Khảo sát enzyme chumopapain và các enzyme thành phần trong mủ trái đu đủ

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA WUX NGUYỄN THỊ THU SANG KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ Chuyên ngành Mã số ngành : Khoa Học Công Nghệ Thực Phẩm : 2.11.00 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH – 12/2005 CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI ĐẠI HỌC BÁN CÔNG TÔN ĐỨC THẮNG Cán hướng dẫn khoa học : Chữ ký : Cán chấm nhận xét : Chữ ký : Cán chấm nhận xét : Chữ ký : TS LÊ THỊ PHÚ TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO TS TRẦN BÍCH LAM Luận văn thạc só bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH Ngày tháng năm 2005 LVTS - KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ A–1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC Tp.HCM, ngày tháng năm 2005 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên : NGUYỄN THỊ THU SANG Phái : Nữ Ngày, tháng, năm sinh : 23/8/1978 Nơi sinh : Lâm Đồng Chuyên ngành : Khoa Học Công Nghệ Thực Phẩm MSHV : 01103275 I TÊN ĐỀ TÀI : KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG : • Tìm hiểu, nghiên cứu tổng quan, tài liệu đu đủ enzyme thành phần mủ trái đu đủ • Khảo sát tổng quát enzyme thành phần mủ tươi, khô • Khảo sát tinh enzyme chymopapain, sắc kí lực peptidase từ mủ khô • So sánh tính chất hoạt lực enzyme, nhận xét, bàn luận kết III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : / / IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : / / V HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS LÊ THỊ PHÚ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM NGÀNH BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH TS LÊ THỊ PHÚ TS LÊ VĂN VIỆT MẪN TS LÊ VĂN VIỆT MẪN Nội dung đề cương luận văn thạc só Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH Ngày tháng năm 2005 KHOA QUẢN LÝ NGÀNH LVTS - KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ A–2 LỜI CẢM ƠN Con xin thành kính cảm ơn Ba, Mẹ nuôi dưỡng nên người tất anh chị em gia đình động viên suốt trình học tập để có ngày hôm Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đếm TS Lê Thị Phú, môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Khoa Học Ứng Dụng trườøng ĐHBC Tôn Đức Thắng nhiệt tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực nghiên cứu làm việc với Cô Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM, tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho chúng em thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn đồng nghiệp quý Thầy, Cô trường ĐHBC Tôn Đức Thắng bạn lớp cao học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập thời gian thực luận văn Tp HCM 22/11/2005 NGUYỄN THỊ THU SANG LVTS - KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ A–3 TÓM TẮT Mủ trái đu đủ nguồn thực vật chứa nhiều enzyme proteolitic Cho đến người ta nghiên cứu mủ đu đủ có enzyme thành phần bao gồm papain (EC 3.4.22.2), chymopapain (EC 3.4.22.6) peptidase Các enzyme có hoạt tính proteolitic có cấu trúc, thành phần trật tự acid amin, phân tử lượng… khác nên tính chất công dụng khác Trong enzyme chymopapain enzyme chiếm tỉ lệ nhiều Các nhà khoa học quan tâm nhiều việc sử dụng chymopapain vào việc chữa trị hữu hiệu bệnh nhân bị lệch đệm cột sống mà không cần phải giải phẫu Trong luận văn khảo sát trình tinh sạch, số tính chất enzyme thành phần mủ tươi mủ đông khô trái đu đủ trồng Việt Nam phương pháp hoá lý, hoá sinh, tập trung vào khảo sát tinh enzyme chymopapain ASTRACT The latex from the fruit of Carica papaya L Caricaceae is one of sources of proteolitic enzymes There are at least three enzymes in papaya latex: papain (EC 3.4.22.2), chymopapain (EC 3.4.22.6) and peptidase These enzymes are protease but their structures, molecular weights, compostions and sequences