell culture, CDV isolation methods on Vero-DST cell environment; virus titration (TCID50 / ml) (Lan et al., 2005a); determination the viral replication Molecular

biological characteristics of the CDV strains isolated were demonstrated by RT-PCR and sequencing methods Phylogenetic tree illustrating the origin of viral strains was established by MEGA6.0 software and Maximum likehood test with the bootstrap value

of 1000 units

Main results and conclusion

Determination of some mainly pathological features of 68 dogs of 3 – 6 months old, from 6 different breeds collected from 5 northern provinces in Vietnam include Hanoi, Hung Yen, Thai Binh, Bac Giang, and Nam Dinh Dogs infected with CDV has mainly clinical symptoms such as fever (100.0%), anorexia, depression (100.0%), rheum (100.0%), vomiting (97.06%), scratchy nose (79.41%), coughing (79.41%), diarrhea with stool of coffee color (76.47%), keratosis in sole of the feet (41.18%), pitches in the thin skin (32.35%) and neurological sign (11.76%) The subclinical indicators of infected dogs such as body temperature (40.23°C – 40.59°C), respiratory rate (71.83 – 78.94 times/minute), heart frequency (118.88 – 130.75 beat/minute) Hematological test revealed that infected dogs have RBC (3.80 – 4.26 x 106/µl), Hb (110.81 – 123.81 g/l), HCT (32.59% - 34.18%), MCV (46,20 – 47,74 fl), MCH (17,88 – 18,65 pg), WBC (4,67 – 4,87 x 103/ml) White blood cell formula has been changed, in which neutrophil rate (62.65% - 63.29%) increases in infected dogs Mainly gross lesions were found in lung, include pulmonary hemorrhage (85.29%), lobular pneumonia (79.41%), bronchopneumonia (79.41%) Gross lesions in digestive tracts were hemorrhage (91.18%) and small intestinal congestion (88.24%) Lymph notes are swelling, hemorrhagic (100%) in heard, under the jaw, and mesentery Mainly micro-lesions found in lung, intestine, and lymph notes of infected dogs were congestion, hemorrhage, necrosis, cell degeneration and infiltration Results of immunohistochemistry staining indicated lung, intestines, organs and lymph nodes are infiltrated with much CDV

Results of the study on biological characteristics of the 5 strains CDV isolated showed that they had the following features: viruses start destroying cells from 24 hours

to 48 hours after inoculation and completely destroyed cells after 60 hours to 72 hours; high titer (3.16 x 104 to 6.25 x 105 TCID50 / 25μl) and adapt well in Vero- DST cell culture; Virus concentration in the cell is always higher than the levels of the virus outside the cell in different collection time CDV-VNUA-768 strain isolated was used for attenuated vaccine production with high antigenicity Experiment in dogs yields a good immune response, protects dogs from experimental virus infection It is recommended to use this strain for further research on vaccine

The results of the study on the molecular characteristics of the 5 isolated strains

of CDV showed that they had the following features: nucleotide sequence of H and P gene was sequenced in length 1824 bp and 402 bp, respectively The nucleotide similarity in the gene H and gene P of 5 studied strains were at a high rate of 90.05% - 99.61% and 94.81% - 99.75%, respectively The nucleotide similarity in the gene H and gene P of 5 strains compared to the vaccine strain were 89.99% - 99.34% and 94.81% - 99.50%, respectively The degree of amino acid similarity of the gene H and gene P was

a high rate of 89.38% - 99.5% and 92.47% -100.0%, respectively The degree of amino acid similarity of the gene H and gene P 89.39% - 99.17% and 92.47% -100.0%, respectively Five studied CDV strains were in 3 different branches belonging to 3 genotypes: Asia 1, 2 and Classic, respectively

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh Care hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm thường xảy ra ở chó con, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao Bệnh Care được biết tới là căn bệnh nguy hiểm nhất trên chó trong nửa đầu thế kỷ 19 Bệnh Care được báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel and Gillespie, 1972) Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã được mô tả lần đầu tiên vào năm 1809 bởi Edward Jenner (Appel and Gillespie, 1972; Shell, 1990)

và virus Care đã được phân lập vào năm 1905 Bệnh Care xảy ra rộng rãi trên toàn thế giới, xảy ra ở một số nước như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi

và nhiều nước ở châu Âu, gần đây nhất là ở các nước châu Á như Nhật Bản (Lan

et al., 2006a), Thái Lan (Keawcharoen et al., 2005), Hàn Quốc (An et al., 2008)

và Ấn Độ (Latha et al., 2007)

Nguyên nhân gây bệnh Care trên chó là do virus Care (Canine distemper

virus - CDV) CDV là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc họ

Paramixoviridae Các thành viên khác của giống Morbillivirus như virus gây

bệnh sởi trên người (Measles virus - MV), virus dịch tả trâu bò (Rinderpest virus

- RPV), virus gây bệnh trên động vật nhai lại nhỏ (Peste des petits ruminants virus - PPRV), virus gây bệnh trên động vật có vú dưới nước (cá heo, hải cẩu)

(Murphy et al., 1999) Virus Care cũng gây bệnh trên động vật hoang dã ăn thịt

và hổ (Appel et al., 1994; Frölich et al., 2000; Martella et al., 2002) Virus Care

có cấu tạo gồm một sợi RNA đơn không phân đoạn gồm khoảng 15.690 nucleotide Trong cấu trúc bộ gene gồm 6 gene mã hóa cho các protein như protein tạo lớp vỏ bọc (M), hai glycoprotein (yếu tố kết dính (H), yếu tố kết hợp virus với thụ thể trên màng tế bào (F)), hai protein có liên quan tới sự sao chép RNA (phosphoprotein – P và large protein – L) và nucleocapsid N đóng gói

RNA của virus (Sidhu et al., 1993) Dựa trên trình tự của protein Haemagglutinin (H), Harder and Osterhaus, (1997) và Martella et al., (2006) đã phân loại virus

Care thành 7 nhóm chính theo ví trí địa lý gồm: Arctic – like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife

CDV là virus gây nhiễm hướng lympho, niêm mạc và mô thần kinh Trước đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân lập CDV trên các môi trường như

dòng tế bào biểu mô và nguyên bào sợi, tế bào lympho của chó (Appel et al.,

1992), đại thực bào phế nang của chó (Appel, 1978), đại thực bào màng bụng

chồn sương (Poste, 1971), xơ phôi gà (Ezeibe, 2005) Tuy nhiên việc phân lập và xác định hiệu giá virus Care rất khó khăn do không có dòng tế bào nào thích hợp

