Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía bắc việt nam luận án tiến sĩ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lan PGS.TS Phạm Cơng Hoạt NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng thân Các kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Lê Thị Toan i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án tơi nhận giúp đỡ tạo điều kiện nhiều người, sau lời cảm ơn chân thành tôi: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lan PGS.TS Phạm Công Hoạt người trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Nhờ có hướng dẫn nhiệt tình ý kiến đóng góp quý báu thầy, cô mà luận án hồn thành Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ mơn Bệnh lý học Thú y, Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, tồn thể thầy, cô giáo cán Khoa Thú y-Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trang bị cho kiến thức quý báu giúp đỡ hồn thành cơng trình nghiên cứu luận án Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân gia đình quan công tác tạo điều kiện thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Lê Thị Toan ii năm 2017 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xiii Thesis abstract xv Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình PRRS giới Việt Nam 2.1.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS giới 2.1.2 Lịch sử tình hình dịch PRRS Việt Nam 2.2 Một số hiểu biết virus PRRS 12 2.2.1 Cấu trúc virus PRRS 13 2.2.2 Phân loại virus PRRS 15 2.2.3 Sức đề kháng virus PRRS 16 2.2.4 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học virus PRRS 16 2.2.5 Một số nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus PRRS 22 2.3 Một số hiểu biết hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS) 26 2.3.1 Truyền nhiễm học 26 iii 2.3.2 Triệu chứng bệnh tích 31 2.3.3 Chẩn đốn phịng trị bệnh 34 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 39 3.1 Địa điểm nghiên cứu 39 3.2 Thời gian nghiên cứu 39 3.3 Vật liệu nghiên cứu 39 3.4 Nội dung nghiên cứu 40 3.4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam 40 3.4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam 41 3.5 Phương pháp nghiên cứu 41 3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào 41 3.5.2 Phương pháp gây nhiễm virus PRRS tế bào 42 3.5.3 Phương pháp xác định TCID50 43 3.5.4 Phương pháp xác định đường biểu biễn nhân lên virus 44 3.5.5 Phương pháp RT-PCR 44 3.5.6 Phương pháp giải trình tự gene 46 3.5.7 Phương pháp Realtime RT-PCR 47 3.5.8 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm 48 3.5.9 Phương pháp khám lâm sàng 50 3.5.10 Phương pháp mổ khám 50 3.5.11 Phương pháp làm tiêu bệnh lý 50 3.5.12 Phương pháp hóa mơ miễn dịch 50 3.5.13 Phương pháp ELISA 51 3.5.14 Phương pháp phân tích xử lý số liệu phần mềm 51 Phần Kết thảo luận 52 4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía bắc Việt Nam 52 4.1.1 Kết nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 52 4.1.2 Kết nghiên cứu xác định khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 53 4.1.3 Kết nghiên cứu xác định ổn định đời virus qua đời cấy chuyển 57 iv 4.1.4 Kết nghiên cứu xác định đường biểu diễn nhân lên 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 59 4.1.5 Nghiên cứu khả gây bệnh 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam 62 4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía bắc Việt Nam 89 4.2.1 Kết phản ứng RT-PCR 89 4.2.2 Kết giải trình tự gene chủng virus PRRS nghiên cứu 90 4.2.3 Kết truy cập ngân hàng gene 91 4.2.4 So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide chủng virus nghiên cứu 103 4.2.5 So sánh mức độ tương đồng trình tự amino acid chủng virus nghiên cứu 105 4.2.6 Kết xây dựng sinh học phân tử chủng virus nghiên cứu 107 Phần Kết luận kiến nghị 112 5.1 Kết luận 112 5.2 Kiến nghị 113 Danh mục cơng trình cơng bố 114 Tài liệu tham khảo 115 Phụ lục 124 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt BCĐNTT