Nghiên cứu một số đặc tính sinh học sinh học phân tử của virus viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vaccin luận văn thạc sĩ nông nghiệp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ĐỘC VÀ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM VACCIN Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Đình Thâu NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, kết nghiên cứu, số liệu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình khoa học chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày … tháng … năm 2016 Tác giả luận văn Lê Thu Hương i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Trịnh Đình Thâu, trưởng Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban giám đốc, Ban quản lý đào tạo, Khoa Thú Y - Học viện nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cám ơn TS Tạ Hoàng Long, giám đốc Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương I, tập thể lãnh đạo, cán công nhân viên chức trung tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin phép gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày … tháng ….năm 2016 Tác giả luận văn Lê Thu Hương ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt .v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis extract x Phần Mở đầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan vịt 2.1.1 Lịch sử phân bố bệnh 2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt giới 2.1.3 Tình hình bệnh Viêm gan vịt Việt Nam 2.2 Virus viêm gan vịt 2.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo virus viêm gan vịt .9 2.2.2 Cấu trúc hệ gen Picornavirus 2.2.3 Quá trình nhân lên virus 11 2.2.4 Đặc tính ni cấy 13 2.2.5 Đáp ứng miễn dịch .15 2.2.6 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt type I (DHV-1) 16 2.2.7 Sức đề kháng virus viêm gan vịt 21 2.2.8 Chẩn đoán .21 2.2.9 Vắc xin chế phẩm sinh học phòng bệnh .22 Phần Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 25 3.1 Vật liệu nghiên cứu 25 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất nghiên cứu 25 3.1.3 Thiết bị, máy móc 26 3.1.4 Địa điểm nghiên cứu 27 iii 3.2 Nội dung nghiên cứu 27 3.2.1 Xác định đặc tính sinh học giống virus Viêm gan vịt cường độc 27 3.2.2 Ứng dụng chủng virus Viêm gan vịt cường độc để kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu .27 3.3.1 Phương pháp kiểm tra vô trùng giống 27 3.3.2 Phương pháp kiểm tra độ khiết giống .28 3.3.3 Phương pháp thu nhận bảo quản mẫu, tiếp truyền virus giống 28 3.3.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà lớp 28 3.3.5 Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm 29 3.3.6 Phương pháp giải trình tự gen virus 30 3.3.7 Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin: Theo TCVN 8685-2:2011 32 3.3.8 Xử lý số liệu nghiên cứu .33 Phần Kết thảo luận 34 4.1 Kết xác định đặc tính sinh học; giải mã gen đặc trưng, xây dựng liệu sinh học giống virus viêm gan vịt cường độc 34 4.1.1 Kết xác định đặc tính sinh học virus Viêm gan vịt cường độc 34 4.1.2 Kết giải mã gen đặc trưng, xây dựng liệu sinh học phân tử giống Viêm gan vịt cường độc 39 4.2 Ứng dụng giống virus viêm gan vịt cường độc công tác kiểm nghiệm 45 4.2.1 Kết kiểm tra cảm quan 47 4.2.2 Kết kiểm tra khiết 47 4.2.3 Kiểm tra tính an tồn vắc xin (Theo TCVN 8685-2:2011) .48 4.2.4 Kết kiểm tra hiệu lực phương pháp công cường độc 48 Phần Kết luận đề nghị 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 51 Tài liệu tham khảo .52 Phụ lục 55 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt cDNA complementary DNA BEI Binary Ethylenimine Bp Base pair (s) DNA Acid DeoxyriboNucleic DVH Duck Virus Hepatitis ĐVTH Đơn vị trung hòa EID50 50 percent Embryo Infectious Dose ELD50 50 percent Embryo Lethal Dose Kb Kilobase LD50 50 percent Lethal Dose Ml Mililit Mg Miligam Nm Nanomet ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction RNA Axít Ribonucleic RT - PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction UI Unit Interval UTR Untranslated Region v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng viêm gan vịt Việt Nam giới cung cấp thị gen để phân tích so sánh thành phần gen mối quan hệ nguồn gốc phả hệ .20 Bảng 4.1 Kết kiểm tra vô trùng giống virus Viêm gan vịt cường độc 35 Bảng 4.2 Kết kiểm tra khiết giống virus Viêm gan vịt cường độc .36 Bảng 4.3 Kết xác định LD50 virus Viêm gan vịt cường độc đợt thí nghiệm 37 Bảng 4.4 Danh sách mồi dùng cho phản ứng PCR/RT-PCR nghiên cứu virus Viêm gan vịt 40 Bảng 4.5 Trật tự xếp nucleotide amino acid hệ gen virus Viêm gan vịt cường độc 45 Bảng 4.6 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 47 Bảng 4.7 Kết kiểm tra an toàn vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 48 Bảng 4.8 Kết công cường độc virus Viêm gan vịt cường độc 49 vi DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Vịt chết thời điểm 48 giống virus Viêm gan vịt cường độc hình ảnh Gan xuất huyết hoại tử .38 Hình 4.2 Sơ đồ bố trí mồi thực PCR q trình giải mã hệ gen virus viêm gan vịt cường độc thuộc DHAV-3 39 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm RT-PCR/PCR nhân gen kháng nguyên VP1 .40 Hình 4.4 Điện di kiểm tra kết cắt ADN plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn EcoRI 41 Hình 4.5 Trình bày chuỗi gen VP1 chủng virus viêm gan vịt cường độc 42 Hình 4.6 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng viêm gan vịt cường độc DN2 Việt Nam giới (thuộc DHAV-3) dựa sở phân tích chuỗi gen VP1 thành phần nucleotide chương trình MEGA4.0 43 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR hệ gen virus viêm gan vịt cường độc .44 Hình 4.8 Vịt lô gây miễn dịch (dấu đầu xanh) khoẻ mạnh vịt lơ đối chứng chết 49 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lê Thu Hương Tên luận văn: “Nghiên cứu số đặc tính sinh học, sinh học phân tử virus Viêm gan vịt cường độc ứng dụng kiểm nghiệm vắc xin” Ngành: Thú Y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định đặc tính sinh học giống vi rút Viêm gan vịt cường độc; Giải mã gen đặc trưng xây dựng liệu sinh học phân tử giống Ứng dụng chủng cường độc kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt Nội dung nghiên cứu - Xác định đặc tính sinh học giống vi rút Viêm gan vịt cường độc thông qua bước cấy truyền, gây nhiễm tế bào, xác định độc lực, xác định đặc tính ổn định, tính kháng nguyên giống; Giải mã gen đặc trưng xây dựng liệu sinh học phân tử giống Giải mã toàn hệ gen chủng virus cường độc lưu giữ - Kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt phương pháp công cường độc với chủng cường độc viêm gan vịt Phương pháp - Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà lớp - Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm - Phương pháp giải trình tự gen virus: tách chiết ARN tổng số; Phương pháp RT- PCR - Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin: Kiểm tra độ khiết; an toàn; hiệu lực - Xử lý số liệu nghiên cứu Kết kết luận - Giống virus Viêm gan vịt không bị tạp với vi khuẩn hay gặp Về độ tinh khiết giống không lẫn Mycoplasma