Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)

Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (LA tiến sĩ)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ TOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU

CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ TOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU

CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân Các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Lê Thị Toan

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Bệnh lý học Thú y, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu luận án

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân trong gia đình và cơ quan đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tác giả luận án

2.3 Một số hiểu biết về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS) 27

3.4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS HUA

01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam 41 3.4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01,

PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam 42

3.5.14 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm 52

4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS

4.1.1 Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus

4.1.2 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng

4.1.3 Kết quả nghiên cứu xác định sự ổn định của các đời virus qua các đời cấy

4.1.4 Kết quả nghiên cứu xác định đường biểu diễn sự nhân lên của 02 chủng

4.1.5 Nghiên cứu khả năng gây bệnh của 02 chủng virus PRRS HUA 01 và

PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam 64 4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01,

PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía bắc việt nam 91

4.2.2 Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu 92

4.2.4 So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt

BCĐNTT Bạch cầu đa nhân trung tính

CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào)

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm)

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

(Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò)

HE Haematoxylin – Eosin (Thuốc nhuộm tiêu bản bệnh lý)

IHC Immuno Histochemistry (Hóa miễn dịch tổ chức)

IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay

(Phản ứng miễn dịch có gắn men trên tế bào một lớp)

MARC 145 Tế bào thận khỉ

MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhược độc)

MOI Multiplicity Of Infection

(Tỷ lệ giữa số lượng virus và số lượng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc)

OD Optical Density (Mật độ quang)

ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở trong hệ gen)

PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn)

PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

(Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

(Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) RNA Ribonucleic acid (gen sợi đơn)

RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngƣợc) S/P Sample/Positive (giá trị tính toán trong phản ứng ELISA)

SP Structural protein (Protein cấu trúc)

TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

(Cơ chất bắt màu huỳnh quang) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm)

DANH MỤC BẢNG

3.1 Thông tin về nguồn gốc 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 40 4.1 Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS

4.2 Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS

4.3 Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS

4.4 Hiệu giá 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 qua các đời

4.5 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của lợn lô 1 trước khi gây nhiễm

4.6 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của lợn lô 2 trước khi gây nhiễm

4.7 Kết quả xét nghiệm sự có mặt của virus PRRS và một số virus khác bằng

4.9 Kết quả xét nghiệm hàm lượng PRRSV bằng phương pháp Realtime RT-PCR 70 4.10 Bảng tổng hợp triệu chứng lâm sàng chủ yếu của các lợn được gây bệnh

thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 75 4.11 Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng PRRS HUA 01,

4.14 Kết quả xác định virus PRRS ở lợn gây bệnh thực nghiệm bằng phương

4.15 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 giữa các chủng virus

4.16 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 giữa các chủng virus

4.17 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa 2 chủng virus

4.18 Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa 2 chủng virus

4.19 Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF7 giữa các chủng

4.20 Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa các chủng

4.21 Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa các chủng virus

4.22 Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa các chủng virus

DANH MỤC HÌNH

2.3 Kết quả quy luật sinh trưởng của virus PRRS trên môi trường nuôi cấy

4.2 Bệnh tích tế bào sau 24 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 57 4.3 Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 57 4.4 Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 57 4.5 Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 57 4.6 Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 57 4.7 Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 58 4.8 Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 58 4.9 Bệnh tích tế bào sau 84 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 58 4.10 Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus PRRS HUA 01 62 4.11 Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus PRRS HUA 02 62

4.13 Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 sau 7 ngày gây nhiễm chủng

4.14 Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 sau 7 ngày gây nhiễm chủng

4.15 Thân nhiệt trung bình của lợn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng 02

4.16 Hàm lƣợng kháng thể trung bình của lợn thí nghiệm đƣợc gây nhiễm

4.31 Xuất huyết kẽ thận, tế bào viêm tăng sinh (HE.10X) 86

4.34 Não sung huyết, hồng cầu tràn ngập lòng mạch quản (HE.40X) 86

4.39 Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A) và ORF5 (hình B) 92 4.40 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gene ORF7

4.44 So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF7 của 2 chủng

4.45 So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF5 của 2 chủng

4.46 Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF5 của các

4.47 Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF7 của các

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Lê Thị Toan

Tên Luận án: “Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus

PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam”

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu:

Mục đích của luận án nhằm chọn ra chủng virus PRRS tiềm năng có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu như: sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu quả bảo hộ cao;chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị PRRS; công cường độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng dùng trong dịch tễ học phân tử

Phương pháp nghiên cứu:

Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Máy PCR, thiết bị điện di, máy giải trình tự gene, máy đọc ELISA, máy chuyển đúc mẫu, máy cắt tổ chức, kính hiển vi quang học, kính hiển vi huỳnh quang Môi trường nuôi cấy tế bào, tế bào Marc 145, bộ kít tách chiết RNA, bộ kít RT-PCR, bộ kít giải trình tự gene, Hematoxylin-Eosin, kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp của PRRSV Để kiểm tra các đặc tính sinh học của virus cần sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào, gây nhiễm virus lên môi trường tế bào, xác định hiệu giá của virus, xác định đường cong sinh trưởng của virus trên môi trường tế bào, nghiên cứu khả năng gây bệnh của virus bằng phương pháp gây bệnh thực nghiệm, khám lâm sàng, mổ khám, kiểm tra bệnh tích đại thể và làm tiêu bản

vi thể của lợn thí nghiệm Kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA Nghiên cứu sự phân bố của virus bằng phương pháp hóa mô miễn dịch Phương pháp RT-PCR để xác định sự có mặt của virus Xác định hàm lượng virus bằng phương pháp Realtime PCR Giải trình tự gene để xác định đặc điểm sinh học phân tử của virus

Kết quả chính và kết luận:

Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02: Biến đổi bệnh tích tế bào bắt đầu quan sát thấy sau 24 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, và sau 36 giờ chủng PRRS HUA 02 Bệnh tích tế bào được biểu hiện là các tế bào co cụm lại với nhau chồi lên ở đáy bình Chủng virus PRRS HUA 01,

CPE đạt 100% tại 60 giờ Chủng virus PRRS HUA 02, CPE đạt 100% tại 72 giờ Quy luật nhân lên của 2 chủng virus nghiên cứu trong môi trường tế bào là giống nhau Virus giải phóng ra ngoài tế bào có hiệu giá cao hơn virus ở trong tế bào Hiệu giá virus tương đối cao chủng PRRS HUA 01 (3,16x105

TCID50/25µl) và PRRS HUA 02 (1,74 x106TCID50/25µl), thời điểm hiệu giá virus đạt cao nhất trong khoảng 60 giờ đến 84 giờ sau gây nhiễm Kết quả khả năng gây bệnh của 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02: Chủng PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 được gây nhiễm trên lợn thí nghiệm

có triệu chứng và bệnh tích rất điển hình của lợn mắc PRRS Triệu chứng lâm sàng: sốt,

ho, khó thở, giảm ăn, phát ban, sưng phù mí mắt Sau gây nhiễm 03 ngày virus PRRS xuất hiện trong máu và sau 05 ngày xuất hiện ở dịch ngoáy mũi Virus tồn tại trong máu đến hết thời gian theo dõi thí nghiệm (21 ngày) Bệnh tích đại thể chủ yếu của các lợn thí nghiệm: phổi viêm, xuất huyết, hạch lympho sưng, xuất huyết, thận xuất huyết Bệnh tích

vi thể chủ yếu của lợn mắc PRRS ở thí nghiệm: Phổi xuất huyết, phế quản - phế viêm, tế bào viêm tràn lan trong phổi Hạch lympho xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, các nang lympho, thận xuất huyết, viêm kẽ thận Sự phân bố của virus được nghiên cứu qua phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy ở lợn gây nhiễm thực nghiệm, virus PRRS tập trung chủ yếu ở hạch lympho và phổi

Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 2 chủng virus PRRS HUA

01 và PRRS HUA 02: Đoạn gene ORF5 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 amino acid của Glycoprotein 5 (GP5) Đoạn gene ORF7 có kích thước 372 bp mã hóa cho 123 amino acid của protein N Mức độ tương đồng nucleotide ở gene ORF7 và ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ lần lượt là 98,64% và 97,29% Mức độ tương đồng về nucleotide ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu với các chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ lần lượt là 93,13%-99,73% và 87,41%-99,67% Mức độ tương đồng về amino acid tương ứng ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 02 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ lần lượt là 100,0% và 94,26%-100% Mức độ tương đồng về amino acid tương ứng ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu với các chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ dao động lần lượt là 93,99%-100% và 84,24%-98,97% Hai chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 có cùng nhánh với chủng độc lực cao của Trung Quốc và thuộc PRRS type 2 (Bắc Mỹ)

Chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 có đặc tính sinh học và sinh học phân tử điển hình, ổn định, có khả năng gây bệnh cao nên có thể lựa chọn làm chủng tiềm năng phục vụ cho việc chọn chủng giống gốc để sản xuất vắc-xin PRRS, đánh giá hiệu lực của các loại vắc-xin, hoặc các chế phẩm sinh học như kít chẩn đoán nhanh, kháng nguyên dùng trong chẩn đoán,… nhằm phòng, trị PRRS

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Le Thi Toan

Thesis title: Study of biological and molecular biological characteristics of PRRSHUA

01 andPRRS HUA 02 virus strains isolated from some northern provinces in Vietnam

Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 62.64.01.02

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture

Research Objectives:

The purpose of this thesis is to find promising PRRS virus strains with typical biological and molecular biologicalcharacteristics to diversify gene bank and for further research such as: Production of effective vaccine and PRRS; assessment of vaccine effectiveness; experimental infection for further study on pathological characteristics of PRRS; to be used as reference in study on new isolated virus and modified strain in molecular epidemiology

Materials and Methods:

Study on biological characteristics of 02 virus strains: PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02 Research on the molecular biological characteristics of 02 virus strains: PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02 PCR machine, electrophoresis equipment, sequencing machine, ELISA reader, automatic paraffin dispenser embedding, microtome, microscopes, fluorescence microscopes, Marc 145 cell culture environment, RNA extraction Kit, RT-PCR Kit, sequencing Kit, Hematoxylin – Eosin, PRRSV primary and secondary antibodies In order to identify biological features of the virus, cell culture and virus title, viral replication curve in cell culture environment were performed Viral virulence was determined through experimental infection, clinical test, necropsy, macro-lesions, and micro-lesions observation ELISA was carried out to identify Antibody titer Immunohistochemistry method was used to study the viral distribution RT-PCR was implemented to identify the presence of virus Realtime PCR showed the quantity of virus Sequencing was conducted to identify molecular biological characteristics of virus

Main findings and conclusions:

Result of study on biological characteristics of PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02: cellular lesions began to be observed at 24 hours post-infection with PRRS HUA 01, and after 36 hours post-infection with PRRS HUA 02 Cellular lesions observed are the cells clumping together, creating clusters in the bottom of the jar In PRRS HUA 01, CPE reached to 100% at 60 hours CPE reached to 100% at 72 hours post-inoculation

with PRRS HUA 02 Two strains multiply in the same way in the cell culture Virus released out of the cells has a higher titer than those inside the cells.The viral titer reached to the highest levelat 60 hours to 84 hours post-infection, PRRS HUA 01 (3,16x105 TCID50/25µl) và PRRS HUA 02 (1,74 x106 TCID50/25µl) PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02 experimentally infected in pigs are virulent and able to cause respiratory and reproductive syndrome (PRRS) in pigs with typical symptoms and lesions of PRRS Clinical symptoms in infected pigs were: fever, cough, anorexia, hives, swelling of the eyelids The presence of PRRS virus in the blood appears on the

3rd day post-inoculation, and the virus found in swab in the 5th day post-inoculation Virus presented in blood until the end the experiment (21st day) Main macroscopic lesions of PRRS infected pigs are: pneumonia, hemorrhage, pulmonary incarnate, lymphadenopathy: hemorrhage, infiltration, renal hemorrhage, interstitial nephritis Study on viral distribution using IHC shows that in infected pigs, accumulation of virus

in lymph nodes and lungs

Results of the study molecular biological characteristics of PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02: ORF5 gene has fragment size of 603 bp encoding 200 amino acids of Glycoprotein 5 (GP5) ORF7 gene has fragment 372 bp in size 123 amino acids encoding the protein of N The degrees of similarity of nucleotide in the gene ORF5 and ORF7 between 2 PRRS strains are at high rate 98.64% and 97.29%, respectively The degrees of similarity nucleotide in the gene ORF7 and ORF5 between 2 PRRS strains and reference strain are of 93.13%-99.73% and 87.41%-99.67%, respectively The degree of similarity of amino acid in the gene ORF7 and ORF5 between 2 PRRS strains are at high rate 100% and 94.26% -100.0%, respectively.The degree of similarity of amino acid in the gene ORF7 and ORF5 between 2 PRRS strains and reference strain are 93.99% - 99.20% and 84.24% - 98.97%, respectively This suggests that the similarity between the results of comparing the degree of similarity between nucleotide sequences and amino acid sequences.PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02 have the same branch with highly pathogenic strain of China and belong to PRRS virus type 2 (North America)

PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02 strains have stable, typical, biological and molecular biological characteristics and high pathogenic which could be used for PRRS vaccine production, assessment of vaccine effectiveness or biotic products such as rapid test Kits, Antigens for diagnosis with the arm of prevention and treatment of PRRS

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh tai xanh hay hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của lợn mọi nòi giống, mọi lứa tuổi Bệnh tai xanh do một loại virus gây ra, virus tấn công là các đại thực bào dẫn đến hiện tượng suy giảm miễn dịch

ở lợn, tạo điều kiện cho các virus, vi khuẩn gây bệnh khác tấn công Bệnh tai xanh gây thiệt hại nặng nề đối với ngành chăn nuôi lợn, đối với lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: sảy thai, lợn con sơ sinh yếu ớt, giảm số con sơ sinh/ổ, tình trạng bệnh kéo dài âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo dài, chậm động dục trở lại Đối với đực giống, số lượng tinh dịch giảm, chất lượng tinh dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Mỹ năm 1987 (Keffaber, 1989), rất nhanh chóng sau đó bệnh lan sang Canada và sau đó lan sang các nước châu Âu Năm 1991, virus được tìm thấy tại

Hà Lan (Terpstra et al., 1991) Năm 1998, bệnh được phát hiện ở Hàn Quốc, Nhật

Bản thuộc khu vực châu Á Từ năm 2005 trở lại đây, bệnh lây lan khắp các nước trên toàn thế giới

Tác nhân gây bệnh - virus PRRS (PRRSV) là một thành viên của giống

Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirale (Collins et al., 1992) PRRSV rất

nhỏ, hệ gene của virus gồm một sợi RNA đơn dương có kích thước khoảng 15

kb Bộ gene gồm có 9 khung đọc mở (ORF) (Lee and Yoo, 2005) Khung đọc

mở ORF 1a và ORF1b mã hoá các polymerase protein liên quan đến sự nhân lên của virus, có thể chia thành ít nhất 13 protein phi cấu trúc (NSP) Nsp1α, Nsp1β, Nsp2-6, Nsp7α, Nsp7β, Nsp8-Nsp12 Mặc dù các Protein phi cấu trúc chiếm ¾ genome của PRRSV nhưng vẫn chưa biết nhiều về chức năng của các protein này Vai trò của Nsp1α, Nsp1β là quan trọng cho sự tổng hợp mRNA

(Nspα) và tái tạo hệ gene (Nspβ) (Krocse et al., 2008) Hai protein này cũng

cản trở sự tổng hợp interferon loại 1 ORF2 - ORF7 đặt tại vị trí đầu 3’ của genome mã hoá cho GP5 và protein màng M (Matrix protein), protein màng nhân N (Nucleocapsid) Tuy nhiên chỉ có 6 phân tử protein chính có khả năng trung hòa kháng thể bao gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 phân tử protein màng (M) và 1 protein màng nhân (N), nhưng hoạt động trung hòa xảy ra mạnh với các protein có khối lượng 45, 31 và 25 KD

Trong đó, N là loại protein có số lượng nhiều nhất trong cấu trúc hạt virus

và đồng thời nó có tính kháng nguyên rất cao vì thế nó là dấu hiệu nhận biết của

kháng thể đặc hiệu và là dấu hiệu dùng trong chẩn đoán bệnh (Done et al., 1996)