Bạch cầu đa nhân trung tính CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Mơi trường nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thai bò) HE Haematoxylin-Eosin (Thuốc nhuộm tiêu bệnh lý) IHC Immuno Histochemistry (Hóa miễn dịch tổ chức) IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay (Phản ứng miễn dịch có gắn men tế bào lớp) KKT Kháng kháng thể MARC 145 Tế bào thận khỉ MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhược độc) MOI Multiplicity Of Infection (Tỷ lệ số lượng virus số lượng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) OD Optical Density (Mật độ quang) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở hệ gen) PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn) PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn) RNA vi Ribonucleic acid (gen sợi đơn) RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngược) S/P Sample/Positive (giá trị tính tốn phản ứng ELISA) SP Structural protein (Protein cấu trúc) TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (Cơ chất bắt màu huỳnh quang) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm) vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Protein cấu trúc PRRSV 15 3.1 Thông tin nguồn gốc 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 39 4.1 Kết xác định hiệu giá 03 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 chủng virus vắc-xin 52 4.2 Khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 53 4.3 Khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 qua đời cấy chuyển 58 4.4 Hiệu giá 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 qua đời cấy chuyển 58 4.5 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể lợn lô trước gây nhiễm thực nghiệm phương pháp ELISA 63 4.6 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể lợn lô trước gây nhiễm thực nghiệm phương pháp ELISA 63 4.7 Kết xét nghiệm có mặt virus PRRS số virus khác phương pháp RT-PCR 64 4.8 Kết xét nghiệm PRRSV phương pháp RT-PCR 65 4.9 Kết xét nghiệm hàm lượng PRRSV phương pháp Realtime RT-PCR 68 4.10 Bảng tổng hợp triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn gây bệnh thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 73 4.11 Bệnh tích đại thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 76 4.12 Bệnh tích đại thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 (tiếp) 77 4.13 Bệnh tích vi thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 81 4.14 Kết xác định virus PRRS lợn gây bệnh thực nghiệm phương pháp hóa mơ miễn dịch 85 4.15 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu 93 4.16 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu 96 viii 30 Collins J E., D A Benfield, W T Christianson, L Harris, J C Hennings, D P Shaw, S M Goyal, S McCullough, R B Morrison and H S Joo (1992) Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs Journal of Veterinary Diagnostic Investigation Vol (2) pp 117-126 31 De Abin M F., G Spronk, M Wagner, M Fitzsimmons, J E Abrahante and M P Murtaugh (2009) Comparative infection efficiency of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates on MA104 cells and porcine alveolar macrophages Canadian Journal of Veterinary Research Vol 73 (3) pp 200-204 32 Ding B.-l., C.-l Sang, M.-h Yan, X.-l LI, Y.-z Wang and J.-h Huang (2005) Pathological Changes in Piglets Infected with SJ Strain of PRRSV [J] Chinese Journal of Veterinary Vol pp 002 33 Done S., D Paton and M White (1996) Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): a review, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects British veterinary journal Vol 152 (2) pp 153-174 34 Fang L., Y Jiang, S Xiao, C Niu, H Zhang and H Chen (2006) Enhanced immunogenicity of the modified GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virus Genes Vol 32 (1) pp 5-11 35 Fang Y., R R Rowland, M Roof, J K Lunney, J Christopher-Hennings and E A Nelson (2006) A full-length cDNA infectious clone of