Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)

Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh Care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)

HC VIN NễNG NGHIP VIT NAM TRN VN NấN NGHIấN CU C IM BNH Lí CH YU CA BNH CARE TRấN CHể, C IM SINH HC V SINH HC PHN T CA VIRUS CARE PHN LP C TI MT S TNH PHA BC VIT NAM Chuyờn ngnh: Bnh lý hc v cha bnh vt nuụi Mó s: 62.64.01.02 TểM TT LUN N TIN S H Ni - Nm 2017 Cụng trỡnh c hon thnh ti: HC VIN NễNG NGHIP VIT NAM Ngi hng dn khoa hc: PGS TS NGUYN TH LAN PGS TS NGUYN VN THANH Phn bin 1: PGS TS PHM VN HOT B KHOA HC CễNG NGH Phn bin 2: PGS.TS Tễ LONG THNH TRUNG TM CHUN ON TH Y TRUNG NG Phn bin 3: TS NG THANH SN VIN TH Y Lun ỏn s c bo v trc Hi ng ỏnh giỏ lun ỏn cp Hc vin hp ti Hc vin Nụng nghip Vit Nam vo hi gi ngy thỏng nm 2017 Cú th tỡm hiu lun ỏn ti th vin: - Th vin Quc gia Vit Nam - Th vin Lng nh Ca - Hc vin Nụng nghip Vit Nam PHN M U 1.1 TNH CP THIT CA TI Bnh Care hay bnh si st l mt bnh truyn nhim cp tớnh nguy him thng xy con, lõy lan nhanh v t l cht rt cao Bnh Care c bit ti l cn bnh nguy him nht trờn na u th k 19 Bnh Care c bỏo cỏo ln u tiờn chõu u vo nm 1760 (Appel and Gillespie, 1972) Cỏc triu chng lõm sng v tin trin ca bnh ó c mụ t ln u tiờn vo nm 1809 bi EdwardJenner (Appel and Gillespie, 1972); (Shell, 1990) v virus Care ó c phõn lp vo nm 1905 Bnh Care xy rng rói trờn ton th gii, xy mt s nc nh M, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi v nhiu nc chõu u, gn õy nht l cỏc nc chõu nh Nht Bn (Lan et al., 2006a), Thỏi Lan (Keawcharoen et al., 2005), Hn Quc (An et al., 2008) v n (Latha et al., 2007) Nguyờn nhõn gõy bnh Care trờn l virus Care (Canine distemper virus - CDV) CDV l mt thnh viờn ca ging Morbillivirus, thuc h Paramixoviridae Cỏc thnh viờn khỏc ca ging Morbillivirus nh virus gõy bnh si trờn ngi (Measles virus - MV), virus dch t trõu bũ (Rinderpest virus - RPV), virus gõy bnh trờn ng vt nhai li nh (Peste des petits ruminants virus - PPRV), virus gõy bnh trờn ng vt cú vỳ di nc (cỏ heo, hi cu) (Murphy et al., 1999) Virus Care cng gõy bnh trờn ng vt hoang dó n tht v h (Appel et al., 1994); (Frửlich et al., 2000); (Martella et al., 2002) Virus Care cú cu to gm mt si RNA n khụng phõn on gm khong 15.690 nucleotide Trong cu trỳc b gene gm gene mó húa cho cỏc protein nh protein to lp v bc (M), hai glycoprotein (yu t kt dớnh (H), yu t kt hp virus vi th th trờn mng t bo (F)), hai protein cú liờn quan ti s chộp RNA (phosphoprotein P v large protein L) v nucleocapsid N úng gúi RNA ca virus (Sidhu et al., 1993) Da trờn trỡnh t ca protein Haemagglutinin (H), Harder and Osterhaus, (1997) v Martella et al., (2006) ó phõn loi virus Care thnh nhúm chớnh theo vớ trớ a lý gm: Arctic like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife CDV l virus gõy nhim hng lympho, niờm mc v mụ thn kinh Trc õy, cỏc nh nghiờn cu ó tin hnh phõn lp CDV trờn cỏc mụi trng nh dũng t bo biu mụ v nguyờn bo si, t bo lympho ca (Appel et al., 1992), i thc bo ph nang ca (Appel, 1978), i thc bo mng bng chn sng (Poste, 1971), x phụi g (Ezeibe, 2005) Tuy nhiờn vic phõn lp v xỏc nh hiu giỏ virus Care rt khú khn khụng cú dũng t bo no thớch hp virus sinh trng v gõy bnh tớch t bo Qua nghiờn cu ca Seki et al (2003) v Lan et al (2005a) ó ch Vero-DST l dũng t bo thớch hp, cú th s dng phõn lp v xỏc nh hiu giỏ virus Vit Nam, bnh Care c phỏt hin t nm 1920 Chú phỏt bnh thng cht vi t l cht 50-80%, cú th lờn n 100% nu khụng c iu tr kp thi (H ỡnh Chỳc, 1993) Cho n nay, bnh Care xy hu ht cỏc tnh v gõy thit hi ln cho n nuụi nc t l t vong ca bnh rt cao (Lờ Th Ti, 2006) Nhng cỏc nghiờn cu v bnh lý, c tớnh sinh hc v di truyn ca virus Care nc cũn rt khiờm tn, bờn cnh ú hiu qu bo h ca cỏc vacxin phũng bnh Care ang lu hnh hin cha cao cng nh cha cú nhiu bỏo cỏo c th Xut phỏt t thc tin ú, ti ny chỳng tụi tin hnh nghiờn cu v c im bnh lý ch yu ca mc Care, ng thi nghiờn cu v c tớnh sinh hc v sinh hc phõn t ca virus Care phõn lp ti Vit Nam Kt qu nghiờn cu cú ý ngha rt quan trng giỳp cỏc bỏc s thỳ y c s ti cỏc phũng mch hay c quan nghiờn cu vic chn oỏn bnh da vo c im bnh lý c trng ca bnh v la chn c ngun mu bnh phm phc v cho vic chn chng virus ch vacxin phũng bnh hiu qu, ch to kit chn oỏn, ch to khỏng nguyờn dựng chn oỏn gúp phn gim thiu thit hi kinh t bnh Care gõy cho n nuụi nc 1.2 MC TIấU CA TI Xỏc nh c mt s c im bnh lý ch yu ca mc bnh Care cng nh c tớnh sinh hc v sinh hc phõn t ca virus Care phõn lp c ti mt s tnh phớa Bc Vit Nam Kt qu nghiờn cu l c s cho vic chn oỏn phỏt hin bnh da vo triu chng lõm sng Bờn cnh ú, thụng tin v cỏc c tớnh sinh hc v sinh hc phõn t ca cỏc virus Care giỳp cho vic sng lc v la chn c chng virus cú tim nng sn xut vacxin v cỏc ch phm sinh hc phc v cụng tỏc chn oỏn, phũng v iu tr bnh Care 1.3 PHM VI NGHIấN CU - i tng nghiờn cu l mc bnh Care, mu virus Care phõn lp c t cỏc mc bnh Care - Thi gian nghiờn cu: t thỏng 6/2014 ti thỏng 12/2016 - a im nghiờn cu: + Bnh vin thỳ y, Khoa Thỳ y, Hc vin Nụng nghip Vit Nam + B mụn bnh lý thỳ y, Khoa Thỳ y, Hc vin Nụng nghip Vit Nam + Phũng thớ nghim trng im cụng ngh sinh hc thỳ y, Khoa Thỳ y, Hc vin Nụng nghip Vit Nam 1.4 NHNG ểNG GểP MI CA TI õy l cụng trỡnh nghiờn cu hon chnh v cú h thng v c im bnh lý bnh Care v c im sinh hc v sinh hc phõn t ca chng virus phõn lp c t ging (3-6 thỏng tui) mc bnh Care thu thp t tnh phớa Bc Vit Nam: H Ni, Hng Yờn, Thỏi Bỡnh, Bc Giang, Nam nh 1.5 í NGHA KHOA HC V THC TIN CA TI 1.5.1 í ngha khoa hc Kt qu nghiờn cu