ORF3 mã hoá glycoprotein cấu trúc nhỏ - GP3 và ORF5 mã hoá glycoprotein vỏ GP5 là các đoạn gene thường được chọn để khảo sát về sự đa dạng và phân tích cây phả hệ nhằm tìm hiểu về sự đa dạng di truyền Gần đây phát hiện thêm protein ORF5a nhưng vẫn chưa hiểu biết rõ về chức năng và vị trí của nó trong cấu trúc virus GP2 được mã hóa bởi ORF2 ở virus PRRSV type I có 249 amino acid và 256 amino acid ở type II GP2 có liên quan đến việc cởi vỏ và giải phóng

hệ gene của virus Protein E được tổng hợp từ khung đọc mở ORF2 cùng với GP2 có chiều dài 70 amino acid đối với PRRSV type I và 73 amino acid với PRRSV type II ORF3 mã hóa cho protein GP3 có chiều dài 265 amino acid đối với PRRSV type I và 254 amino acid đối với PRRSV type II GP3 có cấu trúc luôn thay đổi, GP3 mang epitope B cell và epitope trung hòa thường mang lại dương tính huyết thanh học với các mẫu kháng huyết thanh PRRSV GP4 được

mã hóa bởi ORF4 có độ dài 183 amino acid và 178 amino acid tương ứng cho PRRSV type I và type II Phần đuôi 3’ của ORF3 chính là phần đầu 5’ của ORF4

do vậy thiếu amino acid sẽ xảy ra đồng thời tại protein GP3 và GP4

GP5 là glycoprotein được thấy nhiều nhất trên bề mặt virion của PRRSV,

là phân tử protein được mã hóa bởi ORF5, là một trong những vùng thường thay đổi nhất trong genome của PRRSV và là đoạn gene được xét đến nhiều nhất

trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền (Shi et al., 2010)

Dựa vào phân tích cấu trúc gene, PRRSV được chia thành 2 nhóm genotype: Nhóm I (châu Âu) đại diện bởi virus Lelystad và nhóm II (Bắc Mỹ)

đại diện bởi virus VR – 2332 (Nelson et al., 1993) Mặc dù PRRSV thuộc cả hai

nhóm này đều có thể gây ra hội chứng tương tự nhau trên lợn, chúng chỉ giống nhau 55-70% về nucleotide và khoảng 50-80% về amino acid Tại thực địa, sự đa dạng cả về đặc tính di truyền và đặc tính kháng nguyên của các chủng PRRSV là nguyên nhân dẫn đến việc sử dụng vắc-xin không hiệu quả và đôi khi xảy ra những ổ dịch PRRS lớn

Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới (OIE) là có dịch PRRS lưu hành (trừ châu Úc và Newzeland)

Hiện nay, PRRS đã trở thành dịch địa phương ở nhiều nước trên thế giới,

kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển như Mỹ, Hà Lan, Anh, Đan Mạch, Pháp, Đức và gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho người chăn nuôi, thiệt hại lên đến hàng trăm triệu USD Hàng năm ước tính tiêu phí ngành công nghiệp chăn nuôi lợn ở Mỹ là 560 triệu USD cho bệnh tai xanh (Neumann

et al., 2005) Các nước trong khu vực châu Á có tỷ lệ PRRS lưu hành rất cao

như: Trung Quốc 80%, Đài Loan 94,7 – 76,4%, Philippin 90%, Thái Lan 97%, Malaysia 94%, Hàn Quốc 67,4 – 73,1%

Nghiên cứu về đặc tính của các chủng PRRSV gây bệnh trên lợn đã được thế giới tiến hành từ rất lâu và mỗi quốc gia đều đã đưa ra những thông tin khác nhau về các chủng PRRSV đang lưu hành ở quốc gia mình, cũng như đề ra một chiến lược kiểm soát dịch bệnh riêng Thực tế cho thấy PRRSV đang không ngừng biến đổi và những nghiên cứu về virus này vẫn là đề tài nóng bỏng ở các nước có nền chăn nuôi lợn phát triển Ở Việt Nam cũng vậy, chúng ta cần có những nghiên cứu mới về PRRSV tại Việt Nam, để thấy rõ có sự khác biệt hay không với các chủng cổ điển đã phân lập trên thế giới cũng như trả lời cho câu hỏi tại sao vắc-xin PRRS được sử dụng mà dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra Các chiến lược phòng chống dịch bệnh đã và đang được áp dụng nhưng hiệu quả phòng bệnh chưa thể kết luận là đạt hiệu quả cao, nguyên nhân chúng ta chưa có thông tin chính xác về các chủng PRRSV thực tế đang lưu hành tại Việt Nam, cũng như những đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus này Tình hình dịch bệnh tai xanh ở Việt Nam đang diễn ra rất phức tạp

Cho đến nay, dịch bệnh tai xanh đã xuất hiện tại Việt Nam được hơn 9 năm nhưng các công trình nghiên cứu về virus, đặc biệt là đặc tính sinh học và sinh học phân tử vẫn còn rất hạn chế

Trong các nghiên cứu gần đây của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu được một số triệu chứng lâm sàng, đặc điểm bệnh lý của lợn mắc PRRS tự nhiên và cũng đã phân lập được một số chủng PRRSV gây bệnh từ đàn lợn nuôi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam trên môi trường tế bào Marc 145 Trong các chủng phân lập được, có các chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 được phân lập từ các lợn có triệu chứng và bệnh tích khá điển hình của lợn mắc PRRS, gây

tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết cao Tuy nhiên vẫn chưa đánh giá hết được đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus này Để phục vụ mục đích lựa chọn chủng chế tạo vắc-xin, đánh giá hiệu quả của vắc-xin hoặc sản xuất chế phẩm sinh học phòng, trị

bệnh cho vật nuôi thì việc nghiên cứu các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của

các chủng virus phân lập được là vô cùng quan trọng và cấp thiết

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 đã được Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi về không gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên đối

tượng là chủng virus PRRS HUA 01 được phân lập tại tỉnh Hải Dương, (năm 2013)

và chủng virus PRRS HUA 02 được phân lập tại tỉnh Hưng Yên, (năm 2013)

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học

Thú y và phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý, khu nuôi động vật thí nghiệm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện từ năm 6/2014-12/2016

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Những vắc-xin được sử dụng để phòng bệnh tại Việt Nam hiện nay chưa mang lại hiệu quả rõ rệt Điều này cho thấy có một sự sai khác đáng kể về tính kháng nguyên của chủng virus PRRS gây bệnh trên đàn lợn ở Việt Nam với

chủng virus PRRS của vắc-xin nhập ngoại, vì vậy mà kháng thể kháng virus PRRS có trong lợn được tiêm phòng không thể bảo hộ được chúng khỏi các chủng virus PRRS thực địa Nghiên cứu sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS phân lập và các chủng virus vắc-xin cho phép xác định được tính tương đồng giữa các chủng virus này, từ đó đưa ra các thông tin chính xác về

sự lưu hành của các chủng virus PRRS ở Việt Nam Đồng thời cho phép lựa chọn được các chủng virus PRRS thích hợp để sử dụng làm vắc-xin

Luận án nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của một số chủng virus PRRS đã được phân lập từ trước đó là một trong những nghiên cứu mới và cần thiết để lựa chọn ra được các chủng virus điển hình cho virus gây bệnh tại Việt Nam và có tiềm năng để phục vụ một số mục đích như: sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu quả bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị PRRS; công cường độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng dùng trong dịch tễ học phân tử

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Các thông tin khoa học, những kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh học và

sinh học phân tử của 02 chủng PRRSV phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam là cơ sở khoa học quan trọng cho các nghiên cứu sâu hơn về PRRS như nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng, nghiên cứu sản xuất vắc-xin, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán, bảo tồn nguồn gene virus thực địa với các đặc tính sinh

học rõ ràng và đầy đủ

Kết quả của luận án sẽ chỉ ra được các đặc tính sinh học và sinh học phân

tử của một số chủng PRRSV sẽ rất có ích cho lĩnh vực thú y nói riêng và lĩnh vực công nghệ sinh học nói chung Tạo ra được những tiến bộ khoa học, phát triển các hướng nghiên cứu về công nghệ sinh học trong lĩnh vực thú y