North American type porcine reproductive and respiratory syndrome virus: expression of green fluorescent protein in the Nsp2 region Journal of virology Vol 80 (23) pp 11447-11455 36 Feng Y., T Zhao, T Nguyen, K Inui, Y Ma, T H Nguyen, V C Nguyen, D Liu, Q A Bui and L T To (2008) Porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007 Emerg Infect Dis Vol 14 (11) pp 1774-1776 37 Gorbalenya A E., L Enjuanes, J Ziebuhr and E J Snijder (2006) Nidovirales: evolving the largest RNA virus genome Virus research Vol 117 (1) pp 17-37 38 Grebennikova T.V., Syroeshkin A.V, Musienko M.I, Zaberezhny A.D and Aliper T.I (2005) Changes of microelement content in Marc-145 cells before and after infection with virulent and attenuated strains of PRRS virus 2005 International PRRS Symposium Westport Conference Center, St Louis, Missouri December 2-3, 2005 39 Halbur P., P S Paul, M Frey, J Landgraf, K Eernisse, X.-J Meng, M Lum, J Andrews and J Rathje (1995) Comparison of the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus Veterinary Pathology Online Vol 32 (6) pp 648-660 40 Han J., G Liu, Y Wang and K S Faaberg (2007) Identification of nonessential regions of the nsp2 replicase protein of porcine reproductive and respiratory 118 syndrome virus strain VR-2332 for replication in cell culture Journal of virology Vol 81 (18) pp 9878-9890 41 Han, J., M.S Rutherford and K.S Faaberg (2010) Proteolytic products of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp2 replicase protein Journal of virology 84 (19) pp 10102-10112 42 Han W., J.-J Wu, X.-Y Deng, Z Cao, X.-l Yu, C.-B Wang, T.-Z Zhao, N.-H Chen, H.-H Hu and W Bin (2009) Molecular mutations associated with the in vitro passage of virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virus genes Vol 38 (2) pp 276-284 43 Harel S., M A Salan and J Kanner (1988) Iron release from metmyoglobin, methaemoglobin and cytochrome c by a system generating hydrogen peroxide Free radical research communications Vol (1) pp 11-19 44 Huang, Y., Y Fang and X Meng (2009) Identification and characterization of a porcine monocytic cell line supporting porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) replication and progeny virion production by using an improved DNAlaunched PRRSV reverse genetics system Virus research 145 (1) pp 1-8 45 Ishibata S., M Mori and H Syazawa (2000) Experimental reinfection with homologous porcine reproductive and respiratory syndrome virus in SPF pigs Journal of Veterinary Medical Science Vol 62 (1) pp 105-108 46 Jaffe, E.R (1981) Methaemoglobinaemia Clin Haematol 10 pp 99-122 47 Keffaber K (1989) Reproductive failure of unknown etiol-ogy Am Assoc Swine Pract Newsl Vol pp 1-9 48 Keirstead N D., C Lee, D Yoo, A S Brooks and M A Hayes (2008) Porcine plasma ficolin binds and reduces infectivity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in vitro Antiviral research Vol 77 (1) pp 28-38 49 Kim H., J Kwang, I Yoon, H Joo and M Frey (1993) Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line Archives of virology Vol 133 (3-4) pp 477-483 50 Kim H K., H J Moon, S J Park, H C Chung, M K Choi, A R Kim and B K Park (2014) ORF5-based evolutionary and epidemiological dynamics of the type porcine reproductive and respiratory syndrome virus circulating in Korea Infection, Genetics and Evolution Vol 21 pp 320-328 51 Kim T., C Park, K Choi, J Jeong, I Kang, S.-J Park and C Chae (2015) Comparison of two commercial type porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) modified live vaccines against heterologous type and 119 type PRRSV challenge in growing pigs Clinical and Vaccine Immunology Vol 22 (6) pp 631-640 52 Kim W.-I., J.-J Kim, S.-H Cha, W.-H Wu, V Cooper, R Evans, E.-J Choi and K.