Luận án tiến sĩ Công nghế sinh học: Đánh giá đặc điểm kháng staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của một số dược liệu thu hái tại tỉnh Bình Dương

Nội dung của đề tài bao gồm: Sàng lọc hoạt tính kháng MRSA của cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn từ thực vật thu hái tại tỉnh Bình Dương; Đánh giá khả năng kháng khuẩn MRSA của cao eth

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

MAI THỊ NGỌC LAN THANH

ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS

KHÁNG METHICILLIN (MRSA) CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

THU HÁI TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

MAI THỊ NGỌC LAN THANH

ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS

KHÁNG METHICILLIN (MRSA) CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

THU HÁI TẠI TỈNH BÌNH DƯƠNG

Chuyên ngành: Công Nghệ sinh học

i

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Tác giả luận án

Chữ ký

Mai Thị Ngọc Lan Thanh

ii

TÓM TẮT LUẬN ÁN

Đề tài “Đánh giá đặc điểm kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của

một số dược liệu thu hái tại tỉnh Bình Dương” được thực hiện từ tháng 12/2015 đến tháng 12/2020 tại bộ môn Công nghệ sinh học và Bộ môn Hóa Dược, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh; bộ môn Sinh học ứng dụng, khoa Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Thủ Dầu Một Mục tiêu của đề tài là xác định được hoạt tính

kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của cao ethanol thực

vật/cao phân đoạn/tinh chất

Nội dung của đề tài bao gồm: Sàng lọc hoạt tính kháng MRSA của cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn từ thực vật thu hái tại tỉnh Bình Dương; Đánh giá khả năng kháng khuẩn MRSA của cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn; Xác định công thức hợp lực giữa cao phân đoạn với kháng sinh, và công thức hợp lực giữa các cao phân đoạn với nhau; Xác định hoạt tính ức chế hình thành màng sinh học, hoạt tính ức chế tan huyết, hoạt tính ức chế PBP2a, ức chế khả năng chịu muối trên MRSA của cao phân đoạn; Xác định và phân tích hoạt tính của tinh chất chính từ cao ethanol toàn phần cho hoạt tính kháng MRSA tốt nhất Kết quả đạt được như sau:

Kết quả xác định được bốn cao chiết ethanol toàn phần từ Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke có hoạt tính kháng MRSA, trong đó cao ethanol toàn phần Trâm Tròn, Xăng Mã, Cò Ke được báo cáo lần đầu về hoạt tính kháng MRSA Kết quả thử độc tính trên nguyên bào sợi và tế bào ung thư gan đã xác định tính an toàn của các cao chiết ethanol toàn phần Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke

Mục tiêu của luận án là xác định nhóm hoạt chất kháng MRSA, công thức hợp lực và đích tác động của nhóm hoạt chất kháng MRSA Kết quả của đề tài đã thu nhận được các cao phân đoạn ethylacetate của Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke cho hoạt tính kháng MRSA Trong đó, cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn có giá trị MIC thấp nhất bằng 1 mg/mL Phương pháp bàn cờ được sử dụng nhằm xác định chỉ số FIC của các cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke với kháng sinh,

iii

và giữa bốn cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Xăng Mã, Trâm Tròn, Cò Ke với nhau Kết quả xác định cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Trâm Tròn có khả năng hợp lực với kháng sinh cefoxitin, với công thức hợp lực là cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam ở nồng độ 0,812 mg/mL và cefoxitin ở nồng độ 0,002 mg/mL (1:1); Công thức hợp lực của cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn với cefoxitin

là cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn ở nồng độ 0,500 mg/mL và cefoxitin 0,008 mg/mL (1:1) Tuy nhiên, chỉ có cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn thể hiện sự hợp lực với vancomycin, với công thức hợp lực là cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn ở nồng

độ bằng 0,24 mg/mL và vancomycin có nồng độ bằng 0,001mg/mL (1:1)

Các kết quả từ phương pháp nhuộm với crystal violet và chụp ảnh SEM đã chỉ ra rằng, cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam ở nồng độ bằng 0,4062 mg/mL và cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn ở nồng độ bằng 0,2500 mg/mL ức chế hình thành màng sinh học trên chủng MRSA Ảnh chụp SEM xác định hình thái tế bào MRSA trong màng sinh học thay đổi khi xử lý với hai cao phân đoạn này

Thử nghiệm khả năng chịu muối, xác định vách tế bào là đích tác động của cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam vì phần trăm tế bào MRSA sống sót so với đối chứng giảm 58,89%

Sử dụng phương pháp nuôi trên môi trường thạch máu nhằm xác định khả năng ức chế độc tính tan huyết của chủng MRSA khi tiếp xúc với dung dịch khảo sát Kết quả xác định cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã ức chế hoàn toàn khả năng tan huyết của chủng MRSA ở nồng độ 4 mg/mL

Mục tiêu của luận án là xác định cấu trúc tinh chất chính, công thức hợp lực và cơ chế kháng MRSA Kết quả thu nhận được bốn tinh chất từ cao ethanol toàn phần Trâm Tròn là pinostrobin, 4-methoxy benzoic acid, dimethyl pinocembrin, acid betulonic Trong đó, lượng pinostrobin được tìm thấy nhiều nhất với hiệu suất chiết là 12,79 ± 0,21 mg

pinostrobin/ 1g bột lá khô, dimethyl pinocembrin lần đầu tiên được tách chiết từ chi Trâm

Công thức hợp lực của pinostrobin và vancomycin là pinostrobin ở nồng độ bằng 12,8

µg/mL và vancomycin ở nồng độ bằng 0,5 µg/mL (1:1)

iv

ABSTRACT

The thesis title: “Evaluation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)

characteristics of some medicinal herbs collected in Binh Duong province” was carried out

at the Department of Biotechnology, the Department of Chemistry- Faculty of Chemical Engineering, Ho Chi Minh City University of Technology, the Department of Applied Biology, Thu Dau Mot University from December 2015 to December 2019 The main purpose of this study is to collect the ethanol plant extracts/fractions/main pured

compounds which have anti-MRSA activity

The content of the topic includes: Screening the ethanol plant extracts are collected in Binh Duong province and evaluation of anti-MRSA activity of ethanol plant extracts and fractions; the fractions of ethanol plant extracts are collected, which are evaluated the anti-MRSA activity of these fractions, simultaneous assessment of the mechanism of antibacterial activity of fractions; The main pure compound is isolated from ethanol plant extract which has the most anti-MRSA activity The synergistic formula of main compound with antibiotic is determined The results are as follows:

There are four plant species, including Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata,

Syzygium glomeratum, Grewia asiatica L had been identified with anti-MRSA activity

Among them, ethanol extracts of Carallia brachiata, Syzygium glomeratum, Grewia

asiatica L were reported anti-MRSA activity the first time The Sulforhodamine B assay

is carried out for testing toxicity of ethanol plant extracts on fibroblast cells and hepatocyte

cells The results present that Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium

glomeratum, Grewia asiatica L ethanol extracts are safe

The ethylacetate fractions of Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium

glomeratum, Grewia asiatica L leaf extracts are collected for testing anti-MRSA activity

Especially, ethylacetate Syzygium glomeratum fraction has the lowest MIC value of

1mg/mL The checkerboard method was undertaken to determine synergistic interactions

of plant extracts and isolated pure compounds in combination with antibiotic and the four

v

ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense, Carallia brachiata, Syzygium glomeratum,

Grewia asiatica L extracts together demand for FICIs The results shown that two

ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense, Syzygium glomeratum extracts can synergize with cefoxitin The synergistic formulation of ethylacetate of Cratoxylum cochinchinense

extract and cefoxitin is 0.812 mg/mL (NN Ea) and 0.002 mg/mL (cefoxitin) (1:1); the

synergistic formulation of the ethylacetate of Syzygium glomeratum extract is 0.500 mg/mL

(SCTT Ea) and 0.008 mg/mL (cefoxitin) (1:1), respectively However, only the

ethylacetate of Syzygium glomeratum extract is determined the synergistic activity with vancomycin The synergistic formulation of the ethylacetate of Syzygium glomeratum

extract and vancomycin is 0.24 mg/mL (SCTT Ea) and 0.001 mg/mL (vancomycin) (1:1)