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả của luận án sẽ đưa ra những thông tin về đặc tính sinh học, sinh học phân tử của một số chủng virus PRRS nghiên cứu để có thể lựa chọn được chủng virus tiềm năng dùng để chế vắc-xin phòng bệnh hoặc chế kháng nguyên chẩn đoán bệnh hoặc làm chủng cường độc để thử hiệu lực của vắc-xin Như vậy các chủng virus này có thể giúp ích cho các công ty sản xuất vắc-xin hoặc các cơ sở

nghiên cứu Sản xuất được vắc-xin trong nước, giúp chúng ta không phải lệ thuộc vào sự nhập khẩu vắc-xin và có thể chủ động trong việc phòng chống dịch PRRS nhằm giảm thiểu tối đa thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi, giúp phát triển một ngành chăn nuôi bền vững

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS trên thế giới

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) được ghi nhận lần đầu tiên trong các báo cáo về các thiệt hại của ngành công nghiệp chăn nuôi tại Mỹ Tại các ổ dịch có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng của PRRS đã được báo cáo ở Mỹ vào cuối những năm 80 của thế kỉ trước (1987), số lượng lợn chết trong điều kiện bình thường tăng lên và lợn chậm lớn Các triệu chứng lâm sàng bao gồm rối loạn sinh sản nghiêm trọng, viêm phổi ở lợn con sau cai sữa, chậm lớn, giảm năng suất và tỷ lệ tử vong tăng (Keffaber, 1989) Khi đó đã có nhiều giả thuyết được đặt ra, một số nghiên cứu tập trung kiểm tra sự bất thường ở đường sinh sản của lợn giống nhưng vào thời điểm

đó vẫn chưa thể biết được mối liên hệ của nguyên nhân gây ra tình trạng nêu trên Bệnh vẫn còn là một bí ẩn Hàng năm ước tính tiêu phí ngành công nghiệp chăn

nuôi lợn ở Mỹ là 560 triệu USD cho bệnh tai xanh (Neumann et al., 2005)

Rất nhanh chóng, năm 1988 bệnh tai xanh đã lan sang nước láng giềng Canada và tiếp tục hoành hành trong khi đó bí ẩn về căn bệnh vẫn chưa được giải mã

Hai năm sau các ổ dịch có các triệu chứng lâm sàng tương tự đã được báo cáo ở CHLB Đức (1990) Năm năm sau kể từ khi có báo cáo đầu tiên về bệnh, năm 1991 virus được tìm thấy lần đầu tiên tại Hà Lan Các tác giả người Hà Lan

đã xác định được đặc tính của virus sau khi thực nghiệm thành công các chỉ tiêu của Định đề Koch và virus được đặt tên virus là Lelystad để kỉ niệm phát hiện này

(Terpstra et al., 1991) Sau đó không lâu, virus PRRS được Mỹ đặt tên là ATCC

VR – 2332) (Collins et al., 1992) Đứng trước những thiệt hại cũng như diễn biến

phức tạp của bệnh Năm 1992, trong cuộc họp chuyên đề quốc tế về triệu chứng hô hấp và còi cọc ở lợn tại Minesota, Mỹ tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã chính thức đặt tên cho bệnh này là hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

Tính từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục (trừ châu Úc và New Zealand) trên Thế giới đã báo cáo phát hiện có PRRS lưu hành Con số thực tế sẽ còn khác rất nhiều Trong số các nước nêu trên có cả các nước có ngành chăn nuôi phát triển mạnh như Mỹ, Hà Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức…

Hội chứng này phát hiện ở châu Á vào những năm 1990 Từ những năm

1995 trở lại đây Trung Quốc cũng ghi nhận xảy ra các trường hợp lợn chết hàng loạt do tai xanh ghép với các bệnh khác Năm 2006 dịch xảy ra ở hơn 10 tỉnh Trong vòng 3 tháng, tổng số lợn mắc bệnh là trên 2 triệu con, số chết là trên 400 nghìn con (tỷ lệ chết khoảng 20%) Bệnh có tốc độ lây lân nhanh, trong vòng 3-5 ngày cả đàn có thể bị nhiễm bệnh Độ dài của bệnh khoảng 5-20 ngày tuỳ theo sức khoẻ của lợn Lợn ốm sốt cao 40-42oC - bệnh sốt cao Năm 2007, dịch bệnh

đã xảy ra ở trên 26 tỉnh/33 tỉnh, vùng lãnh thổ, với trên 257.000 lợn mắc bệnh, chết hơn 68.000 con và tiêu huỷ 175.000 con Hiện đang có 2 chủng vi rút PRRS lưu hành tại Trung Quốc: Chủng cổ điển độc lực thấp và chủng độc lực cao gây

ốm, chết nhiều lợn Các nghiên cứu của Tian et al (2007) đã xác định các chủng

virus PRRS ở Trung Quốc thuộc dòng Bắc Mỹ Bên cạnh đó, Xiaofang Hao ở Viện nghiên cứu Thú y Lan Châu của Học viện Khoa học Nông Nghiệp Trung Quốc đã nêu đặc điểm gene ORF7 của virus PRRS ở Trung Quốc trong một bài báo đăng trên tạp chí Virology Tác giả của bài báo giải thích rằng, virus PRRS thể hiện sự biến đổi gene rộng rãi Việc bùng phát dịch bệnh PRRS độc lực cao vào năm

2006 đã khiến cho họ phải nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền của virus PRRS tại Trung Quốc Để đạt được điều này, họ đã phân tích trình tự các gene Nsp2 và ORF7 của 98 chủng virus PRRS Trung Quốc phân lập Phân tích sơ bộ cho thấy những chủng virus PRRS độc lực cao bị xóa mất 30 amino acid trong chuỗi protein không cấu trúc (NSP2) là những chủng virus chủ yếu đang lưu hành tại Trung Quốc Phân tích sâu hơn dựa trên trình tự gene ORF7 cho thấy tất cả các chủng phân lập ở Trung Quốc được chia thành 5 nhóm phụ, và các chủng virus PRRS độc lực cao không có liên quan đến vắc-xin MLV hay CH-1R, điều này làm tăng nghi ngờ về hiệu quả của các loại vắc-xin này

Trong khu vực, tại Hồng Kông: lợn đã được xác định nhiễm đồng thời cả hai chủng dòng Châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ Tại Thái Lan: có cả hai chủng Bắc Mỹ (chiếm 33,58%) và Châu Âu (chiếm 66,42%) lưu hành Tỷ lệ lưu hành

trung bình của PRRS là 17% Theo Thanawongnuwech et al (2004) Thái Lan đã

có công bố về sự xuất hiện đồng nhiễm cả 2 chủng virus Type 1 và Type 2 ở trên đàn lợn mặc dù trước đó vài năm họ chỉ phân lập được Type 2 mà thôi Tại Philippines: từ đầu năm 2007 đến nay, có 18 ổ dịch làm 13.542 lợn mắc bệnh, chết 1.743 con Dịch bệnh xuất hiện rải rác ở hầu hết các địa phương trong cả nước

Ngày nay hội chứng PRRS đã lan ra khắp thế giới gây thiệt hại kinh tế cho ngành công nghiệp chăn nuôi Genome của PRRSV là một sợi đơn RNA và virus

là thành viên của họ Arteriviridae thuộc lớp Nidovirales Dựa trên phân tích về phát sinh loài virus phân lập khác nhau trên thế giới của Nelson et al (1993)

PRRSV có thể được phân biệt thành hai kiểu gene: loại I, European gienotype gồm virus thuộc dòng Châu Âu, đại diện là chủng Lelystad (LV), gồm 3 subtype

đã được xác định trong đó, subtype 1 được chia thành 12 clade khác nhau,

subtype 2 được chia thành 9 clade (Shiet al., 2010); loại II: Northern American

genotype gồm những virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu là chủng virus Bắc

Mỹ ATCC - VR2332 PRRSV phân lập ở Trung Quốc được chỉ định là thành viên của kiểu gene II Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007) Sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gene

có khoảng 15 kb, mã hóa 9 ORFs Bộ gene PRRSV bao gồm hai gene polymerase là ORF1a và ORF1b và bảy gene cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6, và