of acid amin… are different so that their properties and uses are Chymopapain is the most abundant protease in the latex Scientists now are interested in the use of chymopapain as an effective non–surgical treatment for the patients with a symtomatic prolapsed intervertebral disc This thesis studied the isolation and the properties of each enzyme in the fresh and freezed dried Vietnamese papaya latex by physiochemical and biochemical methods We concentrated on the purification of enzyme chymopapain LVTS - KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ A–4 DANH MỤC BẢNG PHẦN – TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bảng Bảng Bảng Baûng Baûng Baûng Baûng Baûng Baûng Baûng Baûng 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 – – – – – – – – – – – Đặc tính số giống đu đủ giới .7 Một số giống đu đủ phân bố đồng sông Cửu Long Thành phần 100g phận đu đủ .9 Sản xuất đu đủ nước giới, từ 2000-2004 11 Lượng đu đủ tươi Mỹ nhập từ nước, từ 2000-2004 .12 Các dạng đu đủ nhập vào Mỹ, từ 2000-2004 .12 Thành phần enzyme chế phẩm papain 14 Thành phần amino acid papain .17 Vài tính chất hoá lý chymopapain 22 Thành phần acid amin chymopapain B 23 Hoạt tính thủy phân protein chế phẩm papain Việt Nam .29 PHẦN – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bảng 2.1 – Hệ số tắt loại protein bước sóng 280nm .47 PHẦN – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Baûng Baûng Baûng Baûng Baûng Baûng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 – – – – – – Baûng Baûng Baûng Baûng Baûng Baûng Baûng 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 – – – – – – – Keát phân tích sơ mẫu mủ tươi .60 Kết chạy sắc kí CM-Cellulose mủ tươi trái non 63 Kết chạy sắc kí CM-Cellulose mủ tươi trái bánh tẻ .65 Kết chạy sắc kí CM-Cellulose mủ tươi trái già 67 Tỉ lệ protein hoạt lực peak mẫu latex tươi 69 Kết phân tích tiêu hoá sinh latex khô chế phẩm Merck 70 Kết chạy sắc kí CM-Cellulose mẫu latex khô .73 Kết chạy sắc kí CM-Cellulose chế phẩm Merck 75 Kết chạy sắc kí CM-Cellulose phân đoạn 65% (NH4)2SO4 80 Đánh giá hiệu thu hồi chymopapain .81 Kết tính toán enzyme peptidase sau chạy sắc kí lực 85 Kết thử hoạt lực đông tụ sữa phân đoạn mủ tươi 87 Kết thử hoạt lực đông tụ sữa phân đoạn tinh saïch chymopapain 88 LVTS - KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ A–5 DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ PHẦN – TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình Hình 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 – – – – – – – – – – Phân loại hoa đu đủ Các loại hoa đu đủ Các dạng trái đu đủ Một số loại giống đu đủ giới Biểu đồ sản xuất đu đủ giới từ 1994 -2004 .10 Điện di đồ chế phẩm papain 16 Cấu trúc không gian papain .17 Cấu trúc tâm hoạt động papain có mặt chất 18 Sự hình thành anion thiolate Cystein 18 Cơ chế phản ứng xúc tác enzyme thông qua hai trình acyl deacyl hoá 19 PHAÀN – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình Hình Hình Hình 2.1 2.2 2.3 2.4 – – – – Sơ đồ nghiên cứu 38 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát enzyme sắc kí trao đổi ion 40 Sơ đồ chiết xuất chymopapain .42 Sơ đồ sắc kí lực phân tách peptidase .44 PHẦN – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hình 3.1 – Kết điện di SDS-PAGE mẫu latex phân đoạn sau sắc kí trao ñoåi ion 77 Hình 3.2 – Kết điện di SDS – PAGE mẫu latex phân đoạn giai ñoaïn tinh saïch chymopapain 83 Hình 3.3 – Kết điện di SDS-PAGE peptidase sau sắc kí lực .86 Đồ thị Đồ thị Đồ thị Đồ thị 3.1 3.2 3.3 3.4 – – – – Đồ thị Đồ thị Đồ thị Đồ thị 3.5 – 3.6 – 3.7 – 3.8 – Sắc kí đồ mủ tươi trái non qua cột CM-Cellulose 61 Sắc kí đồ mủ tươi trái bánh tẻ qua cột CM-Cellulose 64 Sắc kí đồ mủ tươi trái già qua cột CM-Cellulose 66 So sánh hàm lượng protein hoạt lực enzyme mủ tươi .68 Sắc kí đồ latex khô qua cột CM-Cellulose 72 Sắc kí đồ chế phẩm Merck qua cột CM-Cellulose 74 Sắc kí phân đoạn 65% (NH4)2SO4 qua cột CM-Cellulose .79 Sắc kí lực latex đông khô 85 LVTS - KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ A–6 MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHAÀN - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ 1.1 NGUỒN GỐC – PHÂN LOẠI 1.