-J Yoon (2013) Significance of genetic variation of PRRSV ORF5 in virus neutralization and molecular determinants corresponding to cross neutralization among PRRS viruses Veterinary microbiology Vol 162 (1) pp 10-22 53 Kreutz, L (1998) Cellular membrane factors are the major determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus tropism Virus research 53 (2) pp 121-128 54 Kwon B., I H Ansari, F A Osorio and A K Pattnaik (2006) Infectious clonederived viruses from virulent and vaccine strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus mimic biological properties of their parental viruses in a pregnant sow model Vaccine Vol 24 (49) pp 7071-7080 55 Lee, C and D Yoo (2006) The small envelope protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus possesses ion channel protein-like properties Virology 355 (1) pp 30-43 56 Leng X., Z Li, M Xia, Y He and H Wu (2012) Evaluation of the efficacy of an attenuated live vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in young pigs Clinical and Vaccine Immunology Vol 19 (8) pp 1199-1206 57 Li B., L Fang, Y J S Liu, H Chen and S Xiao (2014) The genomic and pathogenic characteristics of the highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate WUH2 ISRN Virology Vol 2014 58 Li G., J Huang, P Jiang, Y Li, W Jiang and X Wang (2007) Suppression of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication in MARC-145 cells by shRNA targeting ORF1 region Virus Genes Vol 35 (3) pp 673-679 59 Li R.-g., Y.-l Jiang, J.-l Wang, Y Wu and X.-e Ma (2010) Comparative clinical pathologic study on highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome Journal of Inner Mongolia Agricultural University (Natural Science Edition) Vol pp 003 60 Li J and M P Murtaugh (2012) Dissociation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus neutralization from antibodies specific to major envelope protein surface epitopes Virology Vol 433 (2) pp 367-376 61 Liu Y., W Shi, E Zhou, S Wang, S Hu, X Cai, F Rong, J Wu, M Xu and M Xu (2010) Dynamic changes in inflammatory cytokines in pigs infected with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus Clinical and Vaccine Immunology Vol 17 (9) pp 1439-1445 120 62 Lou S C., C Patel, S Ching and J Gordon (1993) One-step competitive immunochromatographic assay for semiquantitative determination of lipoprotein (a) in plasma Clinical chemistry Vol 39 (4) pp 619-624 63 Meng X.-J., P S Paul, P G Halbur and M A Lum (1995) Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe Archives of virology Vol 140 (4) pp 745-755 64 Metwally S., F Mohamed, K Faaberg, T Burrage, M Prarat, K Moran, A Bracht, G Mayr, M Berninger and L Koster (2010) Pathogenicity and molecular characterization of emerging porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Vietnam in 2007 Transboundary and emerging diseases Vol 57 (5) pp 315-329 65 Murakami Y., A Kato, T Tsuda, T Morozumi, Y Miura and T Sugimura (1994) Isolation and serological characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) viruses from pigs with reproductive and respiratory disorders in Japan Journal of Veterinary Medical Science (Japan) Vol 56 (5) pp 891- 894 66 Murtaugh M., M Elam and L Kakach (1995) Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus Archives of virology Vol 140 (8) pp 1451-1460 67 Nelsen C J., M P Murtaugh and K S Faaberg (1999) Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents Journal of virology Vol 73 (1) pp 270-280 68 Nelson E., J Christopher-Hennings, T Drew, G Wensvoort, J Collins and D Benfield (1993) Differentiation of US and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies Journal of Clinical Microbiology Vol 31 (12) pp 3184-3189 69 Neumann E J., J B Kliebenstein, C D Johnson, J W Mabry, E J Bush, A H Seitzinger, A L Green and J J Zimmerman (2005) Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States Journal of the American Veterinary Medical Association Vol 227 (3) pp 385-392 70 Nodelijk G., M Nielen, M De Jong and J Verheijden (2003) A review of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Dutch breeding herds: population dynamics and clinical relevance Preventive veterinary medicine Vol 60 (1) pp 37-52 71 OIE (2005) Porcine reproductive and respiratory syndrome in south afica: Fllowup report no disease information 18 pp 422-423 121 72 Opriessnig T., P Halbur, K.