để virus sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào Qua nghiên cứu của Seki et al (2003) và Lan et al (2005a) đã chỉ ra Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể

sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus

Ở Việt Nam, bệnh Care được phát hiện từ năm 1920 Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ chết 50-80%, có thể lên đến 100% nếu không được điều trị kịp thời (Hồ Đình Chúc, 1993) Cho đến nay, bệnh Care xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn cho đàn chó nuôi trong nước do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006) Nhưng các nghiên cứu về bệnh lý, đặc tính sinh học và di truyền của virus Care ở trong nước còn rất khiêm tốn, bên cạnh đó hiệu quả bảo hộ của các vacxin phòng bệnh Care đang lưu hành hiện nay chưa cao cũng như chưa có nhiều báo cáo cụ thể Xuất phát từ thực tiễn đó, trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc Care, đồng thời nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập tại Việt Nam Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa rất quan trọng cung cấp dữ liệu khoa học hỗ trợ việc chẩn đoán bệnh dựa vào đặc điểm bệnh lý đặc trưng của bệnh và lựa chọn được nguồn mẫu bệnh phẩm phục vụ cho việc chọn chủng virus chế vacxin phòng bệnh hiệu quả, chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng trong chẩn đoán góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh Care gây ra cho đàn chó nuôi ở trong nước

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Xác định được một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care cũng như đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc chẩn đoán phát hiện bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng Bên cạnh đó, thông tin về các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các virus Care giúp cho việc sàng lọc và lựa chọn được chủng virus có tiềm năng trong sản xuất vacxin và các chế phẩm sinh học phục vụ công tác chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh Care

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tượng nghiên cứu là chó mắc bệnh Care, mẫu virus Care phân lập được từ các chó mắc bệnh Care

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2014 tới tháng 12/2016

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Bệnh viện thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

+ Bộ môn bệnh lý thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam + Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đây là công trình nghiên cứu hoàn chỉnh và có hệ thống về đặc điểm bệnh

lý bệnh Care ở chó và đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus phân lập được từ 6 giống chó (3-6 tháng tuổi) mắc bệnh Care thu thập từ 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam: Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu về bệnh Care ở chó trong các trường, viện nghiên cứu chuyên ngành thú y Đây cũng là tư liệu khoa học quý báu và cần thiết cho những người làm công tác thú y cơ sở về bệnh Care Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống virus Care phân lập được có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ chủng giống gốc, phục vụ cho các bước đăng ký chủng giống với ngân hàng bảo tồn nguồn gene quốc gia

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus Care đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam 5 chủng virus phân lập được có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất vacxin hoặc chế tạo kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin trong nước từ chính các chủng virus đang lưu hành tại thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện từ năm 1920 Nghiên cứu của Hồ Đình Chúc (1993) đã chỉ ra thời kỳ ủ bệnh Care thường là 3 - 6 ngày (dài nhất là 17 -

21 ngày) và có thể kéo dài trong khoảng thời gian trên dưới 1 tháng Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ chết 50 - 80%, thậm chí lên đến 100% nếu không điều trị kịp thời

Cho đến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006) Tất cả các loài chó đều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm ở là loài chó lai, chó cảnh, chó nội ít mẫn cảm hơn (Tô Du và Xuân Giao, 2006)

Nghiên cứu của Lan et al (2008) đã phân lập được chủng virus gây bệnh

trên chó mắc bệnh tại Việt Nam Virus Care được phân lập trên dòng tế bào Vero-DST, sau đó được kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR Chủng virus CDV-HN1 có hiệu giá virus đạt 3,16 x 105 TCID50/25 l Kết quả nghiên cứu đã cho thấy đàn chó ở Hà Nội đã lây nhiễm với virus Care

Trong nghiên cứu của Lan et al (2009a), hai chủng virus Care là Vn86 và

Vn99 đã được phân lập từ chó 4 tháng tuổi có đặc điểm là viêm não không mưng

mủ, viêm phổi, suy giảm tế bào lympho và viêm dạ dày ruột Kết quả phân tích sinh học phân tử đã chỉ ra 2 chủng phân lập được này đều thuộc nhóm cổ điển (Classic type), khác xa với nhóm Asia 1 và Asia 2

Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam (2012) đã chỉ ra đặc điểm bệnh lý của chó Phú Quốc mắc bệnh Care và ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để chẩn đoán bệnh Các dấu hiệu lâm sàng đầu tiên khi mắc bệnh Care là sốt cao, biếng ăn hoặc không ăn, nôn mửa đối với chó con, ho ở chó trưởng thành, có nốt sài tại vùng da mỏng ở vùng bụng, tiêu chảy và có triệu chứng thần kinh như đi vòng tròn Bệnh tích đại thể tập trung chủ yếu ở phổi và ruột Mặt cắt phổi có nhiều dịch chảy ra; ruột có hiện tượng sung huyết, xuất huyết; đại não bị sung huyết Các dấu hiệu bệnh tích khác là: lách sưng, mặt cắt lồi, hạch lympho sưng, gan thoái hóa, túi mật sưng to Các bệnh tích vi thể gồm có xuất hiện nhiều hồng cầu trong lòng phế nang, vách phế nang đứt nát, thoái hóa tế bào nhu mô, lông nhung ruột bị đứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm ở não

Nguyễn Thị Lan và cs (2015) đã nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của

chó được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus Care (CDV-768) Kết quả gây nhiễm chủng virus Care (CDV-768) cho 3 chó lai Becgie 2 tháng tuổi với liều

106 TCID50/25l qua đường mắt, khí dung và miệng cho thấy chó có triệu chứng

ủ rũ, mệt mỏi, bỏ ăn, sốt, nôn mửa, tiêu chảy, ỉa ra máu, có nốt sài trên da, sừng hóa gan bàn chân Các bệnh tích đại thể chủ yếu ở phổi (mặt cắt phổi có dịch, phổi nhục hóa), ruột có hiện tượng sung huyết, xuất huyết, đại não bị sung huyết, hạch lympho sưng, gan thoái hóa, túi mật sưng to Các bệnh tích vi thể như xuất hiện nhiều hồng cầu trong lòng phế nang, vách phế nang đứt nát, thoái hóa tế bào nhu mô, lông nhung ruột bị đứt nát, thâm nhiễm tế bào viêm ở não Virus tập trung chủ yếu ở các cơ quan như phổi, hạch lympho, ruột Các kết quả thí nghiệm cho thấy chủng virus Care (CDV-768) có độc lực và có khả năng gây bệnh cho chó

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nước

Bệnh Care hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm thường xảy ra ở chó non, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao Đây là một căn bệnh nguy hiểm nhất trên chó trong nửa đầu thế kỷ XIX Tỷ lệ mắc bệnh lớn nhất

ở chó con 3 - 6 tháng tuổi, khi miễn dịch chủ động từ mẹ truyền sang đã giảm thì

tỷ lệ mắc bệnh từ 25% tới trên 30% và tỷ lệ chết ở chó mắc bệnh thường cao từ 50% -90% Chó mắc bệnh này thấy tổn thương lớn ở hệ tiêu hoá đặc biệt ở dạ dày

và ruột, hệ thần kinh trung ương và hệ hô hấp (Woma and Van Vuuren, 2009) Bệnh Care được báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel and Gillespie, 1972) Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã được mô tả

từ năm 1809 bởi EdwardJenner (Shell, 1990) Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp Henri Carré đã phân lập được mầm bệnh từ nước mũi của chó bị bệnh