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 1.3 THÀNH PHẦN DINH DƯỢNG TRÁI ĐU ĐỦ 1.4 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT, TIÊU THỤ ĐU ĐỦ VÀ MỦ ĐU ĐỦ 10 CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ ĐU ÑUÛ 14 2.1 PAPAIN 16 2.2 CHYMOPAPAIN 22 2.3 PEPTIDASE 25 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC ENZYME TRONG MỦ ĐU ĐỦ 27 3.1 TÌNH HÌNH THẾ GIỚI 27 3.2 TÌNH HÌNH TRONG NƯỚC 29 ỨNG DỤNG CỦA CÁC ENZYME TRONG MỦ ĐU ĐỦ 30 4.1 TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM 30 4.2 TRONG Y- DƯC HỌC 31 4.3 TRONG CÁC NGÀNH CÔNG NGHIỆP KHÁC 33 PHẦN - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 NGUYÊN LIỆU- DỤNG CỤ- THIẾT BỊ- HOÁ CHẤT 35 1.1 NGUYÊN LIỆU 35 1.2 DỤNG CỤ – THIẾT BỊ 35 1.3 HÓA CHẤT SỬ DỤNG 36 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 38 2.2 THUYEÁT MINH 39 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 45 LVTS - KHAÛO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ A–7 PHẦN - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59 KHẢO SÁT CÁC MẪU MỦ (LATEX) TƯƠI 60 1.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SƠ BỘ 60 1.2 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÍ TRAO ĐỔI ION 61 KHẢO SÁT MẪU LATEX ĐÔNG KHÔ VÀ CHẾ PHẨM MERCK 70 2.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SƠ BỘ 70 2.2 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÍ TRAO ĐỔI ION 72 2.3 KẾT QUẢ ÑIEÄN DI 77 TINH SẠCH ENZYME CHYMOPAPAIN TỪ LATEX ĐÔNG KHÔ 78 3.1 PHÂN ĐOẠN BẰNG (NH4)2SO4 78 3.2 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÍ PHÂN ĐOẠN 65% (NH4)2SO4 79 3.3 KẾT QUẢ CHẠY ĐIỆN DI 83 KHẢO SÁT PHÂN TÁCH ENZYME PEPTIDASE 84 KẾT QUẢ THỬ HOẠT LỰC ĐÔNG TỤ SỮA 87 5.1 CÁC PHÂN ĐOẠN ENZYME TỪ MỦ TƯƠI 87 5.2 CÁC PHÂN ĐOẠN KHI TINH SẠCH CHYMOPAPAIN TỪ MỦ KHÔ 88 PHẦN - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 KẾT LUẬN 90 KIEÁN NGHÒ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHUÏ LUÏC 98 LVTS - KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ A–8 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ MỞ ĐẦU MỞ ĐẦU Cây đu đủ (Carica papaya L Caricaceae) loại ăn trái nhiệt đới cung cấp nhiều chất dinh dưỡng phổ biến Việt Nam Từ lâu, mủ đu đủ sử dụng làm nguồn enzyme quý ngành công nghiệp, y học Hiện nước phát triển nhiều nước khác tiến hành nhiều nghiên cứu tác dụng enzyme mủ đu đủ, đặc biệt có nhiều công trình nghiên cứu dược tính enzyme chymopapain enzyme thành phần điều trị bệnh cột sống (bệnh lệch đệm cột sống) Kết nghiên cứu công trình nước cho thấy loại đu đủ phát triển Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều, loại enzyme protease thành phần latex enzyme papain, chymopapain, peptidase… vài công trình đề cập tới Đặc biệt chưa có công trình sâu nghiên cứu việc tinh tách riêng enzyme thành phần để ứng dụng ngành công nghiệp Y-Dược điều kiện Việt Nam, nguồn đu đủ Việt Nam nhiều, phong phú số lượng, chủng loại đồng thời chất lượng (hoạt tính enzyme) mủ cao [3,11,43] Trên sở mạnh dạn đưa đề tài “Khảo sát enzyme chymopapain enzyme thành phần mủ trái đu đủ” làm đề tài nghiên cứu bảo vệ Thạc só Nội dung đề tài: ¾ Khảo sát enzyme thành phần trong loại mủ đu đủ theo giai đoạn tuổi trái ¾ Chiết xuất, tinh nghiên cứu số tính chất enzyme thành phần mủ đu đủ (papain, chymopapain, peptidase…) phương pháp hóa lý, hóa sinh… ¾ Chiết tách enzyme chymopapain phương pháp hóa học kết hợp phương pháp sắc kí HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHẦN – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THỬ HOẠT LỰC ĐÔNG TỤ SỮA 5.1 CÁC PHÂN ĐOẠN ENZYME TỪ MỦ TƯƠI Các phân đoạn enzyme papain, chymopapain, peptidase sau chạy sắc kí CMCellulose từ mủ tươi thẩm tích đối nước tiến hành đông khô, sau thử hoạt lực protease hoạt lực đông tụ sữa Lượng cân mẫu khoảng 1mg hòa tan 2ml nước, thu kết bảng 3.12 Bảng 3.12 – Kết thử hoạt lực đông tụ sữa phân đoạn mủ tươi Protein mg/ml Hoạt tính protease (UI /ml) Hoạt tính đông tụ sữa (UI /ml) Tỉ soá R Papain 0,35 1,7 22,0 12,9 Chymopapain 0,32 1,26 10,7 8,5 Peptidase 0,24 1,2 Peptidase 0,48 2,4 Peptidase 0,72 3,6 Phân đoạn (sau 120phút) (sau 120 phút) (sau 120 phút) 0 Với R tỉ lệ hoạt tính đông tụ sữa hoạt tính protease Để so sánh hiệu đông tụ phân đoạn chứa enzyme dựa vào tỉ số R để đánh giá Với tỉ số R = 12,9 enzyme papain thể hoạt tính đông tụ sữa cao peptidase hoàn toàn hoạt tính đông tụ sữa tăng gấp đôi gấp ba hàm lượng enzyme Điều chứng tỏ enzyme peptidase hoạt tính đông tụ sữa yếu so với papain chymopapain nên thí nghiệm không phát HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 87 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHẦN – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 5.2 CÁC PHÂN ĐOẠN KHI TINH SẠCH CHYMOPAPAIN TỪ MỦ KHÔ Trong trình tinh chymopapain từ mủ đông khô, theo giai đoạn phân đoạn kiểm tra hàm lượng protein pha loãng cho không 0,5mg/ml để thử hoạt lực đông tụ sữa thu kết sau Bảng 3.13 – Kết thử hoạt lực đông tụ sữa phân đoạn tinh chymopapain Phân đoạn Protein mg/ml Hoạt tính protease (UI /ml) Hoạt tính đông tụ sữa (ĐV /ml) Tỉ số R 0,34 1,57 3,93 2,5 0,32 1,69 11,49 6,8 0,2 1,05 9,87 9,4 Dịch thô pha loãng 100 lần Dịch 65% pha loãng 30 lần Peak chymopapain Nhận xét : Trong tất phân đoạn, peak chymopapain sau tinh qua cột trao đổi ion CM-cellulose có hoạt lực đông tụ sữa mạnh nhất, thể qua tỉ số R đạt 9,4 Dịch phân đoạn 65% (NH4)2SO4 thể hoạt lực đông tụ thấp hơn, R 6,8 Dịch thô (trước chạy sắc kí) có hoạt lực đông tụ sữa thấp R đạt 2,5 Rõ ràng chymopapain có hoạt tính đông tụ sữa hoạt tính tăng độ tinh tăng lên Như loại enzyme protease thành phần thu hồi từ mủ đu đủ hai enzyme papain chymopapain thể hoạt tính đông tụ sữa tương ứng với hoạt tính protease, peptidase có hoạt tính protease lại hoạt tính đông tụ sữa Điều cho thấy enzyme latex đu đủ thể hoạt tính proteolitic mức độ hoạt lực tính chất khác HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 88 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHẦN – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ PHẦN KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 89 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHẦN – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ PHẦN - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau khảo sát enzyme mẫu mủ (latex) từ trái đu đủ rút số kết luận sau Về sắc kí trao đổi ion CM-Cellulose Có thể sử dụng loại cột chạy sắc kí có kích thước nhỏ (1,4cm x 5,5cm) để thay cho loại cột có kích thước lớn (thông thường 1-1,5cm x 25-30cm) công trình nghiên cứu trước [28,29,36] để chạy sắc kí lỏng trao đổi ion CM-cellulose điều kiện nhiệt độ áp suất bình thường mà kết không sai khác Điều có ý nghóa tiết kiệm lớn điều kiện Việt Nam hóa chất thiết bị chạy sắc kí có giá thương mại cao sẵn Các điều kiện thí nghiệm Dung môi rửa giải : dung dịch đệm acetate pH5 0,4M-1,5M Kích thước cột : 1,4 x 5cm Tốc độ rửa giải : 9ml/giờ Về enzyme thành phần theo giai đoạn phát triển trái đu đủ: ¾ Phát mủ trái đu đủ non chưa hình thành enzyme papain, trái có giai đoạn trưởng thành 40 ngày tuổi xuất enzyme papain hàm lượng tăng dần lên trái giai đoạn lớn Enzyme chymopapain peptidase xuất trái non Chymopapain có hàm lượng cao suốt trình phát triển