-J Yoon, R Pogranichniy, K Harmon, R Evans, K Key, F Pallares, P Thomas and X Meng (2002) Comparison of molecular and biological characteristics of a modified live porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine (ingelvac PRRS MLV), the parent strain of the vaccine (ATCC VR2332), ATCC VR2385, and two recent field isolates of PRRSV Journal of virology Vol 76 (23) pp 11837-11844 73 Park C., H W Seo, I Kang, J Jeong, K Choi and C Chae (2014) A New Modified Live Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vaccine Improves Growth Performance in Pigs under Field Conditions Clinical and Vaccine Immunology Vol 21 (9) pp 1350-1356 74 Paton D., I Brown, S Edwards and G Wensvoort (1991) 'Blue ear'disease of pigs Veterinary Record Vol 128 (26) pp 617-617 75 Pol J., J Van Dijk, G Wensvoort and C Terpstra (1991) Pathological, ultrastructural, and immunohistochemical changes caused by Lelystad virus in experimentally induced infections of mystery swine disease (synonym: porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS)) Veterinary Quarterly Vol 13 (3) pp 137-143 76 Shi M., T T.-Y Lam, C.-C Hon, R K.-H Hui, K S Faaberg, T Wennblom, M P Murtaugh, T Stadejek and F C.-C Leung (2010) Molecular epidemiology of PRRSV: a phylogenetic perspective Virus research Vol 154 (1) pp 7-17 77 Terpstra C., G Wensvoort and J Pol (1991) Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad vims: Koch's postulates fulfilled Veterinary Quarterly Vol 13 (3) pp 131-136 78 Thanawongnuwech R., B Thacker, P Halbur and E L Thacker (2004) Increased production of proinflammatory cytokines following infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae Clinical and diagnostic laboratory immunology Vol 11 (5) pp 901-908 79 Tian K., X Yu, T Zhao, Y Feng, Z Cao, C Wang, Y Hu, X Chen, D Hu and X Tian (2007) Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark PloS one Vol (6) pp e526 80 Tsai, Y.-C (2012) The effect of infection order of porcine circovirus type and porcine reproductive and respiratory syndrome virus on dually infected swine alveolar macrophages BMC veterinary research (1) pp 81 Valicek, L (1997) Isolation and identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in cell cultures Veterinarni medicina 42 (10) pp 281-287 122 82 Wensvoort G., C Terpstra, J Pol, E Ter Laak, M Bloemraad, E De Kluyver, C Kragten, L d Van Buiten, A Den Besten and F Wagenaar (1991) Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus Veterinary Quarterly Vol 13 (3) pp 121-130 83 XiaoLei G., L SiDang, L ZhongZi and W TianHu (2009) Comparative pathology of piglets naturally infected with high-pathogenic PRRSV and artificially infected with American strains PRRSV (VR-2332) Chinese Journal of Veterinary Science Vol 29 (4) pp 451-455 84 Yu X., Z Zhou, Z Cao, J Wu, Z Zhang, B Xu, C Wang, D Hu, X Deng and W Han (2015) Assessment of the safety and efficacy of an attenuated live vaccine based on highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) Clinical and Vaccine Immunology pp CVI 00722-14 85 Zimmerman J., K.-J Yoon, R Wills and S Swenson (1997) General overview of PRRSV: a perspective from the United States Veterinary microbiology Vol 55 (1) pp 187-196 86 Zhang M., J Xie, L Sun, Z Cao, H Gu, S Deng, Y Chen, Z Cao, F Tang and S Su (2013) Phylogenetic analysis and molecular characteristics of 17 porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in Southern China from 2010 to 2011 Microbial pathogenesis Vol 65 pp 67-72 87 Zhou Y J., X F Hao, Z J Tian, G Z Tong, D Yoo, T Q An, T Zhou, G X Li, H J Qiu and T C Wei (2008) Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China Transboundary and emerging 