Năm 1923, Putoni lần đầu tiên sản xuất được vacxin nhược độc, tuy nhiên chủng virus vacxin vẫn còn độc lực Từ năm 1948 tới nay, với sự phát triển mạnh mẽ của các nghiên cứu về virus Care nhiều vacxin phòng bệnh hiệu quả đã ra đời

Hiện nay bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra trên đàn chó nuôi mà còn ở xuất hiện ở nhiều loài động vật hoang dã Chó mắc bệnh Care thể cận lâm sàng trở thành mối đe dọa nghiêm trọng cho việc bảo tồn nhiều loài thú

ăn thịt và thú có túi Qua thống kê các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care là một trong các bệnh quan trọng làm tuyệt chủng chồn chân đen, hổ Tasmania và gây chết theo chu kỳ ở chó hoang dã châu Phi (Assessment, 2005) Năm 1991, bệnh Care gây chết 20% tổng đàn trên đàn sư tử Serengeti ở Tanzania (Woma and Van

Vuuren, 2009) Đặc biệt virus Care cũng có khả năng gây bệnh cho một số động

vật biển (Kennedy et al., 1989) Ở loài cáo tai to lần đầu tiên được báo cáo mắc bệnh Care cùng với cầu trùng (Woo et al., 2010)

McCullough et al (1974) đã nghiên cứu về ảnh hưởng của chủng virus

R252 đối với hệ thống hạch lympho trên 34 chó thí nghiệm 21 chó được gây nhiễm ngoài đường tiêu hóa, 6 chó được gây nhiễm bằng cách tiếp xúc trực tiếp

và 7 chó được nuôi làm lô đối chứng Số lượng tế bào lympho của các chó được gây nhiễm với chủng virus Care R252 là giảm sau 7 tuần gây nhiễm Số lượng tế bào lympho sai khác so với sinh lý bình thường ở 7 chó ốm và có biểu hiện triệu chứng thần kinh sau 7 tới 27 ngày gây nhiễm (nhóm I) Mười chín chó theo dõi ở thời điểm 12 tuần sau khi gây nhiễm có số lượng tế bào lympho bình thường sau

8 tuần gây nhiễm 5 chó (nhóm II) bị tổn thương ở hệ thần kinh trung ương trong khi 14 chó (nhóm III) không có tổn thương ở hệ thần kinh Tuyến ức của các chó

ở nhóm I bị teo và hạch lympho có sự suy giảm tế bào lympho Bên cạnh đó, số lượng các tiểu thể Hassall trong các thùy tuyến ức giảm ở nhóm I Nucleoprotein của virus được tìm thấy trong tuyến ức và tế bào lympho bằng kính hiển vi điện

tử Không có tổn thương ở hạch lympho ở chó nhóm II Một vài tuyến ức của chó nhóm II có hiện tượng sưng to hơn so với nhóm đối chứng và có sự gia tăng số lượng tiểu thể Hassall trong thùy tuyến ức Tuyến ức của chó nhóm III xuất hiện vùng mầm trung tâm

Miry et al (1983) đã kiểm tra sự có mặt của virus Care trên 42 ca chó bị

viêm phổi Bệnh tích vi thể do virus Care gây ra đã được chứng minh bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch Kỹ thuật này có độ nhạy cao trong việc phát hiện virus Care trong các mẫu phổi Các chó mắc bệnh Care cũng mắc Canine adenovirus

và Bordetella bronchiseptica

Kubo et al (2007) đã nghiên cứu về sự phân bố của các thể bao hàm trên

các cơ quan khác nhau của 100 chó được chẩn đoán dương tính với bệnh Care Thể bao hàm được tìm thấy ở các cơ quan như: phổi (70 chó), não (20 chó), bàng quang (73 chó), dạ dày (78 chó), lách (77 chó), và hạch lympho (81 chó) Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra hạch amidan là cơ quan phù hợp nhất để phát hiện thể bao hàm ở bệnh Care

Del Puerto et al (2010) đã nghiên cứu cơ chế apoptosis của tế bào lympho và

não bằng cách đánh giá hàm lượng mRNA trong máu ngoại vi, hạch lympho và não của chó mắc bệnh Care và chó khỏe mạnh bằng phương pháp rRT-PCR Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra cơ chế apoptosis tế bào của virus Care ở não và hạch lympho của chó mắc bệnh Care là theo các cách thức khác nhau

Tan et al (2011) đã phân lập một chủng virus Care mới (ZJ7) từ mẫu phổi

của chó mắc bệnh Care trên môi trường nuôi cấy tế bào thận chó (Madin–Darby canine kidney – MDCK) Chủng virus ZJ7 có khả năng gây bệnh tích hợp bào trên tế bào MDCK sau 6 lần cấy truyền trên môi trường nuôi cấy Nhằm đánh giá độc lực của chủng ZJ7, 3 chó có huyết thanh âm tính với Care được gây nhiễm với chủng virus trên qua nhỏ mũi Tất cả chó được gây nhiễm đều biểu hiện triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy ra máu, viêm kết mạc, tiết nhiều dịch mắt, dịch mũi, ho, sốt và giảm cân tại thời điểm 21 ngày sau khi gây nhiễm; trong khi chó đối chứng khỏe mạnh Kết quả nghiên cứu đã chứng minh chủng virus ZJ7 được phân lập trên tế bào MDCK là có độc lực và không có sự thay đổi về trình tự nucleotide và amino acid so với chủng virus ban đầu thu được từ mẫu bệnh phẩm Kết quả phân tích về sinh học phân tử ở đoạn gene nucleocapsid (N), phosphoprotein (P) và heamagglutinin (H) của chủng virus ZJ7 phân lập được thuộc genotpye Asia 1, genotype này hiện đang lưu hành tại Trung Quốc

2.2 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS CARE

2.2.1 Phân loại virus gây bệnh Care

Morbillivirus là một virus tương đối lớn (đường kính 150 – 250nm) với cấu

trúc xoắn ốc, chúng có một lớp vỏ lipoprotein (Kennedy et al., 1989)

Bảng 2.1 Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra

Rinderpest virus (RPV) Dịch tả trâu bò Ngựa, dê, cừu, lợn Peste des petits ruminants virus (PPRV) Bệnh trên động

vật nhai lại nhỏ

Ghi chú: DMV và PMV gần đây được xếp vào nhóm virus Morbillivirus trên động vật biển có vú

(cetacean morbillivirus – CMV)

Nguồn: Greene et al (1998)

Mặc dù có những sự khác biệt nhỏ về kháng nguyên giữa các chủng CDV khác nhau nhưng nó thường được chấp nhận là chỉ có một serotype Tuy nhiên,

có sự khác biệt đáng kể trong khả năng gây bệnh của các chủng virus phân lập và các type ở các khu vực địa lý khác nhau đã được nói tới Các type của CDV bao gồm: Asia 1 (Nhật Bản, Trung Quốc), Asia 2 (chỉ có ở Nhật Bản), Bắc Cực, động

vật hoang dã châu Âu, USA 1 và 2, CDV cổ điển (Onderstepoort, Convac,

Rockborne và Snyder Hill) (Haas et al., 1997; Haas et al., 1999) Bên cạnh đó, dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gene mã hóa cho protein H (Lan et al., 2005c;