Salmonella - Xác định liều gây chết 50% vịt (LD50): 106,31 - Giải mã gen kháng nguyên VP1 chủng viêm gan vịt cường độc có độ dài 720 bp xác định thuộc genotype III (DHAV-3) Truy cập Ngân hàng gen sử viii dụng chuỗi nucleotide thu nhận cho thấy chủng virus phân tích thuộc virus viêm gan vịt nhóm A (duck hepatitis A), genotype III (DHAV-3) - Đã giải mã toàn hệ gen thu chuỗi ADN toàn hệ gen virus viêm gan vịt cường độc gồm 7777 nucleotide Dựa vào trật tự gen hệ gen chủng virus viêm gan vịt công bố, xác định trật tự xếp gen hệ gen chủng virus viêm gan vịt cường độc - Kết nghiên cứu sinh học phân tử cho thấy: Vị trí phân loại chủng virus cường độc: Group IV:ss RNA positive-strand viruses; Order: Nidovirales; Family: Picornaviridae; Genus: Avihepatovirus; (Genotype: DHAV-3) - Ứng dụng thành công giống cường độc Viêm gan vịt kiểm nghiệm vắc xin Qua kết chứng tỏ giống cường độc Viêm gan vịt sau thời gian tăng cường lưu giữ giữ đặc tính sinh vật học, đặc tính kháng nguyên, tính độc giống ix cường độc viêm gan vịt kiểm nghiệm, tiến hành kiểm tra số tiêu vắc xin trước tiêm cho đàn vịt thí nghiệm 4.2.1 Kết kiểm tra cảm quan Kiểm tra mắt thường: Vắc xin có màu trắng hồng, dạng bánh xốp, dễ tách khỏi thành lọ, kín, có chân khơng, dễ tan pha trở lại 4.2.2 Kết kiểm tra khiết 4.2.2.1 Kết kiểm tra vô trùng Kiểm tra tiêu vô trùng cho vắc xin trước đưa vào thử nghiệm bước bắt buộc quy trình sản xuất vắc xin Để kiểm tra tiêu vô trùng, lấy vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đơng khơ hồn ngun nước sinh lý 0,9%, tiến hành kiểm tra vô trùng loại môi trường thạch máu, thạch nấm, thạch thường, nước thịt yếm khí Mỗi loại mơi trường ống, lượng vắc xin cấy kiểm tra 1–2% dung tích mơi trường Theo dõi -10 ngày 370C, riêng thạch nấm để nhiệt độ phòng Kết kiểm tra vô trùng thể bảng 4.6 Bảng 4.6: Kết kiểm tra vô trùng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc MT Ngày Thạch máu Thạch nấm Thạch thường Nước thịt Yếm khí 2 2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Kết Đạt Đạt Đạt Ghi : (-) âm tính: khơng có vi khuẩn nấm mọc (+) dương tính: Có vi khuẩn nấm mọc 47 Đạt Đạt Kết từ bảng 4.6 cho thấy qua 10 ngày theo dõi môi trường, kết loại môi trường kiểm tra khơng có vi khuẩn, nấm Do chúng tơi sơ kết luận vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đông khô đảm bảo độ vô trùng 4.2.3 Kiểm tra tính an tồn vắc xin (Theo TCVN 8685-2:2011) Yêu cầu loại vắc xin phải an tồn khơng gây phản ứng bất thường vật sử dụng Để kiểm tra tính an tồn, chúng tơi sử dụng 20 vịt ngày tuổi, tiêm da bắp thịt cho tiêm 10 liều vắc-xin quy định Theo dõi 14 ngày, tất vịt phải sống khoẻ Kết kiểm tra an tồn trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7: Kết kiểm tra an toàn vắc xin Viêm gan vịt nhược độc Vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đông khô Đường gây nhiễm Động vật thí nghiệm Liều dùng Tiêm Vịt 10 da ngày tuổi liều Kết Thời gian theo dõi Sống Chết Kết luận 14 ngày 20/20 0/20 Đạt Với kết thu trên, vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đạt tiêu chuẩn độ an toàn theo mục 4.3 TCVN 8685-2:2011 So sánh với Hướng dẫn OIE thử vắc xin đối tượng liều dùng (10 liều vắc xin thử an toàn) Quan sát vòng 10 đến 21 ngày, tất vịt sống khoẻ không bị tác động vắc xin Như vậy, kết thu thí nghiệm tưg đương so với tiêu chuẩn quốc tế Sau tiến hành kiểm tra số tiêu: cảm quan, khiết dùng giống Viêm gan vịt cường độc kiểm tra hiệu lực vắc xin phương pháp công cường độc 4.2.4 Kết kiểm tra hiệu lực phương