7 ORF1a và ORF1b cấu thành khoảng 75% bộ gene của virus và được đặc trưng bởi một quá trình khung ribosome chuyển dịch thành một polyprotein lớn mà sự tự phân tách làm phát sinh các protein không cấu trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc polymerase Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5 tất cả mã hóa cho các protein glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tương ứng Các ORF2b mới được định nghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các hạt virus được chỉ định GP2b ORF7 mã hóa các protein nucleocapsid không glycosyl hóa (N), chiếm 20-40% của hàm lượng protein của virion ORF6 mã hóa các protein tương tự như vậy không glycosyl hóa (M) Heterodimers thành lập bởi GP5 và M đã được tìm thấy trong lưới nội chất của tế bào nhiễm bệnh, và đã được đề xuất được tham gia vào thụ thể tương tác với tế bào nhiễm virus Sự hiện diện của virus có đặc tính di truyền khác nhau trong các lợn nhiễm PRRS có thể làm phức tạp việc kiểm soát bệnh bằng cách tiêm chủng, bởi vì hiệu quả vắc-xin phòng PRRS bị giảm khi virus

đương nhiễm là một loại virus của một kiểu gene khác (Lou et al., 1993) hay của

một nhóm phát sinh khác trong cùng một kiểu gene của chủng vắc-xin gốc

Những nghiên cứu chuyên sâu về cấu trúc virus PRRS và đáp ứng miễn dịch của cơ thể lợn mắc PRRS đã có những thành tựu đáng kể: cấu trúc protein của virus, trình tự hệ gene hay thậm chí các epitop trên bề mặt virus cũng đã được xác định Các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và sản xuất các loại vắc-xin

nhằm kiểm soát và phòng chống bệnh Một số vắc-xin hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới bao gồm các vắc-xin nhược độc như Progressis, Suvaxyn PRRS, Ingelvac PRRS KV, Suipravac PRRS hay các vắc-xin sống nhược độc như Amervac PRRS, Pyrsvac 183, Porcilis PRRS, Ingelvac PRRS MLV

2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS tại Việt Nam

Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS Toàn bộ số lợn này đã được xử lý vào thời gian đó Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2008)

Điều tra huyết thanh học của một số tác giả năm 1999-2003 cho thấy tỷ lệ lợn có kháng thể kháng virus PRRS tại Cần Thơ là 7,7% (37/478 mẫu dương tính với virus PRRS)

Như vậy có thể thấy virus PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta trong một thời gian dài Tuy nhiên, kể từ khi xác định được lợn có kháng thể kháng virus PRRS ở đàn lợn giống nhập từ Mỹ, tại Việt Nam chưa từng có vụ dịch PRRS nào xảy ra

+ Đợt dịch đầu tiên

Năm 2007

Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tại Việt Nam được bắt đầu từ ngày 12/3/2007 khi hàng loạt đàn lợn tại Hải Dương có những biểu hiện ốm khác thường Ngày 23/3/2007, cơ quan thú y tại tỉnh này đã báo cáo cho Cục Thú y, ngay sau đó ngày 26/3/2007, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú

y đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm và cho kết quả dương tính với virus PRRS Do lần đầu tiên dịch PRRS xuất hiện tại Việt Nam và do không quản lý được việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm, dịch PRRS đã lây lan nhanh và phát triển mạnh tại

6 tỉnh thành khác nhau thuộc đồng bằng sông Hồng gồm: Hưng Yên, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Giang và Hải Phòng làm hàng ngàn con lợn mắc bệnh (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

Ngoài các tỉnh được xác định ở trên, Cục thú y cũng đã có kết quả chẩn đoán dương tính với PRRS tại một số đàn lợn thuộc các tỉnh, thành: Thanh Hoá,

Hà Nội, Sơn La và Lào Cai Tuy nhiên, do chỉ xuất hiện ở các đàn riêng lẻ cùng

với các biện pháp xử lý triệt để nên đã không có dịch PRRS phát triển tại các địa phương này

Do thực hiện kiên quyết các biện pháp phòng chống dịch nên sau hơn một tháng dịch PRRS đã được khống chế

+ Đợt dịch thứ 2

Ngày 25/6/2007, dịch lại xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam rồi lan sang một số tỉnh khác như: Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng và Quảng Ngãi làm trên 30 ngàn lợn mắc bệnh, hàng ngàn lợn chết và phải tiêu hủy (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

So với đợt dịch ngoài Bắc, lợn nhiễm bệnh tại các tỉnh miền Trung có tốc

độ chết nhanh hơn, tốc độ lây lan, đặc biệt là tỉnh Quảng Nam cũng nhanh hơn rất nhiều do phát hiện chậm, không kiểm soát được việc vận chuyển lợn ốm ra khỏi vùng dịch

Như vậy chỉ trong 4 tháng dịch PRRS đã xuất hiện ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam với 324 xã thuộc 65 huyện của 19 tỉnh với số lợn chết và phải tiêu hủy là trên 20.000 con Tình hình dịch PRRS vẫn đang diễn biến phức tạp vào không có chiều hướng lắng xuống (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

+ Đợt dịch thứ 3

Theo báo cáo của Cục Thú y (2008), đầu năm dịch tái xuất hiện ở nhiều xã thuộc tỉnh Hà Tĩnh và chỉ 1 tháng sau (tháng 4-2008) dịch đã bùng phát ở 775 xã, phường thuộc 57 huyện, thị của 10 tỉnh: Hà Tĩnh, Thanh Hóa, Quảng Nam, Nghệ

An, Lâm Đồng, Thừa Thiên Huế, Thái Bình, Thái Nguyên, Ninh Bình và Nam Định với tổng số lợn mắc bệnh khoảng 255.250 con, số chết và phải tiêu hủy là 254.242 con Đây là đợt dịch lớn nhất từ trước đến nay

Cho đến tháng 7 năm 2008 tổng số lợn mắc bệnh là 16.677 con, số chết và buộc phải tiêu hủy là 14.799 con Tình hình cho thấy virus gây bệnh đã phân tán rộng và có khả năng bùng phát thành dịch lớn trên cả nước nếu không có biện pháp can thiệp kịp thời (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

Sau một thời gian dài khống chế thành công, ngày 18-2-2009 dịch PRRS trên lợn đã xuất hiện trở lại tại tỉnh Quảng Ninh, dịch bùng phát tại huyện Yên Hưng, Quảng Ninh với tổng số 76 con ốm, trong đó có 23 lợn nái và 53 lợn thịt

Năm 2009

Theo Cục thú y trong năm 2009, dịch PRRS xảy ra lẻ tẻ ở nhiều nơi Theo

thống kê của Cục Thú y, dịch PRRS đã xảy ra tại 14 tỉnh, thành phố trong cả nước làm 7.030 con lợn bị mắc bệnh và phải tiêu hủy 5.847 con (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

Năm 2010

+ Đợt 1: Tại miền Bắc

Theo báo cáo của Cục Thú y, dịch tai xanh xảy ra từ ngày 23/03/2010 tại tỉnh Hải Dương Tính đến hết tháng 6/2010, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch lợn tai xanh tại 461 xã, phường, thị trấn của 71 quận, huyện thuộc 15 tỉnh, thành phố gồm Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng và Sơn

La Tổng số lợn mắc bệnh là 146.051 con, trong đó số tiêu hủy là 65.911 con (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

+ Đợt 2: Tại miền Trung và miền Nam

Đợt dịch này bắt đầu từ ngày 01/06/2010 tại Sóc Trăng Sau đó dịch xuất hiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dương (ngày 27/6), Long An (ngày 15/7), Quảng Trị (ngày 01/7)

Trong đợt dịch này, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch lợn Tai xanh tại 42.080

hộ chăn nuôi của 1.517 xã, phường, thị trấn thuộc 215 quận, huyện của các tỉnh, thành phố: Sóc Trăng, Quảng Trị, Tiền Giang, Long An, Bình Dương, Bạc Liêu, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Phước, Đà Nẵng, Vĩnh Long, Khánh Hòa, Đắk Lắc, Hậu Giang, Bà Rịa – Vũng Tàu, Lâm Đồng, Tây Ninh, An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Kiên Giang, Kon Tum, Cà Mau, Đắc Nông, Gia Lai, Trà Vinh, Bình Thuận, Ninh Thuận, Phú Yên, Thanh Hóa và Hà Tĩnh (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