2006a) đã chia ra thành 5 type virus lớn được phân lập từ những vùng địa lý khác nhau: type Châu Âu, cổ điển (Classic type), Asia 1, Asia 2 và USA

2.2.2 Hình thái của virus Care

Hình thái virus quan sát được dưới kính hiển vi điện tử có hình vòng tròn, hình bán nguyệt do các sợi cuộn quanh tròn mà thành Dạng tròn này có đường kính đo được 115nm đến 230nm Màng cuộn kép có độ dày 75 đến 85Ao với bề

mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy et al., 1989)

2.2.3 Cấu trúc của virus Care

Virus Care không phân đoạn, sợi âm tính, sợi đơn, với bộ gene RNA ước chừng khoảng 15,7 Kb và có vỏ bọc với đường kính có kích thước từ 150 tới 300

nm (Murphy et al., 1999) Virus Care gồm 1 protein không cấu trúc (C) và 6

protein cấu trúc gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo, 1990)

Hình 2.1 Cấu trúc của virus Care

Nguồn: Greene et al (1998)

2.2.4 Sức đề kháng của virus Care

Virus Care là một virus không ổn định và nhạy cảm với nhiệt độ, tia UV,

dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và chất ôxy hóa (Gröne et al., 1998) mặc dù

nó có vỏ bọc protein chống lại sự vô hoạt của các tác nhân bên ngoài

Năm 1954, Celiker và Gillespie đã nuôi cấy virus sài sốt chó trên môi trường phôi trứng để nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến tính cảm nhiễm của virus Kết quả cho thấy virus Care cực kỳ mẫn cảm với sức nóng Virus bị phá hủy ở 500C trong 30 phút nhưng virus có thể tồn tại trong 48 giờ ở 250C và

14 ngày ở 50C (Shen and Gorham, 1980) Ở điều kiện (0-40C), virus có thể tồn tại trong điều kiện môi trường trong vòng một tuần Trong mô cô lập nó tồn tại được ít nhất một giờ ở 370C và 3 giờ ở 200

C (nhiệt độ phòng) Thời tiết ấm áp virus không thể tồn tại lâu trong chuồng nuôi chó sau khi chó bị bệnh được chuyển đi

Thời gian sống và duy trì độc lực của virus sẽ lớn hơn trong điều kiện nhiệt

độ lạnh Ở nhiệt độ dưới 00C, nó có thể tồn tại trong môi trường vài ngày nếu được bảo vệ bởi các vật liệu hữu cơ Dưới nhiệt độ đóng băng virus được ổn định Virus tồn tại được ở nhiệt độ -650C ít nhất là 7 năm Việc bảo quản virus

ở dạng đông khô có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo quản giống virus, sản xuất

vacxin và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm (Greene et al., 2006)

Độ pH: virus ổn định ở pH = 4,5 – 9 Virus bị ảnh hưởng với pH trên 10,4

hoặc dưới 4,4 (Greene et al., 2006)

Vỏ bọc của virus rất mẫn cảm với ete, clorofor, fomalin loãng (<0.5%), phenol (75%), dung dịch amoni Do vậy, khi dùng những chất này để tiêu độc

chuồng và bệnh viện mang lại hiệu quả cao (Greene et al., 2006)

hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương cũng như dây thần kinh thị giác Do sự suy yếu của hệ bạch huyết, hệ thống phòng vệ quan trọng của cơ thể đã làm suy giảm miễn dịch và tạo điều kiện cho các vi khuẩn như:

Staphylococcus, Bronchisepticum, Salmonella, gây bệnh Ít ngày sau, cơn sốt thứ

2 xuất hiện, biểu hiện trầm trọng hơn do các nhiễm trùng nặng trong phủ tạng

Hình 2.2 Cơ chế sinh bệnh của bệnh Care

Nguồn: Greene et al (2006)

2.2.6 Đặc tính sinh học của virus Care

Trước đây, việc phân lập và xác định hiệu giá của virus Care rất khó khăn do không tìm được dòng tế bào thích hợp để virus sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào

Seki et al (2003) đã nghiên cứu và chứng minh được dòng tế bào Vero biểu hiện

SLAM rất phù hợp trong việc phân lập virus Care từ mẫu bệnh phẩm

Lan et al (2005a; 2005b) đã nghiên cứu đặc tính sinh trưởng của một số

chủng virus Care trên dòng tế bào Vero (có gắn receptor tương ứng với virus

Care) (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST) Nghiên cứu của Seki et al (2003) đã

làm rõ những đặc tính sinh trưởng khác nhau khi gây nhiễm các virus Care lên tế bào Vero và tế bào Vero-DST Qua đó, có thể nhận thấy, Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus

Nghiên cứu của Lan et al (2006b) đã tiến hành phân lập 3 chủng virus

007Lm, S124C, Ac96I và chủng virus vacxin Onderstepoort trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST nhằm xác định sự ổn định về đặc tính sinh học của các chủng virus nghiên cứu Các chủng virus này được cấy chuyển một đời (chủng gốc) và 20 đời qua môi trường tế bào Vero-DST Tiến hành so sánh về trình tự gene và đặc tính nuôi cấy giữa chủng virus gốc và chủng virus ở đời cấy truyền 20 Cả 4 chủng virus

ở đời cấy truyền thứ 20 đều sinh trưởng tốt hơn so với chủng giống gốc ban đầu Virus ở đời 20 có khả năng gây bệnh tích tế bào chậm hơn so với chủng gốc ban đầu Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra dòng tế bào Vero có biểu hiện SLAM phù hợp để phân lập và cấy chuyển nhiều đời virus Care mà không làm thay đổi về đặc điểm di truyền của virus

Nghiên cứu của Lan et al (2009b) đã phân loại 10 chủng virus Care được

phân lập trước đó dựa vào khả năng sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào (CPE) trên dòng tế bào Vero Các chủng virus P94S, Ac96I, S124C, MD231, MS232, MSA5

và 095Cr thuộc genotype Asia 1 hiếm khi gây bệnh tích tế bào trên dòng tế bào Vero-DST Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra các chủng virus Care được phân lập tại Nhật Bản thuộc genotype Asia 2, có khả năng gây bệnh tích tế bào trên dòng tế bào Vero, điều này có thể liên quan tới đặc điểm sinh học phân tử của chúng

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan và cs (2012) đã làm rõ thêm một số đặc

tính sinh học của virus Care phân lập trên dòng tế bào Vero-DST Các mẫu bệnh phẩm của chó mắc bệnh Care như : phổi, hạch lympho, ruột cho khả năng phân lập virus rất cao Tế bào Vero-DST là tế bào thích hợp để phân lập virus CDV Virus nhân lên nhanh trong tế bào Vero-DST và gây bệnh tích tế bào điển hình

thể Syncytium - thể hợp bào Bệnh tích tế bào xuất hiện sau 12h gây nhiễm, đạt cao nhất sau 60 giờ gây nhiễm và phá hủy muộn nhất là 96 giờ sau gây nhiễm