pháp công cường độc Hiệu lực vắc xin tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng vắc xin Vắc xin có chất lượng tốt ngồi tiêu cảm quan, khiết, an tồn cần có hiệu lực, bảo hộ đàn vịt sử dụng Để kiểm nghiệm hiệu lực vắc xin, áp dụng theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8685-2:2011về "Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan siêu vi trùng vịt" Sử dụng giống cường độc viêm gan vịt để thử thách kiểm tra tính bảo hộ 48 vắc xin (theo mục 4.4.1 Phương pháp trọng tài TCVN 8685-2:2011) Tiêm da cho cho 20 vịt, liều vắc xin ghi nhãn 20 vịt đối chứng không tiêm vắc xin Sau 72 sử dụng vắc xin, 20 vịt miễn dịch 20 vịt đối chứng thử thách với vi rút viêm gan vịt cường độc (chủng Quốc gia lưu giữ Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1), liều 103,0 LD50/con, vào da Lô vắc xin đánh giá đạt 80 % vịt miễn dịch sống 80 % vịt đối chứng chết Theo dõi 10 ngày sau công cường độc Kết công cường độc trình bày bảng 4.8 hình 4.8: Hình 4.8: Vịt lô gây miễn dịch (dấu đầu xanh) khoẻ mạnh vịt lô đối chứng chết (ảnh chụp Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1) Bảng 4.8 Kết công cường độc virus Viêm gan vịt cường độc Các tiêu theo dõi Số vịt thí nghiệm (con) Đường đưa vắc xin Số vịt công cường độc (con) Lơ thí nghiệm Lơ đối chứng 20 20 Tiêm da Không tiêm 20 20 103,0LD50/con Liều công cường độc Thời gian theo dõi (ngày) 14 14 18 Số vịt sống sau công cường độc (con) 20 Tỷ lệ bảo hộ (%) 100 10 Số vịt có triệu chứng lâm sàng (hoặc) chết (con) 49 Qua kết bảng 4.8 cho thấy: Ở lô miễn dịch 20 vịt sử dụng liều vắc xin theo quy định, sau 10 ngày công cường độc 20/20 vịt sống khỏe, tỷ lệ bảo hộ đạt 100% Trong đó, 18 vịt (tỷ lệ 90%) lô đối chứng không sử dụng vắc xin chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình bệnh Viêm gan vịt như: Vịt chết nhanh với tỷ lệ chết cao chết trạng thái đặc biệt đầu ngoẹo bên, chân duỗi thẳng Mổ khám thấy gan sưng to, xuất huyết lốm đốm gan, có điểm hoại tử Điều chứng tỏ rằng, vịt lô miễn dịch sử dụng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc tạo đáp ứng miễn dịch giúp vịt bảo hộ chống lại virus Viêm gan vịt cường độc thử thách cường độc Theo Hướng dẫn OIE, vịt gây miễn dịch với liều vắc xin 3,3 10 ELD50 da, sau 72 thử thách chủng cường độc viêm gan vịt với liều 103,0LD50 cho vịt Ít 80% vịt miễn dịch bảo hộ Tỷ lệ vịt đối chứng phải chết 80% chấp nhận Đối chiếu theo Tiêu chuẩn Việt Nam kiểm nghiệm - TCVN 86852:2011, vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đông khô công ty Vetvaco sản xuất đạt tiêu hiệu lực phòng bệnh Viêm gan vịt Qua kết chứng tỏ giống cường độc Viêm gan vịt sau thời gian tăng cường lưu giữ giữ đặc tính sinh vật học, đặc tính kháng nguyên, tính độc giống 50 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, rút kết luận sau: - Giống virus Viêm gan vịt không bị tạp với vi khuẩn hay gặp - Về độ tinh khiết: giống không lẫn Mycoplasma Salmonella - Chất lượng giống virus Viêm gan vịt cường độc thông qua tiêu giữ ELD50 ổn định môi trường nước trứng vịt, nước trứng gà, tế bào xơ phôi vịt tế bào xơ phôi gà - Liều gây chết 50% vịt (LD50): 106,31 - Đã giải mã gen kháng nguyên VP1 chủng viêm gan vịt cường độc Gen kháng nguyên VP1 chủng virus viêm gan vịt cường độc có độ dài 720 bp xác định thuộc genotype III (DHAV-3) - Đã giải mã toàn hệ gen virus Viêm gan vịt Thu toàn hệ gen virus viêm gan vịt cường độc gồm 7777 nucleotide - Sử dụng giống virus Viêm gan vịt cường độc kiểm nghiệm vắc xin với liều công liều 