Theo thông tin tình hình dịch bệnh của Cục Thú y, tổng số lợn trong đàn mắc bệnh là 970.857 con, số mắc bệnh là 717.830 con, trong đó số chết và tiêu hủy là 413.540 con

Ngày 05/08/2010 cả nước có 13 tỉnh là Nghệ An, Cao Bằng, Sóc Trăng, Quảng Trị, Tiền Giang, Lào Cai, Long An, Bình Dương, Bạc Liêu, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Phước và Đà Nẵng có dịch Tai xanh chưa qua 21 ngày (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

Theo kết quả xét nghiệm của Phân viện Thú y miền Trung đã phát hiện virus PRRS (dương tính) tại các huyện Ninh Hòa, Khánh Vĩnh, Cam Lâm và thành Phố Nha Trang của tỉnh Khánh Hòa Ngày 05/08/2010, huyện Ninh Hòa

đã tổ chức tiêu hủy 57 con lợn mắc bệnh tại xã Ninh Quang với tổng trọng lượng trên 5.054 kg

Trên cơ sở diễn biến tình hình dịch bệnh, ngày 06/08/2010 UBND tỉnh Khánh Hòa đã ban hành quyết định công bố dịch Tai xanh tại huyện Ninh Hòa, thành phố Nha Trang; các xã Cam Hòa, Suối Tân, huyện Cam Lâm và xã Khánh Đông, huyện Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hòa (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011)

Năm 2011

Theo báo cáo của Cục Thú y (2011) dịch được ghi nhận nổ ra đầu tiên khi tỉnh Quảng Trị công bố dịch vào ngày 25/03/2011 Sau đó Nghệ An công bố dịch vào ngày 16/04/2011 tiếp đó các tỉnh Thái Bình, Hải Dương, Hà Tĩnh, Bắc Ninh đồng loạt công bố dịch Tổng số lợn mắc bệnh là 14.704 con, số con chết và tiêu hủy là 13.831 con

Theo thống kê của Cục Thú y (2011), riêng tỉnh Nghệ An có 11.858 con mắc bệnh chiếm tỷ lệ 80,64% so với cả nước Tổng số con chết và tiêu hủy là 11.816 con chiếm tỷ lệ 99,64% so với tổng số con mắc của tỉnh và chiếm tỷ lệ 85,43% tổng số lợn tiêu hủy của cả nước tính đến cùng thời điểm Sáu tháng cuối năm không phát sinh thêm ổ dịch mới

Năm 2012

Theo báo cáo của Cục Thú y (2012) dịch tai xanh bắt đầu xảy ra từ 11/01 tại tỉnh Lào Cai; đến những tháng cuối năm toàn quốc đã ghi nhận 14 tỉnh có dịch lợn Tai xanh là Điện Biên, Yên Bái, Nam Định, Phú Thọ, Lào Cai, Lai Châu, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hòa Bình, Lạng Sơn, Bạc Liêu, Đồng Nai, Nghệ

An, Bình Dương Cục Thú y cũng nhận định dịch Tai xanh năm 2012 có diễn biến bất thường hơn so với năm 2011, tốc độ lây lan rất nhanh Tính đến cuối năm 2012 còn 6 tỉnh: Đăk Lăk, Quảng Nam, Phú Yên, Khánh Hòa, Thái Bình và Long An có dịch Tai xanh chưa qua 21 ngày

Năm 2013

Theo thống kê của Cục Thú y (2013), tình hình bệnh diễn ra tương đối phức tạp, bùng phát mạnh thành dịch ở 6 tỉnh thành: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Nam Định, Bắc Ninh và Thái Bình Cục Thú y cũng nhận định dịch Tai xanh năm 2013 có diễn biến bất thường hơn so với năm 2012, tốc độ lây lan rất nhanh, số lượng lợn mắc bệnh phải tiêu hủy cao, tỷ lệ lợn chết và lợn tiêu hủy đã lên đến 18.452 con

đã xảy ra chủ yếu trên các đàn lợn chưa được tiêm phòng vắc xin phòng bệnh tai xanh Căn cứ vào tình hình dịch tai xanh trong thời gian này, có thể thấy virus tai xanh đang tiềm ẩn trong đàn lợn ở một số địa phương Dịch tai xanh mới xảy ra trong thời gian khoảng hơn 1 tháng trước đó tại Căm-pu-chia, trong đó có 3 tỉnh

có đường biên giới với Việt Nam, cũng cho thấy nguy cơ dịch tai xanh có xu

hướng xảy ra trở

Năm 2016

Theo thông tin của Cục Thú y (2016), các địa phương cơ bản vẫn khống chế được dịch Tai xanh trên lợn Tuy nhiên, có thể virus vẫn tồn tại trong môi trường chăn nuôi kết hợp với những diễn biến phức tạp của thời tiết ảnh hưởng xấu đến đàn gia súc nuôi, nên trong thời gian tới dịch có thể xuất hiện và gây ra các ổ dịch nhỏ lẻ trên địa bàn tỉnh có dịch cũ như tỉnh Quảng Trị (5/2016), Hậu Giang (8/2016), Hà Tĩnh (tháng 9/2016), Nghệ An (11/2016)

2.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS

Khi dịch xảy ra, ban đầu một số giả thiết cho rằng 1 số virus như: Parvo virus, virus giả dại (Pseudorabies), virus cúm lợn (Porcine entero virus), đặc biệt

là virus gây viêm cơ tim (Encephalomyo carditis) gây nên Tuy nhiên, mọi sự nhầm lẫn xung quanh vấn đề bệnh nguyên học của PRRS đã được giải quyết vào

tháng 6 năm 1991, Wensvoort et al (1991) ở Viện Thú y Trung Ương Hà Lan đã

phân lập được 1 virus trước đây chưa từng được công nhận từ những con bệnh mắc PRRS ở thành phố nơi đặt Viện Thú y Họ đặt tên virus mới là “Lelystad” Virus được phân lập ở 16 trong 20 lợn con bị bệnh, 41 trong 63 lợn nái bị bệnh, phát hiện thấy 75% trong số 165 lợn nái mắc bệnh có huyết thanh dương tính, có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, ngoài ra còn phát hiện trong bào thai của lợn nái đang có chửa

và ở lợn đang phát triển (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007)

Năm 1992 tại Mỹ các nhà khoa học cũng phân lập được 1 loại virus gây

bệnh PRRS và đặt tên là virus VR2332 (Benfield et al., 1992)

Nguyên nhân gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn là một virus

thuộc họ Arteriviridae, giống Arterivirus, lớp Nidovirales

2.2.1 Cấu trúc virus PRRS

Virus PRRS là một RNA virus chuỗi đơn dương, virus này được xếp vào bộ

Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins et al., 1992) Họ Ateriviridae chỉ có một giống Aterivirus bao gồm hai thành viên là: Equine Ateritis Virus (EAV) gây viêm động mạch, sảy thai và viêm phổi ngựa non; Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSV) gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

Ngày nay các nhà khoa học cho rằng giống Aterivirus còn có hai thành viên nữa là: Lactate Dehydrogennase Elevating Virus (LDEV) gây bệnh trên chuột và Simian Hemorrhagic Fever Virus (SHFV) gây bệnh sốt xuất huyết ở khỉ

và một số loài linh trưởng

Hình 2.1 Hình thái virus PRRS

Nguồn: Dẫn theo Tiêu Quang An (2012) Quan sát virus PRRS dưới kính hiển vi điển tử thấy virus có dạng hình cầu, có vỏ bọc, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra, kích thước 45 - 80nm và chứa nhân nucleocapxit kích thước 25- 35nm

Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng hợp chất ức chế tổng hợp DNA là 5-bromo-2-deoxyuridin, 5-iodo-2-deoxyuridin và mitomycin C chứng tỏ acid nucleic đó là ARN Đây là RNA virus với bộ gene là một phân tử RNA sợi đơn dương Sợi RNA này có đường kính 40 - 70 nm, có vỏ bọc, kích thước khoảng 15 kilobase, có 9 khung đọc mở (ORF − open reading frame) mã hoá cho 9 protein cấu trúc