123 PHỤ LỤC Đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chủ yếu chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam” Phụ lục Bảng kết nghiên cứu xác định đường biểu diễn nhân lên chủng virus PRRS HUA 01 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi Virus tế bào ( PRRS HUA 01) 2,5 3,83 3,5 4,16 4,83 3,83 3,5 Virus dịch tế bào (PRRS HUA 01) 2,16 3,5 4,5 4,83 4,5 4,83 4,5 Virus tế bào (vắc-xin JXA1) 1,5 3,16 5,5 4,16 3,83 2,83 2,83 Virus dịch tế bào (vắc-xin JXA1) 2,83 3,83 5,5 4,83 5,16 4,16 3,83 Phụ lục Bảng kết nghiên cứu xác định đường biểu diễn nhân lên chủng virus PRRS HUA 02 Virus tế bào (PRRS HUA 02) Virus dịch tế bào (PRRS HUA 02) Virus tế bào (vắc-xin JXA1) Virus dịch tế bào (vắc-xin JXA1) 124 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi 2,16 3,5 4,16 5,5 4,83 3,83 3,5 2,83 3,5 4,83 5,83 4,5 5,16 4,5 1,5 3,16 5,5 4,16 3,83 2,83 2,83 2,83 3,83 5,5 4,83 5,16 4,16 3,83 Phụ lục Bảng kết hàm lượng kháng thể lợn thí nghiệm sau gây nhiễm (S/P) Ngày Lơ thí nghiệm Lơ thí nghiệm Lô đối chứng Lô đối chứng TN1.1 TN1.2 TN1.3 TN1.4 TN1.5 TN2.1 TN2.2 TN2.3 TN2.4 TN2.5 ĐC1.1 ĐC1.2 ĐC1.3 ĐC2.1 ĐC2.2 ĐC2.3 0,22 0,21 0,19 0,12 0,16 0,21 0,22 0,21 0,24 0,23 0,19 0,23 0,20 0,2 0,18 0,14 0,27 0,26 0,22 0,21 0,19 0,26 0,33 0,26 0,3 0,22 0,18 0,15 0,18 0,21 0,19 0,15 0,28 0,28 0,2 0,21 0,22 0,27 0,35 0,28 0,32 0,26 0,2 0,2 0,20 0,2 0,18 0,21 0,35 0,46 0,47 0,37 0,34 0,45 0,47 0,38 0,43 0,48 0,18 0,1 0,20 0,21 0,2 0,2 0,81 0,89 0,9 0,69 0,92 0,89 0,9 0,82 0,96 0,92 0,2 0,11 0,18 0,22 0,18 0,23 11 1,18 1,22 1,28 1,03 1,22 1,47 1,38 1,15 1,26 1,21 0,2 0,13 0,11 0,2 0,2 0,1 13 1,28 1,23 1,26 1,13 1,23 1,54 1,48 1,46 1,35 1,43 0,21 0,11 0,22 0,21 0,2 0,11 15 1,22 1,26 1,12 1,22 1,35 1,42 1,45 1,51 0,2 0,18 0,20 0,23 0,18 0,13 17 1,13 1,16 1,18 1,16 1,3 1,35 1,37 1,42 0,21 0,19 0,21 0,21 0,11 0,11 19 1,02 1,12 1,15 1,06 1,35 1,32 1,31 1,35 0,22 0,16 0,23 0,25 0,19 0,14 21 1,05 1,16 1,13 1,06 1,3 1,25 1,18 1,24 0,11 0,18 0,21 0,2 0,2 0,11 Ghi chú: Chỉ số S/P lơ thí nghiệm (TN) lô đối chứng (ĐC) Lô 1: Lô lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 Lơ 2: Lơ lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02 Lô ĐC: Lô lợn đối chứng (+) Dương tính (-) Âm tính (*) Lợn thí nghiệm chết + Nếu S/P ≥ 0,4 dương tính + Nếu S/P < 0,4 âm tính 125 Phụ lục Thân nhiệt lợn sau gây bệnh thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 (0C) Ngày Lô gây nhiễm PRRS HUA 01 TN1.1 TN1.2 TN1.3 TN1.4 Lô gây nhiễm PRRS HUA 02 TN1.5 TN2.1 TN2.2 TN2.3 TN2.4 Lô đối chứng Lô đối chứng TN2.5 ĐC1.2 ĐC1.2 ĐC1.3 ĐC2.2 ĐC2.2 ĐC2.3 38,5± 0,2 38,6± 0,2 38,5±0,2 38,5± 0,3 38,5±0,2 39,2±0,2 39,3±0,4 39,0±0,2 38,3±0,4 39,4±0,3 38,5±0,1 39,3±0,4 38,5 ±0,3 39,3 ±0,4 38,5± 0,2 38,6± 0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,3 39,2± 0,2 39,3± 0,4 38,3± 0,2 38,5± 0,2 38,3± 0,2 38,5± 0,2 38,3± 0,2 38,0± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 38,5 ±0,1 38,4± 0,2 38,50 ± 0,1 38,4± 0,2 39,9± 0,2 39,4±0,2 39,4±0,3 40,1 ±0,3 39,8±0,3 40,2 ±0,3 39,4± 0,2 39,4± 0,2 39,4± 0,3 38,35±0,1 38,3 ± 0,1 38,3 ±0,1 38,4 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 40,3± 0,2 40,1±0,3 40,1 ±0,3 40,2 ±0,3 40,1 ±0,3 40,0±0,1 40,3 ±0,1 40,2 ±0,3 39,7± 0,2 40,2 ± 0,3 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,6± 0,2 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 40,4 ±0,3 40,2±0,3 40,1±0,3 40,3±0,3 40,4±0,5 40,0±0,3 40,4± 0,3 40,3± 0,3 40,2 ± 0,1 40,1 ± 0,3 38,5 ±0,1 38,50 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,5± 0,1 38,5± 0,2 38,5± 0,2 40,5 ±0,3 40,2±0,3 40,4±0,5 40,2 ±0,3 40,2±0,5 40,4±0,5 40,4± 0,3 40,2± 0,3 40,2± 0,3 40,4± 0,5 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,6± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 41,8 ±0,1 41,8±0,1 41,2±0,5 41,6±0,1 41,7±0,4 41,6±0,4 41,2 ±0,5 41,6± 0,1 41,8 ± 0,1 41,2± 0,5 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,4 ±0,1 38,4± 0,2 