l ti liu tham kho dựng ging dy v nghiờn cu v bnh Care cỏc trng, vin nghiờn cu chuyờn ngnh thỳ y õy cng l t liu khoa hc quý bỏu v cn thit cho nhng ngi lm cụng tỏc thỳ y c s v bnh Care ng thi, thụng tin chi tit ca cỏc chng ging virus Care phõn lp c cú ý ngha vic xõy dng ngõn hng h s chng ging gc, phc v cho cỏc bc ng ký chng ging vi ngõn hng bo tn ngun gene quc gia 1.5.2 í ngha thc tin ti ó thu thp, sng lc v ỏnh giỏ cỏc c tớnh sinh hc v sinh hc phõn t ca chng virus Care ang gõy bnh ti mt s tnh phớa Bc Vit Nam chng virus phõn lp c cú tim nng cho chn ging sn xut vacxin hoc ch to kit, lm khỏng nguyờn cho chn oỏn hoc lm ging cụng cng c ỏnh giỏ hiu qu bo h v kim nghim vacxin Kt qu nghiờn cu to tin giỳp thỳc y cỏc nghiờn cu phỏt trin sn xut vacxin nc t chớnh cỏc chng virus ang lu hnh ti thc a, t ú nõng cao hiu qu phũng bnh PHN TNG QUAN TI LIU 2.1 TèNH HèNH NGHIấN CU BNH CARE TRONG V NGOI NC 2.1.1 Tỡnh hỡnh nghiờn cu nc Nghiờn cu v c im bnh lý ch yu ca mc bnh Care c thc hin bi cỏc tỏc gi nh: H ỡnh Chỳc (1993); Lờ Th Ti (2006); Tụ Du v Xuõn Giao (2006); Lan et al., (2008); Nguyn Th Lan v Khao Keonam (2012); Nguyn Th Lan v cs., (2015) Nghiờn cu v c tớnh sinh hc v sinh hc phõn t ca virus Care c thc hin bi cỏc tỏc gi nh: Nguyn Th Lan v cs (2012); Lan et al., (2008); Lan et al., (2009a) 2.1.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cu ngoi nc Nghiờn cu v c im bnh lý ch yu ca mc bnh Care c thc hin bi cỏc tỏc gi nh: Appel (1969), McCullough et al., (1974); Miry et al (1983); (Shell, 1990); Summers and Appel, (1994); Maeda et al., (1994); (Bittegeko et al., 1994); (Baumgọrtner et al., 1995); Appel and Summers, (1995); Grone et al., (2003); Amude et al., (2006); Amude et al., (2007); Kubo et al (2007); Del Puerto et al (2010) Nghiờn cu v c tớnh sinh hc v sinh hc phõn t ca virus Care c thc hin bi cỏc tỏc gi nh: Appel et al., (1992); Appel, (1978); Poste, (1971); Carpenter et al., (1992); Haas et al., (1997); Harder and Osterhaus, (1997); Iwatsuki et al., (1997); Mochizuki et al., (1999); von Messling et al., (2001); Seki et al., (2003); Hirama et al., (2004); Ezeibe, (2005); Martella et al., (2006); Lan et al., (2005a; 2005b; 2005c; 2006a; 2006b; 2007; 2008; 2009a; 2009b); Tan et al., (2011); Guo et al., (2013) 2.2 MT S THễNG TIN V VIRUS CARE 2.2.1 Phõn loi virus gõy bnh Care Canine Distemper Virus (CDV) l mt thnh viờn ca ging Morbillivirus, thuc h Paramixoviridae 2.2.2 Hỡnh thỏi ca virus Care Hỡnh thỏi virus quan sỏt c thy di kớnh hin vi in t cú hỡnh vũng trũn, hỡnh bỏn nguyt cỏc si cun quanh trũn m thnh Dng trũn ny cú ng kớnh o c 115nm n 230nm Mng cun kộp cú dy 75 n 85Ao vi b mt ph cỏc si xon c t bờn (Kennedy et al., 1989) 2.2.3 Cu trỳc ca virus Care Virus Care khụng phõn on, si õm tớnh, si n, vi b gene RNA c chng khong 15,7 Kb v cú v bc vi ng kớnh cú kớch thc t 150 ti 300 nm (Murphy et al., 1999) 2.2.4 Sc khỏng ca virus Care Virus Care l mt virus khụng n nh v nhy cm vi nhit , tia UV, dung mụi hũa tan lipid, cht ty v cht ụxy húa (Grửne et al., 1998) mc dự nú cú v bc protein chng li s vụ hot ca cỏc tỏc nhõn bờn ngoi 2.2.5 C ch sinh bnh Virus gõy bnh Care l virus gõy nhim hng mụ lympho, niờm mc v mụ thn kinh u tiờn, virus nhõn lờn mụ lympho ca h hụ hp Sau ú virus nhim vo cỏc dch bch huyt ri vo mỏu gõy bi huyt Virus tỏc ng n ni mc mch mỏu v gõy st, st kộo di t - ngy Virus theo mỏu vo h hụ hp, h tiờu húa, h tit niu v h thng thn kinh trung ng cng nh dõy thn kinh th giỏc t ngy sau, cn st th xut hin, biu hin trm trng hn cỏc nhim trựng nng ph tng 2.2.6 c tớnh sinh hc ca virus Care Nghiờn cu ca Seki et al., (2003) ó lm rừ nhng c tớnh sinh trng khỏc gõy nhim cỏc CDV lờn t bo Vero v t bo Vero-DST Qua ú, cú th nhn thy, t bo Vero-DST l dũng t bo thớch hp, cú th s dng phõn lp v xỏc nh hiu giỏ virus (Lan et al., 2005a; 2005b; 2006b) 2.2.7 c tớnh sinh hc phõn t ca virus Care Cu trỳc ca virus Care gm protein khụng cu trỳc (C) v protein cu trỳc gm: Large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) v matrix protein (M) (Diallo, 1990) Phõn loi theo a lý ca virus Care da trờn trỡnh t ca protein H (Harder and Osterhaus, 1997) gm nhúm chớnh: Arctic like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife 2.3 MT S THễNG TIN V BNH CARE 2.3.1 c im dch t ca bnh Care Bnh Care xut hin trờn ton th gii Trong t nhiờn tt c cỏc ging u cm th vi virus Care, nhng ngoi mn cm hn ni Virus Care cng gõy bnh trờn ng vt hoang dó n tht (Appel et al., 1994) Trong t nhiờn hu ht xy t n 12 thỏng tui, nhiu nht l t n thỏng tui Bnh xy quanh nm nhng xut hin nhiu cú s thay i thi tit c bit l nhng ngy ma, m cao Vit Nam, bnh thng din vo thi im giao mựa, t xuõn sang hố Chú phỏt bnh thng cht vi t l cht 50 - 80%, thm lờn n 100% nu khụng iu tr kp thi (H ỡnh Chỳc, 1993) 2.3.2 Triu chng bnh tớch Triu chng ca bnh thng liờn quan ti h thng hụ hp, tiờu húa v h thng thn kinh Bnh Care thng cú c im st hai giai on, kốm theo tit dch mt mi, sau ú l dch m, chỏn n, viờm kt mc, viờm ph qun, viờm phi, viờm d dy rut, v triu chng thn kinh (Summers and Appel, 1994) Theo Appel and Summers (1995) bnh tớch i th cú th gp bao gm sng hoỏ mừm v gan bn chõn 2.3.3 Chn oỏn bnh Care Da vo c im dch t hc ca bnh, triu chng lõm sng chn oỏn bnh Care Trong phũng thớ nghim cú th ỏp dng cỏc phng phỏp nh xột nghim mỏu, tỡm th Lents, chn oỏn virus hc, ELISA, nhum húa mụ dch, dch hunh quang, RT-PCR, kit chn oỏn nhanh 2.3.4 Phũng v iu tr bnh Phũng bnh bng v sinh v tiờm phũng vacxin iu tr bng dựng khỏng huyt thanh: liu 15 30 ml/con, tiờm sm Khi vt ó cú triu chng viờm phi hay triu chng thn kinh thỡ khỏng huyt khụng cú hiu lc PHN VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 3.1 A IM NGHIấN CU - Bnh vin thỳ y, khoa Thỳ y, Hc vin Nụng nghip Vit Nam - B mụn bnh lý thỳ y, khoa Thỳ y, Hc vin Nụng nghip Vit Nam - Phũng thớ nghim trng im cụng ngh sinh hc thỳ y, khoa Thỳ y, Hc vin Nụng nghip Vit Nam 3.2 THI GIAN NGHIấN CU Thi gian: t thỏng 6/2014 ti 12/2016 3.3 I TNG V VT LIU NGHIấN CU 3.3.1 i tng nghiờn cu Chú mc bnh Care, mu virus Care phõn lp c t cỏc mu bnh phm ca mc bnh Care c thu thp t mt s tnh phớa Bc Vit Nam: H Ni, Hng Yờn, Thỏi Bỡnh, Bc Giang, Nam nh 3.3.2 Vt liu nghiờn cu - Dng c, trang thit b phc v nghiờn cu: B n nhit, mỏy ỳc chuyn mu t ng, mỏy ct t chc Microtom, mỏy lm khụ tiờu bn, kớnh hin vi quang hc, mỏy xột nghim huyt hc t ng CELL-DYN 3700, t m nuụi cy t bo (5% CO2), kớnh hin vi soi ni, mỏy ly tõm, mỏy gia nhit PCR, mỏy gii trỡnh t gene t ng Beckman Coulter CEQ 8000 - Húa cht phc v nghiờn cu: Formol 10%, parafin, xylen, thuc nhum Hematoxilin Eosin, dũng t bo Vero-DST; DMEM, 10% FBS, dung dch m EDTA, khỏng sinh; kit tỏch chit RNA, DNA tng s, cp mi gene H v P, kit phn ng RT-PCR v PCR, m TBE hoc TAE, agarose, húa cht tinh sch sn phm PCR sequence v kit chy gii trỡnh t gene, kit ELISA 3.4 NI DUNG NGHIấN CU 3.4.1 Nghiờn cu c im bnh lý ch yu ca mc bnh Care - Nghiờn cu mt s triu chng lõm sng ca mc bnh Care - Nghiờn cu mt s ch tiờu lõm sng ca mc bnh Care - Nghiờn cu s thay i v ch tiờu mỏu ca mc bnh Care - Nghiờn cu bin i bnh lý i th ca mc bnh Care - Nghiờn cu bin i bnh tớch vi th ca mc bnh Care - Nghiờn cu ng dng k thut húa mụ dch xỏc nh s phõn b ca virus Care trờn cỏc c quan t chc ca bnh 3.4.2 Nghiờn cu c im sinh hc ca ca nhng chng virus Care phõn lp c - Nghiờn cu kh nng gõy bnh tớch t bo (CPE) ca nhng chng virus Care phõn lp c - Nghiờn cu xỏc nh hiu giỏ virus ca nhng chng virus Care phõn lp c - Nghiờn cu xỏc nh quy lut nhõn lờn ca nhng chng virus Care phõn lp c - Nghiờn cu v tớnh khỏng nguyờn ca nhng chng virus Care phõn lp c 3.4.3 Nghiờn cu c im sinh hc phõn t ca nhng chng virus Care phõn lp c - Nghiờn cu gii trỡnh t gene ca nhng chng virus nghiờn cu - Nghiờn cu so sỏnh trỡnh t nucleotide ca nhng chng virus nghiờn cu - Nghiờn cu so sỏnh trỡnh t amino acid ca nhng chng virus nghiờn cu - Nghiờn cu so sỏnh mc tng ng v trỡnh t nucleotide gia nhng chng virus nghiờn cu - Nghiờn cu so sỏnh mc tng ng v trỡnh t amino acid gia nhng chng virus nghiờn cu - Nghiờn cu xõy dng cõy sinh hc phõn t th hin mi quan h phỏt sinh loi 3.5 PHNG PHP NGHIấN CU 3.5.1 Phng phỏp khỏm lõm sng Nhit c th c o bng nhit k thy ngõn, trc trng, ngy ln vo lỳc gi sỏng v gi chiu Tn s hụ hp c kim tra bng phng phỏp quan sỏt, thụng qua s lờn xung ca cỏc c vựng ngc Tn s tim c o bng ng nghe m nhp tim mt phỳt 3.5.2 Phng phỏp m khỏm, quan sỏt bnh tớch i th Chú bnh c c nh trờn bn m hoc khay m, c m khỏm nhm bc l cỏc c quan xoang ngc, xoang bng, xoang chu, hp s v nóo, quan sỏt 3.5.3 Phng phỏp lm tiờu bn vi th v quan sỏt bnh tớch trờn tiờu bn Phng phỏp lm tiờu bn vi th theo quy trỡnh tm ỳc bng parafin, nhum Haematoxilin Eosin (HE) thng quy ti phũng thớ nghim b mụn Bnh lý thỳ y, Hc vin Nụng nghip Vit Nam 3.5.4 Phng phỏp nhum húa mụ dch Phng phỏp nhum hoỏ dch t chc cú quy trỡnh tm ỳc bng paraffin ging phng phỏp lm tiờu bn vi th Cỏc bc thc hin chớnh gm: lm sch tiờu bn; hot húa enzyme; kh peroxydase ni sinh; gn khỏng th; gn khỏng khỏng th; b sung c cht; nhum nhõn t bo v c kt qu 3.5.5 Phng phỏp xột nghim cỏc ch tiờu sinh lý mỏu Ly 2ml mỏu/con, a vo ng bo qun cú cha cht chng ụng, sau ú phõn tớch cỏc ch tiờu sinh lý mỏu bng mỏy m huyt hc Cell-Dyn 3700 3.5.6 Phng phỏp nuụi cy t bo Dũng t bo Vero-DST c nuụi cy trờn mụi trng DMEM cú b sung 10% FCS v 5% CO2 3.5.7 Phng phỏp phõn lp virus Care trờn mụi trng t bo Vero-DST Mu bnh phm c nghin nỏt bng chy v ci vụ trựng sau ú c ng nht dung dch MEM Tin hnh ly tõm tc cao v lc hn dch bnh phm Hỳt b mụi trng nuụi cy cỏc a lng t bo ó chun b v b sung 100 àl hn dch bnh phm T bo gõy nhim virus c 370C vi 5% CO2 30 phỳt B sung 1,5 ml mụi trng DMEM cú cha 10% TPB (Tryptose Phosphate Broth) vo a lng v 370C vi 5% CO2 Hng ngy theo dừi s phỏ hy t bo bng kớnh hin vi soi ni v thu virus t bo b phỏ hy t 80% - 90% din tớch ỏy ca a lng 3.5.8 Phng phỏp xỏc nh hiu giỏ virus (TCID50/ml) TCID50 xỏc nh theo phng phỏp Behrens-Karber (Lan et al., 2005a) 3.5.9 Phng phỏp xỏc nh ng biu bin s nhõn lờn ca virus Gõy nhim virus Care trờn mụi trng t bo Vero-DST vi MOI = 0,01 Xỏc nh hiu giỏ virus t v virus nm t bo cỏc thi im 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 96 gi sau gõy nhim virus ng biu din s nhõn lờn ca virus c xõy dng cú bin l log10 ca TCID50 ti mi thi im thu virus 3.5.10 Phng phỏp xỏc nh tớnh khỏng nguyờn ca virus Care Hn dch khỏng nguyờn virus Care sau c vụ hot bng formaldehyde (35%), kim tra vụ hot v thun khit, sau ú c trn vi Al(OH)3 10% theo t l 1:1 Hn dch ny c tiờm cho becgie vi mi tiờm cỏch 28 ngy Sau 21 ngy tiờm mi cui tin hnh cụng cng c bng chng virus CDV-HUA-04H vi liu 100 LD50 Theo dừi triu chng lõm sng, mu mỏu v dch swab ca thớ nghim c ly cỏc ngy 4, 7, 10, 14, 21 kim tra huyt hc v phõn lp virus 3.5.11 Phng phỏp ELISA Cỏc bc thc hin theo hng dn i kốm ca b kit ELISA Ingezime MOQUILLO IgG 1.5.CDG.K1 ca hóng Ingenasa (Tõy Ban Nha) nhm phỏt hin khỏng th huyt 3.5.12 Phng phỏp RT-PCR v PCR Mu RNA tng s sau c tỏch chit s c tin hnh phn ng RT-PCR