103,0 LD50 cho kết tương đồng đối chiếu theo Tiêu chuẩn Việt Nam - TCVN 8685-2:2011, Tiêu chuẩn ASEAN (2012 update) OIE (2014) - Sau thời gian lưu giữ bảo tồn giống virus Viêm gan vịt cường độc giữ đầy đủ đặc tính sinh vật học, sinh học phân tử Đáp ứng đầy đủ tiêu chí giống vi sinh vật ngân hàng giống quốc gia 5.2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu phương pháp tăng cường giống loại môi trường tế bào nhằm thay phương pháp tăng cường động vật đảm bảo giữ đặc tính ổn định giống vi sinh vật Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc sinh học phân tử giống Viêm gan vịt cường độc, theo dõi thay đổi khác biệt với chủng Viêm gan vịt lưu giữ ngân hàng gen giới 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thanh Khiết (2007) Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc DH - EG - 2000 ứng dụng phòng, can thiệp dịch vào thực tế sản xuất Luận văn thạc sỹ nông nghiệp Trường Đại học nơng nghiệp I Lê Thanh Hồ, Nguyễn Như Thanh Nguyễn Bá Hiên (1984) Đặc tính sinh học giống virus vacxin viêm gan vịt chủng TN Asplin vacxin phịng bệnh Việt Nam Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 2, (1-1985), tr 21-25 Nguyễn Bá Hiên (2007) Khảo sát số đặc tính sinh học chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 bước đầu nghiên cứu chế tạo vacxin phịng bệnh Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 14(2), hội thú y Việt Nam, tr 11-15 Nguyễn Đức Lưu, Vũ Như Quán (2002) Bệnh viêm gan virus vịt Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 9(1), Hội thú y Việt Nam, tr.87-90 Nguyễn Đường, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Khắc Tuấn, Nguyễn Thị Bích Lộc, Nguyễn Bá Hiên (1990) Vi sinh vật đại cương NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hữu Vũ, Nguyễn Đức Lưu, Trần Thị Thu Hiền, Nguyễn Khánh Ly (2001) Kết sử dụng kháng thể viêm gan vịt phòng trị bệnh cho vịt ngan Khoa học kỹ thuật thú y, tập VIII số 4, Hội thú y Việt Nam, tr 52- 58 Nguyễn Luận (2008) Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 chủng virus vacxin viêm gan vịt Việt Nam so sánh với số chủng khác giới Luận văn thạc sỹ nông nghiệp Trường Đại học nông nghiệp I Nguyễn Phục Hưng (2004) Tình hinh mắc bệnh viêm gan vịt virus số tỉnh đồng Bắc Bộ Phân lập virus gây bệnh, nghiên cứu đặc tính sinh học chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 quy trình sản xuất vacxin Luận văn thạc sỹ nông nghiệp Trường Đại học nông nghiệp I Nguyễn Thát (1975) Bệnh gia cầm NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 10 Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà Nguyễn Khánh Ly (2001) Nghiên cứu biến đổi bệnh lý bệnh viêm gan virus vịt Khoa học kỹ thuật Thú y, 8(4), Hội thú y Việt Nam, tr 48-51 11 Nguyễn Xuân Bình (1995) 109 bệnh gia cầm NXB Long An 52 12 TCVN 8685-2:2011 Quy trình kiểm nghiệm vacxin-phần II: Vacxin viêm gan siêu vi trùng vịt 13 Trần Minh Châu Lê Thu Hồng (1985) Thăm dò tạo chủng vacxin nhược độc Viêm gan vịt chủng virus phân lập địa phương Tạp chí KHKT Thú y, Tập (3-1985), tr.3-8 14 Trần Thị Lan Hương, Phạm Thị Hường, Nguyễn Bá Hiên (2008) Ảnh hường miễn dịch thụ động viêm gan vịt đến đáp ứng miễn dịch củ vịt tiêm liều vacxin Tạp chí Khoa học phát triển, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 6(4), tr 338-342 15 Vũ Triệu An (1997) Miễn dịch học NXB Y học Hà Nội Tiếng Anh 16 Adamiker D (1969) Elektronenmikros kopiscle untersuchungen zus virushepatitis der Etenkken, Zentrabl Veterianezmed [B] 16: 620-636 17 Adamiker D (1970) Die Virushepatitis der Entenkken im elektronenmikroskopischen Bild, Teil II: Befunde an der Milz und am Muskei Zentralbl Veterinaermed [B] 17: 880-889 18 Aspin F.D (1958), An attenuated strain ò duck hepatitis virus , Vet Rec 70, pp 1226-1230 19 Asplin F.D (1961) Notes on epidemiology and wacination for virus hepatitis of ducks Epizôt bull 56,pp.793-800 20 Asplin F.D (1970) Examination of sera from wild fowl for antibodies against the viruses of duck plague duck hepatitis and duck influenza, Vet Rec 87, pp 182-183 21 Asplin, F.D (1965) Duck hepatitis: Vaccination against two serological types, Veterinary Record, 87, pp 182-183 22 Ding C and Zhang D (2007) Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1, Virology 361, pp 9-17 23 Fabricant J and Levine P.P (2002) Duck virus hepatitis, Diseases of Poultry, (9th Ed), Lowa State University Press, Ames, Lowa, U.S.A 24 Fabricant J, Rickard C.G and Levine P.P (1957) The pathology of duck virus hepatitis, Avian Diseases, pp 256-275 25 Ghazi F, Hughes P.J, Hyypiä T and Stanway G (1998) Molecular analysis of human pacherovirus type (formerly echovirus 23), Virol 79, pp 2641-2650 53 26 Golubnichi V.P and G.V Malinovskaya (1984) Dynamics of postvaccinal antibodies in blood serum against duck hepatitis virus, Vet Nauk Proiz (Minsk) 22, pp 72-75 (Abstr Agro Salekt 1985: 1973) 27 Gough R.E and Spackman D (1981) Studies with inactivated duck virus hepatitis vacxins in breeder ducks, Avian Pathol 10, pp 471-479 28 Haider S.A and B.W Calnek (1979) “In vitro isolation, propagation and characterization of duck hepatitis virus type III” Avian disease, 23, pp 715-729 29 Hwang, J (1973) Active immunization against duck hepatitis virus Amj Vet Res 33, pp 2539-2544 30 enkins K.A, Bean A.G and Lowenthal J.W (2007) Avian genomics and the innate immune response to viruses, Cytogenet Genome Res 117, pp 207-212 31 Jenkins K.A, Bean A.G and Lowenthal J.W (2007) Avian genomics and the innate immune response to viruses, Cytogenet Genome Res 117, pp 207-212 32 Johansson S, Niklasson B, Tesh R.B, Shafren D.R, Travassos da Rosa A.A and Lindberg A.M (2003) Molecular characterization of M 1146, an American isolate of Ljungan virus (LV) reveals the presence of a new LV genotype, Virol 84, pp 837-844 33 Levine, P.P and J Fabricant (1950) Virus disease in ducks in North America, Cornell Veterinary, 40, pp.71- 86 34 Oberste M.S, Maher K, Kennett M.L, Campbell J.J, Carpenter M.S, Schnurr D and Pallansch M.A (1999) Molecular epidemiology and genetic diversity of echovirus type 30 (E30): genotypes correlate with temporal dynamics of E30 isolation, J Clin Microbiol 37, pp 3928-3933 35 OIE (2000) Manual of Standards for diagnostic test and vacxins 36 OIE (2006) Annual animal disease status 37 Priz N.N (1973) Comparative study of virus hepatitis in animals (dogs and ducks) using different routes of influence, Vopr Virusol 6, pp 696-700 38 Reuss U (1959) Versuche zur aktiven und passiven Immunisierung bei der Virus hepatitis der Entenkuken, Zentrabl Veterinaermed 6, pp 808-815 39 Toth, T.E (1969) Studies of an agent causing mortality among ducklings immune to duck virus hepatitis, Avian Diseases, 13, pp 535- 539 40 Veterinariya (8), pp 50-52 54 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Quy trình bảo quản sử dụng giống virus Viêm gan vịt cường độc TRUNG TÂM KIỂM NGHIỆM THUỐC Số hiệu: STCL/QT/KN1 THÚ Y TWI Số ban hành: QUY TRÌNH Trang: ½ BẢO QUẢN VÀ SỬ DỤNG GIỐNG VI RÚT VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ĐỘC Ngày ban hành: Ngày sửa đổi: Phạm vi áp dụng Quy trình quy định yêu cầu kỹ thuật việc bảo quản sử dụng giống vi rút Viêm gan vịt cường độc Yêu cầu kỹ thuật giống vi rút Viêm gan vịt cường độc 2.1 Nhận dạng: Dùng phản ứng ELISA phát kháng nguyên Nếu phản ứng cho kết dương tính đạt u cầu 2.2 Thuần khiết: 2.2.1.Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn: - Cấy vi rút ống môi trường kiểm tra sau đây: môi trường thioglycollat, môi trường trypticaza đậu tương, đĩa môi trường thạch máu, lượng vi rút cấy từ % đến % (phần thể tích) so với mơi trường kiểm tra - Ủ môi trường cấy vi rút tủ 37 oC, theo dõi từ ngày đến 10 ngày - Giống vi rút xem đạt tiêu chuẩn khơng có vi sinh vật mọc môi trường kiểm tra thời gian theo dõi 2.2.2.Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc: - Mẫu vi rút ria cấy môi trường thạch Sabouraud sản phẩm thủy phân casein đậu tương Theo dõi 14 ngày nhiệt độ phòng (từ 20 0C đến 25 0C) - Giống vi rút xem đạt tiêu chuẩn khơng có tạp khuẩn nấm mốc mọc môi trường kiểm tra thời gian theo dõi 2.2.3 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma - Mẫu vi rút cấy kiểm tra môi trường canh thang PPLO với nồng độ từ % đến % vi rút 100 ml môi trường đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vi rút đĩa Có thể sử 55 dụng dung dịch DPN-cystein, bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua huyết ngựa sử dụng môi trường canh thang tim bổ sung proteoza pepton chất chiết nấm men để làm môi trường kiểm tra Theo dõi môi trường lỏng 14 ngày nhiệt độ từ 33 0C đến 37 0C Tại thời điểm ngày, ngày, 10 ngày 14 ngày, lấy canh khuẩn môi trường lỏng ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa) Ủ tủ ấm CO2 37 0C có % khí CO2, theo dõi 28 ngày - Mẫu vi rút xem đạt khơng có khuẩn lạc Mycoplasma mọc môi trường kiểm tra 2.2.4 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella - Mẫu vi rút cấy môi trường kiểm tra, dùng loại môi trường sau: thạch MacConkey, thạch Salmonella-Shigella, thạch Brilliant Green, thạch desoxycholat xitrat thạch XLD, với nồng độ từ % đến % dung tích mơi trường kiểm tra - Ủ mơi trường cấy vi rút tủ 37 oC, theo dõi từ 18 h đến 24 h sau cấy chuyển tiếp sang ống môi trường nước, dùng loại môi trường sau: canh thang selenit canh thang tetrathionat Ủ tủ 37 oC, theo dõi từ 48 h đến 72h Mẫu vi rút xem đạt khơng có vi khuẩn Salmonella mọc loại môi trường kiểm tra 2.3 Độc lực: - Bệnh tích điển hình gan vịt tuần tuổi phôi - LD50/ml = 106,3 3.Bảo quản giống vi rút - Giống vi rút sau kiểm tra đạt tiêu chuẩn mục tiến hành bảo quản giống phương pháp giữ tươi đông khô - Giống vi rút Viêm gan vịt cường độc bảo quản nhiệt độ ≤ -500C - Giống đơng khơ năm tăng cường lần, giống tươi tháng tăng cường lần - Mỗi tủ lạnh bảo quản giống vi rút phải có sổ theo dõi riêng, ghi chép đầy đủ thông tin: Nhiệt độ lạnh hàng ngày, số lô sản xuất, hạn sử dụng, số lượng tổng, số lượng xuất, số lượng dư, - Hàng ngày phải kiểm tra nơi bảo quản giống vi rút, phải đảm bảo nguồn điện ổn định, máy lạnh hoạt động tốt Có máy phát điện dự phịng có cố điện, ổ cắm điện phải chắn không bị lỏng để tránh điện cho tủ bảo quản 56 - Giống vi rút trình vận chuyển bảo quản thùng xốp có đá khơ xe lạnh chuyên dụng, không mở thùng giống vi rút lúc vận chuyển để tránh giống vi rút tiếp xúc với nhiệt độ cao dẫn đến giảm độc lực giống Sử dụng giống vi rút - Đọc kỹ thông tin lọ giống - Giống đơng khơ năm tăng cường lần, giống tươi tháng tăng cường lần - Giống vi rút