trái, chiếm 50% tổng lượng enzyme trái Ngược lại enzyme peptidase trái non chiếm 20% trái già hàm lượng enzyme giảm xuống độ khoảng 15% HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 90 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHẦN – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ¾ Các enzyme thành phần mẫu mủ tươi khô rửa giải qua cột CM-Cellulose với hệ đệm acetate pH gradient 0,4-1,5M Trong đó: • Peak (phân đoạn) chứa papain rửa giải gradient 0,4 – 0,47M • Peak chứa chymopapain rửa giải gradient 0,62- 0,99M • Peak chứa peptidase đẩy sau 1,13-1,28M Về tinh chymopapain: Muối tích hai lần 45% 65% (NH4)2SO4 bão hòa để thu chymopapain loại trừ hoàn toàn papain kéo theo lượng nhỏ peptidase, dễ dàng bị loại bỏ sau tinh qua cột trao đổi ion độ tinh chymopapain tăng lên 1,91 lần với hiệu suất thu hồi 20,1% Về phân tách peptidase sắc kí lực với chất ức chế tripsin: Peptidase nhanh chóng hoàn toàn tách khỏi chế phẩm dung dịch đệm photphat 0,01M pH 7,0 chứa 0,2M NaCl Peptidase thu hồi chiếm đến 13,9% protein tổng 19,9% hoạt lực chung, cao hẳn so với phân tách sắc kí trao đổi ion chiếm 6,8% protein tổng 5,2% hoạt tính chung Các điều kiện thí nghiệm Dung môi rửa giải : đệm phosphat 0,1M pH 7,0 có chứa 0,2M NaCl Kích thước cột : 1x 6cm Tốc độ rửa giải : 40ml/giờ Về khả đông tụ sữa enzyme thành phần: Papain thể hoạt tính đông tụ sữa cao chymopapain Riêng peptidase mặïc dù protease (thủy phân casein) thử khả đông tụ sữa enzyme hoàn toàn không làm kết tủa casein sữa bổ sung nồng độ enzyme khác nhau, papain chymopapain có hoạt tính đông tụ sữa tương ứng hoạt tính proteolitic HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 91 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHẦN – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KIẾN NGHỊ Do hạn chế thời gian, kinh phí, thiết bị, đặc biệt hóa chất sử dụng nên chưa nghiên cứu đề tài cách sâu sắc toàn diện Chúng đề xuất số hướng nghiên cứu sau để hoàn thiện đề tài: Nghiên cứu sâu chymopapain, hỗ trợ có nguồn kinh phí nên kết hợp với quan ngành y - dược làm thuốc chữa bệnh lệch đệm cột sống, thử lâm sàng thực thêm nghiên cứu ứng dụng enzyme thành phần lónh vực y dược Nghiên cứu khảo sát quy trình tinh chymopapain quy mô lớn kèm theo trình thu hồi enzyme peptidase sắc kí lực Đồng thời nghiên cứu để đạt độ tinh khiết cao Đặc biệt enzyme peptidase có tính đặc hiệu cao tính lực hoạt tính đông tụ sữa nên nghiên cứu thêm phương pháp thu hồi hướng ứng dụng Một hướng nghiên cứu không phần quan trọng tận thu, tìm cách chế biến sử dụng hiệu trái đu đủ sau thu nhận mủ Khảo sát kó thành phần tính chất enzyme thành phần loại mủ từ phận cây, trái, đu đủ đực, đu đu cái, đu đủ lưỡng tính, đủ ruột đỏ ruột vàng HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 92 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Thị Ân (cb) - Hóa sinh học, tập – NXB Y học – 1982 Trần Thị Áng - Hoá sinh học – NXB Giáo Dục – 2001 Nguyễn Trọng Cẩn (cb), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến Công nghệ enzyme – NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh – 1998 Nguyễn Hữu Chấn – Enzyme xúc tác sinh học # Enzyme & biological catalysis – NXB Y học – 1996 Phạm Thị Trân Châu(cb), Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường - Thực hành hóa sinh học – NXB Giáo Dục – 1998 Nguyễn Thị Chung cộng , khoa dược ĐH Y dược tpHCM – Khảo sát điều kiện tối ưu sản xuất papain thô papain thương phẩm Nguyễn Thành Hối, Dương Minh, Võ Thanh Hoàng – Cây ăn trái đu đủ (Cacica papaya)- NXB Nông nghiệp -1999 Phạm Thị Ánh Hồng – Kỹ thuật sinh hóa – NXB ĐHQG TpHCM – 2003 Bùi Văn Lệ, Lê Thị Mỹ Phước tác giả - Thực tập sinh hoá - Đại học Khoa học Tự Nhiên 2/2001 10 Lâm Viết Lợi - Cty dược liệu trung ương II “Phytopharco”– Thực nghiệm chọn giống trồng đu đủ tập