bng b kit QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen, Hilden, c) vi cỏc bc thc hin theo hng dn i kốm 3.5.13 Phng phỏp gii trỡnh t gene v x lý d liu gii trỡnh t gene Tinh sch sn phm ca phn ng RT-PCR, chy phn ng PCR sequence ri tinh sch sn phm phn ng PCR sequence, sau ú a vo mỏy gii trỡnh t gene t ng Beckman Coulter SEQ 8000 D liu cỏc trỡnh t gene thu c trờn mỏy gii trỡnh t gene c kim tra bng chng trỡnh Blast trờn ngõn hng gene th gii Xỏc nh ngun gc ph h phỏt sinh chng loi trờn c s trỡnh t gene ca chng virus thu nhn bng phn mm Genetyx (version 5.0.4) v MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) version 6.0 S dng phng phỏp test Maximum likehood vi giỏ tr bootstrap l 1000 n v vi cỏc chng tham chiu c ly t ngõn hng gene th gii 3.5.14 X lý s liu Cỏc s liu thu thp c gm thõn nhit, tn s hụ hp, tn s tim v cỏc ch tiờu mỏu c tớnh toỏn cỏc giỏ tr trung bỡnh (Mean) v sai s chun (SE) bng phn mm Minitab version 16.2.4 S dng phng phỏp thng kờ phõn tớch phng sai (ANOVA/One Way) vi phng phỏp Tukey ca phn mm Mintab version 16.2.4 nhm ch s sai khỏc cú ý ngha thng kờ ca cỏc s liu thu thp c PHN KT QU V THO LUN 4.1 KT QU NGHIấN CU C IM BNH Lí CH YU CA CHể MC BNH CARE 4.1.1 Kt qu chn oỏn mc bnh Care bng phng phỏp RT-PCR Nghiờn cu ó tin hnh ly dch swab ca 68 nghiờn cu chn oỏn bng RT-PCR (vi bnh Care) v PCR (vi bnh Parvovirrus) nhm sng lc c cỏc ch mc bnh Care Kt qu chn oỏn bng phng phỏp RT-PCR v PCR c trỡnh by bng 4.1 Bng 4.1 Kt qu chn oỏn bng phng phỏp RT-PCR v PCR Parvovirus CDV Mu bnh phm Dch swab Dch swab S mu dng tớnh 0/68 68/68 T l dng tớnh (%) 0,0 100,0 Bng 4.4 Cỏc ch tiờu lõm sng ca ging Rottweiler mc bnh Care Chú khe (n = 12) Chú bnh (n = 12) Ch tiờu theo dừi Mean SE Mean SE 38,78 0,05 40,33 0,05* Thõn nhit ( C) 39,33 0,32 71,83 0,44* Tn s hụ hp (ln/ phỳt) 93,67 0,36 130,75 0,58* Tn s tim mch (ln/ phỳt) Ghi chỳ: Mean l giỏ tr trung bỡnh; SE l sai s chun; *: khỏc cú ý ngha thng kờ vi giỏ tr P < 0,05 4.1.4 Kt qu nghiờn cu s thay i v ch tiờu mỏu ca cỏc ging mc bnh Care Kt qu m s lng hng cu, s lng bch cu, t l cỏc loi bch cu bng mỏy o ch tiờu huyt hc ca ging Phỳ Quc c trỡnh by bng t 4.5 Khi xem xột cỏc ging thỡ cú s thay i v cỏc ch tiờu mỏu nh sau: S lng hng cu: nhng bnh, s lng hng cu trung bỡnh l t 3,80 ti 4,26 (106/àl), u gim so vi kho Trờn lõm sng, cú th iu ny cú th vt b mt mỏu nh xut huyt, tiờu chy mỏu kốm theo st cao viờm phi Hm lng huyt sc t: nhn thy hm lng huyt sc t bnh l t 110,81 ti 123,81 (g/l), gim so vi khe T hng cu: T hng cu ca bnh trung bỡnh l t 32,59% ti 34,18% gim so vi khe Ch tiờu ny cng gim tng quan thun vi s gim s lng hng cu, iu ny cho thy õy hin tng gim s lng hng cu l mt mỏu l ch yu Th tớch trung bỡnh hng cu: Th tớch trung bỡnh hng cu nhúm bnh l t 46,20 ti 47,74 (fl) gim so vi kho Lng huyt sc t trung bỡnh hng cu bnh l t 17,88 ti 18,65 pg gim so vi lụ khe Nng huyt sc t trung bỡnh ca hng cu khe gim xung cũn t 133,96 (g/l) ti 138,01 (g/l) bnh Nh vy s bin i ch tiờu lng huyt sc t trung bỡnh v nng huyt sc t trung bỡnh ca hng cu bnh l rt ỏng chỳ ý Cỏc ch tiờu ny núi n s thiu mỏu bnh st cao v xut huyt S lng bch cu: lụ bnh s lng bch cu l t 4,67 ti 4,87 (10 /ml) mỏu, gim so vi lụ khe S gim bch cu trờn lõm sng cú th vt b viờm, nhim trựng cp tớnh dn ti s suy gim nghiờm trng s lng bch cu bnh, t l cỏc loi bch cu thay i rừ rt so vi lụ khe cỏc loi bch cu nh: T l bch cu ỏi toan; bch cu ỏi kim; bch cu n nhõn; lõm ba cu lụ bnh gim so vi lụ khe Ch cú t l bch cu trung tớnh bnh tng nh so vi khe Trờn lõm sng, s gia tng s lng bch cu trung tớnh chng t ang b nhim trựng iu ny cú th c gii thớch c ch sinh bnh ca bnh Care 11 Bng 4.5 Mt s ch tiờu mỏu ca ging Phỳ Quc mc bnh Care Chú kho Chú bnh (n = 8) (n = 8) Ch tiờu xột nghim Mean SE Mean SE S lng hng cu (10 /àl) 5,85 0,04 3,80 0,06* Hm lng huyt sc t (g/l) 153,06 1,42 121,89 0,80* T hng cu (%) 40,22 0,06 33,97 0,05* Th tớch trung bỡnh hng cu (fl) 62,32 0,05 46,48 0,13* Lng huyt sc t trung bỡnh hng cu (pg) 23,00 0,10 18,12 0,05* Nng huyt sc t trung bỡnh hng cu (g/l) 334,70 0,78 137,74 0,73* S lng bch cu (103/ml) 9,52 0,05 4,78 0,04* Bch cu ỏi toan (%) 6,32 0,03 5,75 0,04* Bch cu ỏi kim (%) 0,54 0,05 0,45 0,06 Bch cu a nhõn trung tớnh (%) 58,19 0,07 63,28 0,05* Bch cu n nhõn (%) 4,89 0,07 3,66 0,03* Lõm ba cu (%) 30,06 0,14 26,86 0,10* Ghi chỳ: Mean l giỏ tr trung bỡnh; SE l sai s chun; *: khỏc cú ý ngha thng kờ vi giỏ tr P < 0,05 4.1.5 Bin i bnh lý i th ca mc bnh Care Kt qu cỏc bin i i th ch yu ca mc bnh Care ó c th hin bng 4.6 Bng 4.6 Cỏc tn thng i th mc Care S S T l C quan Ch tiờu nghiờn cu nghiờn cú tn (%) cu thng Phi Rut Hch lympho Gan Thn Lỏch Tim Nóo Viờm phi thựy Viờm ph qun phi Phi xut huyt Rut viờm, xut huyt Sung huyt rut non Hch lympho sng to, xut huyt Gan sng, xut huyt Thn sng, xut huyt Lỏch nhi huyt, sng to Tim nhóo, xut huyt Nóo sung huyt 12 68 68 68 68 68 54 54 58 62 60 79,41 79,41 85,29 91,18 88,24 68 68 100,0 68 68 68 68 68 60 40 48 11 88,24 58,82 70,59 16,18 5,88 Qua kt qu c trỡnh by bng 4.6, nhn thy bnh tớch i th ca cỏc nghiờn cu trung ch yu cỏc c quan nh hch lympho, phi, rut, gan, lỏch, thn, tim v nóo hch lympho, tn thng ch yu quan sỏt c l sng to, xut huyt chim t l 100% 68 ca m khỏm Cỏc hch lympho nh hch vựng u c, hch di hm v hch mng treo rut sng to, rỡa tự, cng, xut huyt lm cho hch sm tng vựng hoc ton b hu ht cỏc nghiờn cu phi, bnh tớch ch yu l phi xut huyt (hỡnh 4.3), viờm phi thựy, viờm ph qun phi chim t l ln lt l 85,29%, 79,41% v 79,41% Kt qu nghiờn cu ny