cường độc Viêm gan vịt dùng gây bệnh cho vịt từ – ngày tuổi Giống lưu giữ, ứng dụng việc kiểm nghiệm, khảo nghiệm vắc xin Viêm gan vịt chế phẩm sinh học dùng để phòng trị bệnh Viêm gan vịt - Giống sử dụng theo đường tiêm - Trước dùng phải pha loãng giống nước muối sinh lý dung dịch PBS Bơm tiêm phải xử lý vô trùng - Nhân viên thực trang bị đầy đủ dụng cụ bảo hộ lao động (mũ, quần áo, găng tay, trang, ) NGƯỜI BIÊN SOẠN NGƯỜI PHÊ DUYỆT 57 Phụ lục 2: Tiêu chuẩn Việt Nam - Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan siêu vi trùng vịt TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8685-2:2011 Xuất lần QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN – VIÊM GAN SIÊU VI TRÙNG VỊT PHẦN 2: VẮC XIN Vaccine testing procedure – Part 2: Duck hepatitis virus vaccine HÀ NỘI − 2011 58 Lời nói đầu TCVN 8685-2:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 894:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a khoản Điều Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8685-2:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố 59 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8685-2:2011 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin – Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt Vaccine testing procedure – Part 2: Duck hepatitis virus vaccine Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình kiểm nghiệm vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt, sản xuất từ chủng vi rút viêm gan vịt, dạng đông khô Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8684:2011, Vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y – Phép thử độ khiết Lấy mẫu sản phẩm chuẩn bị động vật thí nghiệm 3.1 Lấy mẫu sản phẩm Lấy mẫu sản phẩm theo qui định Bảng sau: Bảng – Số lượng mẫu vắc xin dạng đơng khơ cần lấy Quy cách đóng gói (liều) Số lượng mẫu lấy (sản phẩm) Đến 100 Từ đến 10 Trên 100 Từ đến 3.2 Chuẩn bị động vật thí nghiệm Chuẩn bị 60 vịt mẫn cảm, khỏe mạnh, từ ngày đến ngày tuổi 10 phôi gà từ ngày đến 10 ngày tuổi Quy trình kiểm nghiệm 4.1 Kiểm tra cảm quan Kiểm tra mắt thường: vắc xin phải có màu trắng hồng vàng nhạt, dạng bánh xốp, dễ tách khỏi thành lọ 60 4.2 Kiểm tra độ khiết Kiểm tra độ khiết theo TCVN 8684:2011 4.3 Kiểm tra tính an tồn Tiêm da cổ bắp thịt cho 20 vịt, 10 liều vắc xin ghi nhãn, theo dõi 14 ngày Lô vắc xin coi đạt tất vịt sống khỏe mạnh 4.4 Kiểm tra hiệu lực 4.4.1 Phương pháp trọng tài Tiêm da cho cho 20 vịt, liều vắc xin ghi nhãn 20 vịt đối chứng không tiêm vắc xin Sau 72 h, 20 vịt miễn dịch 20 vịt đối chứng thử thách với vi rút viêm gan vịt cường độc, liều 103,0 LD50/con, vào da Theo dõi 10 ngày sau công cường độc Lô vắc xin coi đạt 80 % vịt miễn dịch sống 80 % vịt đối chứng chết 4.4.2 Phương pháp thay Chuẩn độ vi rút vắc xin phương pháp tiêm túi niệu phôi gà từ ngày đến 10 ngày tuổi Lô vắc xin coi đạt có 103,3 (Embryo Lethal Dose) ELD50/liều 61 ... định đặc tính sinh học giống virus Viêm gan vịt cường độc 27 3.2.2 Ứng dụng chủng virus Viêm gan vịt cường độc để kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu. .. hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu số đặc tính sinh học, sinh học phân tử virus Viêm gan vịt cường độc ứng dụng kiểm nghiệm vắc xin" Đề tài thực với mục tiêu nội dung sau: Mục tiêu nghiên cứu: ... đặc tính sinh học giống vi rút Viêm gan vịt cường độc Giải mã gen đặc trưng xây dựng liệu sinh học phân tử giống Ứng dụng chủng cường độc kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt Nội dung nghiên