Để tìm hiểu sâu hơn về đặc tính sinh học của virus phân lập được, chúng tôi không chỉ tiến hành nghiên cứu với những virus phân lập được mà còn đồng thời tiến hành đối với cả chủng virus vacxin Onderstepoort Virus CDV4-H phân lập được có khả năng phá hủy tế bào mạnh hơn virus vacxin chủng Onderstepoort Virus CDV4-H có hiệu giá virus cao nhất sau 36 giờ gây nhiễm với CPE đạt 90% Hai chủng virus này đều tồn tại trong tế bào và ngoài tế bào, hiệu giá virus trong tế bào cao hơn hiệu giá virus giải phóng ra ngoài tế bào Kết quả này có ý nghĩa cho người làm nghiên cứu virus có thể xác định được thời điểm thu hoạch virus dựa vào việc quan sát bệnh tích tế bào (CPE)

Hình 2.3 Bệnh tích tế bào do chủng virus CDV4-H và Onderstepoort gây ra sau 36 và 48 giờ gây nhiễm trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST

Nguồn: Nguyễn Thị Lan và cs (2012)

Hình 2.4 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus vacxin

Onderstepoort và chủng 007Lm

Nguồn: Lan et al (2006b)

2.2.7 Đặc tính sinh học phân tử của virus Care

Dựa trên các nghiên cứu về sinh học phân tử đã chỉ ra cấu trúc của virus Care gồm có: Protein phi cấu trúc (C) được tạo ra bởi một khung đọc mở thay thế

ở gene P của virus Nhiều báo cáo về đột biết xảy ra ở các protein cấu trúc như H,

F và N Trong đó, protein H và F được coi là kháng nguyên chính của virus kích thích đáp ứng miễn dịch trên vật chủ, đây cũng là vị trí mà có sự sai khác nhau về

gene/ kháng nguyên của virus Care đã được tìm ra (Mochizuki et al., 1999)

Protein không cấu trúc (C) được mã hóa từ một khung đọc mở khác ở gene

P Chức năng của protein C chưa được xác định rõ ràng

N: Nucleocapsid, khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và bảo vệ cho hệ gene của virus, nhạy cảm với những chất phân giải protein

P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa, nhạy cảm với những yếu tố phân giải protein, đóng vai trò quan trọng trong sự sao chép

của RNA (Sidhu et al., 1993)

M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, đóng vai trò quan trọng trong

sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc

F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59 –

62 kDa, đóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào)

H: Protein gây ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là glycoprotein thứ hai của vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 – 80 kDa, đóng vai trò gắn virus vào tế bào đích Ở virus Care, protein này không hấp phụ hồng cầu cũng không ngưng kết hồng cầu Protein H quyết định chính tới ái lực và khả

năng gây bệnh trên tế bào (von Messling et al., 2001) Protein này tạo ra kháng

thể trung hòa và có tính chất bảo vệ protein của virus Protein H thường khác nhau giữa các chủng virus Care phân lập do vai trò của protein trong đáp ứng miễn dịch ở vật chủ nên do đó được sử dụng rộng rãi cho việc phân tích cây phát

sinh loài (Haas et al., 1997; Mochizuki et al., 1999) Phân loại theo địa lý của

virus Care dựa trên trình tự của protein H (Harder and Osterhaus, 1997) gồm 7 nhóm chính: Arctic – like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife

L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, do có kích thước lớn, nó sẽ thể hiện phần lớn các hoạt động của RNA polymerase (Diallo, 1990)

Carpenter et al (1992) đã tiến hành nghiên cứu bệnh Care trên đàn sư tử tại

Serengeti ở châu Phi Một số loài động vật khác ở Serengeti cũng mắc bệnh Care Nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự gene H và P của các chủng virus phân

lập được từ sư tử (Panthera leo), linh cẩu (Crocuta crocuta), cáo (Otocyon

megalotis) và chó nhà (Canis familiaris) ở Serengeti Kết quả phân tích trình tự

gene đã chứng minh các chủng virus Care được phân lập từ các loài động vật ở Serengeti có mối quan hệ di truyền gần gũi và khác so với các chủng virus Care được phân lập trên các loài động vật khác ở các khu vực khác Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra: (1) một chủng virus Care độc lực cao đã xuất hiện trên loài động vật ăn thịt ở Serengeti trong vài năm qua; (2) các chủng virus phân lập được khác về mặt di truyền ở gene H và P khi so sánh với các chủng virus Care ở các nơi khác trên thế giới; và (3) các chủng virus Care thường truyền qua các vật chủ là các loài động vật ăn thịt ở Serengeti

Iwatsuki et al (1997) đã phân lập 3 chủng virus Care là Ueno, Hamamatsu

và Yanaka từ chó ở Nhật Bản và phân tích đặc điểm di truyền ở đoạn gene H Phân tích trình tự gene H đã chỉ ra 9 vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine ở trình tự amino acid mã hóa từ gene H của các chủng virus mới phân lập được, ngược lại chủng virus Onderstepoort chỉ có 4 vị trí Do đó, sự sai khác về số lượng vị trí glycosyl hóa ở trình tự amino acid mã hóa từ gene H có thể dẫn đến

sự sai khác về tính kháng nguyên của các chủng virus Trình tự gene H của các chủng virus mới được phân lập ở Nhật Bản có mức độ tương đồng giữa các chủng là 99%, và 95% với chủng Châu Âu và Hoa Kì (phân lập từ chó biển, chó Đức và chồn sương và thú thuộc họ mèo) và 90% với chủng vacxin Dựa trên cây sinh học phân tử, các chủng virus mới phân lập tại Nhật Bản thuộc một nhánh phát sinh khác với các chủng phân lập được tại Châu Âu và Hoa Kỳ, và tất cả các chủng này khác với nhánh phát sinh của chủng vacxin

Hirama et al (2004) đã phân tích trình tự gene Hemagglutinin (H) của hai

chủng virus Care (Haku93 và Haku00) phân lập được từ loài cầy hương hoang dã

(Paguma larvata) Trình tự amino acid mã hóa từ gene H của hai chủng virus

phân lập được có độ dài là 607 amin acid mã hóa 1 khung đọc mở Trình tự nucleotide và amino acid mã hóa từ đoạn gene H của chủng virus Haku93 và Haku00 có mức độ tương đồng cao với các chủng virus được phân lập từ thực địa như Yanaka và Tanu96, nhưng lại tương đồng thấp với chủng virus vacxin phân lập trước đó Vị trí glycosyl hóa liên kết với N (Asparagine) của cả 2 chủng Haku93 và Haku00 giống với các chủng virus Care phân lập trước đó Phân tích cây sinh học phân tử đã chỉ ra các chủng virus Care phân lập từ cầy hương hoang

dã thuộc nhánh phát sinh với các chủng virus Care gần đây được phân lập tại Nhật Bản