l phự hp vi triu chng lõm sng quan sỏt c trờn cỏc vi biu hin l ho nhiu v cú nhiu dch mi chy Bnh tớch ng tiờu húa th hin sung huyt rut viờm, xut huyt (91,18%); sung huyt rut non (88,24%) (hỡnh 4.4) v gan sng v xut huyt (88,24%) Kt qu nghiờn cu phự hp vi bnh tớch sung huyt, xut huyt rut c gõy bnh thc nghim bng chng virus Care cng c (Nguyn Th Lan v cs., 2015) Bnh tớch nóo biu hin l nóo sung huyt chim t l 5,88% l thp nht cỏc bnh tớch quan sỏt c trờn 68 mc bnh Care Khi xem xột bnh tớch i th 68 nghiờn cu cỏc ging khỏc thỡ bnh tớch u trung ch yu cỏc c quan nh hch lympho, phi v rut iu ny cho thy s phõn b v trung ca virus cỏc c quan khỏc l hon ton khỏc Ngoi ra, mt s tn thng khỏc cng c quan sỏt thy m khỏm nh lỏch nhi huyt, sng to chim t l 70,59%; thn sng, xut huyt chim t l 58,82% Bnh tớch trờn tim chim t l thp nht ln lt l 16,18% Mt s hỡnh nh minh bnh tớch i th ca mc bnh Care Hỡnh 4.3 Xut huyt phi Hỡnh 4.4 Rut b sung huyt mc bnh Care mc bnh Care 4.1.6 Bin i bnh tớch vi th ca mc bnh Care Kt qu quan sỏt nhng bin i bnh lý vi th trờn kớnh hin vi quang hc c chp nh v tng hp thụng tin bng 4.7 13 Bng 4.7 Bin i vi th mt s c quan ca mc bnh Care Cỏc tn thng C quan Phi Gan Thn Lỏch Tim Nóo Hch lympho Rut non Rut gi S Sung huyt Xut huyt block nghiờn S S cu T l T l blo blo (%) (%) ck ck 12 12 100,0 10 83,33 12 12 100,0 33,33 12 12 100,0 66,67 12 12 100,0 75,0 12 58,33 50,0 12 8,33 0,0 S blo ck 25,0 0,0 16,67 10 66,67 12 33,33 0,0 33,33 66,67 83,33 100,0 41,67 16,67 Thõm nhim t bo viờm S T l blo (%) ck 12 100,0 12 100,0 10 83,33 11 91,67 75,0 16,67 Hoi t t bo S blo ck Thoỏi húa t bo T l (%) T l (%) 12 12 100,0 12 100,0 58,33 75,0 12 100,0 12 12 100,0 12 100,0 12 100,0 12 100,0 12 100,0 12 11 91,67 12 100,0 25,0 10 83,33 11 91,67 Kt qu bng 4.7 cho thy t l cú tn thng sung huyt v thõm nhim t bo viờm chim t l cao hn so vi cỏc tn thng khỏc c bit cỏc c quan nh rut non, rut gi, phi v hch lympho l nhng c quan cú tn thng vi th chim t l cao hn so vi cỏc c quan khỏc cỏc c quan c nghiờn cu phi cú tn thng sung huyt v thõm nhim t bo viờm chim chim t l 100%; xut huyt chim t l 83,33%; hoi t t bo v thoỏi húa t bo ch chim t l ln lt l 25,0% v 33,33% Kt qu nghiờn cu bnh tớch vi th trờn phi khỏc vi nghiờn cu ca Lan et al., (2005b; 2006a; 2007), ch bnh tớch phi l xut hin nhiu viờm phi, viờm phi thựy v xut hin th bao hm (ỏi toan) nguyờn sinh cht ca cỏc t bo biu mụ ph qun hoc ph nang Hch lympho cú cỏc tn thng sung huyt, xut huyt v thõm nhim t bo viờm chim t l 100%; thoỏi húa t bo chim t l 75,0% v hoi t t bo chim 58,33% Kt qu nghiờn cu bnh tớch vi th trờn hch lympho cú s sai khỏc vi kt qu nghiờn cu ca Lan et al., (2005b; 2006a; 2007) so sỏnh v bnh tớch thoỏi húa v hoi t t bo chim t l thp hn vi kt qu nghiờn cu trc õy ca Lan et al., (2005b; 2006a; 2007) ch bnh tớch vi th ch yu cỏc mc bnh Care l s suy gim t bo lympho rut: c rut non v rut gi u cú tn thng sung huyt, xut huyt, thoỏi húa t bo v thõm nhim t bo viờm vi t l dao ng khong 91,67% - 100%; riờng rut gi thỡ tn thng hoi t t bo ch chim 25,0% thp hn rt nhiu so vi rut non l 100% Kt qu nghiờn 14 cu cú s sai khỏc vi nghiờn cu ca Lan et al., (2005b; 2006a; 2007) v bnh tớch vi th ch yu rut mc bnh l viờm rut cata; xut hin th bao hm nguyờn sinh cht biu mụ rut Nóo l c quan cú tn thng vi th chim t l thp nht cỏc c quan c nghiờn cu, tn thng thõm nhim t bo viờm, thoỏi húa t bo chim t l 16,67%; hin tng sung huyt chim t l 8,33%; khụng xut hin cỏc tn thng nh xut huyt v hoi t t bo Kt qu nghiờn cu cú s sai khỏc vi kt qu nghiờn cu ca Lan et al., (2005b; 2006a; 2007) ch bnh tớch vi th ch yu nóo l tn thng t bo myelin; viờm nóo th mn tớnh, xut hin th bao hm Kt qu nghiờn cu v bnh tớch trờn cỏc c quan nh gan, thn v lỏch cú s sai khỏc vi nghiờn cu ca Lan et al., (2005b; 2006a; 2007; 2008) v Nguyn Th Lan v cs., (2015) ch c cỏc bnh tớch xut hin trờn cỏc c quan trờn Mt s hỡnh nh minh bin i bnh tớch vi th ca mc bnh Care Hỡnh 4.5 Viờm ph qun phi (HE 10X) Hỡnh 4.6 Lụng nhung rut t nỏt (HE 10X) 4.1.7 Kt qu ng dng k thut nhum húa mụ dch xỏc nh s phõn b virus Care trờn cỏc c quan t chc ca bnh Tin hnh la chn mu phi, hch phi, rut, hch rut, lỏch t 68 mc bnh Care lm húa mụ dch Kt qu c trỡnh by bng 4.8 Kt qu bng 4.8 cho thy mc dng tớnh cú s sai khỏc gia cỏc c quan chn oỏn bng k thut nhum húa mụ dch Trong ú, mc dng tớnh tiờu bn phi, rut, hch phi v hch rut l cao hn so vi lỏch Kt qu nghiờn cu v s phõn b ca virus bng nhum húa mụ dch l tng i phự hp vi kt qu quan sỏt c trờn bnh tớch vi th v i th ca 68 nghiờn cu Nh vy, chn oỏn bng k thut nhum húa mụ dch chn oỏn mc Care nờn chn loi mu bnh phm gm phi, rut, hch lympho 15 STT Phi Hch phi Rut Hch rut Lỏch Bng 4.8 Kt qu nhum húa mụ dch Kt qu chn oỏn bng nhum húa mụ dch (n = 68) T l dng tớnh (%) m tớnh (+) (++) (+++) 0,0 10,29 57,35 32,35 0,0 27,94 47,06 25,0 11,76 42,65 33,82 11,76 22,06 14,71 45,59 17,65 36,76 54,41 8,82 0,0 Chỳ thớch: (-) : m tớnh (+) : Dng tớnh mc I (Cú cỏc ỏm nõu vng nhng mc ri rỏc) (++) : Dng tớnh mc II (Cú cỏc ỏm nõu vng vi mc trung bỡnh) (+++) : Dng tớnh mc III (Cú cỏc ỏm ri rỏc vi mc dy c) Mt s hỡnh nh nhum húa mụ dch Hỡnh 4.7 Húa dch dng Hỡnh 4.8 Húa dch dng tớnh ti phi (IHC 40X) tớnh ti hch lympho (IHC 10X) 4.2 KT QU NGHIấN CU MT S C IM SINH HC CA NHNG CHNG VIRUS CARE PHN LP C 4.2.1 Thụng tin ca nhng chng virus Care phõn lp c s dng nghiờn cu chng virus Care c la chn i din cho a phng nghiờn cu cú thụng tin chi tit c trỡnh by bng 4.9 Bng 4.9 Thụng tin ca cỏc chng virus Care s dng nghiờn cu Kớ hiu