Ứng dụng quy trình PCR RFLP xác định genotýp virus sởi phân lập được ở một số tỉnh miền bắc việt nam

Ứ N G D ỤN G Q U Y TR ÌN H P C R -R F LP X Á C ĐỊNH G E N O T Ý P VIRUS SỞI PH ÂN LẬ P ĐƯ C Ở M Ộ T SÓ TỈN H M IÈN B Ắ C V IỆ T N A M sv Tổng Bức Minh*; s v Trần T hị M inh H ằng*; s v N gơ C hí Cơng*; s v Đ ễ Trung Kiên* H ưởng dẫn: P G S.T S Nguyễn Thái S n* TÓ M TẲ T Trong năm gần đây, vaccine sởi đưa vào chương tr nh tiêm chủng mở rộng, bệnh sởi bùng phát diễn biến phức tạp số địa phương Xác định genotýp virus lưu hành giúp cho việc điều tra dịch tễ học, góp phần vào kiểm sốt việc lây lan du nhập dịch sởi Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) hay gọi phương pháp đa h nh độ đài đoạn cắt giới hạn kỹ thuật sinh học phân íử có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh chóng genotýp virus sời Nghiên cứu nhằm: Xác định g notỷp virus sởi lưu hành s tinh miền Bắc - Việt Nam phư ng pháp PCR-RFLP Đổi tirựng phương pháp nghiên cún: 46 chủng virus sdi hoang dại thu ổuọc từ số vụ dịch sỏi từ năm 2006 đến năm 2013 số tỉnh miền Bắc ­ Việt Nam lưu giữ Khoa virus, Viện Vệ sinh Dịch íễ TW Sử dụng chủng chuẩn phân lập từ loại vacxin sống giảm độc lực gồm: W6675/Rouvax Aventis Pasteur (Pháp), AIK­C vero MMR (Mỹ) chủng genotýp H MVC/Hanam.VNM/6.09/9 (Genbank JF 824649) ỉàm đối chứng Các chùng virus sau phân lập tách chiết ARN khuếch đại đoạn gen N đặc hiệu tạo sản phẩm ADN có kích thước 660 bp, tiếp tục chạy nested PCR để có sản phẩm 492 bp tiến hành cắt enzym giới hạn Mboỉ, HaelII, ScrFI, so sánh chủng nghiên cứu vởi chủng đối chứng để xác định genotýp Đoạn gen N đặc hiệu virus sởi đuợc tiến hành giải tr nh tự kiểm chửng kết PCR­RFLP Kết quả: 46 chủng virus hoang đại thu thập giai đoạn 2006 ­ 2013 nhân gen RT­PCR nested­PCR cho kết quà dương tính với band ADN đặc hiệu, kích thước tương ứng 660 bp 492 bp, tương tự kết nhân gen chủng sởi vaccine ỉ chủng sời đối chứng Hl_Genbank: JF824649 46/46 chủng virus sởi hoang dại thuộc genotýp Hl Kết phân tích genotýp giải tr nh tự gen phù hợp với kết quà phân tích genotýp PCR­RFLP Các chủng virus sởi nghiên cứu thuộc genotýp Hỉ Kết luận: Các chủng virus sởi phân ỉập số tỉnh miền Bắc ­ Việt Nam giai đoạn 2006 ­ 2013 thuộc genotýp H I PCR­RFLP có giá trị xác định genotýp virus sởi * Từ khóa: Virus sởi; Genotysp; PCR­RFLP Applicationo/PCR-HFLPinM nứỵỳingg notyp ofm asl svirusinnorth rnofVi tnam Sum m ary Measles is a highly contagious, serious disease caused by a virus in the paramyxovirus family It is also one of the leading causes of death among children globally In recent years, there has been routine measles vaccination for children, combined with mass immunization, which results in a sharp drop in death rate Identification of existing measles virus’s genotype plays an important role in epidemiological investigation, contributes to the control of measles import and infection RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) technology