Vongpunsawad et al (2004) đã nghiên cứu xác định vị trí liên kết trên

protein mã hóa từ gene H là cần thiết giúp cho việc phá vỡ tế bào qua các receptor Nghiên cứu đã phân tích trình tự protein mã hóa từ gene H của morbillivirus bằng cách gây đột biến theo chu kỳ ở các sản phẩm protein theo phương pháp dựa vào chức năng cơ bản của từng receptor tương ứng, và sử dụng

mô hình 3 chiều gene H của morbillivirus Mô hình sử dụng cấu trúc protein hemagglutinin-neuraminidase của virus Newcastle làm khuôn mẫu Kết quả đã xác định được 7 amino acid quan trọng cho SLAM và 9 amino acid quan trong cho CD46 (receptor của tế bào Vero) tham gia vào việc phá vỡ tế bào Kết quả nghiên cứu góp phần vào việc nghiên cứu cơ chế sinh bệnh của morbillivirus và ứng dụng trong sản xuất vacxin và điều trị bệnh

Lan et al (2005c) đã tiến hành phân tích dựa trên dữ liệu cây sinh học phân

tử của đoạn gene H và P đã chỉ ra trình tự nucleotide và amino acid của chủng virus 007Lm sau khi phân lập trên môi trường tế bào Vero-DST giống với trình

tự của chủng virus ban đầu được phân lập từ mẫu bệnh phẩm Chủng 007Lm thuộc genotype Asia 2 và khác xa với các nhánh phát sinh khác dựa trên kết quả xây dựng cây sinh học phân tử từ đoạn gene H và P

Hình 2.5 Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene H của virus Care

Nguồn: Lan et al (2007) Nghiên cứu của Lan et al (2007) đã tiến hành so sánh về đặc điểm di

truyền phân tử và đặc tính nuôi cấy của 2 chủng virus Care mới phân lập được thuộc genotype Asia 1 và Asia 2 Các chủng virus nghiên cứu được phân lập từ chó có biểu hiện lâm sàng mắc bệnh Dữ liệu kết quả giải trình tự gene H và P được so sánh với đặc tính nuôi cấy của các virus nghiên cứu Trình tự amino acid của đoạn gene H gồm 12 Cysteine ở cả genotype Asia 1 và Asia 2 Vùng kị nước

ở trình tự amino acid mã hóa từ gene H của genotype Asia 2 dài hơn so với genotype Asia 1 là 1 amino acid Trình tự amino acid được mã hóa từ đoạn gene

H của các virus thuộc genotype Asia 1 có 9 vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine, trong khi genotype Asia 2 có 8 vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine Ở các chủng virus thuộc genotype Asia 1, hàm lượng virus trong tế bào của các chủng thuộc genotype Asia 1 cao hơn so với hàm lượng virus giải phóng ngoài môi trường tế bào và các chủng virus thuộc genotype Asia 2 thì ngược lại Đặc điểm di truyền phân tử và đặc tính nuôi cấy của 2 genotype Asia 1

và Asia 2 rất khác nhau dù không có sự khác biệt về triệu chứng lâm sàng và bệnh tích quan sát được trên các chó mắc 2 genotype này

Hình 2.6 Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene P của virus Care

Nguồn: Lan et al (2007)

Nghiên cứu của Guo et al (2013) đã phân tích cây sinh học phân tử dựa

trên trình tự đoạn gene H và chỉ ra các chủng virus Care phân lập từ gấu trúc và chó hoang có nguồn gốc khác xa với chủng vacxin và các chủng virus Care tự nhiên khác Các chủng virus Care phân lập được đều thuộc genotype Asia 1 và

có mức độ tương đồng cao là 91,5-99,8% (trình tự nucleotide) và 94,4-99,8% (trình tự amino acid) Kết quả nghiên cứu này giúp nâng cao hiểu biết về đặc điểm bộ gene của các chủng virus Care phân lập được và góp phần vào việc phát triển các phương pháp giám sát và kiểm soát dịch bệnh Care trực tiếp hoặc gián tiếp ở Trung Quốc

2.3 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE

2.3.1 Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care

2.3.1.1 Phân bố địa lý của bệnh

Những nghiên cứu về dịch tễ học, huyết thanh học đã chỉ ra nhiều nơi trên thế giới có bệnh Care lưu hành Ở Châu Phi, sự lây nhiễm của bệnh được báo cáo

giữa chó nuôi ở Nam Châu Phi và Nigeria (Ezeibe, 2005; Leisewitz et al., 2001)

Có bằng chứng về sự lây nhiễm bệnh được xuất hiện giữa các loài hoang dã ở Botswana, Zimbabwe, Nam Châu Phi, Tanzania và các phần khác ở Châu Phi

(Van Vuuren et al., 1997)

Bệnh Care xuất hiện trên chó nuôi và chó hoang dã ở Châu Mỹ (Pardo et

al., 2005) Hơn 300 chó đã chết trong một trận dịch bệnh Care ở Alaska (Maes et al., 2003) và bệnh Care cũng được báo cáo ở chó đã tiêm phòng vacxin tại

Mexico Bệnh Care cũng được tìm thấy ở Brazil (Headley and Graça, 2000) Bệnh cũng được phát hiện ở chó đã tiêm phòng vacxin và chưa tiêm phòng

vacxin ở Argentina (Calderon et al., 2007), trong khi dịch bệnh xảy ra trên gấu trúc ở Chicago vào năm 1998 (Lednicky et al., 2004)

Ở Châu Âu, bệnh Care được phát hiện tại Italy (Martella et al., 2006), Đức (Frisk et al., 1999), Hungary (Demeter et al., 2007) và Bắc Ireland (Harder and

Osterhaus, 1997) Ở Phần Lan, đợt dịch bệnh Care đã xảy ra trên đàn chó đã được tiêm phòng vacxin Bệnh Care là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên đàn chó nuôi khi 71% chó chưa được tiêm phòng vacxin Bệnh Care gần đây xuất hiện tại một số trang trại chăn nuôi tại Australia

Dịch bệnh Care cũng bùng phát ở Châu Á và nhiều nơi trên thế giới Phân tích chủng virus Care được phát hiện trên toàn cầu ở nhiều vật chủ khác nhau sẽ cung cấp cách nhìn khái quát về sinh thái học của virus Care và cung cấp nền tảng cho việc nâng cao chất lượng vacxin hiện nay

2.3.1.2 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên tất cả các giống chó đều cảm thụ với virus Care, nhưng chó ngoại mẫn cảm hơn chó nội Virus Care cũng gây bệnh trên động vật hoang dã ăn

thịt (Appel et al., 1994) Năm 1987, bệnh do virus Care trên hải cẩu đã được tìm

thấy (Phocasibirica) ở hồ Baikal Sibero những chủng này lần lượt được đặt tên PDV1 và PDV2 (Phocine Distemper virus) Năm 2006, bệnh Care trên khỉ nâu châu Âu được tìm thấy trong trại Quảng Đông Trung Quốc Qua phân tích trình

tự amino acid của virus tại thực địa cho thấy đây là chủng virus cường độc

Trong phòng thí nghiệm, virus Care có thể gây bệnh cho chó con và chồn Ngoài ra, có thể dùng chuột lang, thỏ, chuột nhắt trắng, khỉ để gây nhiễm