Nm C quan a phng STT Chng virus Care nghiờn cu phõn phõn lp phõn lp lp CDV-VNUA-768 ND03 Phi Nam nh 2015 CDV-HUA-02H TB06 Hch phi Thỏi Bỡnh 2015 CDV-HUA-03R HY08 Rut Hng Yờn 2015 CDV-HUA-04H HN09 Hch phi H Ni 2015 CDV-HUA-05P BG10 Phi Bc Giang 2015 16 Qua bng 4.9, thụng tin chi tit ca chng virus Care nghiờn cu c la chn t cỏc mc bnh Care c phõn lp t thc a Cỏc mu bnh phm dựng phõn lp virus ó c chn oỏn dng tớnh vi virus Care bng phng phỏp RT-PCR v nhum húa mụ dch 4.2.2 Kh nng gõy bnh tớch t bo (CPE) ca nhng chng virus Care phõn lp c Kt qu nghiờn cu kh nng gõy bnh tớch t bo (CPE) ca chng virus Care v chng virus vacxin Onderstepoort trờn mụi trng t bo VeroDST c trỡnh by bng 4.10 Bng 4.10 Kt qu nghiờn cu kh nng gõy bnh tớch t bo ca chng virus Care v chng virus vacxin Onderstepoort CPE (%) STT Virus CDV-VNUA-768 25 55 90 100 B CDV-HUA-02H 20 50 80 95 100 B CDV-HUA-03R 30 45 80 95 100 B CDV-HUA-04H 25 50 90 100 B CDV-HUA-05P 10 30 55 80 95 100 Onderstepoort 20* 40 60 90 100 B 12hpi 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi B Chỳ thớch: 20*%: s % t bo b phỏ hy so vi tng din tớch b mt nuụi cy B: T bo bong trúc hon ton b mt nuụi cy hpi: hour post inoculation (gi sau gõy nhim virus) Phõn tớch kt qu bng 4.10 cho thy chng virus c la chn nghiờn cu gõy bnh tớch t bo sm, in hỡnh v phỏ hy t bo hon ton rt ging vi chng virus vacxin vi biu hin l thi gian xut hin bnh tớch sm sau 24 gi gõy nhim vi biu hin gõy bnh tớch kiu syncytium - th hp bo vi cỏc t bo co cm li, mng t bo b tan ró, cỏc nhõn co cm li v thi gian hy hoi hon ton t bo din nhanh, sau 60-72 gi gõy nhim cỏc chng virus ny CPE t 95 - 100%, lỳc ny khụng cũn cm t bo no bỏm vo ỏy bỡnh, cỏc t bo u ó b tan v bong trúc b mt nuụi cy, cỏc t bo u b phỏ hy 4.2.3 Hiu giỏ ca nhng chng virus Care phõn lp c Bờn cnh vic kho sỏt kh nng gõy bnh tớch t bo, cng tin hnh kim tra hiu quỏ virus, kt qu c trỡnh by bng 4.11 17 Bng 4.11 Hiu giỏ ca nhng chng virus Care s dng nghiờn cu Hiu giỏ virus STT Chng virus (Log TCID50/25àl) CDV-VNUA-768 3,16 x 104 CDV-HUA-02H 3,16 x 105 CDV-HUA-03R 5,83 x 104 CDV-HUA-04H 6,25 x 105 CDV-HUA-05P 3,16 x 105 Bng 4.11 cho thy chng virus phõn lp c cú hiu giỏ cao v thớch nghi tt trờn mụi trng t bo Vero-DST 4.2.4 Nghiờn cu xỏc nh biu tng trng ca nhng chng virus Care phõn lp c Kt qu minh ng biu din ca mt s chng virus so sỏnh vi chng vacxin c trỡnh by hỡnh 4.9, 4.10 Hỡnh 4.9 ng biu din s nhõn lờn ca chng virus CDV-VNUA-768 v chng virus vacxin Onderstepoort Hỡnh 4.10 ng biu din s nhõn lờn ca chng virus CDV-HUA-05P v chng virus vacxin Onderstepoort Qua kt qu hỡnh 4.9, 4.10 nhn thy cỏc chng virus Care cú c im chung ú l hm lng virus trung t bo luụn cao hn so vi hm lng virus trung ngoi t bo qua cỏc thi im thu khỏc thỡ khỏc tng virus ng thi, cỏc chng virus ny cú ng biu din s nhõn 18 lờn tng i ging vi chng virus vacxin, tựy thuc vo thi im thu khỏc thỡ s cú s khỏc gia chng virus vacxin v chng virus mi phõn lp c C chng virus vacxin Onderstepoort v chng virus Care phõn lp c u cho thy chỳng tn cụng, xõm nhp, nhõn lờn t bo mnh hay yu tựy tng thi im nht nh Kt qu nghiờn cu l hon ton phự hp vi cỏc nghiờn cu trc õy ca Lan et al (2005a, 2005b, 2007) 4.2.5 Nghiờn cu v tớnh khỏng nguyờn ca chng virus Care phõn lp c Sau nghiờn cu c mt s c tớnh sinh hc ca nhng chng virus Care phõn lp c, chỳng tụi la chn mt s chng cú c tớnh sinh hc in hỡnh, tin hnh dựng lm ging sn xut th nghim vacxin vụ hot ỏnh giỏ tớnh khỏng nguyờn v kh nng gõy ỏp ng dch, trờn c s ú la chn chng nghiờn cu sn xut vacxin phũng bnh 4.2.5.1 Kt qu kim tra hm lng khỏng th ca thớ nghim sau tiờm phũng vacxin lp li Sau tiờm vacxin vụ hot th nghim ch t chng CDV-VNUA-768, cỏc c ly mỏu hng tun kim tra hiu giỏ khỏng th khỏng virus Care bng phng phỏp ELISA vi kt qu c trỡnh by hỡnh 4.11 Hỡnh 4.11 Bin ng dng tớnh huyt hc c tiờm hn dch khỏng nguyờn virus CDV-VNUA-768 vụ hot so vi lụ i chng lụ tiờm vacxin Care vụ hot thỡ hiu giỏ khỏng th tng dn sau tiờm ln v ln t ti 35 ngy, sau ú gim dn sau 42 ngy ti 49 ngy theo dừi Hiu giỏ khỏng th vi giỏ tr OD ln hn giỏ tr ti hn (Cut off) sau 21 ngy tiờm, sau ú t cc i giai on 35 42 ngy tiờm (ODtb = 1,54 > 0,3) cỏc ngy 42 ti 49 ngy sau tiờm, hiu giỏ khỏng th gim dn v t trờn ngng giỏ tr ti hn (Cut off) 49 ngy (ODtb = 1,35> 0,3) Hiu giỏ khỏng th sau tiờm lp li ln cao hn so vi sau tiờm ln iu ny cú th c gii thớch cú ỏp ng trớ nh dch nờn cú hiu giỏ khỏng th v cú t l bo h cao hn nhiu 4.2.5.2 Kt qu kim tra hm lng khỏng th ca thớ nghim sau cụng cng c 19 Kt qu xỏc nh hiu giỏ khỏng th cho thy cỏc lụ i chng sau cụng cng c vi chng CDV-HUA-04H thỡ giỏ tr OD tng dn t ngy ti 21 ngy sau gõy nhim, ti 21 ngy sau gõy nhim giỏ tr ODtb t 0.27 nh hn giỏ tr ti hn (Cut off = 0,3) Trong ú, lụ tiờm vacxin thỡ khong thi gian 21 ngy sau gõy nhim, biu biu din cú chiu hng i xung nhng giỏ tr ODtb ti ngy 21 sau gõy nhim t 0.56 ln hn giỏ tr ti hn (Cut off = 0,3) Nh vy, hiu giỏ khỏng th lụ tiờm vacxin sau cụng cng c 21 ngy thỡ hm lng khỏng th trờn ngng giỏ tr ti hn, iu ny giỳp cho vt cú kh nng bo h cụng cng c vi chng virus CDV-HUA-04H 4.3 KT QU NGHIấN CU MT S C IM SINH HC PHN T CA NHNG CHNG VIRUS CARE PHN LP 4.3.1 Kt qu gii trỡnh t gene ca nhng chng virus nghiờn cu Kt qu gin gii trỡnh t gene on gene H v gene P cho thy cht lng sn phm ca quỏ trỡnh gii trỡnh t gene tt, mi nh ca gin u xỏc nhn mt loi nucleotide, cỏc nucleotide khỏc thỡ s tip nhn thuc nhum hunh quang khỏc c bng tia laser Kt qu gii trỡnh t gene ó thu c trỡnh t nucleotide ca on gene H v gene P ca cỏc virus nghiờn cu cú di ln lt l 1824bp v 402bp 4.3.2 Kt qu so sỏnh trỡnh t nucleotide ca nhng chng virus nghiờn cu Qua vic so sỏnh trỡnh t nucleotide gia chng virus Care v chng virus vacxin, ó ch c 231 v trớ sai khỏc v nucleotide cỏc v trớ nh: 36, 54, 61, 87, 90, 91, 96, 108, 111, 115, 133, 136, 139, 162, 166, 182, 186, 189, 202, 211, 225, 228, 243, 252, 267, 291, 322, 330, 339, 348, 369, 387, 426, 432, 436, 453, 462, 465, 466, 469, 475, 479, 484, 486, 493, 494, 507, 511, 522, 525, 528, 531, 533, 538, 552, 555, 556, 590, 591, 594, 606, 609, 625, 630, 635, 639, 653, 660, 666, 678, 679, 687, 696, 700, 712, 717, 721, 723, 733, 735, 739, 741, 756, 765, 772, 792, 801, 819, 828, 830, 840, 846, 864, 868, 876, 877, 894, 903, 926, 937, 939, 940, 957, 958, 963, 970, 981, 985, 990, 991, 993, 996, 999, 1009, 1017, 1026, 1029, 1032, 1041, 1046, 1056, 1059, 1072, 1074, 1076, 1094, 1095, 1096, 1100, 1108, 1116, 1118, 1119, 1126, 1127, 1128, 1140, 1156, 1164, 1179, 1182, 1194, 1201, 1202, 1212, 1218, 1243, 1249, 1272, 1275, 1281, 1290, 1299, 1305, 1325, 1336, 1356, 1362, 1365, 1375, 1377, 1378, 1379, 1386, 1392, 1399, 1422, 1423, 1424, 1434, 1437, 1450, 1455, 1458, 1474, 1476, 1491, 1494, 1500, 1505, 1515, 1517, 1528, 1539, 1550, 1557, 1564, 1572, 1578, 1584, 1587, 1588, 1589, 1590, 1591, 1599, 1608, 1619, 1632, 1644, 1645, 1674, 1683, 1711, 1714, 1728, 1738, 1743, 1747, 1750, 1752, 1755, 1756, 1758, 1776, 1779, 1780, 1809, 1814, 1818, 1821 Qua vic so sỏnh trỡnh t nucleotide on gene P gia chng virus CDV v chng virus vacxin, ó ch c 27 v trớ sai khỏc v nucleotide cỏc v trớ 20 nh: 48, 49, 52, 55, 88, 96, 105, 129, 174, 183, 186, 216, 225, 230, 237, 243, 246, 250, 253, 269, 288, 307, 308, 344, 350, 356, 392 Nh vy, so sỏnh v thnh phn nucleotide on gene H v gene P gia chng virus cú s sai khỏc v nucleotide khụng quỏ 12,66% v 6,72% tng s nucleotide ca on gene H v gene P iu ny s dn n cỏc chng virus cựng mt nhỏnh phỏt sinh s cú ớt s sai khỏc v trỡnh t nucleotide 4.3.3 Kt qu so sỏnh trỡnh t amino acid ca nhng chng virus nghiờn cu T kt qu so sỏnh trỡnh t nucleotide, tin hnh so sỏnh trỡnh t amino acid c mó húa tng ng t gene H v gene P gia cỏc chng virus nghiờn cu vi chng virus vacxin Kt qu ch cỏc v trớ sai khỏc axit amin mó húa t gene H gia cỏc chng virus nghiờn cu v chng virus vacxin 83 v trớ: 21, 30, 31, 47, 56, 61, 68, 71, 76, 78, 89, 108, 123, 146, 155, 156, 157, 159, 160, 162, 165, 171, 178, 180, 186, 197, 212, 218, 225, 227, 237, 238, 241, 245, 247, 277, 293, 298, 303, 309, 313, 314, 324, 329, 330, 331, 337, 342, 344, 358, 359, 365, 367, 370, 373, 376, 386, 401, 415, 417, 442, 446, 459, 460, 467, 475, 484, 500, 502, 506, 510, 517, 522, 530, 531, 540, 549, 571, 572, 583, 584, 586, 594 Kt qu ch cỏc v trớ sai khỏc axit amin mó húa t gene P gia cỏc chng virus nghiờn cu v chng virus vacxin 13 v trớ: 17, 18, 19, 30, 77, 84, 85, 90, 103, 115, 117, 119, 131 iu ny s dn n s sai khỏc tớnh khỏng nguyờn gia cỏc chng virus Care nghiờn cu 4.3.4 So sỏnh mc tng ng v trỡnh t nucleotide gia nhng chng virus nghiờn cu Kt qu cho thy chng virus nghiờn cu cú mc tng ng v nucleotide gene H v gene P t t l khỏ cao ln lt l 90,05%-99,61% v 94,81% - 99,75% Nh vy thnh phn nucleotide ca cỏc chng ny ging tng i cao S tng ng v nucleotide gene H v gene P gia chng virus nghiờn cu vi chng virus vacxin t t l ln lt l 89,99%-99,34% v 94,81%99,50% iu ny cho thy s gn gi mi quan h di truyn gia chng virus Care nghiờn cu v chng virus vacxin 4.3.5 So sỏnh mc tng ng v trỡnh t amino acid gia nhng chng virus nghiờn cu Kt qu cho thy chng virus CDV nghiờn cu cú mc tng ng v axit amin tng ng gene H v gene P t t l khỏ cao ln lt l 89,38%-99,5% v 92,47%-100,0% Mc tng ng v axit amin tng ng gene H v gene P gia chng virus Care nghiờn cu vi chng virus vacxin t t l dao ng ln lt l 89,39%-99,17% v 92,47%-100,0% iu ny cho thy s tng ng gia kt qu so sỏnh mc tng ng gia trỡnh t nucleotide v trỡnh t amino acid 4.3.6 Kt qu xõy dng cõy sinh hc phõn t 21 Kt qu phõn tớch ngun gc phỏt sinh loi theo s sai khỏc nucleotide on gene H (hỡnh 4.12) v gene P (hỡnh 4.13) ca chng virus Care nghiờn cu, nhn thy chng virus nghiờn cu nm nhỏnh phỏt sinh khỏc (thuc genotype ln lt l Asia1, Asia2 v Classic), khỏc vi nhỏnh phỏt sinh ca cỏc chng tham chiu trờn th gii thuc cỏc genotype khỏc nh: Europe, Europe Wildlife, America 2, Africa, Arctic like, Asia Kt qu nghiờn cu ny sai khỏc vi nghiờn cu ca Lan et al (2005c, 2006a, 2006b, 2009b) ch cỏc chng virus phõn lp ti Nht Bn v chõu ang lu hnh genotype chớnh l Asia v Asia ng thi, kt qu nghiờn cu ny cú s sai khỏc vi kt qu nghiờn cu ca Guo et al (2013) ó ch chng virus Care gõy bnh trờn gu trỳc v hoang l thuc genotype Asia Bờn cnh ú, nghiờn cu ca Lan et al (2009a) ó ch chng virus phõn lp u tiờn ti Vit Nam l thuc genotype Classic cựng vi chng virus CDV-HUA-04H mi c phõn lp nghiờn cu ny iu ny cho thy cú s lõy truyn bnh gia cỏc quc gia trờn th gii nhiu nguyờn nhõn khỏc Kt qu ca nghiờn cu ny cú ý ngha quan trng vic la chn chng virus nhp khu vacxin hoc ch to vacxin t cỏc chng virus ang gõy bnh Care nc phũng bnh 100 BJ080514 China 2009 Asia1 70 97 CDV SY China 2014 Asia1 CDV-HUA-01P CDV-HUA-05P 99 Hamamatsu Japan 2003 Asia1 92 monkey-KM-01 China 2008 Asia1 94 100 Asia NM China 2009 Asia1 Tanu96 Japan 1998 Asia1 KDK-1 Japan 2002 Asia1 99 93 Yanaka strain Japan 1999 Asia1 207/00 Italy 2006 Euro Wildlife 74 60 Europe Wildlife Danish mink Denmark 1997 Europe Wildlife 1493/Han89 UK 