The results from crystal violet assay and SEM technique have shown that ethylacetate

Cratoxylum cochinchinense fraction at a concentration of 0.4062 mg/mL and ethyl acetate Syzygium glomeratum fraction at a concentration of 0.2500 mg/mL, which inhibited the

biofilm formation on MRSA SEM images are collected, which presented the change of morphologies of MRSA cells inside the biofilm when MRSA had been treated with these

two fractions

The salt tolerance test was undertaken to identify damage to the cell wall on MRSA The

results show that MRSA cells are treated with the ethylacetate of Cratoxylum

cochinchinense extract, which decreased the surviving of MRSA cells on high salt

concentrated medium

The MRSA cultured blood agar method was carried out to determine the ability to inhibit hemolytic toxicity of MRSA strains when MRSA cells were treated with the ethylacetate

of plant extracts or pinostrobin The results showed that the ethylacetate of Carallia

brachiata extract completely inhibited the hemolytic ability on the MRSA strain at a

concentration of 4 mg/mL

In this research, four pure compounds are isolated from the Syzygium glomeratum ethanol

extract, which are pinostrobin, 4-methoxy benzoic acid, dimethyl pinocembrin, betulonic acid Among them, the amount of pinostrobin was highest with an extraction yield of

vi

12.79±0.21 mg of pinostrobin in 1 g of dried leaf powder, dimethyl pinocembrin is the first

isolated from the genus Syzygium

The synergistic formulation of pinostrobin and vancomycin is 12.8 µg/mL (pinostrobin)

and 0.5 µg/mL (vancomycin) (1:1), respectively

vii

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin trân trọng gửi lời biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trương Vũ Thanh và TS Hoàng Anh Hoàng là hai người thầy đã hướng dẫn tận tình, chỉ bảo cho tôi hoàn thành Luận Án Đặc biệt, Tôi xin kính dâng lòng biết ơn của tôi cho người thầy đã giúp tôi định hướng và giúp đỡ tôi rất nhiều cũng như động viên cho tôi vượt qua rất nhiều khó khăn để có ngày hôm nay, đó chính là người thầy PGS.TS Lê Phi Nga Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình đã luôn ủng hộ, giúp đỡ về vật chất cũng như tinh thần để tôi yên tâm hoàn thành Luận Án Tôi chân thành cám ơn đến Lãnh đạo Đại học Thủ Dầu Một, Thầy cô Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Phòng sau đại học Bách Khoa TP.HCM và các đồng nghiệp đã cung cấp tài liệu, tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu hoàn thành Luận Án và đóng góp ý kiến Đặc biệt, tôi xin gửi lời đến TS Nguyễn Thị Nhật Hằng, chị luôn ủng hộ và tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu, học tập, làm việc Tôi cám ơn các bạn sinh viên, các đồng chí, đồng đội luôn sát cánh bên tôi, đặc biệt cám ơn bạn Trần Thị Mai Thy đã luôn ủng hộ tinh thần cũng như vật chất Luận án được hoàn thành là sự giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện đặc biệt cho tôi biến ước mơ thành hiện thực Tôi kính dâng lòng thương mến và biết ơn đến Ngoại của tôi, người đã cho tôi rất nhiều ý tưởng trong nghiên cứu này Một lần nữa, xin chân thành biết ơn đến tất cả mọi người luôn bên cạnh tôi trong khó khăn, thử thách hay những giây phút vui sướng khi nhận được những kết quả mong đợi…

viii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

TÓM TẮT LUẬN ÁN ii

ABSTRACT iv

LỜI CẢM ƠN vii

DANH MỤC CÁC HÌNH xi

DANH MỤC BẢNG xiii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xvi

MỞ ĐẦU 1

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

Nội dung nghiên cứu 3

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về MRSA 4

1.1.1 Đặc điểm vi thể và độc tính chi Staphylococcus 4

1.1.2 Cơ chế kháng thuốc của MRSA 4

1.1.3 Đặc điểm sinh lý của MRSA 5

1.2 Tổng quan một số kháng sinh 6

1.2.1 Nhóm Glycopeptide 6

1.2.2 Nhóm Oxazolidinone 7

1.2.3 Cephalosporin 8

1.2.4 Các thuốc khác 8

1.3 Cao chiết/phân đoạn/tinh chất kháng MRSA 8

1.3.1 Tóm lược các nghiên cứu 8

1.3.2 Các đích tác động của cao chiết/tinh chất 14

1.4 Tổng quan một số dược liệu thu hái tại Bình Dương 18

1.4.1 Ngành Ngạnh Nam 18

ix

1.4.2 Xăng Mã 20

1.4.3 Trâm Tròn 21

1.4.4 Cò Ke 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Vật liệu, hóa chất thí nghiệm 25

2.1.1 Mẫu thực vật 25

2.1.2 Hóa chất thí nghiệm 25

2.1.3 Chủng vi khuẩn 26

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 26

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Thu mẫu dược liệu và khảo sát sơ bộ 29

2.2.2 Thu cao chiết/phân đoạn/tinh chất 30

2.2.3 Định tính thành phần hóa học của cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn Trâm Tròn; Thu tinh chất chính trong cao ethanol toàn phần Trâm Tròn 31

2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao chiết/phân đoạn/tinh chất 35 2.2.5 Cơ chế kháng khuẩn của cao phân đoạn/tinh chất trên chủng MRSA47 2.2.6 Xác định độc tính tế bào của các cao thực vật 51

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 54

3.1 Cao ethanol toàn phần thực vật, hoạt tính kháng MRSA, tính an toàn của cao ethanol toàn phần 54

3.1.1 Cao ethanol toàn phần thực vật, hoạt tính kháng MRSA của cao 54

3.1.2 Độc tính tế bào của các cao ethanol toàn phần thực vật 55

3.2 Cao phân đoạn và hoạt tính kháng MRSA 56

3.2.1 Cao phân đoạn 57

3.2.2 Hoạt tính kháng MRSA của cao phân đoạn 57

3.2.3 Thử nghiệm đánh giá khả năng diệt khuẩn theo thời gian của hai cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam, Trâm Tròn 60

3.2.4 Hợp lực giữa cao phân đoạn với kháng sinh cefoxitin 63

x

3.2.5 Hợp lực giữa cao phân đoạn với kháng sinh vancomycin 71

3.2.6 Hợp lực của các cao phân đoạn 73

3.3 Định tính thành phần hóa học cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn Trâm Tròn; Thu tinh chất chính và hoạt tính kháng MRSA 81

3.3.1 Định tính thành phần hóa học trong cao ethanol toàn phần và cao phân đoạn Trâm Tròn 81

3.3.2 Phân lập và xác định cấu trúc 83

3.3.3 Hợp lực giữa pinostrobin và vancomycin 93

3.4 Cơ chế kháng MRSA của phân đoạn/tinh chất 95

3.4.1 Ức chế hình thành màng sinh học 95

3.4.2 Ức chế sinh độc tố tan huyết 101

3.4.3 Ức chế biểu hiện protein PBP2a trên chủng MRSA 102

3.4.4 Thử nghiệm khả năng chịu muối của MRSA 103

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 106

4.1 Kết luận 106

4.2 Kiến nghị 106

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ TỪ KẾT QUẢ CỦA LUẬN ÁN 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108

PHỤ LỤC 124

xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Staphylococcus aureus-Tụ cầu vàng 5

Hình 1.2 Cấu trúc kháng sinh vancomycin 6

Hình 1.3 Con đường tổng hợp vách tế bào của Staphylococcus aureus 17

Hình 1.4 Hoa và lá cây Ngành Ngạnh Nam 20

Hình 1.5 Hoa, lá và toàn cây Xăng Mã 21

Hình 1.6 Hoa, lá và toàn cây Trâm Tròn 22

Hình 1.7 Toàn cây, hoa và lá cây Cò Ke 24

Hình 2.1 Hình ảnh thực tế địa điểm thu mẫu 25

Hình 2.2 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 28

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình phân lập 34

Hình 3.1 Hoạt tính kháng MRSA của cao phân đoạn 58

Hình 3.2 Đường cong tăng trưởng của MSSA trong thử nghiệm time-killing 61

Hình 3.3 Đường cong tăng trưởng của MRSA trong thử nghiệm time-killing 62

Hình 3.4 Hợp lực giữa kháng sinh cefoxitin và cao phân đoạn ethyl acetate Trâm Tròn, Ngành Ngạnh Nam trên hai chủng MSSA, MRSA 64