is one of molecular biological methods which have high sensitivity enabling quickly measles genotype identification This study aims at identifying circulating meales’ genotype in some Northern provinces of Vietnam by using PCR ­ RFLP method * Đại học Dược Hà N ội 619 Subject and methods: 46 strains of wild­type measles virus obtained from some measles epidemics from 2006 to 2013 in some Northern provinces of Vietnam which are being stored in Virus Department, National Institute of Hygiene and Epidemiology Standard measles strain isolated from vaccines: W6675/Rouvax Aventis Pasteur (France), AIK­C vero and MMR (US.) and the strain genotype HỈ­MVC/ Hanam.VNM/6.09/9 (Gen Bank JF 824 649) is used to control After RNA extraction, strains of measles virus is amplified specific N gene fragments to create 660bp­size DNA After that, nested PCR is continued to perform on this DNA to create 492 bp fragments, then cut by restricted enzymes: Mboì, Ha ĩỉĩ, ScrFl Comparing between wild­type strains and control strains to identify genotype The measies virus N gene 660 bp fragments were sequenced to verify the FCR ­ RFLP results Results: 46 strains of wild­type measles virus were amplified by RT­PCR and nested­PCR show the same result with specific band DNA which sizes 660 bp and 492 bp, respectively Similarly, the amplification of strains of measles vaccine and a strain of control measles virus H l_ Genbank JF824649 show the same result Results analyzed 46 strains of wild­type measles virus by RFLP when compared with the control strains showed that they all belong to genotype HI The results were similar when analyzed by sequencing of measles virus N gene Conclusions: The measles virus strains isolated in some provinces in northern Vietnam in the 2006­2013 period were of genotype HI PCR­RFLP is useful in determining the genotype of measles virus * Key words: Meals virus; Genotype; PCR­RFLP I Đ Ặ T V Ấ N Đ È Sởi bệnh nhiễm trùng đường hô hấp virus sởi gây ra, thường gặp trẻ em Theo thống kê Tổ chức Y tể Thế giới (WHO), t nh trạng tử vong đo bệnh sởi giảm 78% vaccine cứu sống 4,3 triệu người thập kỷ qua Tuy nhiên, số liệu W HO năm 2012, trung b nh 330 nguời chết ngày, Ỉ4 trẻ chết v bệnh lớn bệnh hoàn toàn phịng ngừa [7] Tại Việt Nam, năm gần đây, địch bệnh lại bùng phát với diễn biến phức tạp hơn, bệnh gặp người lớn 18 ­ 40 tuổi, tản phát khó khống chế, riêng từ cuối năm 2013 đến hết quý 1/2014 ghi nhận 5.000 trường hợp nghi bệnh sởi [1] Trước t nh h nh đó, ngồi việc tiêm phịng vaccine, vấn đề đặt phải nhanh chóng xác định xác genotýp chủng virus sởi lưu hành vùng lãnh thổ quốc gia, nhằm phục vụ cho công tác giám sát địch tễ học Đây chiến lược chung WHO mục tiêu tốn bệnh sởi tồn càu dựa vào việc hoàn thiện đồ phân bố genotýp virus sởi lưu hành vùng địa lý dân cư tất châu lục [8] Để xác định genotýp virus sởi, có nhiều phương pháp như: phương pháp giải tr nh tự gen (sequencing), phương pháp reaỉtime­PCR, phương pháp PCR­RFLP [6, 8] Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng Trong đó, phương pháp PCR­RFLP sử dụng enzym giới hạn cắt tr nh tự biết cùa sản phẩm PCR nhằn đoạn gen virus sởi, qua xác định kiểu gen virus sỏi thơng qua phân tích tính đa h nh đoạn giói hạn Đây m ột phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, khơng địi hỏi trang thiết bị đăt tiền, đáp ứng yêu cầu mặt giá thành rút ngắn thời gian, phù hợp với nghiên cứu dịch tễ Chính v lý đo đó, chúng tơi tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định genotýp virus sởi lưu hành số t nh miền Bắc V iệt Nam phương pháp PCR­RFLP II Đ Ó I TƯỢNG VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P N G H IÊ N CỨU 2.1 Đ ố i tư ợng nghiên cứu ­ Các chủng virus sởi phân ỉập từ ba loại vaccine sống giảm độc ỉực gồm: 6675/Rouvax Aventis Pasteur (Pháp); AIK­C Vero M M R (Mỳ) thuộc genotýp nhánh A Các chủng dùng chủng chuẩn nghiên cứu genotýp virus sởi 620 ­ Chủng virus sởi nhóm H I MVi/Hanam.VNM/6.09/9 (Genbank: JF824649) sử đụng làm chủng đôi chứng đê so sánh phân tích với chủng hoang dại nghiên cứu ­ 46 chủng virus sởi thu từ số vụ dịch sởi từ 2006 đến 2013 tỉnh miền Bắc Việt Nam lưu giữ Khoa Virus, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương sử dụng để nghiên cứu genotýp 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phát genotýp virus sởi chủng thu thập kỳ thuật PCR­RFLP giải tr nh tự gen Các chủng virus sau tách chiết ARN làm khuếch đại đoạn gen N đặc hiệu tạo sản phẩm AĐN có kích thước 660bp phản ứng RT­PCR, sau tiến hành chạy nested PC R giải tr nh tự gen [4, 5], Sản phẩm nested PCR kích thước 492 bp cắt loại enzym giới hạn M boĩ, lỉa iu , ScrFI, kiểm tra kêí gel agarose 3% với thang ADN chuẩn, so sánh chủng nghiên cứu với chủng đối chứng, rút kết luận genotýp Sản phẩm RT­PCR kích thước 660 bp chủng virus sởi giải tr nh tự theo phương pháp Sanger, kết so sánh với tr nh tự chủng chuẩn Genbank để kiểm chứng kết PCR­RFLP Các tr nh tự cặp mồi đặc hiệu cho virus sởi dùng nghiên cứu gồm [4]: ­ Cặp mồi cho phản ứng RT­PCR: MN5: ’ ­ GCC ATG GGA GTA GGA GT G GAA c ­ 3’ MN6: 5’ ­ CTG GCG GCTGTG TGG ACC TG ­ 3’ ­ Cặp mồi cho phản ứng nested ­ PCR: N fl: ’­ GAT GGT AAG GAG GTC AGC TGG ­ 3’ Nr7: ’ ­ TCG GCC TCT CGC ACC TA ­ ’ ĨII K É T QUẢ 3.1 K ết qu P C R nhân đoạn gen đặc hi u N virus sô i Bảng I Ket khuếch đại đoạn gen đặc hiệu virus sởi n RT­PCR Sô (+) (660bp) Chủng vaccine 3 Chủng đối chứng 1 Hà Nội 14 14 14 Điện Biên 1 Lào Cai 4 Lai Châu 5 Thái Nguyên 2 Băc Giang 4 Hải Đương 3 Thái B nh 1 Hòa B nh I Ninh B nh 4 Thanh Hóa 3 Nghệ An 4 Tông 50 50 50 Chúng nghiên cứu Nested­PCR Sô(­) Sô (+ )(492bp) số(­) s 46 chủng virus hoang dại thu thập giai đoạn 2006 ­ 2013 nhân gen RT­PCR nested­ PCR có kết đương tính, cho band ADN đặc với kích thước tương ứng 660 bp 492 bp kểt tương đồng kết nhân gen chủng sởi vaacine chủng sởi đối chứng H l„ Genbank: JF824649 621 3.2 K ết qu xác địn h genotýp v iru s s i k ỹ thuật R F L P * Kết cắt giới hạn chủng chuẩn chửng đổi chứng nghiên cứu T r n h t ự c h ù n g cliu ă n A _ E d m o n S to n ­ w t/ S H l _ n ix n a n C Ỉ I N / > / c 240 231 21 151 135 80 S3 52 21 T rtn l* t ự I h ự c n g h iệ m H I C ỉc n b an k : J F 146 115 77 53 52 23 21 s H nh Kết RFLP chủng virus sởi cắt với ScrFI (M: M arker ®X174 ­ H a \l\\ 1: Chủng vaccine MMR; 2: Hl_Genbank:JF824649; 3: Chủng vaccine 6675/Rouvax; 4: Chủng sỏi VN) ­ Kết phân tích chủng vaccine enzym ScrFI cho band ADN có kích thước khoảng 240, 231 21 bp, kết phù hợp tính tốn lý thuyết ­ Kết phân tích chủng Hl_Genbank: JF824649 enzym ScrFI cho band ADN với kích thước khoảng 146, 115,77, 53, 52 bp phù hợp với tính tốn lý thuyết Tr nh tự chúng chuẩn A_Eđmonston­wƯ54 Hl_Hunan.CHN/93/7 Tr nh ỉự thực nghiệm IIl_Genbank: JF824649 Ha in 264 228 228 203 61 242 223 26 H nh Kêt RFLP chùng virus sởi căt với HaelII (M: M arker pBR_M spI; 1: Chủng vaccine AIK; 2: Chủng vaccine M MR; 3: Chủng vaccine 6675/Rouvax; 4­17: chủng sởi VN; 18: chủng H l_G enbank: JF824649) ­ Khi phân tích chủng vaccine enzym H a ĩỉỉ có vạch ADN với kích thước khoảng 264 228 bp, phù hợp với tính tốn lý thuyết ­ Phân tích chùng đối chứng Hl_Genbank: JF824649 enzym Ha ỉn cho vạch ADN với kích thước khoảng 242 223 bp, phù hợp với tính tốn lý thuyết * K t xác định g notýp ” 48= = ' H nh Kết RFLP chủng virus sởi cắt với enzym M bol H aẽlĩí (M: Marker oX174 ­ H a R I; 1,4­7: chùng virus sởi VN; 2, 9: Chủng virus H I; 3: Chủng vaccine cắt với M boI; 8, 11­14: chủng virus sỏi VN; 10: Chủng vaccine cắt với H a líĩ) 622 Các đoạn ADN chủng virus sởi hoang dại phân lập m ột số địa phương miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2006 ­ 2013 phân tích với enzym M bol có kích thước khoảng 242, 155, 55 bp, phân tích với H a ĩỉỉ cho 02 vạch ADN có kích thước khoảng 242 223 bp tương tự với chủng đối chứng Hl_Genbank: JF824649 t>»> ‘111­ Ị H nh Kết RFLP chủng virus sởi cắt với enzyme ScrFI (M: Marker ®X174 ­ Ha ĩlĩ; 1, 4­ 7: chủng virus sởi VN; 2: Chủng Hl_Genbank: JF824649; 3: Chủng vaccine cắt với ScrVĨ) Khi phân tích chủng virus sởi hoang dại với enzym ScrFI cho band ADN có kích thước khoảng 146, 115,77, 53, 52 bp, tương tự phân tích chủng đối chứng Hl„G enbank: JF824649 Từ kết thấy, chủng virus sởi hoang đại phân lập số tỉnh miền Bắc VN giai đoạn 2006 ­ 2013 phân tích đoạn gen có kích thước 492 bp enzym Mbol, Scr¥ỉ Ha III cho vạch ADN tương tự vói chủng đối chứng Hl_Genbank: JF824649 Kết xác định genotýp chủng virus sởi hoang dại phân lập số tỉnh miền Bắc Việt Nam phương pháp RFLP thể bảng sau: Bảng Kết xác định genotýp chủng virus sởi Việt Nam phân lập giai đoạn 2006 ­ 2013 n Genotýp HI Genotýp khác Hà Nội Địa phương 14 14 Điện Biên 1 Lào Cai 4 Lai Châu 5 Thái Nguyên 2 Bắc Giang 4 Hải Dương 3 Thái B nh 1 Hòa B nh 1 Ninh B nh 4 Thanh Hóa 4 46 46 Nghệ An Tông 46 chủng virus sởi hoang dại phân lập V iệt Nam sử dụng nghiên cứu thuộc genotýp H l 3.3 K ế t qu xác đ ịn h genotýp viru s sỏ i phân tích trìn h tự Để khẳng định kết PCR­RFLP, nghiên cứu này, tiến hành giải tr nh tự 44 chủng (gồm chủng vaccine, chủng đối chửng H l_G enbank JF824649 40 chủng virus hoang dại thu thập Việt Nam) Các chủng giải tr nh tự có số thứ tự từ ­ 44 đanh sách chủng nghiên cứu 623 a l- G ẹ n b o n k jr S « B a K o i V Z E / B H N o i.V X E / H O B D io n B io o V I E / S € X h o iB g u y o n V I t/ Thim h.H rĩã -V I E / - O B U a K o i V I E / S S O e H o i O u o u g V X E / e O S T ii a n h H a a V I E / l S O e Ó M o i- V l i / x s 08 T h u h U o a V I E / l 08 V i n h B ị n h •»» l i l / s / o f i ) H i n l i B i n h 3D (9 / / O B ) H a H o i.V I E / O S H a N o i V E / i lla t io l.V I E / o e H a L H o i.V I S / OS i i i i o i VX S/S2 09 n a N o i.V I R / Bite s i o n g / 0 H oa a i n h C9 /2009 T h ọ iS i n h v r K / - O Ê f j iic h n u V I E / l D a iD u o n a y iE / S O e a » K o i.V I B / • H a N o i.V I E / S O B fic ẽ i n n g ãã /2ÕD i n h B i l t h S B ( ii / G / O B ) B a c G i a n g V I E / 09 T h o iK g u y o n V I E / 6 rta iD u 19 V i e / B o c G i t t n g V I E / 09 BaHoi.VÍS/25.09 R * N o i T x e / » H nh Ket giải tr nh tự số chủng virus sởi nghiên cứu Kết giải tr nh tự đoạn gen đặc hiệu chủng virus sởi hoang dại nghiên cứu cho thấy tr nh tự nucleotide chủng có độ tương đồng cao, xảy thay đổi vài vị trí nucleotide Tr nh tự chủng virus sởi nghiên cứu xử lý phân tích phần mềm BioEdit MEGA 4.0 cho kết phát sinh chủng loại sau: H nh Cây phát sinh chủng loại số chủng virus sởi miền Bắc V iệt Nam Cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng virụs sởi phân lập số tỉnh khu vực miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2006 ­ 2013 thuộc genotýp H L Như vậy, kết xác định genotýp giải t n h tự phù hợp với kết phân tích genotýp PCR­RFLP IV BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, xác định genotýp số chủng virus sởi kỹ thuật PCR­RFLP dựa in * A 624 — C —A ^ T 'TP n n r t_ _ X ô ã / ã t ô ã « A ^ « « £ 2006 ­ 2013 nghiên cứu thuộc genotýp H I (bảng 3.2) Kết tương tự với nghiên cứu Nguyễn Hạnh Phúc [3] phân tích 10 chủng virus sởi thu thập nãm 2006 " 2008 số tỉnh miền Bắc cững thuộc genotýp H l Kết giải tr nh tự kiểm chửng đoạn gen N đặc hiệu virus sởi cho thấy toàn chủng phân tích PCR­RFLP thuộc genotýp H I Ngồi ra, phân tích chủng đối chứng H1_JF824649 chủng hoang dại với enzym M boì Ha HL cho số vạch ADN có kích thước khác biệt so với chủng chuẩn N hư vậy, có vài thay đổi vị trí nhận biết enzym tr nh tự gen chủng Việt Nam so với chủng chuẩn Kết thu nhận từ thực nghiệm đề tài phù hợp với đánh giá chung ưu điểm cùa kỹ thuật RFLP K ỹ thuật phát số thay đổi tr nh tự nucỉeotiđ liên quan đến vị trí nhận biết enzym giới hạn, khơng địi hỏi nhiều trang thiết bị đắt tiền, quy tr nh thực đơn giản, có khả tiến hành phân tích đồng thời với số lượng mẫu lớn, thời gian cho kết nhanh Điều phù hợp với yêu cầu dịch tễ học phân tử việc sàng lọc xác định nhanh chóng nguyên gây dịch genotýp vi sinh vật gây bệnh V K Ế T LUẬN ­ Các chủng virus sởi phân lập số tỉnh miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2006 ­ 2013 thuộc genotýp H l ­ PCR­RFLP có giá trị xác định genotýp virus s i K IẾ N N G H Ị Tiếp tục nghiên cứu với quy mô lớn kiểu gen chủng virus sởi lưu hành Việt Nam dể góp phần hồn thiện đồ dịch tễ học phân tử virus sởi toàn quốc Đánh giá đáp ứng miễn dịch chủng lưu hành chủng vaccine để góp phần kiểm sốt bệnh sởi Việt Nam tốt ưong tương lai T À I L IỆ U T H A M KH ẢO ỉ Bộ Y tế (2014), Công điện khẩn số 1696/CĐ­BYT ngày 5/4/2014 iăng cường phòng chống bệnh sởi kế hoạch tiêm vacxin phòng bệnh sời Cục Y tế dự phòng Lê Thị Kim Tuyến c s (2005) “Nghiên cứu đặc điểm di truyền sổ chùng sởi lưu hành Việt Nam phư ng pháp RFLP ịĐa dạng độ dài đoạn cắt giới hạn)”, Đề tài cấp năm Y tế, nghiệm thu 2005 Nguyễn Hạnh Phúc, Nguyễn Hiền Thanh, Nguyễn Thị Thu Thủy c s (2009) "G notyp HI virus sởi lim hành vụ dịch sởi năm 2006 - 2008 miền Bắc Việt Nam", Tạp chí y học dự phòng 2009, số (104), 50 ­ 56 Julia R Kessler, Jacques R Kremer, Sergey V Shulga, Nina T Tikhonova, Sabine Santibanez, Annette Mankertz, Galina V Semeiko, Elena o Samoilovich, Jean­Jacques Muyembe Tamfum, Elisabeth Pukuta, and Claude P Muller “R v aling N w M asl s Virus Transmission Rout s by Us of S qu nc Analysis o f Phosphoprot in and H magglutinin G n s” Journal of Clinical Microbiology, Feb 2011, Vol 49, No 2, pp 677­683 Paul A Rota, Stephanie L Liffick, Jennifer s Rota, Russell s Katz, Susan Redd, Mark Papania, and William J Bellini “Mol cular Epid miology o f M asl s Virus s in th Unit d Stat s, 1997-2001” Emerging Infectious Diseases, Vol 8, No 9, pp 902­908, September 2002 William J Bellini and Paul A Rota “G n tic Div rsity o f Wild-Typ M asl s Virus s: Implications for Global M asl s Elimination Programs” Emerging Infectious Diseases 1998 Vol 4, No 1, pp29 ~ 35 WHO (Fact sheet N°286): Measles, who.int/mediacentre/factsheets/fs286/en/ Updated February 2014 WHO (2013), Measles and Rubella Laboratory Network, Genava Switzerland, June 2013 625 ... chứng Hl_Genbank: JF824649 Kết xác định genotýp chủng virus sởi hoang dại phân lập số tỉnh miền Bắc Việt Nam phương pháp RFLP thể bảng sau: Bảng Kết xác định genotýp chủng virus sởi Việt Nam phân. .. gây dịch genotýp vi sinh vật gây bệnh V K Ế T LUẬN ­ Các chủng virus sởi phân lập số tỉnh miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2006 ­ 2013 thuộc genotýp H l ­ PCR? ?RFLP có giá trị xác định genotýp virus s... chủng virụs sởi phân lập số tỉnh khu vực miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2006 ­ 2013 thuộc genotýp H L Như vậy, kết xác định genotýp giải t n h tự phù hợp với kết phân tích genotýp PCR? ?RFLP IV BÀN