1996 Euro Wildlife 54 Europe BV4 Austria 2011 Europe A92-6 Netherlands 1996 America2 55 100 41 black leopard Denmark 1997 America2 America 4sp South Africa 2010 Africa 100 Africa 7L South Africa 2010 Africa OND USA 2002 58 99 Wyeth-Lederke USA 1998 99 CDV-HUA-04H Convac vaccine Denmark 1994 America1 100 America 1/Classic Snyder Hill Germany 2000 99 98-2654 USA 2004 America1 HL China 2009 Arctic like 70 179/94 Italy 2006 100 Arctic like liud China 1999 Arctic like 98 009L Japan 2007 Asia2 CDV-HUA-03R 96 CDV-HUA-02H 5VD Japan 2003 Asia2 82 81 HLJ1 China 2008 Asia3 63 Seoul Korea 2007 Asia2 100 98Marten Korea 2008 Asia2 HM-3 Japan 2002 Asia2 0.01 22 Asia Asia Hỡnh 4.12 Cõy sinh hc phõn t da trờn trỡnh t nucleotide gene H ca nhng chng virus Care nghiờn cu CDV-HUA-01P S124C Japan 2006 Asia1 65 Hamamatsu Japan 1999 P CDV SY China 2014 Asia Ac96I Japan 2006 Asia1 96 65 P94S Japan 2006 Asia1 CDV-HUA-05P Yanaka Japan 1999 P Jujo Japan 1999 P German dog Russia 2000 Europe 87 Europe 5804 USA 2003 Europe 007Lm Japan 2005 Asia2 011C Japan 2007 Asia2 99 CDV-HUA-03R Asia CDV-HUA-02H 51 007Lm/B Japan 2014 009L Japan 2007 Asia2 OND USA 2002 74 ferret 1017 Japan 2010 65 99 Rockborn Russia 1999 Classic Classic CDV-HUA-04H Snyder Hill USA 2004 Classic 0.005 Hỡnh 4.13 Cõy sinh hc phõn t da trờn trỡnh t nucleotide gene P ca nhng chng virus Care nghiờn cu PHN KT LUN V KIN NGH 5.1 KT LUN 1) c im bnh lý ch yu ca bnh Care trờn 68 ( tui 3-6 thỏng) thuc ging khỏc nhau, c thu thp t tnh phớa Bc Vit Nam gm H Ni, Hng Yờn, Thỏi Bỡnh, Bc Giang v Nam nh: - Triu chng lõm sng: st (100,0%), bing n, r (100,0%), cú d mt (100,0%), nụn ma (97,06%), d mi (79,41%), ho (79,41%), tiờu chy phõn mu c phờ (76,47%), sng húa gan bn chõn (41,18%), cú cỏc nt si vựng da mng (32,35%) v xut hin cỏc triu chng thn kinh (11,76%) - Cỏc ch tiờu cn lõm sng: thõn nhit (40,230C 40,590C), tn s hụ hp (71,83 78,94 ln/phỳt), tn s tim (118,88 130,75 ln/phỳt) tng so vi khe - Xột nghim mỏu: s lng hng cu (3,80 4,26 x 106/àl), hm lng huyt sc t (110,81 123,81 g/l), t hng cu (32,59% - 34,18%), th tớch trung bỡnh hng cu (46,20 47,74 fl), lng huyt sc t trung bỡnh hng cu (17,88 18,65 pg), s lng bch cu (4,67 4,87 x 103/ml) Cụng thc bch cu cú s thay i, ú t l bch cu a nhõn trung tớnh (62,65% 63,29%) tng so vi khe - Bnh tớch i th: phi xut huyt (85,29%), viờm phi thựy (79,41%), viờm ph qun phi (79,41%); rut viờm, xut huyt (91,18%) v sung huyt rut non (88,24%); hch lympho vựng u, c, di hm, mng treo rut sng to, rỡa tự, xut huyt (100%) 23 - Bnh tớch vi th: phi, rut, hch lympho sung huyt, xut huyt, hoi t t bo, thoỏi húa t bo, thõm nhim t bo viờm - Nhum húa mụ dch thy virus trung nhiu ti phi, rut v hch lympho 2) Mt s c tớnh sinh hc ca chng virus Care phõn lp c t mc bnh Care: - Cỏc chng virus Care phõn lp c phỏ hy t bo Vero-DST t 24 gi n 48 gi sau gõy nhim v phỏ hy hon ton t bo sau 60 gi n 72 gi Hiu giỏ virus bin ng cao t 3,16 x 104 ti 6,25 x 105 (TCID50/25àl) cỏc thi im thu hoch virus khỏc nhau: lng virus trung t bo luụn cao hn so vi lng virus ngoi t bo - Chng virus Care CDV-VNUA-768 phõn lp c, dựng sn xut vacxin Care vụ hot cú tớnh khỏng nguyờn cao, tiờm thớ nghim cú kh nng gõy ỏp ng dch tt, bo h c trc s tn cụng ca virus cụng cng c Cú th s dng chng virus ny nghiờn cu vacxin phũng bnh 3) c tớnh sinh hc phõn t ca chng virus Care phõn lp c da trờn kt qu gii trỡnh t gene H v P l: - on gene H v P cú di ln lt l 1824 bp v 402 bp - Mc tng ng v nucleotide gene H v gene P gia chng virus nghiờn cu t t l ln lt l 90,05%-99,61% v 94,81%-99,75% - Mc tng ng v amino acid mó húa t gene H v gene P gia chng virus nghiờn cu t t l ln lt l 89,38%-99,5% v 92,47%-100,0% - chng virus Care phõn lp c nm nhỏnh phỏt sinh khỏc thuc genotype ln lt l Asia 1, Asia v Classic 5.2 KIN NGH 1) Tip tc thu thp cỏc mc bnh Care ti a phng nghiờn cu trờn cỏc ging khỏc cú th phõn lp c nhiu mu virus Care phc v cho vic sng lc v la chn chng virus t thc a 2) Tip tc nghiờn cu v ỏnh giỏ v s n nh c tớnh sinh hc ca chng virus Care phõn lp c trờn mụi trng nuụi cy dũng t bo VeroDST qua nhiu i v ỏnh giỏ c lc trờn thớ nghim 3) Tip tc nghiờn cu gii trỡnh t ton b genome ca chng virus Care phõn lp c nhm xỏc nh c s khỏc v d liu di truyn gia cỏc chng virus nghiờn cu 24 DANH MC CễNG TRèNH CễNG B Cể LIấN QUAN N LUN N Trn Vn Nờn, Nguyn Th Lan, Nguyn Th Hoa v Nguyn Hu Nam (2016a) ỏnh giỏ kh nng bo h ca vacxin vụ hot Care ch t chng CDV-VNUA-768 trờn thớ nghim Tp Khoa hc v Phỏt trin 14 (1) tr 21-27 Trn Vn Nờn, Nguyn Th Lan, Nguyn Vn Thanh v Nguyn Hu Nam (2016b) Mt s ch tiờu lõm sng, sinh lý mỏu v c im bnh lý ch yu ca lai Becgie mc bnh Care trờn a bn H Ni Tp Khoa hc K thut Thỳ y 23 (8) tr 21-28 Trn Vn Nờn, Nguyn Th Lan, Nguyn Vn Thanh v Lng Quc Hng (2017) Nghiờn cu mt s c im sinh hc phõn t ca virus Ca rờ phõn lp c ti mt s tnh phớa Bc Vit Nam Tp Khoa hc Nụng nghip Vit Nam 15 (1) tr 44-57 25 ... THễNG TIN V VIRUS CARE 2.2.1 Phõn loi virus gõy bnh Care Canine Distemper Virus (CDV) l mt thnh viờn ca ging Morbillivirus, thuc h Paramixoviridae 2.2.2 Hỡnh thỏi ca virus Care Hỡnh thỏi virus quan... ti ny chỳng tụi tin hnh nghiờn cu v c im bnh lý ch yu ca mc Care, ng thi nghiờn cu v c tớnh sinh hc v sinh hc phõn t ca virus Care phõn lp ti Vit Nam Kt qu nghiờn cu cú ý ngha rt quan trng giỳp... 1.2 MC TIấU CA TI Xỏc nh c mt s c im bnh lý ch yu ca mc bnh Care cng nh c tớnh sinh hc v sinh hc phõn t ca virus Care phõn lp c ti mt s tnh phớa Bc Vit Nam Kt qu nghiờn cu l c s cho vic chn oỏn