2.3.1.3 Lứa tuổi mắc bệnh

Chó mắc bệnh Care thường có độ tuổi từ 3 tháng tới 1 năm tuổi (Zafar et

al., 1999) Việc gây bệnh thử nghiệm trên chó 6 tháng tuổi dễ hơn chó 3 tuần tuổi

do chó 3 tuần tuổi có miễn dịch thụ động thu nhận được từ mẹ (Hồ Đình Chúc, 1993) Người ta cũng đã ghi nhận virus Care gây viêm não trên chó lớn tuổi

cứu của Lan et al (2005a) Virus có thể bài thải trong khoảng thời gian 60 tới 90

ngày sau khi gây nhiễm mặc dù phần lớn chó dừng trong vòng 2 tuần

b Đường xâm nhập và cách thức lây lan

Chó mắc bệnh bài xuất virus qua các chất bài tiết của cơ thể như phân, nước tiểu, nước mũi, các dịch tiết… và khuếch tán vào không khí trong các giọt nước nhỏ Virus có thể tồn tại trong các dạng này 6 - 22 ngày ngoài môi trường Từ đó,

virus dễ dàng xâm nhập vào thức ăn, nước uống Bệnh Care có tính chất lây lan rất cao, các chó tiếp xúc trực tiếp với chó mắc bệnh, với chất bài tiết chứa virus hay thông qua thức ăn, nước uống có mầm bệnh thì dễ mắc bệnh Đặc biệt, virus còn có thể xâm nhập vào cơ thể qua da

Mặc dù virus được bài tiết ra ngoài môi trường qua hầu hết những dịch tiết của cơ thể nhưng bệnh ít lây lan qua nước tiểu Theo Hồ Đình Chúc (1993) dịch tiết ở đường hô hấp do chó mắc bệnh ho bắn ra có thể gây bệnh cho các con chó khác

Trong phòng thí nghiệm, có thể đưa virus vào cơ thể của động vật thí nghiệm theo con đường tiêm, uống, bôi vào niêm mạc mũi đều gây được bệnh

2.3.2 Triệu chứng bệnh tích

2.3.2.1 Triệu chứng lâm sàng

Biểu hiện của bệnh thường rất đa dạng phụ thuộc vào tuổi chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khoẻ, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng và độc lực của mầm bệnh Bệnh Care là bệnh cấp tính hoặc á cấp tính trên chó với biểu hiện sốt, rối loạn hô hấp, viêm dạ dày ruột, và triệu chứng thần kinh (Appel and Summers, 1995) Chó mắc bệnh Care có các biểu hiện trên lâm sàng là viêm kết mạc mắt, mắt

có dử, mũi chảy nhiều dịch, con vật ốm yếu, ho, tiêu chảy, sốt cao và gầy còm (Appel, 1969)

Triệu chứng thần kinh thường xuất hiện trong giai đoạn đầu của bệnh hoặc một vài tuần hoặc vài tháng sau đó (Appel and Summers, 1995) Triệu chứng thần

kinh có thể xuất hiện khi viêm màng não và tủy sống cấp tính (Zurbriggen et al., 1987; Baumgartner et al., 1989) Chó có thể mắc bệnh Care có thể viêm não tủy dạng mạn tính nên không quan sát được biểu hiện trên lâm sàng (Amude et al.,

2006; 2007)

Có sự sai khác nhau về triệu chứng lâm sàng quan sát được trên chó mắc bệnh Care được chứng minh do tính chất gây bệnh đa hệ thống của bệnh Triệu

chứng của bệnh thường liên quan tới hệ thống hô hấp, tiêu hóa và hệ thống thần kinh Bệnh Care thường có đặc điểm sốt hai giai đoạn, kèm theo tiết dịch ở mắt – mũi, sau đó là dịch mủ, chán ăn, viêm kết mạc, viêm phế quản, viêm phổi, viêm

dạ dày ruột, và triệu chứng thần kinh (Summers and Appel, 1994)

Tổn thương trên da như viêm da mụn nước và mụn mủ có thể xảy ra trên chó Tăng sừng hóa với sự xuất hiện các mụn nước và mủ có thể được tìm thấy ở chó mắc bệnh Sự có mặt của virus Care trong biểu bì ở gan bàn chân của chó mắc Care liên quan tới sự phát triển của các tế bào sản sinh keratin dẫn đến hiện

tượng sừng hóa (Grone et al., 2003) Tuy nhiên, các tổn thương trên thường ít khi

liên quan đến các triệu chứng thần kinh, đây thường được coi là dấu hiệu tiên

lượng tốt (Maeda et al., 1994)

Bất thường về răng có thể xuất hiện ở các chó con nhiễm bệnh Care

(Bittegeko et al., 1994) Ở chó con, chó trưởng thành có thể xuất hiện các biến dạng ở xương dài (Baumgärtner et al., 1995)

2.3.2.2 Bệnh tích

Theo Appel and Summers (1995) bệnh tích đại thể có thể gặp bao gồm sừng hoá ở mõm và gan bàn chân Tuỳ theo mức độ kế phát các vi khuẩn có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột, mụn mủ ở da,

Theo nghiên cứu của Lan et al (2005b; 2006a; 2007) bệnh tích vi thể trên

chó mắc bệnh Care gồm: viêm não không sinh mủ, thể bao hàm ở não, phá hủy bao myelin, thâm nhiễm tế bào thần kinh đệm ở não; viêm phổi và thể bao hàm trong tế bào ở phổi; viêm kẽ phổi; suy giảm và hoại tử tế bào lympho ở các hạch lympho và lách; thể bao hàm ở biểu mô dạ dày, ruột non và thận; viêm dạ dày ruột; viêm ruột cata

Nghiên cứu của Lan et al (2008) chỉ ra bệnh tích vi thể ở phổi là viêm kẽ

phổi với thể bao hàm ái toan trong biểu mô phế nang Hạch lympho có sự suy giảm tế bào hoặc hoại tử Viêm ruột non với thể bao hàm ái toan trong tế bào tiết

ở ruột và tuyến ở dạ dày Không có bệnh tích xuất hiện ở hệ thần kinh trung ương

ở các chó nghiên cứu

Pope et al (2016) đã chỉ ra bệnh tích vi thể trên chó nhà và động vật

hoang dã (gấu trúc và cáo) Bệnh tích ở phổi gồm thể hợp bào và thể bao hàm ở trong biểu mô niệu quản, thần kinh và phế quản Có sự thâm nhiễm tế bào viêm ở

hệ thống thần kinh trung ương của các con vật mắc bệnh với biểu hiện triệu chứng thần kinh cấp tính Viêm phổi và ký sinh trùng cũng được tìm thấy ở các

ca chó mắc bệnh Care

2.3.3 Chẩn đoán bệnh Care

2.3.3.1 Dựa vào đặc điểm dịch tễ học của bệnh

Bệnh chủ yếu xảy ra ở chó 2 đến 12 tháng tuổi, ở thời điểm giao mùa, thời tiết thay đổi đột ngột, độ ẩm cao hoặc lạnh Tuy nhiên cần chẩn đoán phân biệt với bệnh viêm ruột cấp tính do parvovirus gây ra trên chó Ở giai đoạn từ 6 tuần tuổi tới 6 tháng tuổi thì chó có thể bị mắc bệnh viêm ruột cấp tính do parvovirus gây ra (Pollock and Coyne, 1993; Hoskins, 1997, Prittie, 2004; Lamm and Rezabek, 2008)