38,4± 0,2 41,7 ±0,1 41,2±0,1 41,7±0,4 41,6±0,2 41,4±0,2 41,4±0,2 41,7± 0,4 40,7± 0,1 41,2 ± 0,1 41,7 ± 0,4 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,5± 0,2 38,4 ± 0,1 38,45 ± 0,1 41,8 ±0,3 41,0±0,3 41,4±0,2 41,5±0,2 41,6±0,1 41,5±0,1 41,4± 0,2 40,8± 0,3 41,0 ± 0,3 41,4± 0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,2 38,5 ±0,1 38,1± 0,2 38,4± 0,2 10 41,6 ±0,2 41,5±0,2 41,6±0,1 41,6±0,2 41,5±0,2 41,3±0,2 41,6± 0,1 41,6± 0,2 41,5 ± 0,2 41,6 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 11 41,7 ±0,2 41,6±0,2 41,5±0,2 41,6±0,2 41,5±0,1 41,8±0,2 41,5± 0,2 41,6± 0,2 41,6 ± 0,2 41,5 ± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,5 ±0,1 38,4± 0,2 38,6± 0,2 12 41,5± 0,3 41,5±0,2 41,5±0,1 41,1±0,3 41,4±0,2 41,3±0,1 41,5± 0,1 41,5± 0,3 41,5± 0,2 41,51±0,1 38,4 ± 0,1 38,45 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,5± 0,2 38,4 ± 0,1 38,5 ± 0,1 13 41,8± 0,2 40,8±0,2 41,0±0,2 41,1±0,2 40,8±0,1 40,8±0,2 41,4± 0,2 41,8± 0,2 40,8± 0,2 41,0 ± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,1± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 38,6± 0,2 14 * 40,5±0,2 40,5±0,1 40,8±0,2 39,3 ±0,2 40,3±0,2 41,0± 0,1 41,3 ±0,2 40,5± 0,2 40,5 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 15 * 39,6±0,2 39,6±0,2 39,5 ±0,2 39,6±0,2 39,3±0,2 40,5±0,1 * 39,6±0,2 39,6 ± 0,2 38,6± 0,2 38,6± 0,2 38,6± 0,2 38,4 ± 0,1 38,6± 0,2 38,5± 0,2 16 * 38,5±0,4 39,1±0,2 38,7 ±0,2 38,6 ±0,2 39,1±0,1 39,6±0,2 * 38,5±0,4 39,1 ± 0,2 38,5± 0,1 38,5 ± 0,1 38,5± 0,1 38,4± 0,2 38,5± 0,1 38,5 ±0,1 17 * 38,6±0,3 38,5±0,3 38,5 ±0,3 38,5±0,3 38,5±0,4 39,1±0,2 * 38,6±0,3 38,5± 0,3 38,6± 0,2 38,6± 0,2 38,0± 0,2 38,4 ± 0,1 38,4 ± 0,1 38,5± 0,2 18 * 38,4±0,3 38,8±0,2 38,8±0,2 38,8±0,2 38,5±0,1 38,5±0,3 * 38,4±0,3 38,8± 0,2 38,4 ±0,1 38,4 ± 0,1 38, ±0,1 38,6± 0,2 38,4± 0,2 38,4 ± 0,1 19 * 38,4±0,4 38,5±0,2 38,5±0,2 38,5±0,2 38,5±0,4 38,8±0,2 * 38,4±0,4 38,5±0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,2 38,5± 0,1 38,4 ± 0,1 38,4± 0,2 20 * 38,5±0,1 38,4±0,1 38,7±0,1 38,6±0,1 38,6±0,1 38,5±0,2 * 38,5±0,1 38,4±0,1 38,5 ±0,1 38,5 ± 0,1 38,5 ±0,1 38,4 ± 0,1 38,6± 0,2 38,4 ± 0,1 21 * 38,5±0,3 38,4±0,1 38,4±0,1 38,4±0,1 38,6±0,4 38,6±0,4 * 38,5±0,3 38,4±0,1 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,4± 0,2 38,6± 0,2 38,5 ± 0,1 38,5 ± 0, 39,4±0,2 Ghi chú: Thân nhiệt lơ thí nghiệm (TN) lơ đối chứng (ĐC) lấy giá trị trung bình cộng hai lần đo ngày(*) Lợn thí nghiệm chết 126 Phụ lục Bảng kết xét nghiệm PRRSV phương pháp RT-PCR Lô TN1 gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 Dịch ngoáy Máu mũi 5/55/52/5+ 5/55/5+ 3/5+ 5/5+ 5/5+ 5/5+ 5/5+ 5/5+ 11 13 15 17 19 21 5/5+ 5/5+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 5/5+ 5/5+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 5/5+ 5/5+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ Ngày gây nhiễm Lô TN2 gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 Dịch ngoáy Máu mũi 5/55/54/5+ 5/55/5+ 4/5+ 5/5+ 5/5+ Lơ ĐC1 ĐC2 6/66/66/66/6- Dịch ngốy mũi 6/66/66/66/6- 5/5+ 6/6- 6/6- 5/5+ 5/5+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 4/4+ 6/66/66/66/66/66/6- 6/66/66/66/66/66/6- Máu Ghi chú: (+) Dương tính: Virus xuất máu thải qua dịch ngoáy mũi (-) Âm tính: khơng xuất virus máu thải qua dịch ngốy mũi Lơ TN1 có 01 lợn thí nghiệm chết vào số 13 sau gây nhiễm Lô TN2 có 01 lợn thí nghiệm chết vào ngày số 14 sau gây nhiễm Lô ĐC1, ĐC2: Lô đối chứng lô đối chứng 127 Phụ lục Một số hình ảnh triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể nhuộm hóa mơ miễn dịch lợn gây nhiễm thực nghiệm Hình Xuất huyết da tai, mõm Hình Hai chân sau sưng to Hình Phân lợn tiêu chảy Hình Phân lợn táo bón Hình Não sung huyết Hình Thận xuất huyết đinh ghim 128 Hình Phổi viêm, bề mặt phổi căng bóng Hình Hạch màng treo ruột tụ máu Hình Virus phân bố phổi (IHC.20X) Hình 10 Virus phân bố hạch ruột (IHC.10X) Hình 11 Virus phân bố phổi (IHC.20X) Hình 12 Virus phân bố hạch (IHC.10X) 129 Phụ lục Các chủng tham chiếu sử dụng để xây dựng sinh học phân tử Mã hiệu (Accession number) Tên chủng virus STT Gene Full gene U87392 ATCC VR-2332 Hoa Kỳ 1990 Full gene M96262 Lelystad Hà Lan 1991 Full gene AY032626 CH-1a TQ 1995 ORF5 U66380 34075-NE Hoa Kỳ 1996 ORF5 AF121131 MD-001 Đài Loan 1997 Full gene DQ779791 Prime Pac Hoa Kỳ 1998 ORF5 AF176476 PRRSV55 Hoa Kỳ 2000 ORF5 AF339494 98-31701-1 Hoa Kỳ 2001 ORF5 AY297118 02SP3 Thái Lan 2002 10 ORF7 AY209228 31D Mexico 2003 11 Full gene EF532801 INGELVAC ATP Hoa Kỳ 2004 12 Full gene FJ536165 NB/04 Trung Quốc 2004 13 ORF5 AY656993 SDSU73 Hoa Kỳ 2005 14 Full gene GU269541 GD3 Trung Quốc 2005 15 Full gene DQ176019 MN184A Hoa Kỳ 2005 16 Full gene EF112445 JXA1 Trung Quốc 2006 17 Full gene EU864233 TP Trung Quốc 2006 18 Full gene EF635006 HUN4 Trung Quốc 2006 19 ORF7 EF441853 06K805 Hàn Quốc 2006 20 Full gene FJ394029 07QN Việt Nam 2007 21 Full gene FJ393457 07HEN Việt Nam 2007 22 ORF5 EU758940 PRRSV0000008973 Hoa Kỳ 2007 23 ORF5 JQ860371 DN153 Việt Nam 2008 24 ORF5 JQ860362 DN444 Việt Nam 2008 25 ORF5 EU556160 2000-5424 Hoa Kỳ 2008 26 ORF5 AB546105 Miyagi08-2 Nhật Bản 2008 27 ORF7 JQ860392 DN444 Việt Nam 2008 28 ORF7 JQ860396 DN499 Việt Nam 2008 29 ORF7 JQ860394 DN456 Việt Nam 2008 130 Quốc gia Năm phân lập STT Gene Mã hiệu (Accession number) Tên chủng virus Quốc gia Năm phân lập 30 ORF5 GU187014 BCL-PS 100 Singapore 2009 31 Full gene FJ895329 SX2009 Trung Quốc 2009 32 ORF5 JQ860372 DN292 Việt Nam 2009 33 ORF7 JQ860398 DN42 Việt Nam 2009 34 Full gene GU168567 09HUB7 Trung Quốc 2009 35 ORF5 JQ860375 DN1 Việt Nam 2010 36 Full gene HM214915 GX09-32 Trung Quốc 2010 37 Full gene JQ663556 10-10QN Trung Quốc 2010 38 ORF7 JQ860408 DN1 Việt Nam 2010 39 ORF5 JN642707 SHZ-2010 Trung Quốc 2010 40 ORF5 JQ860378 DN11 Việt Nam 2010 41 Full gene JF748718 DC Trung Quốc 2010 42 ORF7 JQ860410 HCM.CC3 Việt Nam 2010 43 ORF7 JQ860413 BD.X13 Việt Nam 2010 44 ORF7 JQ860411 HCM.D06 Việt Nam 2010 45 ORF7 JQ860412 BD.R1 Việt Nam 2010 46 ORF7 HM027592 LC Trung Quốc 2010 47 ORF7 KM659199 HCM2011-1P Việt Nam 2011 48 ORF5 KC263023 HUAY2-11 Trung Quốc 2011 49 ORF5 AB856283 HUA-Vet.labPRRS1 Việt Nam 2011 50 ORF5 AB856284 HUA-Vet.lab PRRS2 Việt Nam 2011 51 ORF5 JQ860387 DT7 Việt Nam 2012 52 Full gene KP771773 NVDC-HeB1-2012 Trung Quốc 2012 53 ORF7 JQ860414 CT.C1 Việt Nam 2012 54 Full gene KP771770 NVDC-HuN-2011 Trung Quốc 2012 55 ORF5 AB856286 HUA-Vet.lab PRRS4 Việt Nam 2012 56 ORF5 JQ860382 CT.C1 Việt Nam 2012 57 ORF5 JQ860391 HG.RV2 Việt Nam 2012 58 ORF5 JQ860389 DT9 Việt Nam 2012 59 ORF5 AB856285 HUA-Vet.lab PRRS3 Việt Nam 2012 60 ORF7 JQ860422 HG.RV1 Việt Nam 2012 131 STT Gene Mã hiệu (Accession number) Tên chủng virus Quốc gia Năm phân lập 61 ORF7 JQ860423 HG.RV2 Việt Nam 2012 62 Full gene JX087437 SD16 Trung Quốc 2012 63 ORF7 KP771764 NVDC-BJ1-2012 Trung Quốc 2012 64 Full gene JQ955657 GX1001 Trung Quốc 2013 65 ORF5 KM244763 MN1 Việt Nam 2013 66 ORF5 KF699846 HP1 Việt Nam 2013 67 ORF5 AB856287 HUA-Vet.lab PRRS5 Việt Nam 2013 68 Full gene KP771739 NVDC-SC1-2014 Trung Quốc 2014 69 ORF5 KU556995 HENHB1 Trung Quốc 2014 70 Full gene KP771739 NVDC-SC1-2014 Trung Quốc 2014 71 ORF5 KC263033 ZQ5-GD-11 Trung Quốc 2014 72 Full gene KP998478 FJZH Trung Quốc 2015 73 ORF5 LC102499 KTY-PRRS-01 Việt Nam 2015 74 ORF5 LC102500 KTY-PRRS-02 Việt Nam 2015 75 ORF5 LC102501 KTY-PRRS-03 Việt Nam 2015 132 ... Nghiên cứu khả gây bệnh 02 chủng virus PRRS HUA 01 PRRS HUA 02 phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam 62 4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập số. .. virus phân lập biến chủng dùng dịch tễ học phân tử Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 02 chủng. .. học phân tử 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định số đặc tính sinh học chủ yếu 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 - Xác định số đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02