Hình 2.2 Hình ảnh cấu trúc hệ gene của virus PRRS

Nguồn: Dẫn theo Tiêu Quang An (2012) Tuy nhiên trong cấu trúc của virus PRRS, có 6 phân tử protein chính có khả năng trung hoà kháng thể bao gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 phân tử protein màng (M) và 1 protein vỏ nhân virus (N) Nhƣng hoạt động trung hoà xảy ra mạnh với các protein có khối lƣợng phân tử 45,31 và 25kDa (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Protein cấu trúc của PRRSV Protein

cấu trúc

KL phân tử

GP 5 25 kDa ORF 5 Là protein liên kết vỏ bọc, có vai trò

nhận diện thụ thể trên tế bào đích

Là protein liên kết vỏ bọc có tính bảo tồn cao nhất, đóng vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích

Là protein vỏ bọc nhân có tính kháng nguyên cao, dùng để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn

Nguồn: dẫn theo Delputte et al (2001) và Nathalie et al (2003)

2.2.2 Phân loại virus PRRS

Về tính đa dạng di truyền, virus PRRS có hai prototyp, phân lập ở châu Âu (virus Lelystad-LV) và phân lập ở Bắc Mỹ (VR-2332) Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập, một số nghiên cứu đã chứng minh đƣợc có sự biến dị di truyền mạnh

trong cả hai typ phân lập, được khẳng định qua phân tích trình tự Nucleotid và Aminoacid của các khung đọc mở (ORFs) của LV và VR-2332 Trình tự Aminoacid của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4&5), 91% (ORF6)

và 74% (ORF7) Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hóa do đột biến ngẫu

nhiên và tái tổ hợp trong gene Theo Murtaugh et al (1995), Meng et al (1995) và Nelsen et al (1999) các chủng virus này gây bệnh trên động vật cảm thụ với bệnh

cảnh giống nhau nhưng chúng lại đại diện cho 2 genotyp khác biệt

Những nghiêm cứu gần đây còn cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotide khá cao đến 20% Chủng bắc Mỹ có 3 subtyp: VR-2332, Taiwan và 807/94 phân lập ở Canada Chủng châu Âu có 2 subtyp: I10 phân lập tại Hà Lan và Olot tại Tây Ban Nha Chính sự khác biệt và sự đa dạng về tính khánh nguyên, khả năng biến đổi cấu trúc kháng nguyên của virus đã làm tăng khó khăn cho việc sản xuất vắc-xin chống lại chúng

PRRSV bền vững ở pH dao động trong khoảng 6,5 đến 7,5, tuy nhiên tính

gây nhiễm giảm ở pH < 6,0 hoặc pH > 7,65 (Paton et al., 1991)

Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệt virus Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng

2.2.4 Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS

2.2.4.1 Tính chất nuôi cấy của virus PRRS

Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus Tuy nhiên virus PRRS chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang lợn (Porcine Alveolar Macrophage) và tế bào thận khỉ (Marc 145, CL2621)

PAM là môi trường tốt nhất cho phân lập virus vì nó có độ nhạy cao nhất, virus có thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virus

PRRS trên thế giới Nhưng nhược điểm của nó là phải chuẩn bị môi trường từ những con lợn khỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lên của tế bào là

có giới hạn do đó không thể lưu giữ virus trong thời gian lâu dài (Kim et al., 1993)

Với môi trường là các tế bào dòng như: MA - 104, Marc 145, CL - 2621 hiện đang được sử dụng nhiều hơn và khắc phục được nhược điểm của tế bào PAM MA - 104 chỉ có thể phân lập được các chủng virus của Bắc Mỹ CL -

2621 có thể phân lập virus PRRS chủng châu Âu nhưng hiệu quả phân lập của chúng thấp hơn so với PAM Marc - 145 có thể phân lập được 11 dòng virus của

cả 2 chủng châu Âu và Bắc Mỹ hơn nữa thời gian và mức độ gây bệnh tích tế bào, số lượng virus thu được sau khi phân lập đều đảm bảo yêu cầu nên dòng tế bào này đang được ứng dụng nhiều cho chẩn đoán và nghiên cứu

Theo Yoon and Stevenson (1999) thì không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này mà PAM nhạy cảm với virus hơn so với CL2621, đặc biệt khi mẫu được dùng là huyết thanh Một số tác giả cho rằng PRRSV chủng Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên Marc 145, ngược lại PRRSV chủng Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM Theo những nghiên cứu về dịch tễ học phân tử thì virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam có độ tương đồng cao với virus PRRS chủng châu Mỹ hơn là với virus PRRS chủng châu Âu Vì thế dòng tế bào Marc 145 đã từng được lựa chọn trong hầu hết những nghiên cứu về PRRSV tại Việt Nam

Năm 2010, sau khi có kết quả so sánh về sự tương đồng giữa chủng virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam và chủng PRRS tại Trung Quốc, Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn đã quyết định nhập khẩu vắc-xin phòng PRRS từ Trung Quốc Đây là loại vắc-xin nhược độc đông khô chủng JXA1-R sản xuất từ chủng virus độc lực cao Vắc-xin JXA1-R cũng là dòng vắc-xin được nhược độc hóa qua nhiều lần tiếp truyền trên tế bào Marc 145 Lúc đầu chủng virus JXA1 là chủng virus cường độc, sau 82 đời tiếp truyền trên tế bào Marc 145, chủng virus này trở nên nhược độc và được sử dụng để sản xuất vắc-xin Chỉ số TCID50 của chủng virus này ổn định ở mức độ TCID50/ml ≥ 104 (Yu et al., 2015)

Một chủng virus PRRS cường độc khác phân lập tại Trung Quốc cũng được sử dụng trong nghiên cứu là chủng TJ Chủng virus PRRS này sau khi tiếp truyền qua 92 đời tế bào Marc 145 đã đạt tiêu chuẩn trở thành chủng nhược độc

và được thử nghiệm cho công việc sản xuất vắc-xin (Leng et al., 2012)

Những nghiên cứu sâu hơn cho thấy có sự liên quan giữa những đột biến về genome của virus PRRS với sự thay đổi về nồng độ của những nguyên tố vi lượng trong môi trường nuôi cấy tế bào (Ni, Mn và Fe)

(Grebennikova et al., 2005)

2.2.4.2 Một số nghiên cứu về khả năng nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc 145 thông qua khả năng gây bệnh tích tế bào

Nghiên cứu của Chiou et al (2000) đã tiến hành lựa chọn chủng virus

tw91 hay là chủng MD 001 được phân lập từ các vụ dịch PRRS diễn ra vào năm

1991 Dung dịch virus sau khi được cấy chuyển 7 đời trên môi trường nuôi cấy dòng tế bào Marc 145 và được xác định hiệu giá dựa trên phương pháp của Reed Muench là 106,5 TCID50/ml

Nghiên cứu của De Abin et al (2009) đã sử dụng 2 dòng tế bào là đại thực

bào phế nang (PAM) và MA104 để phân lập virus PRRS từ các mẫu thu thập được Dòng tế bào MA104 có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu Phi Tế bào MA104 được nuôi cấy trên môi trường MEM có bổ sung 2 mM L-glutamine, và muối đệm cơ bản Earle có chứa 1,5g/L NaHCO3, 0,1 mM amino acid không thiết yếu, 1mM dung dịch CH3COCOONa và 10% FBS Hai dòng tế bào đại thực bào phế nang (PAM)

và MA104 được nuôi cấy trên khay 24 giếng với số lượng tế bào trên mỗi giếng tương ứng là 2 x 106 và 2 x 105 tế bào Các giếng tế bào được gây nhiễm với 300 µl dung dịch mẫu huyết thanh kiểm tra với tỷ lệ gây nhiễm (M.O.I) là 2 Sau một giờ ủ

ở nhiệt độ phòng, bổ sung thêm môi trường nuôi cấy và nuôi ở 370

C trong tủ ấm

có bổ sung CO2 Dịch nổi và tế bào được thu thập khi quan sát thấy bệnh tích tế bào (CPE) chiếm khoảng 70% hoặc nhiều hơn sau 6 ngày gây nhiễm hoặc nếu không quan sát thấy bệnh tích Các virus phân lập được kiểm tra lại bằng phương

pháp RT-PCR và miễn dịch huỳnh quang (IF) theo Valicek et al (1997)