Hình 3.5 Hợp lực của cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã với cefoxitin 68

Hình 3.6 Hợp lực của cao phân đoạn ethyl acetate Trâm Tròn với vancomycin 71

Hình 3.7 Hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn và Ngành Ngạnh Nam 74

xii

Hình 3.8 Hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethyl acetate Trâm Tròn và Cò Ke 75

Hình 3.9 Hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn và Xăng Mã 77

Hình 3.10 Hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã và Ngành Ngạnh Nam 79

Hình 3 1 Phổ 1H -NMR của hợp chất H1.1 83

Hình 3 2 Phổ 13C -NMR của hợp chất H1.1 84

Hình 3 3 GC-MS của H1.1 86

Hình 3.14 Cấu trúc của pinostrobin 86

Hình 3 4 Phổ 1H-NMR của H7.1 87

Hình 3 5 Phổ 13C-NMR của H7.1 88

Hình 3.17 Dimethyl pinocembrin 88

Hình 3.18 Công thức acid 4-methoxy-benoic 90

Hình 3 6 Phổ 1H-NMR của hợp chất E7.1 90

Hình 3 7 Phổ 13C- NMR của E 7.1 91

Hình 3.21 Acid betulonic 91

Hình 3.22 Hợp lực của pinostrobin với vancomycin 93

Hình 3.23 Ức chế hình thành màng sinh học của ba cao phân đoạn ethyl acetate Trâm Tròn, Ngạnh Ngạnh Nam, Cò Ke 96

Hình 3 8 Màng sinh học của chủng MRSA 98

Hình 3 9 Màng sinh học của MRSA khi Môi trường TSB+1% glucose được bổ sung cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam 99

xiii

Hình 3 10 Màng sinh học MRSA khi môi trường TSB, 1% glucose có bổ sung

cao phân đoạn ethyl acetate Trâm Tròn 100

Hình 3 11 Môi trường TSB+1% glucose được bổ sung tinh chất pinostrobin 100

Hình 3.28 Ức chế độc tính tan huyết từ cao phân đoạn Xăng Mã 102

Hình 3.29 Kiểm tra sự hiện diện PBP2a trên chủng MRSA 103

Hình 3.30 Phần trăm tế bào MRSA sống sót 105

xiv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Cao chiết thực vật kháng MRSA 9 Bảng 1.2 Hoạt chất thực vật kháng MRSA 11 Bảng 2 1 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn, Ngành Ngạnh Nam với cefoxitin 37 Bảng 2.2 Sơ đồ chú thích giếng kết hợp theo sơ đồ 38 Bảng 2.3 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm hợp lực giữa cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã

và cefoxitin 39 Bảng 2.4 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm hợp lực giữa cao phân đoạn ethylacetate Cò Ke và cefoxitin 40 Bảng 2.5 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm hợp lực giữa pinostrobin và vancomycin 41 Bảng 2.6 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn và Ngành Ngạnh Nam 42 Bảng 2.7 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn và Cò Ke 44 Bảng 2.8 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn và Xăng Mã 45 Bảng 2.9 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Xăng

Mã và Ngành Ngạnh Nam 46 Bảng 3.1 Độ ẩm và độ tro toàn phần của mẫu thực vật 54 Bảng 3.1 Hoạt tính kháng MRSA của các cao ethanol toàn phần thực vật 55 Bảng 3.3 Phần trăm độc tế bào của các mẫu cao trên dòng tế bào ung thư gan Hep G2 và nguyên bào sợi được xác định bằng phương pháp SRB 56

xv

Bảng 3.4 Hiệu suất chiết cao phân đoạn 57 Bảng 3.5 Giá trị MIC của cao phân đoạn 59 Bảng 3.6 Kết quả của thí nghiệm khảo sát hợp lực của cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn, Ngành Ngạnh Nam với cefoxitin 64 Bảng 3.7 Chỉ số FIC của cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn với cefoxitin 65 Bảng 3.8 Chỉ số FIC của cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam với cefoxitin 66 Bảng 3.9 Kết quả của thí nghiệm kết hợp giữa cao phân đoạn ethylacetate Xăng

Mã với kháng sinh cefoxitin 68 Bảng 3.10 Chỉ số FIC của cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã với cefoxitin 69 Bảng 3.11 Chỉ số FIC của cao phân đoạn ethyl acetate Cò Ke với cefoxitin 66 Bảng 3.10 Chỉ số FIC của cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn với vancomycin 66 Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm hợp lực giữa cao phân đoạn ethylacetate Cò Ke với cefoxitin 70 Bảng 3.12 Chỉ số FIC của cao phân đoạn ethylacetate Cò Ke với cefoxitin 70 Bảng 3.13 Chỉ số FIC của cao phân đoạn ethyl acetate Trâm Tròn với vancomycin 71 Bảng 3.14 Chỉ số FIC của phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam với vancomycin 72 Bảng 3.15 Kết quả khảo sát hợp lực SCTT Ea và NN Ea trên sơ đồ 96 giếng 73

xvi

Bảng 3.16 Chỉ số FIC của hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn với Ngành Ngạnh

Nam 75

Bảng 3.17 Kết quả của thí nghiệm hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn và Cò Ke 76

Bảng 3.18 Chỉ số FIC của hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn và Cò ke 76

Bảng 3.19 Kết quả của thí nghiệm hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn và Xăng Mã 78

Bảng 3.20 Chỉ số FIC của hai cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn và Xăng Mã 78 Bảng 3.21 Kết quả của thí nghiệm hợp lực giữa hai cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã và Ngành Ngạnh Nam 80

Bảng 3.22 Chỉ số FIC của hai cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã và Ngành Ngạnh Nam 80

Bảng 3.23 Thành phần hóa học của cao ethanol toàn phần Trâm Tròn 82

Bảng 3.24 Thành phần hóa học của các cao phân đoạn Trâm Tròn 82

Bảng 3 2 Bảng so sánh H1.1 và Pinostrobin 85

Bảng 3 3 Bảng so sánh H7.1 và Dimethyl pinocembrin 89

Bảng 3.27 Kết quả thí nghiệm hợp lực giữa pinostrobin với vancomycin 94

Bảng 3.28 Chỉ số FIC của pinostrobin và vancomycin 94

Bảng 3.29 Phần trăm tế bào MRSA sống sót 104

xvii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

96W đĩa 96 giếng Alt Autolysin

CC Sắc ký cột CDC Trung tâm kiểm soát và phòng tránh bệnh Hoa Kỳ CFT Cefoxitin

CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc CLSI Tiêu chuẩn Xét nghiệm Lâm sàng DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

ED Cao ethanol toàn phần được chiết từ thực vật khô

EF Cao ethanol toàn phần được chiết từ thực vật tươi eDNA Extracellular DNA

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EGCg Epigallocatechin-gallate

EPI Nhân tố ức chế bơm FDA Cục Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ FIC Nồng độ ức chế từng phần

FICI chỉ số nồng độ ức chế từng phần phối hợp FnBP Fibronection-binding protein

GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase HPLC Sắc ký lòng cao áp (High performance liquid chromatography) MBC Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

xviii

MDR Đa kháng thuốc MHA Môi trường Mueller Hinton Agar MHB Môi trường lỏng Muller Hinton MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

MRSA Khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus kháng methicillin

MSA Môi trường Manitol salt agar MSSA Staphylococcus aureus nhạy methicillin

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

OD Mật độ đo quang Oxa Oxacillin sodium PBP2a Protein gắn kháng sinh Penicillin của gen mecA

PBPs Protein liên kết Penicillin PBS Dung dịch đệm sinh lý PCR Phản ứng khuếch đại gen Rpm Tốc độ ly tâm vòng trên phút (Rotation per minute)

S Hợp lực (Synergy) SCCmec Staphylococcal Chromosome Cassette mec

TLC Sắc ký bản mỏng TSA Môi trường Tryptone soya agar TSB Môi trường lỏng Tryptone soya VAN Vancomycin

WHO Tổ chức Y tế Thế giới SCTT Cao ethanol toàn phần Trâm Tròn

NN Cao ethanol toàn phần Ngành Ngạnh Nam

xix

XM Cao ethanol toàn phần Xăng Mã

CK Cao ethanol toàn phần Cò Ke SCTT Ea Cao phân đoạn ethylacetate Trâm Tròn

NN Ea Cao phân đoạn ethylacetate Ngành Ngạnh Nam

XM Ea Cao phân đoạn ethylacetate Xăng Mã

CK Ea Cao phân đoạn ethylacetate Cò Ke SCTT hex Cao phân đoạn hexan Trâm Tròn

NN hex Cao phân đoạn hexan Ngành Ngạnh Nam

XM hex Cao phân đoạn hexan Xăng Mã

CK hex Cao phân đoạn hexan Cò Ke

1

MỞ ĐẦU

Tụ cầu vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus kháng methicillin-MRSA) là

một vấn đề y tế toàn cầu và một thách thức trong điều trị [1] MRSA có cơ chế kháng với kháng sinh nhóm β-lactam như methicillin và penicillin làm cho các bệnh nhiễm trùng do MRSA rất khó điều trị [2] Năm 2014, cơ quan nghiên cứu y tế và chất lượng Hoa Kỳ (AHRQ) đã công bố gần 375.000 trường hợp nhiễm trùng và 23.000 trường hợp

tử vong ở Hoa Kỳ có liên quan đến nhiễm MRSA Chi phí điều trị cho một vết mổ sâu

bị nhiễm MRSA, ước tính khoảng 43.970 USD cho một bệnh nhân từ 65 tuổi trở lên ở Hoa Kỳ [3] với thời gian điều trị dài, kèm theo những thương tật [3, 4] Nghiên cứu ở

10 nước châu Á xác định tỷ lệ tử vong 30 ngày liên quan viêm phổi bệnh viện từ 18,7

% đến 40,8 %, trong đó MRSA chiếm 82,1 % trong tổng số các chủng S aureus phân

lập [5] Năm 2017, WHO đã công bố danh sách các mầm bệnh, các kiểu hình kháng kháng sinh ưu tiên nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị mới, được phân chia thành ba mức độ ưu tiên là quan trọng, cao và trung bình Trong đó, MRSA được xếp vào nhóm quan trọng ưu tiên toàn cầu để nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị mới [6]

MRSA có nhiều yếu tố độc lực, là nguyên nhân gây ra hàng loạt các bệnh về nhiễm trùng da, nhiễm trùng máu, viêm phổi, viêm khớp rất khó điều trị [7] Một đặc điểm quan trọng khác là khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) Màng sinh học được tạo bởi các vi sinh vật sống bám dính và liên kết với nhau trên bề mặt cơ chất [8] Sự hình thành màng sinh học có vai trò rất quan trọng trong tồn tại, thoát khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ [9] Màng sinh học và các thành phần bao quanh bên ngoài màng

có vai trò như một trở ngại vật lý góp phần ngăn chặn thuốc và sự xâm nhập của tế bào miễn dịch vào bên trong màng sinh học [10]

Vancomycin là thuốc ưu tiên hàng đầu cho điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do MRSA [11] Tuy nhiên, các chủng MRSA kháng vancomycin (VRSA) chiếm tỉ lệ 6,1% đã được báo cáo [12] Hơn nữa trong khoảng 30 năm trở lại đây, các nhà khoa học chưa thực sự thành công trong việc tìm ra loại kháng sinh mới, mà chủ yếu là các dạng sửa đổi

2

(modify) dựa vào khung nguyên bản của thuốc kháng sinh thế hệ cũ

Đứng trước các thực trạng nói trên, việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới hoặc các phương pháp mới để kiểm soát vi khuẩn kháng kháng sinh, đặc biệt dạng siêu kháng thuốc là hết sức cấp bách [13] Một trong những phương pháp có khả năng kháng vi khuẩn kháng kháng sinh là sự kết hợp các hợp chất thực vật với các kháng sinh [14] hoặc kết hợp các hợp chất thực vật với nhau [15]

Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng về tài nguyên cây thuốc Thực vật dùng làm thuốc trong điều trị các bệnh cấp tính và mãn tính đã và đang được sử dụng từ xa xưa theo các đơn thuốc y học cổ truyền Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn của các loài thực vật được chú ý [16] Bình Dương với 698 loài cây thuốc đã được phát hiện, trong đó có 140 loài cây thuốc quý điều tra từ vốn tri thức bản địa tỉnh đã được báo cáo theo Trần Công Luận và cộng sự với đề tài “Điều tra khảo sát tình hình cây thuốc tỉnh Bình Dương” nhiều loài có tác dụng kháng khuẩn [17] Từ bộ dữ liệu

này, đề tài “Sàng lọc kháng sinh thực vật tan trong dung môi nước kháng Staphylococcus

aureus” tiếp tục thực hiện khảo sát hoạt tính kháng khuẩn S aureus, kết quả ghi nhận

một số loài thực vật thu hái tại Bình Dương cho hoạt tính kháng S aureus

Xuất phát từ những nguyên nhân nói trên, đề tài: “Đánh giá đặc điểm kháng

Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của một số dược liệu thu hái tại

tỉnh Bình Dương” đã được thực hiện

Mục tiêu đề tài

Xác định được hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin

(MRSA) của cao ethanol thực vật/cao phân đoạn/tinh chất

Đối tượng nghiên cứu

Cao ethanol toàn phân/cao phân đoạn từ bốn loài thực vật thu hái tại tỉnh Bình Dương

bao gồm: Trâm Tròn (Syzygium glomerulatum), Xăng Mã (Carallia Brachiata), Cò Ke (Grewia asiatica), Ngành Ngạnh Nam (Cratoxylum cochinchinensis)

Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC® 33591,

chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus nhạy methicillin (MSSA) ATCC® 6538 được

Nội dung nghiên cứu

Sàng lọc hoạt tính kháng MRSA của cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn từ thực vật thu hái tại tỉnh Bình Dương

Đánh giá khả năng kháng khuẩn MRSA của cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn; Xác định công thức hợp lực giữa cao phân đoạn với kháng sinh, và công thức hợp lực giữa các cao phân đoạn với nhau

Xác định hoạt tính ức chế hình thành màng sinh học, hoạt tính ức chế tan huyết, hoạt tính ức chế PBP2a, ức chế khả năng chịu muối trên MRSA của cao phân đoạn

Xác định và phân tích hoạt tính của tinh chất chính từ cao ethanol toàn phần cho hoạt tính kháng MRSA tốt nhất

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Luận án góp phần ghi nhận các loài thực vật mọc tại Bình Dương (Việt Nam) cho hoạt tính kháng MRSA

Đồng thời, luận án tìm kiếm các công thức hợp lực giữa cao phân đoạn/tinh chất với kháng sinh và giữa cao phân đoạn với nhau cho hoạt tính kháng MRSA, nhằm tìm ra liệu pháp kháng MRSA mà hạn chế xuất hiện cơ chế kháng, và tái sử dụng lại các kháng sinh thế hệ cũ bị kháng bởi MRSA

Đề tài cô lập các tinh chất chính từ cao ethanol toàn phần có hoạt tính kháng MRSA cao nhất, và xác định công thức hợp lực giữa tinh chất và kháng sinh trên MRSA

Kết quả của luận án sẽ giúp đưa ra một số giải pháp kiểm soát MRSA trong thực tiễn

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về MRSA

1.1.1 Đặc điểm vi thể và độc tính chi Staphylococcus

S aureus lần đầu tiên được phân lập từ mủ người vào năm 1880 bởi Scotland Alexander

Ogston [18] Chi Staphylococcus có hơn 40 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu gây bệnh được chú ý trong y học: S aureus (Tụ cầu vàng), S epidermidis (Tụ cầu da), và S

saprophyticus S aureus là những vi khuẩn hình cầu, không di động, gram dương, đường

kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho S aureus là những vi khuẩn hiếu khí

hay kị khí không bắt buộc, có thể phát triển trong môi trường không có oxi nhờ enzyme catalase hoặc sử dụng một chất nhận điện tử Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNase, phosphatase dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose

[19] Ở cơ thể người, S aureus là vi sinh vật cơ hội tấn công vào vết thương hở hoặc

những người có sức đề kháng kém Vi khuẩn thường kí sinh trên mũi, họng và da của con người và động vật

1.1.2 Cơ chế kháng thuốc của MRSA

Trong chiến tranh thế giới thứ hai, penicillin được đưa vào sử dụng lâm sàng, S aureus lúc này còn rất nhạy với kháng sinh Tuy nhiên, chỉ vài năm sau đó các chủng S aureus kháng penicilin đã được phát hiện [20] Hiện nay, S aureus kháng penicillin - PRSA (Penicillin Resistant S aureus) chiếm khoảng 90 % , MRSA dao động từ 30-50 % trong tổng số các chủng S aureus được phân lập [21]

Methicilin là penicilin bán tổng hợp, MRSA kháng methicillin xuất hiện 2 cơ chế kháng phổ biến: một là siêu biểu hiện β-lactamases, hai là thay đổi dạng bình thường của Protein gắn Penicillin (PBPs) Biểu hiện enzyme β-lactamase được kiểm soát bởi operon

bla Trong Operon bla, blaZ là vùng gen mã hóa cho β-lactamase, và hai protein đóng

vai trò là các protein điều hòa là: blaI (nhân tố ức chế) và blaR1 (nhân tố hoạt hóa) BlaI

ức chế sự biểu hiện của blaZ bằng việc gắn với promoter BlaR1 tồn tại như là protein

xuyên màng; khi vùng bên ngoài tế bào gắn với β-lactam, thì vùng bên trong tế bào sẽ

được giải phóng và phân giải BlaI, việc này cho phép biểu hiện blaZ Cơ chế kháng thứ

phân giải mecI và cho phép sự phiên mã mecA Sự hiện diện của protein PBP2a-là cơ

chế hiện diện sau cùng trong hầu hết các chủng lâm sàng

A Khuẩn lạc màu vàng Của Staphylococcus aureus trên môi trường thạch Trypton Soy (Http://www.Bacteriainphotos.Com/S.Html)

B Staphylococcus aureus dưới kính hiện vi điện tử (Centers For Disease

Control And Prevention)

Hình 1 1 Staphylococcus aureus - Tụ cầu vàng

S aureus có 4 tiền chất PBPs thông thường trên màng tế bào chất tham gia vào quá trình

liên kết chéo peptidoglycan của vách tế bào Những PBPs này có hoạt động tương tự với serine của protease và có ái lực cao với những chất β-lactam Khi xảy ra việc gắn, những PBPs không có chức năng hình thành phức hợp vách tế bào, dẫn đến vi khuẩn chết PBP2a là protein có trọng lượng phân tử 76kDa, được biểu hiện trong các chủng MRSA PBP2a có ái lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam Nên dù có sự hiện diện của kháng sinh, PBP2a vẫn có chức năng sinh tổng hợp vách như PBPs thông thường,

bằng cách này tế bào sẽ tránh được sự ly giải PBP2a được biểu hiện từ gene mecA không hiện diện trong các chủng S.aureus nhạy kháng sinh [22]

1.1.3 Đặc điểm sinh lý của MRSA

Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của S aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dòng

S aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7 ºC - 48ºC, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30 ºC - 34 ºC; pH 4,2 - 9,3, pH tối ưu là 7,0 - 7,5; và phát triển tốt

6

trên môi trường chứa NaCl 15 %; nồng độ đường từ 33 % – 60 % [7] Trong môi trường

thạch máu, S aureus có khả năng làm tan huyết Ở môi trường TSB lỏng, sau 5-6 giờ S

aureus tăng sinh làm đục môi trường, sau 24 giờ S aureus tăng sinh, môi trường đục có

thể quan sát bằng mắt thường Tế bào dạng cặn, tạo một vòng nhăn ở bề mặt môi trường

Ở môi trường thạch, khuẩn lạc có hình tròn, trơn láng, đục mờ và có màu vàng hoặc trắng

MRSA có nhiều cách khác nhau để thoát khỏi hệ miễn dịch của con người, như chúng

có khả năng sống sót bên trong bạch cầu trung tính [23]; hoặc tạo ra protein Map cản

trở phản ứng của tế bào lympho T [24] S aureus tiết ra một loại protein là Efb

(Extracellular fibrinogen binding protein) Protein này có kích thước khoảng 19 kDa và

có thể bám vào tơ huyết cũng như C3b (một thành phần vô cùng quan trọng của quá trình hoạt hóa bổ thể) Sự liên kết này ngăn cản C3b bám lên các tế bào nhiễm MRSA,

từ đó ngăn chặn sự hoạt hóa bổ thể theo con đường cổ điển và con đường nhánh, vì vậy dẫn tới quá trình thực bào nhờ opsonin hóa cũng bị bất hoạt [25]

1.2 Tổng quan một số kháng sinh sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm MRSA

7

Cơ chế hoạt động của vancomycin trên MRSA: vancomycin có ái lực cao với ala tại đầu C của pentapeptide (tiền chất để tổng hợp vách tế bào trên MRSA), do đó ngăn cản quá trình tổng hợp vách tế bào trên MRSA [26] Một tính chất của vancomycin

D-ala-D-là không có tính thấm qua màng tế bào chất, do đó nó chỉ tương tác với đích thuốc sau khi tiền chất được khảm qua bề mặt màng

MRSA kháng vancomycin do có sự hiện diện của operon chứa mRNA dịch mã cho enzyme tổng hợp những tiền chất có ái lực thấp với vancomycin Đặc biệt, ở đầu C của D-ala-D-ala được thay thế bằng D-lactate hoặc D-Serine do đó làm thay đổi vị trí gắn của vancomycin, dẫn đến phá huỷ ái lực cao của tiền chất với vancomycin, cuối cùng xoá bỏ đích thuốc [27]

b) Telavancin Telavancin là kháng sinh bán tổng hợp từ vancomycin, thuộc nhóm lipoglycopeptide

Cơ chế tác động giống vancomycin, nhưng thêm khả năng phá hủy chức năng vận chuyển của màng tế bào, làm khử sự phân cực của màng [28]

c) Teicoplanin Teicoplanin là một glycopeptide với hoạt động tương tự như vancomycin, teicoplanin dùng điều trị bệnh viêm phổi có liên quan MRSA Liều tối ưu của Teicoplanin trong điều trị viêm phổi MRSA vẫn chưa rõ, và chưa có bằng chứng lâm sàng chắc chắn chứng minh teicoplanin tốt hơn hay kém hơn vancomycin trong điều trị viêm phổi MRSA [29, 30]

1.2.2 Nhóm Oxazolidinone

a) Linezolid

Linezolid là kháng sinh thuộc nhóm oxazolidinone [31] dùng cho điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương, dùng kháng MRSA Linezolid là kháng sinh thuộc nhóm ức chế vi khuẩn Linezolid ức chế quá trình tổng hợp protein ở bước khởi

sự, không giống như những kháng sinh khác ở bước kéo dài trong tổng hợp protein Linezolid gắn với 23S của tiểu phần 50S (trung tâm hoạt động của enzyme peptidyl transferase) gần với vị trí gắn của chloramphenicol Linezolid cũng ức chế sản xuất độc

8

tố của các chủng Staphylococci và Streptococci Vi khuẩn gram dương thường phát triển

cơ chế kháng linezolid là kết quả của việc đột biến điểm G2576T, một base guanine được thay thế thymine ở vị trí 2576 của vùng gen phiên mã của 23S ribosomal RNA,

đây là cơ chế kháng phổ biến ở Staphylococci Linezolid có phổ hoạt động rộng đối với

vi khuẩn gram dương Linezolid thường được lựa đầu tiên điều trị nhiễm trùng bệnh viện do MRSA ở bệnh nhân lớn hơn 65 tuổi, và có nguy cơ rối loạn chức năng thận hoặc dùng thuốc gây độc thận [29]

1.2.3 Cephalosporin

Ceftaroline và ceftobiprole có hoạt tính chống MRSA trên in vitro, hai kháng sinh có ái

lực đối với protein gắn penicillin (PBP2a) FDA chấp thuận ceftaroline cho điều trị viêm

phổi cộng đồng, nhiễm trùng da và mô mềm do S auresus Thuốc được chứng minh lợi

ích lâm sàng, tuy nhiên đã quan sát được đề kháng trong ống nghiệm [30]

1.2.4 Các thuốc khác

a) Tigecycline: có hoạt tính chống vi khuẩn kháng thuốc bao gồm MRSA và Enterococci

kháng vancomycin, được dùng trong điều trị viêm phổi do MRSA tại Châu Âu [31] Nồng độ Tigecycline trong huyết tương thấp làm cho thuốc không thích hợp sử dụng cho trường hợp nhiễm trùng huyết

b) Fluoroquinolon: có hoạt tính chống lại một số chủng MRSA cộng đồng, nhưng không được khuyến cáo dùng thường quy, vì đề kháng có thể xuất hiện với đơn trị liệu [32]

1.3 Cao chiết/phân đoạn/tinh chất kháng MRSA

1.3.1 Tóm lược các nghiên cứu

Kháng sinh là một nhóm thuốc đặc biệt vì việc sử dụng kháng sinh không chỉ ảnh hưởng đến người bệnh mà còn ảnh hưởng đến cộng đồng Với những nước đang phát triển như Việt Nam, đây là một nhóm thuốc quan trọng vì bệnh lý nhiễm khuẩn nằm trong số những bệnh đứng hàng đầu cả về tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong [21] Vancomycin là

kháng sinh cuối cùng điều trị các chủng S aureus kháng thuốc, MRSA kháng vancomycin đã được báo cáo năm 2002 tại Hoa Kỳ [33], tuy S aureus kháng

vancomycin xuất hiện tại Việt Nam với tỉ lệ thấp nhưng nếu không kiểm soát tốt thì

9

nguy cơ phát tán các chủng kháng thuốc này sẽ gia tăng [34] Bên cạnh việc sử dụng kháng sinh hợp lý thì việc tìm các hoạt chất kháng khuẩn mới hoặc một liệu pháp thay thế là một nhiệm vụ cần thiết Các sản phẩm chiết từ dược liệu được chứng minh có tiềm năng trong hoạt tính kháng khuẩn mặc dù hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn so với kháng sinh, nhưng các sản phẩm chiết từ dược liệu có khả năng hợp lực với kháng sinh [35]

Vì vậy, tổng quan các nhóm hoạt chất thực vật kháng MRSA với giá trị MIC/MBC đã được tóm tắt trong Bảng 1.1

Bảng 1 1 Cao chiết thực vật kháng MRSA Thành phần hóa

Trích dẫn

Tannin 300 mg/mL Caryophyllus aromaticus,

saponin và alkaloid

và resin ở mức trung bình

10

Phenolic, carbohydrate

Boswellia papyrifera Hochst

Phenolic 3,5 mg/mL Walidda antidysenterica [46] Phenolic và

flavonoid

alkaloid, saponin

0,08–0,845 mg/mL Eugenia jambolana [47]

Tannin, saponin, sterol/steroid và glycoside

3 mg/mL Acalypha wilkesiana [48],

[49] Alkaloid, tannin,

saponin, steroid, glycoside

and flavonoid

0,75 mg/mL Duabanga grandiflora [50]

Tannin, alkaloid flavonoid, saponin, steroid, đường và

terpenoid

0,63 - 10/1,25 - 10 mg/mL Chrysophyllum albidum [51]

Đích tác động của các hoạt chất thực vật được tóm tắt trong Bảng 1.2 nhằm định hướng cho nghiên cứu hoạt tính kháng MRSA từ dược liệu và phát hiện các cơ chế kháng MRSA của cao chiết/tinh chất chiết từ dược liệu Các tinh chất từ thực vật có hoạt tính kháng khuẩn thuộc các nhóm khác nhau như polyphenol, alkaloid, flavonoid, triterpenoid, anthraquinone, polyol

Nhiều cơ chế kháng khuẩn khác nhau như ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào có các hợp chất như magnolol, epigallocatechin gallate thuộc nhóm polyphenol; nhóm phá vỡ cấu trúc màng tế bào như acid nordihydroguaiaretic, oxyresveratrol (ORV), isobavachalcone, bakuchiol thuộc nhóm flavonoid, sanguinarine thuộc nhóm alkaloid;

cơ chế kháng MRSA còn liên quan đến nhân tố ức chế các kênh bơm thuốc như reserpine, quinine, harmaline và piperine

Một hướng đang được nghiên cứu hiện nay là nhóm hợp chất thực vật từ địa y và tảo cũng cho thấy tiềm năng kháng khuẩn như fucoidan từ tảo biển, acid usnic, acid vulpinic

từ địa y

Các tinh chất tách chiết từ thực vật có hoạt tính kháng MRSA, nhưng hoạt tính thường

11

thấp hơn so với kháng sinh chuẩn Tuy nhiên, tinh chất thực vật cho hoạt tính kháng khuẩn cao hơn cả vancomycin như hydroxydihydrosanguinarine (hhS) với MIC bằng 1,95 mg/L, so với vancomycin có MIC bằng 2,34 mg/L; AZA (azadirachtin) với MIC bằng 2,5 mg/L và có khả năng ức chế sự hình thành biofilm

Bảng 1 2 Hoạt chất thực vật kháng MRSA Hoạt chất thực vật MIC/MBC Tên thực vật Đích tác động Trích

dẫn

Magnolol (magnolol và honokiol hợp lực oxacillin)

50 mg/L (10 mg/L và

25 mg/L)

Magnolia officinalis Thành phần tổng hợp

Rubus ulmifolius

Ức chế sự hình thành màng sinh học

[53]

demethyl-isoguaiacin

3′-Demethoxy-6-O-12,5 mg/L lá cây Larrea

Tridentata

Protein trên màng của

hệ thống vận chuyển ABC

[54]

Acid nordihydroguaiaretic

4 mg/L hợp lực với amino-glycosides

lá cây Larrea

Tridentata

Đích tác động là màng tế bào

[55]

Oxyresveratrol (ORV)

125 mg/L Morus alba Tăng tính thấm của

màng tế bào, ức chế ATPase

Ức chế sự hình thành biofilm và phá hủy biofilm đã hình thành

[56] [57]

Epigallocatechin gallate (polyphenol)

100 mg/L

25 mg/L EGCg + kháng sinh beta-

lactam

Camellia sinensis

Hợp lực với kháng sinh nhóm β-lactams

[60], [61], [62]

12

bakuisoflavone [63]

bakuflavanone (2), 2 hợp chất mới

isobavachalcone (10) bakuchiol (12),

8 μg/mL Psoralea

corylifolia

Tương tác với các thành phần của màng

tế bào

[64], [65]

Baicalein 64-256/

64-512 μg/mL

Scutellaria baicalensis

Georgi

Ức chế hoạt động của enzyme pyruvate kinase (PK)

[66], [67]

Sanguinarine 3,12 - 6,25

mg/L

Sanguinaria canadensis

Màng tế bào chất, có sự giải phóng enzyme phân hủy vách gắn trên màng

[68]

Reserpine (phytoalkaloid) quinine, harmaline và piperine

50 mg/L Quinine

trong vỏ cây canh kin a Harmaline trong hạt của cây họ Lạc

Đà hồng Piperine trong họ Hồ tiêu

Nhân tố ức chế bơm kháng thuốc trên chủng MRSA

[69] [70] [71] [72]

Acid ursolic 64 mg/L Alstonia

scholaris

Có tác dụng bảo vệ tế bào gan

Ức chế sự hình thành biofilms ở MRSA thông ức chế quá trình trao đổi chất aminoacid

và biểu hiện dính chặt

[73] [57] [74]

Linoleic và acid oleic 32/64

mg/L

Portulaca oleracea

[77] [78]

Shikonin gắn trực tiếp với peptidoglycan

[80]

Acid usnic 25–50

μg/mL

Usnea subfloridana

Phá hủy màng tế bào [81]

Acid vulpinic 31,25

mg/L

Letharia vulpine

Tính ổn định của màng

TB

[82]

Các nghiên cứu trong nước về cao chiết/hoạt chất kháng MRSA còn ít, như hoạt tính

kháng MRSA của cao chiết ethylacetate từ lá cây ổi (Psidium guajava L.) với giá trị

MIC bằng 1,5625 mg/mL của Dương Nhật Linh và cộng sự [83] Văn Đức Thịnh và

cộng sự đã khảo sát dược liệu Tứ Bạch Long (Blepharis maderspatensis (L.) Roth), kết

quả xác định có hai cao phân đoạn cho hoạt tính ức chế MRSA là cao phân đoạn chloroform với giá trị MIC bằng 25 mg/mL và cao phân đoạn ethylacetate với giá trị MIC bằng 125 mg/mL [84] Trần Công Luận và cộng sự khảo sát hoạt tính kháng MRSA

của cao chiết từ cây cây Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban), kết quả xác

định cao alkaloid toàn phần cho hoạt tính mạnh nhất với giá trị MIC bằng 0,1953 mg/mL, cao chloroform với giá trị MIC bằng 3,125 mg/mL, cao n-butanol với giá trị MIC bằng 3,125 mg/mL [85] Các nghiên cứu về hợp lực giữa cao chiết/tinh chất với kháng sinh có thể liệt kê nghiên cứu của Trần Thành Đạo và cộng sự (2011) về khảo sát

tác động kháng S aureus của phối hợp berberin và kháng sinh β-lactam, kết quả xác

định berberin có sự hiệp đồng với ampicillin, oxacillin và cefuroxim Từ đó, xác định giá trị MIC của berberin trên MRSA là 128 µg/mL Trên MRSA, berberin có tác dụng hiệp đồng với ampicillin (FIC = 0,375), oxacillin (FIC=0,5) và cefuroxim (FIC=0,313) Berberin có tác dụng hiệp lực hay cộng hợp với các β-lactam bán tổng hợp (ampicillin

và oxacicillin) và cephalosporin thế hệ 2 (cefuroxim) trên S aureus và không hiệp đồng

với cephalosporin thế hệ 3 [86] Nghiên cứu của Phạm Ngọc Tuấn Anh và cộng sự (2019) về khả năng phối hợp giữa dẫn xuất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran

và một số kháng sinh như ampicillin, cefuroxim, ciprofloxacin, gentamicin và vancomycin, kết quả xác định khả năng phối hợp giữa dẫn xuất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran và kháng sinh gentamicin với FICI bằng 0,375, giá trị MIC của

14

gentamicin giảm 4 lần trong phối hợp này, không có dẫn xuất nào hợp lực với vancomycin [87] Các nghiên cứu hoạt tính kháng MRSA trong nước chủ yếu là nghiên cứu về cao chiết hoặc hoạt chất kháng khuẩn, có nghiên cứu về sự hợp lực với kháng sinh nhưng cơ chế kháng MRSA còn rất ít Đặc biệt hoạt tính hợp lực với vancomycin của cao chiết hoặc tinh chất có một nghiên cứu của Phạm Ngọc Tuấn Anh và cộng sự (2019) vẫn chưa có kết quả, các dẫn xuất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran chỉ hợp lực với gentamicin [87]

1.3.2 Các đích tác động của cao chiết/tinh chất

Từ cao chiết đến tinh chất, các đích tác động của nhóm hợp chất trên chủng MRSA được quan tâm bao gồm

S aureus ở giai đoạn hình thành màng sinh học thì các tế bào vi khuẩn trong màng sinh

học bao gồm những vi khuẩn dạng tĩnh giảm nhạy với kháng sinh, trong đó có vancomycin, việc phá hủy tế bào trở nên khó khăn hơn [93] Nếu màng sinh học được hình thành thì khả năng kháng thuốc kháng sinh tăng đến 1000 lần [94] Hơn nữa, đích tác động này chỉ có ở tế bào Prokaryote Chính vì vậy, các hợp chất ức chế sự hình thành

15

màng sinh học rất đáng được lưu tâm đối với các mầm bệnh khó điều trị như MRSA [95]

Pinostrobin được tìm thấy hiện diện trong lá cây Trứng cá (Muntingia calabura) [96],

kháng lại những chủng vi khuẩn đột biến kháng thuốc Nồng độ pinostrobin từ 2 -16 µg

có khả năng ức chế khoảng 60 % sinh khối màng sinh học, khi nồng độ pinostrobin cao hơn 32 µg/ml thì khả năng phá hủy tới 80 % sinh khối màng sinh học Hơn nữa, pinostrobin còn làm tăng tính thấm của màng trong thí nghiệm với PI (propidium iodide) [97]

Sự kết hợp gallic acid với các hợp chất quinolines halogen hóa cho hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng bao gồm MRSA Đáng chú ý, màng sinh học của MRSA bị phá hủy với liệu pháp kết hợp này [98] Dẫn xuất 5-iodoindole khi kết hợp với các kháng sinh thương mại tránh sự hình thành màng sinh học và phá hủy màng sinh học [99]

b) Hệ thống tín hiệu Quorum sensing

Hệ thống quorum sensing (QS) là một đích tác động tiềm năng, vì phân tử của QS được giải phóng ở giai đoạn hình thành khuẩn lạc vi sinh và biểu hiện nhiều gene để kiểm soát sự trưởng thành màng sinh học [100] Vì vậy, hệ thống QS là cần thiết cho sự hình thành màng sinh học [101] Trong màng sinh học, vi khuẩn có đặc điểm biểu hiện độc tính và khả năng kháng kháng sinh Nhóm tác giả Amelia Muhs và cộng sự đã sử dụng các loài thực vật bản địa được dùng trong điều trị làm lành vết thương và các bệnh nhiễm

khuẩn, nghiên cứu sử dụng cao chiết từ loài Schinus terebinthifolia (Brazilian

Peppertree) như là nguồn chất ức chế độc tính Nhóm tác giả đã báo cáo hoạt tính ức chế từ phân đoạn cao chiết giàu flavone 430D-F5 cho hoạt tính ức chế các gene điều hòa

16

MRSA COL có kiểu hình kháng đa thuốc bằng cơ chế bơm thuốc ra bên ngoài tế bào MRSA, dẫn đến thuốc không đến được đich tác động của nó [97, 104] Pinostrobin có thể được tìm thấy trong nhiều nguồn khác nhau như từ cao chiết thực vật, hoặc trong nghiên cứu của nhóm Lowrence Rene Christena và cộng sự đã tách được pinostrobin từ mật ong [97] Trong nghiên cứu này, tác giả đã xác định hoạt tính ức chế bơm và kháng

sự hình thành màng sinh học của pinostrobin

NorA là một kênh bơm thuốc hiện diện trên S aureus Nhiều nhân tố ức chế kênh bơm

thuốc nhưng không được sử dụng vì liên quan đến độc tính của nó Ví dụ như reserpine

là một nhân tố ức chế bơm tiềm năng nhưng gây thoái hóa thần kinh Do đó, cần có nghiên cứu về những nhân tố ức chế NorA với khả năng gây độc tính thấp hơn [105] Những nhân tố ức chế bơm không có tính độc thường có thể dùng như những chất trợ với kháng sinh để tái nhạy trên chủng MRSA

Pinostrobin biểu hiện hoạt tính kết hợp với ciprofloxacin kháng lại vi khuẩn và sự hợp lực mạnh này giúp giảm đáng kể MIC ciprofloxacin trên chủng MRSA Pinostrobin có chức năng là nhân tố ức chế kênh natri trong não người [97] Do đó có giả thuyết cho

rằng pinostrobin được chứng minh là nhân tố ức chế bơm NorA ở S aureus Tuy nhiên,

kết quả chứng minh pinostrobin thúc đẩy quá trình ức chế bơm nhưng không thông qua

bơm NorA ở S aureus, mà có liên quan đến những bơm MFS khác như NorB, NorC,

MdeA

d) Độc tố là đích tác động cho sự thay đổi liệu pháp điều trị

S aureus có khả năng phá hủy tế bào hồng cầu bằng cách tiết ra các độc tố

Hemolysis là độc tố của S aureus, gồm bốn loại (alpha, beta, gamma, delta), mang bản

chất protein gây tan máu beta, tác động khác nhau lên các hồng cầu khác nhau Có khả năng gây hoại tử da tại chỗ và giết chết súc vật thí nghiệm Beta-hemolysis là một trong

những exotoxin được sản xuất bởi hầu hết các chủng S.aureus, là protein có khả năng

gây thoái hóa sphingomyelin gây ngộ độc cho nhiều tế bào kể cả hồng cầu người [106]

e) Vách tế bào

Acid teichoic của vách tế bào (WTA) là một đích tác động tiềm năng bởi vì WTA liên