2.3.3.2 Dựa vào triệu chứng lâm sàng

Chẩn đoán bệnh Care thể cấp tính và á cấp tính có thể dựa vào bệnh sử và triệu chứng lâm sàng Khi có những triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh thì

có thể nghi ngờ chó mắc bệnh Care Ở những chó chưa tiêm phòng hoặc chó trưởng thành không được tiêm phòng đầy đủ có những triệu chứng sốt, triệu chứng hô hấp như chảy nước mũi, ho, có dử mắt, triệu chứng tiêu hóa hoặc triệu chứng thần kinh thì khả năng chó mắc phải bệnh Care là rất cao (Hồ Đình Chúc, 1993)

Chẩn đoán bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng cần phân biệt với những

bệnh trên chó theo Nguyễn Văn Thanh và cs (2016)

Bệnh viêm gan truyền nhiễm: Bụng chướng to, sờ nắn vùng gan thấy con vật rất đau đớn Giác mạc đục hơn, có thể như ―cùi nhãn‖

Bệnh do Parvovirus: Gây viêm dạ dày, ruột xuất huyết do hoại tử tế bào thượng bì nhung mao ruột, thường tiêu chảy phân loãng như nước và có máu tươi, con vật chết rất nhanh, không có triệu chứng thần kinh

Bệnh do Leptospira: Viêm dạ dày, ruột chảy máu, viêm loét miệng và

thường xuất hiện ở chó lớn, vàng da, niêm mạc, số lượng bạch cầu tăng

2.3.3.3 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

a Xét nghiệm máu

Đặc trưng của chó mắc bệnh Care cấp tính gồm thiếu máu, giảm tiểu cầu, giảm tế bào lympho, bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân (Shell, 1990) Virus Care có thể vùi trong hồng cầu thường đơn lẻ, hình bầu dục hoặc hình dạng bất thường xuất hiện màu đỏ hoặc xanh khi nhuộm bằng phương pháp Wright

(Gossett et al., 1982) Thể bao hàm trong tế bào bạch cầu được miêu tả như đồng

nhất, hình trong, hình bầu dục, hoặc hình dạng bất thường có đường kính 1-4

micron Chúng bắt màu đỏ bằng phương pháp Schorr (Cello et al., 1959) và phương pháp Wright (Gossett et al., 1982)

Sự suy giảm số lượng tế bào lympho ở giai đoạn đầu của chó mắc bệnh Care và mức độ suy giảm tế bào lympho liên quan tới mức độ trầm trọng của bệnh và sự tồn tại của virus trong hạch lympho và hệ thống thần kinh trung ương

(Schobesberger et al., 2005)

b Tìm thể Lents

Lấy mẫu bệnh phẩm là dịch cạo niêm mạc mắt hay mũi chó bệnh, đem nhuộm Hematoxilin – Eosin (HE), tìm tiểu thể Lents qua kính hiển vi Cần chú ý, ở não, thể Lents rất giống thể Negri ở bệnh dại

c Chẩn đoán virus học

Tiêm truyền bệnh phẩm cho động vật thí nghiệm

Mẫu bệnh phẩm là máu, lách, gan, phổi, các chất bài tiết và dịch nước mũi, nước mắt của chó nghi mắc bệnh đem nghiền, chế thành huyễn dịch và tiêm cho động vật thí nghiệm Ưu tiên sử dụng chồn hoặc chó non, ngoài ra có thể tiêm cho chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ

Quan sát tiến triển của bệnh gây ra trên động vật thí nghiệm, mổ khám bệnh tích đại thể và kết luận

Trong bệnh phẩm có thể phân lập được một số vi khuẩn kế phát như

Pasteurella, Bacillus bronchisepticus, Staphylococcus, E coli và Salmonella Phân lập virus trên môi trường tế bào

Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên môi trường tế bào một lớp thích hợp Virus Care chỉ có thể nhân lên và gây bệnh tích tế bào

(Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp Bệnh tích tế

bào do CDV gây ra có thể quan sát được là những thể hợp bào, tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE

Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, độc lực của virus và ―tuổi‖ tế bào Tế bào mới nuôi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuôi

cấy nhiều ngày (Lan et al., 2005a)

d Chẩn đoán bằng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym

ELISA (Enzim Linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp xét

nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế kết quả đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, có sử dụng kháng thể có gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát hiện ra

sự kết hợp đó

e Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp

có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu theo

nghiên cứu của Lan et al (2006a)

Nghiên cứu của Iwatsuki et al (1995) đã nghiên cứu cơ chế sinh bệnh của ba

ca chó mắc bệnh Care tự nhiên Các hạch lympho ở chó mắc bệnh bị teo đi và không có nang bao bọc Sự phân bố kháng nguyên của virus Care được xác định bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với Thy-1, IgM, CD4, CD8, CD21 và CD45RB, và huyết thanh kháng protein nucleocapsid của virus sởi Kháng nguyên của virus Care có trong các tế bào T phụ thuộc ở các khu vực và các nang lympho; trong đó chủ yếu trong các tế bào Thy-1, hoặc tế bào dương tính với CD4-, và các tế bào dương tính với CD8-, CD21- hoặc IgM Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra các tế bào T dương tính với Thy-1

và CD4- là tế bào đích chính của virus trong giai đoạn cấp tính của bệnh

Nghiên cứu của Muller et al (1995) đã xác định sự phá hủy myeline trong

các trường hợp chó mắc bệnh Care mạn tính có liên quan tới sự tồn tại của virus trong hệ thống thần kinh Virus Care tồn tại trong não nhưng virus không phá hủy tế bào khi nhân lên, giới hạn sự gây nhiễm đối với các tế bào và giảm sự mã hóa protein của virus Cả hai cơ chế trên dẫn tới hệ miễn dịch chậm nhận ra được virus trong cơ thể

Nghiên cứu của Haines et al (1999) đã sử dụng phương pháp nhuộm hóa

mô miễn dịch để xác định kháng nguyên của virus Care trong các mẫu dịch tiết

từ mũi và biểu mô gan bàn chân và lông của chó khi phát hiện hoặc không phát hiện được kháng nguyên của virus trong phổi hoặc não Mẫu bệnh phẩm từ 57 chó mắc Care đã được kiểm tra Kháng nguyên của virus Care được tìm thấy trong phổi và não của 28 chó Trong đó, kháng nguyên virus được tìm thấy trong

tế bào biểu mô ở dịch nhầy mũi của 24/27 chó, tế bào biểu mô gan bàn chân của 24/26 chó, và trong lông cổ của 26/27 chó Trong 29 chó không tìm thấy kháng nguyên của virus Care trong phổi và não có 1 chó chứa kháng nguyên của virus