trung Tạo nguồn nguyên liệu để chiết xuất papain sử dụng công nghiệp dược phẩm xuất khẩu- Chương trình nghiên cứu quốc gia KY 02 Bộ Y tế, đề tài KY 02.17, 1994-1995 11 Nguyễn Đức Lượng (cb), Cao Cường, Nguyễn nh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền- Công nghệ enzyme – NXB ĐHQG Tp HCM- 2004 12 Nguyễn Văn Mùi – Thực hành hóa sinh học - NXB Khoa Học Kỹ thuật Hà Nội – 2001 13 Nguyễn Văn Rư, Nguyễn Xuân Thắng, Bộ môn Hoá Sinh - Vi sinh –Trường ĐH Dược Hà Nội – Nghiên cứu phân giải protid thực phẩm chế phẩm pancreatin, papain hỗn hợp chúng – 2004 14 Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nhu Thuận – Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm - Nhà xuất Khoa Học & Kỹ Thuật, Hà Nội – 2000 15 Nguyễn Thị Thu Sương (Hướng dẫn: Trần Bích Lam) - Nghiên cứu tinh chế enzyme papain từ chế phẩm thô - LVTN, Bộ môn Hoá thực phẩm, khoa CNHH Dầu khí, ĐH Bách Khoa 2002 16 Đỗ Thị Thanh, Nguyễn Xuân Thắng - Papain từ đu đủ, dạng thuốc sirô theo dõi hoạt tính enzyme - Tạp chí dược học, No 4, 1994 , trang 16-18 HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 93 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ TÀI LIỆU THAM KHẢO 17 Trần Đình Toại, Đỗ Ngọc Lanh, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Thu Hoài, trung tâm nhiệt đới Việt Nga – Nghiên cứu khả thủy phân số loại protein papain – Tạp chí hóa học, T.32, số 4, trang 33-36, 1994 18 Trần Đình Toại, Đỗ Ngọc Lanh, Nguyễn Thu Hoài, Trần Đình Thanh, trung tâm nhiệt đới Việt Nga, Nguyễn Thị Vân Hải, viện Hóa Học công nghiệp – Mô hình phản ứng thủy phân protein dự trữ xúc tác papain – Tạp chí Hóa học, T.34, số 4, trang 19-23, 1996 19 Lê Ngọc Tú (Cb), La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên - Hoá sinh học công nghiệp – NXB KHKT Hà Nội – 1998 20 Giáo trình thực hành Hóa sinh, trường đại học BC Tôn Đức Thắng - Tài liệu lưu hành nội 2004 21 Baldev S Baines and Keith Brocklehurst - Characterization of papaya peptidase A as a cystein peptidase of Carica papaya L with active-centre properties that differ from those of papain by using 2,2’- dipirydil disulphide and 4-chloro-7- nitrobenzofurazan as reactivity probes Use of two-protonicstate electrophiles in the identification of catalytic-site thiol groups Biochem J (1982) 205(1), 205-211 22 Barrett, Alan J; Buttle, David J.; Rich, Daniel H Pharmaceutical composition of purified chymopapain Patent No 5468480 1995 23 ВохонгНьан, ЛеТхиФу, Т.А.Валуева,Л.И.Григорьева, В.В.Мосолова Протеолитическиеферменты из плодов Дынного дерева (Carica papaya.L.), прорастующего в условияхВъетнама - Москва.1994 24 Dando PM, Sharp SL, Buttle DJ, Barrett AJ Department of Biochemistry, Strangeways Research Laboratory, Cambridge, UK– Immunoglobin E antibodies to papaya proteinases and their relevance to chemonucleolysis – Spine 1995 May 1;20(9):981-5 25 David J Buttle, Alan J Barrett cộng - Chymopapain: Chromatogaphic purification and immunological characterization Biochem J (1984) vol 223, 81-88 26 David J Buttle, Alan J Barrett cộng Affinity purification of the novel cysteine peptidase papaya peptidase IV, and papain from papaya latex Biochem J (1989) 261,469-476 27 David J Buttle and Alan J Barrett cộng Selective cleavage of glycyl bond by papaya peptidase IV Feredation of European Biochemical Societirs.vol.260, No 2.1990, 195-197 HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 94 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 Derek H.Calam, Janice Davidson And Roy Harris High-performance liquid chromatographic investigations on some enzymes of papaya latex Journal of Chromatography, 326 (1985) 103-111 29 Donald K.Kunimitsu and Kerry T.Yasunobu Chymopapain, The chromatographic fractionation of partially purified chymopapain and the characterization of crystalline