17

kết cộng hóa trị với peptidoglycan, đóng vai trò chính trong phân chia tế bào, kháng kháng sinh, và độc tố [107] Cấu trúc WTA có độ đa dạng cao trên các chủng vi khuẩn gram dương và thường đặc trưng cho từng loài [108] Việc tổng hợp WTA và peptidoglycan xảy ra ở các bước sớm trong quá trình tổng hợp Như vậy, ức chế tổng hợp WTA cũng sẽ ngăn chặn sự tổng hợp peptidoglycan Hơn nữa, acid teichoic (WTA) của vách tế bào được đề nghị có vai trò trong việc kháng lại các hợp chất kháng khuẩn,

và khả năng kháng nhóm β-lactam trên chủng S aureus [109] Do đó, khi MRSA tái

nhạy với kháng sinh β-lactam thì nguyên nhân có thể là do ức chế quá trình tổng hợp WTA [110]

Hình 1 3 Con đường tổng hợp vách tế bào của Staphylococcus aureus [111]

Việc ức chế TagO và kênh vận chuyển WTA TagGH sẽ dẫn đến khả năng MRSA tái nhạy với kháng sinh β-lactam [110, 112, 113]

Nhân tố ức chế WTA cũng có thể khóa sự xâm nhập của MRSA vào tế bào chủ Zhao và cộng sự đã chứng minh khả năng hợp lực giữa EGCg và thuốc kháng sinh nhóm β-lactam gắn trực tiếp hoặc gián tiếp lên cùng một vi trí peptidoglycan trên vách tế bào Trong nghiên cứu, tác giả và cộng sự sử dụng phương pháp bàn cờ, RT-PCR xác định

sự biểu hiện của gen mecA, thử nghiệm Latex agglutination trên PBP2' protein Kết quả

18

xác định MRSA tái nhạy với kháng sinh nhóm β-lactam gồm benzylpenicillin, oxacillin, methicillin, ampicillin, và cephalexin khi hợp lực với EGCg Đồng thời, EGCg làm giảm khả năng chịu đựng nồng độ ion cao và khả năng chịu muối trên hai chủng vi khuẩn MRSA và MSSA, kết quả này chứng tỏ vách tế bào là đích tác động [58]

Như vậy, khi MRSA tái nhạy với kháng sinh nhóm β-lactam thì vách tế bào là đích tác động và quá trình tổng hợp WTA bị ức chế

1.4 Tổng quan một số dược liệu thu hái tại Bình Dương

Y học cổ truyền được người dân trên địa bàn tỉnh Bình Dương quan tâm, hiện trên địa bàn tỉnh có một nguồn tài nguyên cây thuốc rất phong phú và đa dạng Tỉnh cũng có truyền thống lâu đời trong việc bảo tồn vốn quý y học cổ truyền, nghiên cứu, chế biến

sử dụng, nuôi trồng thảo dược phục vụ cho công tác phòng và chữa bệnh trong nhân dân Theo đề án phát triển công nghiệp dược và xây dựng mô hình hệ thống cung ứng thuốc của Việt Nam giai đoạn 2007 – 2015 và tầm nhìn đến năm 2020; chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020; thực hiện đề án thành lập Vườn quốc gia bảo tồn và phát triển cây thuốc Việt Nam… Trên cơ sở đó, đề tài “Điều tra khảo sát tình hình cây thuốc tỉnh Bình Dương” của tác giả Trần Công Luận được thực hiện nhằm đánh giá lại hiện trạng nguồn tài nguyên cây thuốc, cập nhật các cây thuốc của tỉnh để có định hướng cho nhu cầu khai thác sử dụng, khả năng trồng trọt phát triển, bảo tồn tài nguyên, tạo nguồn nguyên liệu dược ổn định phục vụ cho nhu cầu sản xuất, điều trị phòng và chữa bệnh góp phần cải thiện nâng cao đời sống đồng bào khu vực tỉnh Bình Dương

Theo danh mục cây thuốc bản địa tỉnh Bình Dương của Trần Công Luận và nguồn tri thức thuốc cổ truyền của người dân, đề tài sàng lọc hoạt tính kháng MRSA của 140 loài thực vật, sau cùng 4 loài thực vật gồm Ngành Ngạnh Nam, Trâm Tròn, Xăng Mã, Cò

Ke được lựa chọn dựa trên tiêu chí hoạt tính kháng MRSA

1.4.1 Ngành Ngạnh Nam

Bộ: Bộ Sơ Ri (Malpighiales) Họ: Họ Măng Cụt (Clusiaceae)

Chi: Lành Ngạnh (Cratoxylum)

19

Tên khoa học: Cratoxylum cochinchinensis L

Chi phân bố ở Đông Nam Á, các loài thực vật thuộc chi này thường được sử dụng trong các bài thuốc dân gian ở các quốc gia Châu Á như Trung Quốc, Indonesia, Malaysia,

Thái Lan và Việt Nam

Cratoxylum cochinchinensis tên thường gọi là Ngành Ngạnh Nam, Thành Ngạnh Nam

hay Lành Ngạnh Nam Bộ Đây là cây đại mộc cao 10 – 15 m, có gai; vỏ trăng trắng Lá

có phiến xoan ngược, chót tà hay nhọn nhọn, mỏng, nâu tươi vàng vàng, mặt dưới mốc trắng; cuống 2 – 5 mm Hoa 1 - 4, đỏ điều, không lông, cọng dài bằng cuống lá; cánh hoa hẹp, dài 9 mm, không vảy tiết; tiểu nhụy thành 3 bó Nang dài bằng hai đài, 12 mm; hột nhiều, dài 8 mm, có cánh Gỗ hồng, nặng, dẻo, tốt Nhánh trị bệnh da, ghẻ ngứa, phỏng, vết thương, vỏ trị xáo trộn ở bụng [114] Các tài liệu nghiên cứu chỉ ra nhiều

cách sử dụng truyền thống khác nhau của các loài thuộc chi Cratoxylum như chữa đau

dạ dày, sốt, ho, ngứa, loét, tiêu chảy, chảy máu trong và ngộ độc thức ăn

Thành phần hóa học của chi Cratoxylum bao gồm flavonoid xanthone, benzophenone,

terpenoid, quinone, sterol và các thành phần phenolic khác Cao chiết các loài thực vật

thuộc chi Cratoxylum có phổ rộng về hoạt tính dược như độc tính tế bào, chống muỗi,

kháng khuẩn, kháng oxi hóa, kháng viêm và ức chế hoạt động của enzyme

α-glucosidase Cratoxylum spp được sử dụng trong nhiều bài thuốc truyền thống Tuy

nhiên, một vài loài thuộc chi này cần được nghiên cứu nhiều hơn về cơ chế của hoạt tính dược và các thành phần hóa học [115]

Rattanaburi (2007) đã nghiên cứu các thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ cành

non, quả, và rễ từ cây Ngành Ngạnh Nam Kết quả xác định hoạt tính kháng S.aureus

ATCC 25923 và MRSA SK1 với MIC của cao chiết acetone từ cành non cùng là 80

µg/ml, cao chiết choloroform từ cành non với giá trị MIC là 160 µg/ml đối với S.aureus

ATCC 25923, 80 µg/ml đối với MRSA SK1 [116]

Nguyễn Ngọc Chí và Nguyễn Diệu Liên Hoa (2016) đã phân lập được một triterpenoid

là (13E,17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3β-ol và bốn xanthon là cochinchinon A,

cratoxylumxanthon B, 9-hydroxycalabaxanthon và 1,5-dihydroxy-13-methyl-13-