Nghiên cứu của Fang et al (2006) đã chọn chủng virus PRRS là YA được

phân lập từ phổi lợn mắc triệu chứng cấp tính với PRRS tại một tỉnh của Trung Quốc và được xác định là thuộc serotype Bắc Mỹ độc lực cao Chủng virus này được nuôi cấy trên môi trường tế bào Marc 145, là một dòng tế bào có nguồn gốc

từ dòng tế bào MA104 thích ứng tốt cho việc nhân lên của virus Tế bào Hela được sử dụng để gây nhiễm Cả tế bào Marc 145 và tế bào Hela được nuôi trong môi trường DMEM, GIBCO có bổ sung 10% FBS, 100 µg/ml streptomycin và

100 IU/ml penicillin, được nuôi cấy ở điều kiện 370C và 5% CO2

Nghiên cứu của Benson et al (2002) đã thực hiện phân lập virus trên môi

trường tế bào Marc 145 có bổ sung vào môi trường nuôi cấy EMEM 10% FCS và gentamycin sulfate (0,05 mg/ml) 200 µl của mẫu được bổ sung thêm 1ml môi trường dinh dưỡng được ủ với môi trường tế bào Marc 145 mọc một lớp ở điều kiện 370C và 5% CO2 Môi trường nuôi cấy tế bào được kiểm tra hàng ngày sau 7 ngày gây nhiễm để phát hiện bệnh tích tế bào Môi trường nuôi cấy (khoảng 0,2ml) được sử dụng để cấy chuyển virus sang đời thứ 2 khi việc phân lập lần 1 không thành công Ở lô đối chứng âm không quan sát thấy bệnh tích tế bào xuất hiện trên môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu của Keirstead et al (2008) đã thực hiện nuôi cấy dòng tế bào

Marc 145 trên môi trường DMEM có bổ sung 5% FBS, 2mL L-Glutamine, 100 đơn vị/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin Tế bào được nuôi cấy ở điều kiện

370C và 5% CO2 Chủng virus PA8 (Bắc Mỹ) được nuôi cấy trên môi trường tế bào Marc 145 được gây nhiễm với dung dịch virus với liều 200 TCID50 và ủ ở điều kiện 370

C và 5% CO2 trong 72 giờ Hỗn dịch sau khi gây nhiễm virus được bảo quản ở -700C và được giã đông 3 lần Kháng nguyên của virus được tinh chế quan đường sucrose gradient nồng độc với ly tâm tốc độ 90 000 g trong 1 giờ Việc tiến hành gây nhiễm virus được thực hiện bằng các trộn hỗn dịch virus với

tế bào, sau đó ủ trong 1 giờ ở 370C với khoảng chừng 2 x 105 tế bào Marc 145 với 100 µl được cho vào mỗi giếng Sau 3 ngày gây nhiễm, từng giếng sẽ được đánh giá bệnh tích tế bào theo phương pháp của Lee and Yoo (2006)

Nghiên cứu của Kreutz (1998) đã thực hiện xác định sự nhân lên của virus trên các dòng tế bào khác nhau, các tế bào được ủ với virus và cố định sau 20 giờ gây nhiễm để xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) Các tế bào được cố định được ủ với kháng kháng thể, sau đó là chất gắn huỳnh quang và được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang

Trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu Li et al (2007), nhóm tác giả đã

thực hiện dòng tế bào Marc 145 và 293A được nuôi cấy trong môi trường DMEM của Gibco-BRL có bổ sung 10% FCS, 170 mM penicillin và 40 mM streptomycin Môi trường nuôi cấy được nuôi trong điều kiện tủ ấm có bổ sung 5% CO2 và được ủ ở điều kiện 370C Sau đó các tế bào được trypsin hóa và chia

ra khay 96 giếng với số lượng tế bào trên mỗi giếng đạt khoảng 104 tế bào/giếng (với khay 24 giếng thì số lượng tế bào đạt 105 tế bào/giếng), các tế bào này được chuẩn bị trước 16h trước khi gây nhiễm Với khay 96 giếng, các tế bào được gây

nhiễm với 0,4 µg/giếng plasmid chứa shRNA bằng cách sử dụng bộ kit FAST Với khay 24 giếng dùng 0,2 µg/giếng pEGFP-N1 cùng với 0,8 µg/giếng plasmid chứa shRNA, tổng là 1 µg/giếng Sau một giờ gây nhiễm, bổ sung môi trường DMEM có 4% FCS, không đổ bỏ dung dịch sau khi gây nhiễm Sau 24 giờ, các

tế bào được gây nhiễm với 10 lần MOI và quan sát bệnh tích tế bào

Nghiên cứu của Tsai et al (2012) đã tiến hành gây nhiễm chủng virus

tw91 được phân lập tại Đài Loan và đã được cấy chuyển 8 đời với hiệu giá virus đạt 107

TCID50/ml Chủng virus này được nuôi cấy trên môi trường tế bào Marc

145 và được quan sát theo dõi bệnh tích tế bào theo phương pháp của nghiên cứu

Chiou et al (2000)

2.2.4.3 Một số nghiên cứu về quy luật nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào

Nghiên cứu của Fang et al (2006) đã thực hiện nghiên cứu đặc điểm sinh

trưởng của virus trong điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào Marc 145 Virus được tiến hành gây nhiễm trên môi trường Marc 145 với giá trị MOI = 0,1 Sau khi gây nhiễm virus với tế bào, tế bào được thu tại các thời điểm 0, 6, 12, 24, 36,

48, 60 và 72 giờ sau khi gây nhiễm, hiệu giá virus được xác định bằng phương pháp miễn dịch huỳng quang gián tiếp trên môi trường tế bào Marc 145 và xác địn số lượng bằng phương pháp huỳnh quang (FFU/ml) Hình thái khuẩn của virus và chủng virus bố mẹ được so sánh với chủng ban đầu trên môi trường Marc 145 Sau khi gây nhiễm 2 giờ, dịch nổi được loại bỏ và bổ sung thêm thạch agar Khuẩn lạc được xác định sau 5 ngày nuôi cấy ở 370C và được nhuộm bằng tinh thể 0,1%

Nghiên cứu của Han et al (2007) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh

trưởng của virus trên dòng tế bào MA 104 trên môi trường nuôi cấy tế bào bằng bình T25 với giá trị MOI là 5 x 104 PFU Sau một giờ ủ ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ, hỗn dịch ủ được loại bỏ khỏi môi trưởng nuôi cấy, sau đó được rửa 3 lần bằng môi trường EMEM Sau khi rửa, 7ml môi trường được thêm vào các bình

và được ủ ở điều kiện 370C với 5% CO2 sau 5 ngày Các mẫu được lấy từ môi trường nuôi cấy tạo các thời điểm gây nhiễm khác nhau và hiệu giá bằng cách tính khuẩn lạc Với chủng virus V7-nsp2324-726 và VR-V7 được gây nhiễm với

103 TCID50 Dịch gây nhiễm virus được lấy 12 giờ và hiệu giá bằng phương pháp pha loãng tới hạn, hiệu giá được xác định dựa trên giá trị TCID50

Hình 2.3 Kết quả quy luật sinh trưởng của virus PRRS

trên môi trường nuôi cấy Marc 145

Nguồn: dẫn theo Han et al (2007) Nghiên cứu của Han et al (2010) đã tiến hành nuôi cấy tế bào Marc 145

trong bình T25, sau đó tiến hành gây nhiễm với giá trị MOI là 0,1 với chủng virus bố mẹ và chủng virus đột biến sau khi cấy chuyển 3 đời Sau khi ủ một giờ

ở nhiệt độ phòng, trộn nhẹ, hỗn dịch gây nhiễm được rửa 3 lần với dung dịch EMEM không có huyết thanh; môi trường sau đó được bổ sung 7ml môi trường nuôi dưỡng Các mẫu được thu thập từ môi trường tại các thời điểm gây nhiễm khác nhau và được xác định khuẩn virus trên môi trường nuôi cấy Marc 145

Hình 2.4 Quy luật nhân lên của virus trên các môi trường nuôi cấy

dòng tế bào BHK-21, Marc 145, 3D4/31

Nguồn: Dẫn theo Huang et al (2009)