Chymopapain B Biochimica et Biophysica Acta, 139 (1967), p405-417 30 Dominic W.S.Wong- Food enzymes: structure and mechansism – Chapman & Hall – 1995 31 Eugene J Nordby, MD., Manucher J.Javid, MD, khoa giải phẫu thần kinh, ĐH Winconsin, Myõ– Continuing Experience with Chemonucleolysis - 2000 32 Khoe, Teng H Enteric coated papain containing food supplement for controlling auto immune diseases Patent No 5466547 1995 33 László Polgár, Institute of Enzymology, Biological Research center, Hungarian Academy of Sciences – Isolation of highly active papaya peptidases A and B from commercial chymopapain - Biochimica et Biophysica Acta,658 (1981) 262-269 34 L.A.E Sluyterman The effect of methanol, urea and other solutes on the action of papain Biochimica et Biophysica Acta,139 (1967) 918-429 35 M.Umar Dahot, M Yakoub Khan, A N Memon - Screening of some pakistani plants for milk clotting activity - Journal of Islamic Academy of Sciences 3:4, 284-286, 1990 36 Mitsuo Ebata and Kerry T.Yasunobu Chymopapain, isolation, crystallization and preliminary characterization The Journal of Biological Chemistry, vol 237, No.4 4/1962, p1086-1094 37 Mosolov V.V Konstanova E.A., Valueva T.A Intereaction between cysteine peptidases and the soybean tripsin inhibitor (Kunitz) Biochem J, VOL.21 1994, 167-171 38 Ozlen, Susan N Cosmetic composition containing alpha hydroxyacids, salicylic acid, and enzyme mixture of bromelain and papain Patent No 5441740 1995 39 Protopapa, Evangelia Enzyme preparations containing papain or chymotripsin and methods of permanent enzymic depilation Patent: EP 0622069 A1 941102 40 Rodney F.Boyer - Modern Experimental Biochemistry, second edition – The Benjamin/Cummings Puslishing Company Inc – 1993 HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 95 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Rubin, Stan M Treatment for insect bites Patent No 5543149 1996 42 Rubens Monti, Carmelita A.Basilio, Hemrique C Trevisan vaø Jonas Contiero, khoa Hoá Sinh, ĐH Estadual Paulista, Brasil – Purification of papain from fresh latex of Carica papaya – Brazilian Archives of Biology and Technology, v.43, n.5, p 501-507, 2000 43 Sidney P Colowick, Nathan O.Kaplan - Methods in Ezymology, vol II, vol XIX, – McCollum-Pratt Institute, the Jonh Hopkins university, Baltimore, Maryland 44 Staley Zucker, David J Buttle, Martin J H Nicklin vaø Alan J Barrett The proteolytic activities of chymopapain, papain and papaya proteinase III Biochim Biophys Acta 828 (1985) 196-204 45 T.A.Valueva, L.I.Grygoryeva, Le Thi Phu, N.A Potapen, T Ye Kovalevich, Vo Hong Nhan, V.V Mosolov Interaction of a soybean trypsin inhibitor (kunitz) with cystein peptidase Biochem J vol 20, No 1994.162-168 46 Thomas M.P, Topham C.M., Kowlessur D., Mellor G.W., Thomas E.W., Whitford D., Brocklehurt K - Structure of chymopapain M the late-eluted chymopapain deduced by comparative modelling techniques and activecentre characteristics determined by pH-dependent kinetics of catalysis and reactions with time-dependent inhibitors: the Cys-25/His-159 ion-pair is insufficient for catalytic competence in both chymopapain M and papain Biochem J (1994) 300, 805-820 47 http://www.chem.uwimona.edu.jm:1104/lectures/papaya.html Prof Robert J Lancashire, The Department of Chemistry, University of the West Indies, Mona Campus, Kingston 7, Jamaica Papaya - pawpaw 48 http://www.siu.edu/~elb/leaflets/papaya.htm The medicinal properties of Papaya, Caraca papaya L Emma Dawson 49 http://www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Carica_papaya.html James A - Carica papaya L - Duke.1983 Handbook of Energy Crops 50 http://www.nass.usda.gov/hi/fruit/papaya.htm Hawaii Department of Agriculture – Báo cáo tháng 8-2005 tình hình sản xuất tiêu thụ đu đủ giới 51 http://www.raintree-health.co.uk Thông tin hình thái trái đu đủ 52 http://www.worthington-biochem.com/PCYP/default.html Các thông tin enzyme chymopapain HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 96 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 http://www.worthington-biochem.com/PAP/cat.html Các thông tin enzyme papain 54 http://www.arc.agric.za/institutes/itsc/main/papaya.htm Các giống đu đủ giới 55 http://www.fao.org/inpho/content/compend/text.htm Hình thái trái đu đủ giống đu đủ giới 56 http://www.cimsi.org.vn/ Thông tin Y dược Việt Nam – Vietnamese Medical Pharmaceutical Information - Website Viện thông tin thư viện Y học trung ương 57 http://www.ansci.cornell.edu/plants/medicinal/index.html Các thông tin sinh học đu đủ - Papaya factsheet 91004, Agricultural Biotechnology Support Project II (ABSPII), đề tài nghiên cứu trường đại học Cornell University, hỗ trợ United States Agency for International Development (USAID) 58 http://www.MDidea.com/ Refined Papain Series – thông tin giá loại chế phẩm enzyme papain 59 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ Enzyme Nomenclature database – tra cứu thông tin enzyme theo hệ thống quốc tế Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 97 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHỤ LỤC PHỤ LỤC Phụ lục Đồ thị : Đường chuẩn BSA bước sóng 595nm theo phương pháp Braford Đường chuẩn BSA y = 0.1449x - 0.0039 R = 0.9939 0.10 mg BSA 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG 0.20 0.40 A595 0.60 0.80 TRANG 98 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHỤ LỤC Phụ lục Điện di đồ chế phẩm papain peptidase [23,45] Trong Cột :Latex đông khô Việt Nam Cột :Chế phẩm papain Merck Cột : Latex tươi Việt Nam Cột :Enzyme peptidase latex khô Vạch _ Enzyme papain Vaïch 2,3,4 _ Enzyme chymopapain Vaïch _ Enzyme peptidase Điện di đồ latex tươi phân đoạn [42] Trong Cột 1,4,6 :Latex tươi thô Cột 2,3 :papain sau kết tinh Cột :papain sau tái kết tinh Vạch _ Enzyme papain Vaïch 2,3,4 _ Enzyme chymopapain Vaïch _ Enzyme peptidase HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 99 LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHỤ LỤC Phụ lục Một số trang thiết bị sử dụng Máy quang phổ UV-VIS Cột sắc kí-collector tự động Bộ điện di đứng Máy đông khô Máy ly tâm lạnh HVTH : NGUYỄN THỊ THU SANG TRANG 100 TÓM TẮT LÝ LỊCH LÝ LỊCH SƠ LƯC Họ Tên : NGUYỄN THỊ THU SANG Ngày sinh : 23 / 08 / 1978 Nơi sinh : Lâm Đồng Giới: nữ Địa thường trú : 43 Lam Sơn, Lộc Sơn, Bảo Lộc, Lâm Đồng QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 09/1996 – 01/2001 : Sinh viên Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, hệ quy, Khoa Công Nghệ Hóa Học Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM, 23/3/2001 : Tốt Nghiệp Đại Học loại giỏi 09/2003 – 2005 : Học viên cao học khóa 14, chuyên ngành Khoa Học Công Nghệ Thực Phẩm, trường Đại Học Bách Khoa Tp.HCM QUÁ TRÌNH CÔNG TÁC 04/2001-03/2003 : nhân viên phòng QC, công ty rượu thực phẩm WineFood Co., khu chế xuất Tân Thuận - Hồ Chí Minh, chuyên sản xuất rượu thực phẩm tinh chế cồn thực phẩm 6/2003 – : giảng viên hữu môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Khoa Học Ứng Dụng, trường ĐHBC Tôn Đức Thắng Hồ Chí Minh ... : KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG : • Tìm hiểu, nghiên cứu tổng quan, tài liệu đu đủ enzyme thành phần mủ trái đu đủ • Khảo sát. .. LVTS - KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ A–3 TÓM TẮT Mủ trái đu đủ nguồn thực vật chứa nhiều enzyme proteolitic Cho đến người ta nghiên cứu mủ đu đủ có enzyme. .. SĨ CBHD : TS LÊ THỊ PHÚ KHẢO SÁT ENZYME CHYMOPAPAIN VÀ CÁC ENZYME THÀNH PHẦN TRONG MỦ TRÁI ĐU ĐỦ PHẦN – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.3 THÀNH PHẦN DINH DƯỢNG TRÁI ĐU ĐỦ Trái đu đủ chứa nhiều dinh dưỡng: