Khóa luận tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh Enzyme protease cao trong thủy phân đậu tương

Vì thế hiện nay thủy phânprotein trong khô đậu tương bằng enzyme protease đang được nghiên cứu, sửdụng nhiều và hiệu quả tương đối cao.Mặt khác, protease là enzyme xúc tác thủy phân các

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này làtrung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã đượccảm ơn và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2017

Người cam đoan

Lê Thị Hợi

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS VũVăn Hạnh – Trưởng phòng – Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Côngnghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người Thầy đãđịnh hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, tạo điều kiện về vật tư, hóa chất,thiết bị cho nghiên cứu và chỉnh sửa luận văn để tôi hoàn thành bài khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến ThS Nguyễn Thị Thu Hằng thuộc bộ môn

Vi sinh - Hóa sinh đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, làm khóaluận cùng các thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp ViệtNam đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu giúp tôihoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN Nguyễn Danh Hưng đã trực tiếp hỗtrợ thí nghiệm, cùng tập thể cán bộ và anh chị trong Phòng Các chất chức năngsinh học, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trìnhlàm khóa luận

Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, tập thể lớp K58B –Công nghệ sinh học và tất cả bạn bè đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt quátrình thực hiên đề tài này

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp dothời gian và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót rấtmong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo tận tình của quý thầy, cô để đề tàikhóa luận hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Lê Thị Hợi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tìm hiểu chung về khô đậu tương 3

1.2 Một số chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đậu tương 3

1.2.1 Nấm 4

1.2.2 Vi khuẩn 4

1.3.2 Phân loại 6

1.3.3 Cơ chế thủy phân của protease 8

1.3.4 Ứng dụng của protease 9

1.4 Phương pháp lên men chìm và lên men bề mặt 10

1.4.1 Lên men chìm 10

1.4.2 Lên men bề mặt 11

1.5 Tình hình nghiên cứu về enzyme protease trong thủy phân đậu tương 11

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 12

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 12

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy 14

2.3.1 Vật liệu 14

iii

2.3.2 Hóa chất 14

2.3.3 Môi trường nuôi cấy 15

2.3.4 Trang thiết bị 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Phương pháp phân lập và giữ chủng 17

2.4.2 Phương pháp vi sinh 17

2.4.2.1 Hoạt hóa chủng 17

2.4.2.2 Phương pháp lên men chìm 17

2.4.3 Phương pháp quan sát hình thái 17

2.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng đo đường kính vòng phân giải casein 18

2.4.5 Phương pháp hóa sinh 18

2.4.5.1 Nguyên lý của phương pháp 19

2.4.5.2 Hóa chất 19

2.4.5.3 Chuẩn bị đường chuẩn 19

2.4.5.4 Phương pháp tiến hành 20

2.4.5.5 Tính kết quả 21

2.4.6 Phương pháp tách chiết dịch enzyme thô từ môi trường lên men xốp và định tính enzyme 22

2.4.7 Phương pháp tối ưu điều kiện lên men xốp 22

2.4.7.1 Tối ưu tỉ lệ nguyên liệu 22

2.4.7.2 Tối ưu độ ẩm cơ chất khô đậu tương 23

2.4.7.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy 24

2.2.7.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 25

2.4.7.5 Tối ưu thời gian lên men 26

2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh

protease từ chế phẩm 28

3.2 Tuyển chọn sơ bộ các chủng có hoạt tính protease 32

3.3 Tối ưu điều kiện sinh enzyme protease 36

3.3.1 Tối ưu tỉ lệ nguyên liệu 36

3.3.2 Tối ưu độ ẩm 38

3.3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy 39

3.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 41

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 42

3.4 Một số đặc điểm sinh học và khả năng kháng sinh của nấm sợi N11 44

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 46

4.1 Kết luận 46

4.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 56

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của khô đậu tương 3

Bảng 2.1 Công thức môi trường LB 15

Bảng 2.2 Công thức môi trường PDA 15

Bảng 2.3 Công thức môi trường định tính enzyme protease 15

Bảng 2.4 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 2.5 Xây dựng đường chuẩn tyrosine 19

Bảng 2.6 Phương pháp xác định hoạt độ protease 21

Bảng 2.7 Tỷ lệ nguyên liệu môi trường lên men rắn 23

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật phân lập 28

Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính protease các chủng nấm sợi phân lập 33

Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính protease các chủng vi khuẩn phân lập 33

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính của 9 chủng được chọn 35

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ khô đậu tương và tinh bột đến khả năng tổng hợp protease của chủng N11 37

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp protease của chủng nấm sợi N11 38

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến khả năng tổng hợp protease của chủng nấm sợi N11 40

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng tổng hợp protease của chủng nấm sợi N11 41

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tổng hợp protease của chủng nấm sợi N11 42

DANH MỤC HÌNH

vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khô đậu tương là loại nguyên liệu rất sẵn và rẻ, công dụng của nó lạihữu ích một cách trái ngược so với giá thành Trước đây người ta hay sử dụngacid hoặc H2SO4 để thủy phân protein trong khô đậu tương Nhưng kết quảcho thấy bằng cách này không tạo ra được nhiều sản phẩm mong muốn vàkhông đáp ứng được tiêu chuẩn an toàn thực phẩm Vì thế hiện nay thủy phânprotein trong khô đậu tương bằng enzyme protease đang được nghiên cứu, sửdụng nhiều và hiệu quả tương đối cao

Mặt khác, protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kếtpeptide trong phân tử protein, được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiềulĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp,công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng và chiếm khoảng60% thị trường enzyme Hiện nay trên thế giới, đa số các chế phẩm enzymeđược thu nhận từ vi sinh vật do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợpnhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ, đời sống và cónhiều ưu điểm vượt trội như chu kỳ phát triển 280 ngắn, môi trường nuôi cấy

rẻ, dễ điều khiển… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như làmột nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sảnphẩm được tạo ra nhiều hơn Vì vậy, hai phần ba protease ứng dụng trongcông nghiệp được sản xuất ra từ vi sinh vật Hiện nay, trên thế giới, các chếphẩm protease đã được thương mại hóa và được đưa vào ứng dụng một cáchrộng rãi Tuy vậy, trong thời gian gần đây, trên thế giới, nhiều nhà khoa họcvẫn tiếp tục tiến hành nghiên cứu thu nhận, tinh chế, xác định các tính chấtcủa chế phẩm sản xuất từ enzyme protease Ở Việt Nam cũng đã có một sốnghiên cứu về protease vi sinh vật, tuy nhiên chỉ mới dừng lại ở quy môphòng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng enzyme vẫn còn hạn chế

Nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật,cũng như mong muốn tạo ra chế phẩm sản xuất từ enzyme protease có hoạttính cao trong thủy phân đậu tương cơ chất tự nhiên sẵn có, tôi đã tiến hành

1

đề tài khóa luận: “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn

có khả năng sinh enzyme protease cao trong thủy phân đậu tương”.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1 Tìm hiểu chung về khô đậu tương

Khô đậu tương (có khi gọi là khô đậu) là sản phẩm phụ của ngành côngnghiệp ép dầu đậu nành, là một thành phần quan trọng trong thức ăn chănnuôi nhằm đáp ứng nhu cầu tăng cao đối với thức ăn protein cho động vậttrong nước và xuất khẩu Theo AAFCO (hiệp hội quản lý thức ăn chăn nuôiMỹ), thì loại thức ăn này thu được khi đã xay nhuyễn phần đậu đã tách, épdầu thông qua quá trình tinh chiết hoặc dùng dung môi hòa tan Khô đậutương có hàm lượng protein, lysin tổng số, lysin tiêu hóa, năng lượng cao vàhàm lượng chất xơ thấp là nguồn phế phụ phẩm cung cấp protein tốt nhất chogia súc, gia cầm Đặc biệt khô đậu tương là loại sản phẩm rất sẵn và rẻ, ởnước ta mỗi năm lượng KĐT thải ra từ các nhà máy là rất lớn phục vụ choviệc sản xuất thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Chế phẩm thức ăn chăn nuôi từKĐT được xem như là loại thức ăn cung cấp năng lượng và bổ sung đạm chogia súc, gia cầm, lượng tiêu thụ KĐT ước tính khoảng 3.8 triệu tấn (2013) và4.05 triệu tấn (2014) và tăng dần đều lên hàng năm …[13]

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của khô đậu tương

1.2 Một số chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đậu tương

Các vi sinh vật thường được sử dụng trong lên men đậu tương như: các

loại nấm mốc: Aspergillus oryaze, Mucor, Rhizopus, Oligosporus Nấm men:

Saccharomyces cerevisiae Các loại vi khuẩn như: Streptococcus thermophiles, Bacillus subtilis….

1.2.1 Nấm

3

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease

được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus

oryzae, A.tericola, A fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum… Các

loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả 3 loại protease: acid, kiềm vàtrung tính Nấm mốc đen tỏng hợp chủ yếu các loại protease acid, có khảnăng thủy phân protein ở pH 2,5- 3 [23]

Một số nấm mốc khác như: A cadidatus, P cameberti, P roqueforti…

cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trongsản xuất forrmat [17]

Trong thực tế A oryzae có khả năng tiết ra môi trường các enzymethủy phân như cellulase, pectinase… khi sống trên môi trường cơ chất khôđậu tương và được ứng dụng rất rộng rãi trong sản xuất chế biến thực phẩm[22] [12]

1.2.2 Vi khuẩn

Vi khuẩn (bacteria) là những sinh vật đơn bào, nhỏ bé đến mức chỉ có

thể thấy chúng được dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử Badạng chủ yếu ở vi khuẩn: trực khuẩn, cầu khuẩn, xoắn khuẩn [12]

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loạiendopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn sinh ra cả hai loại trên, do

đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năngphân hủy tới 80% các liên kết peptid trong phân từ protein [9]

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống

thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease

mạnh nhất Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ởvùng pH trung tính và kiềm yếu [19]

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủyphân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease đông vật và tăng giá trịdinh dưỡng Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino

acid ưa béo và thơm Chúng được sinh ra nhiều bởi B mesentericus, B.

thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium [6].

Protease của bacillus ưa kiềm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân ra từ

20.000-30.000, ổn định ở trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng

pH rộng 7-12 [29]

1.3 Enzyme protease

1.3.1 Giới thiệu chung

Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kếtpeptide (-O–NH-) trong phân tử protein và các polypeptide Sản phẩm củaquá trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptidechuỗi ngắn Nhiều protease còn có thể xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kếtester, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin Phản ứng xảy ratheo sơ đồ sau:

5

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân dưới xúc tác của enzyme protease

1.3.2 Phân loại

 Dựa vào cơ chế xúc tác [27]

Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm:

- Nhóm 1: Exopeptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cách đầumạch Thuỷ phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptidase Nếu xúc tác ở đầu

có gốc amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase

- Nhóm 2: Endopeptidase còn gọi là proteinase hay enzyme phân cắt nộimạch Xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptide bên trong chuỗipolypeptidase

Hình 1.2 Cơ chế xúc tác của enzyme protease

Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động [28]

Dựa vào cấu trúc nhóm chức ở trung tâm hoạt động, endopeptidaseđược chia thành 4 nhóm:

- Serin – proteinase (EC 3.4.21): là những protease có nhóm (-OH)của serine trong trung tâm hoạt động ở vùng kiềm và có tính đặc hiệu tươngđối rộng

- Cystein – proteinase (EC 3.4.22): là các protein có nhóm thiol (-SH)của acid amin cysteine ở trung tâm hoạt động Cysteine protease bao gồm cácprotease thực vật như papain, bromelin, một vài protease kí sinh trùng Cáccyteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơchất rộng

- Aspartic protease (EC 3.4.22): hầu hết các aspartic protease thuộcnhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin,chymosin, cathepsin, renin Các aspartic protease có các nhóm carboxyl trongtrung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

- Metallo protease (EC 3.4.23): metallo protease là nhóm proteasetrong cấu tạo có kim loại được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm sợi, sinh vật bậc caohơn Các metallo protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạtđộng giảm mạnh dưới tác động của EDTA

Dựa vào pH hoạt động [24]

Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau màenzyme protease được chia làm 3 loại:

- Protease acid: pH ở trong khoảng 2÷5 Loại protease này thường

được thu nhận từ các loại NS đen như: A niger, A awmori, A saitoi

- Protease trung tính: có pH trong khoảng hẹp, từ 6÷7,5, không bền

với nhiệt độ cao Thu nhận chủ yếu từ các loại NS vàng như: A oryzae, A.

flavus, A fumigatus, A tericola.

- Protease kiềm tính: có pH ở trong khoảng 8÷11 thường được tổnghợp nhiều bởi nấm men và VK Những protease kiềm tính là nhóm được quantâm khá nhiều trong những năm gần đây vì có thể sử dụng chúng như chấtphụ gia trong việc giặt tẩy, trong quá trình thuộc da, xử lý chất thải môitrường

7

Dựa vào tính đặc hiệu của chúng với cơ chất tổng hợp hoặc đối

với chuỗi β- insulin bị oxy hóa [10]

Năm 1975, Morihara đã phân loại các protease được chia ra thành bốnnhóm lớn, dựa vào tính đặc hiệu của chúng đối với cơ chất tổng hợp hoặc đốivới chuỗi β – Insulin đã bị oxy hóa

- Nhóm I - Serin proteinase: Tính đặc hiệu đối với các gốc amino acid

ở về phía nhóm –CO2 của liên kết peptide hoặc gọi là carbonxyendopeptidase

- Nhóm II - Cystein proteinase: Giống như cách phân loại theo đặcđiểm có cấu tạo của trung tâm hoạt động

- Nhóm III - Metallo proteinase: Có đặc hiệu đối với các gốc aminoacid về phía nhóm –NH– của liên kết peptide, được gọi làaminoendopeptidase

- Nhóm IV - Aspartic proteinase: Có tính đặc hiệu đối với các nguồngốc amino acid ở cả hai phía của liên kết peptide

1.3.3 Cơ chế thủy phân của protease

Hình 1.1 Mô hình enzyme protease thủy phân phân tử protein

Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kếtpeptide (-O–NH-) trong phân tử protein và các polypeptide Sản phẩm củaquá trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các peptide, các polypeptidechuỗi ngắn

 Công nghiệp thực phẩm [26]

- Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomatnhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng

- Trong sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộnbột, giảm độ nhớt của bột nhào do gluten gây ra, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột,tạo độ xốp và nở tốt hơn

- Trong công nghiệp chế biến thịt, đồ hộp, sản xuất dịch đạm thủy phân

từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da, …

- Trong chế biến thuỷ sản, sản xuất nước mắm,…

- Bên cạnh đó, trong công nghiệp thực phẩm, protease được sử dụng đểlàm trong bia và nước hoa quả [1]

 Công nghiệp nhẹ[16]

- Protease được sử dụng để sản xuất chất tẩy rửa, nước lau kính, kemđánh răng và đặc biệt là trong sản xuất bột giặt, Một số protease kiềmthương mại được sử dụng chất tẩy bột giặt như Alcalase, Everlase, Esperrase

do hãng Novo sản xuất

- Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da … Một sốsản phẩm protease dùng trong công nghệ thuộc da do công ty Novo sản xuấtnhư Greasex, NovoCor…

- Trong công nghiệp dệt và sản xuất tơ tằm, protease được sử dụng đểlàm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo

- Ngoài ra, protease còn được ứng dụng trong sản xuất mĩ phẩm vàhương phẩm [10]

9

 Nông nghiệp [10, 17]

Protease được sử dụng để xử lý nhằm tận dụng các phế liệu giàuprotein làm thức ăn cho động vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ sốtiêu hóa thức ăn Nhiều loại protease của vi nấm cũng có thể bổsung vào khẩu phần ăn trong chăn nuôi gia súc, gia cầmnhằm tăng nhanh quá trình tiêu hóa thức ăn, tăng tốc độtăngtrọng của động vật, nhất là động vật non Ngoài ra, protease cònđược sử dụng để thủy phân trùn quế thành dịch acid amin làm thức ăn cho ấutrùng tôm [18]

Y học [11]

Chế phẩm protease được sử dụng để sản xuất các môi trường dinhdưỡng hỗn hợp giàu protein và acid amin dùng trong nuôi cấy VK và cácVSV khác Người ta còn dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chếcác huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch) Một sốprotease như trypsin, α–chymotrypsin dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh kémtiêu hóa, bệnh nghẽn mạch, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấp,bệnh thiếu enzyme bẩm sinh, GS TSKH Phan Thị Trân Châu đã kết hợpcùng với viện Quân Y 108 nghiên cứu sử dụng protease có tên gọi prozimabo

để điều trị phỏng [3] Ngoài ra, protease còn được sử dụng trong các lĩnh vựcnhư xử lý phim X quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc (Fujiwara et al.,1991; Ishikawa et al., 1993), xử lý chất thải từ động vật giáp xác (Yang et al.,2000), xử lý rác thải trong các lò mổ gia cầm (Dalev, 1994) [7]

1.4 Phương pháp lên men chìm và lên men bề mặt

1.4.1 Lên men chìm

Vi sinh vật phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn Cacbon

và nguồn Nito Để tạo điều kiện cho VSV sinh trưởng tốt, người ta thường bổsung vào môi trường một số chất thích hợp như: bột đậu tương, tinh bột, cámmì…

Các thiết bị lên men dễ cơ khí và tự động hóa.

Song phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểmsau [8]:

- Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối

- Trong quá trình nuôi cấy phải khuấy liên tục

- Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ

1.4.2 Lên men bề mặt

Là phương pháp nhằm tạo điều kiện cho VSV phát triển trên bề mặtmôi trường Nguyên liệu chính là đậu tương, cám gạo… môi trường được bổsung thêm một số chất dinh dưỡng khác, rồi tiến hành trộn đều với nước saocho độ ẩm khoảng 40-90%, tùy chủng giống Khử trùng ở 1150C trong 15-20phút, để nguội rồi cho bào tử VSV vào [4]

Ưu điểm của phương pháp [8]:

- Độ thoáng khí cao, dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản khôngđòi hỏi quá cao về trang thiết bị

- Môi trường không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm visinh vật lạ cũng dễ dàng xử lý

- Chế phẩm dễ sấy khô, bảo quản và dễ vận chuyển

Nhược điểm của phương pháp [8]

- Không thể kiểm soát hay điều chỉnh môi trường một cách chính xáctheo ý muốn

- Không thể áp dụng có hiệu quả các phương pháp tối ưu

- Khó tinh sạch

1.5 Tình hình nghiên cứu về enzyme protease trong thủy phân đậu tương

Các nghiên cứu đều theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chếphẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giũa cấu trúc

và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng của enzyme trong thựctế

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Vũ Ngọc Bội (2004) nghiên cứu protease của chủng Bacillus sp CPE thu nhận từ B subtilis S5 có hoạt tính 33U/g, để chế biến nước mắm[7] Âu Thị Bích Phượng (2006), protease từ Bacillus sp đạt 1,7 U/g, Lê Văn Việt (2007) protease từ Bacillus sp đạt 30,9 (U/g) [17] Đỗ Trần Ngoan (2007) nghiên cứu protease kiềm tính từ B subtilis [2] Trần Ngọc Hùng (2010) nghiên cứu protease 14 (U/g) từ B.subtilis để sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm Trần Thị Hồng Nghi và cs (2009), nghiên cứu protease từ B subtilis

để thủy phân phụ phẩm cá tra[18]

Từ Acinetobacter sp QN6 phân lập từ biển sinh tổng hợp protease cao

Quyền Đình Thi, và cs (2007)[12]

Lê Thị Bích Phượng và cs (2012) đã nghiên cứu phân lập, tuyển chọn

một số chủng Bacillus sinh tổng hợp protease [7].

Trần Thanh Trúc và cs (2015) đã xác đinh được điều kiện nuôi cấy tối

ưu Aspergillus niger sinh tổng hợp protease cao [16].

Lê Văn Việt Mẫn và cs (2006) đã khảo sát một số tính chất của chế

phẩm protease từ A oryzae để sản xuất nước mắm, rút ngắn thời gian thủy

phân protein[14]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme côngnghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là cácenzyme thủy phân (75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất

sử dụng trong công nghiệp (60%)

Các tác giả Devi MK và cs (2008) đã xác định đặc điểm protease của

Aspergillus niger; Hajji M và cs (2007) khảo sát protease của A clavatus(2007); Agarwal D, và cs (Năm 2008) nghiên cứu khả năng sinh

protease của Penicillium sp.[19, 21, 26].

Nhiều công trình nghiên cứu về protease từ Bacillus như: B cereus (Sirecka

et al., 1998), B sphaericus (Singh et al., 1999), B stearothermophilus (Kim

13

et al, 2002), B subtilis (Yang.et al., 2000), B mojavensis (Beg và Gypta et al., 2003), B lichieniformis (Mancrzinger et al., 2003, Sareen et al., 2005)[2, 32] Protease từ A.oryzae trong lên men rắn ứng Jarun Chutmanop [20] Jin

Fujita và cs.(2003), Morten Carlsen (1995, 2003), Ruohang Wang và cs

(2003) đã nghiên cứu sản xuất protease từ A oryzae [31] Guowan Su và cs (2010) thủy phân protein đậu tương bởi protease từ A oryzae, [33].

CHƯƠNG 1 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn được chủng nấm sợi và vi khuẩn có hoạt tính

protease cao từ đất trồng đậu tương

- Tối ưu điều kiện lên men xốp các chủng nấm sợi và vi khuẩn tuyển

chọn sử dụng cơ chất là khô đậu tương (KĐT) để sản xuất enzyme protease

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập các chủng nấm sợi và vi khuẩn từ mẫu đất kí hiệu là DOM(QB) và mẫu đất kí hiệu EM (QO) Các mẫu đất được lấy tại vùng trồng đậutương ngoại thành Hà Nội)

- Tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có hoạt tính protease vàchọn ra chủng có hoạt tính protease cao nhất

- Tối ưu các điều kiện lên men xốp cơ chất khô đậu tương với chủngnấm sợi và vi khuẩn được tuyển chọn nhằm thu được hoạt tính protease cao

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học chủng chủngnấm sợi và vi khuẩn tuyển chọn

2.3 Vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy

2.3.1 Vật liệu

- Các chủng giống được phân từ mẫu đất kí hiệu là DOM (QB) và EM

(QO), sau đó được bảo quản tại phòng Các chất chức năng sinh học, ViệnCông nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Cơ chất: Khô đậu tương

2.3.2 Hóa chất

- Hóa chất được dùng để chuẩn bị môi trường như: cao nấm men,

peptone, glucose, casein, khoai tây, các loại muối khoáng, thuốc thử Ciocalteu, các hóa chất dùng trong phản ứng sinh hóa có độ tinh khiết ở mứcphân tích được cung cấp bởi các Công ty đại diện hóa chất của Đức, Mỹ,Anh, Trung Quốc… tại Việt Nam

Folin-15

2.3.3 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường Luria-Bertani (LB)

Bảng 2.2 Công thức môi trường LB

- Môi trường (Potatose Dextrose Agar: PDA)

Bảng 2.3 Công thức môi trường PDA

- Môi trường PDB: là môi trường PDA bỏ đi thành phần agar

- Môi trường định tính enzyme protease bằng phương pháp khuếch tán đĩathạch

Bảng 2.4 Công thức môi trường định tính enzyme protease

Thành phần Khối lượng (%)

- Dụng cụ: đĩa petri, ống falcon, ống eppendorf, đầu tip, pipet, đèn cồn…

- Thiết bị: Các thiết bị sử dụng trong khóa luận này thuộc Phòng Cácchất Chức năng sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm khoa học

và công nghệ Việt Nam Dưới đây là bảng liệt kê chi tiết:

Bảng 2.5 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

7 Tủ lạnh 40C, -200C (Pinimax), -800C (MDF-192) Nhật Bản

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân lập và giữ chủng

- Cân 0,1 g đất đã xử lý cho vào 900 µl nước cất khử trùng, dùng máy

vortex hòa tan

- Pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-3-10-7 là cácnồng độ thích hợp để phân lập

- Hút 50µl dịch pha loãng ở các nồng độ trên nhỏ lên đĩa Petri chứa môi

trường phân lập Dùng que gạt trang đều dịch trên bề mặt thạch

- Nuôi trong tủ ấm 370C khoảng 1 ngày sau đó cấy ria các khuẩn lạc đểtạo các dòng thuần

- Giữ chủng trong glycerol 40% [15].

17

2.4.2 Phương pháp vi sinh

2.4.2.1 Hoạt hóa chủng

- Chủng nấm sợi được hoạt hóa lại trên môi trường PDA, sau đó nuôi ở

điều kiện nhiệt độ 300C±20C trong 2-3 ngày

- Chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường LB, sau đó nuôi ở

nhiệt độ 370C trong 24h

- Sau đó bảo quản các chủng này trong tủ -40C

2.4.2.2 Phương pháp lên men chìm

- Chủng nấm sợi sau khi được hoạt hóa, được nuôi lỏng trong môi

trường PDB ở điều kiện nhiệt độ 300C±20C, lắc 200rpm/phút, thời gian 3ngày sau đó thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính protease

- Chủng vi khuẩn sau khi đã hoạt hóa, được nuôi lỏng trong môi trường

LB ở điều kiện nhiệt độ 370C, lắc 200rpm/phút, thời gian 2 ngày sau đó thudịch enzyme thô để xác định hoạt tính protease

2.4.3 Phương pháp quan sát hình thái

Cấy chủng nấm mốc lên môi trường PDA, để ở nhiệt độ phòng trong 48giờ, chủng vi khuẩn trên môi trường LB để trong tủ ấm 370C trong 24h Sau

đó quan sát và ghi nhận hình thái khuẩn lạc nấm mốc trên đĩa như: màu sắc,hình dạng, kích thước, đặc điểm bề mặt khuẩn lạc, đặc điểm phát triển trênmôi trường rắn (lồi, lõm, dẹt…) [12]

2.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng đo đường kính vòng phân giải casein

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng giữa enzyme protease và cơ chấtcasein trên môi trường casein - agar khi cho protease tiếp xúc với casein ởnhiệt độ thích hợp xảy ra phản ứng thủy phân tạo thành vòng tròn thủy phântrong suốt Khả năng sinh enzyme protease được đánh giá dựa trên sự thủyphân casein thông qua đường kính của vòng phân thủy phân casein với sựnhận biết dựa vào chất chỉ thị Coomassie Brillant Blue R - 250 [30] [25]

Dùng pipet hút 50µl dịch chiết enzyme được nhỏ vào giếng đục trên đĩathạch với 2% agar vầ 0.2% casein (cơ chất) trong đệm phosphate 0.1M, pH7.

Đĩa thạch được nhỏ dịch chiết được ủ ở 4 0C trong 4h để enzymekhuếch tán đều trên đĩa thạch Sau đó chuyển ra ủ trong tủ ấm 370C trong 24h

Kiểm tra kết quả: Nhuộm bởi chất chỉ thị màu Coomassie BrilliantBlue R-250, pha với lugol (1:3) pha trong dung dịch methanol, acid acetic,nước cất theo tỷ lệ 3:1:6 trong 1 h

Cách đánh giá khả năng tạo enzyme:

Dùng thước đo đường kính vòng phân giải: D là đường kính vòng phângiải, d là đường kính của khoan lỗ thạch, ∆D là đường kính vòng phân giảicủa chủng VSV sau khi trừ đi đường kính của khoan lỗ thạch

∆D > 25mm: hoạt tính enzyme rất mạnh

∆D > 20mm: hoạt tính enzyme mạnh

∆D > 10mm: hoạt tính enzyme trung bình

∆D < 10mm: hoạt tính enzyme yếu

2.4.5 Phương pháp hóa sinh

Phương pháp Anson cải tiến định tính enzyme protease [7] [31] [17]

2.4.5.1 Nguyên lý của phương pháp

Casein bị phân giải bởi protease, sau đó kết tủa protease

dư thừa bằng TCA Sản phẩm tạo thành là các peptid ngắnhay các acid amin, trong các acid amin thì tyrosine chiếm đa

số Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin,

từ đó xác định hoạt độ enzyme

B.Dibasic sodium phosphate gồm:

- Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml

- Dung dich Na2CO3 0,5M: hòa tan 5.3 g Na2CO3 trong nước cho đủ

100 ml

- Thuốc thử Folin-Ciocalteu (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4)

- Dung dịch Tyrosin chuẩn: 10mg/100ml (55.2 micromol)

2.4.5.3 Chuẩn bị đường chuẩn

Bảng 2.6 Xây dựng đường chuẩn tyrosine

Lắc mạnh, ủ 370C trong 20 phút, đo OD ở bước sóng 660nm

- Ống số 1 là ống blank, các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN) Vẽđường chuẩn tyrosine tương quan tương quan giữa lượng tyrosine (µM) vàΔOD (ΔOD = ODOD (ΔOD (ΔOD = ODOD = ODTN – ODBlank)

2.4.5.4 Phương pháp tiến hành

Chiết mẫu

- Mẫu cân chính xác 1g (đối với mẫu rắn) hoặc 1 ml (đối với mẫulỏng) cho vào becher, định mức vừa đủ 10ml bằng nước cất đem lắc trên máylắc trong vòng 15 phút Đem ly tâm lạnh với 10000 vòng/ phút trong 4 phút,thu dịch, bỏ bã (đối với mẫu lỏng không cần ly tâm, chỉ lắc để đồng nhấtmẫu)

Tiến hành

21

Bảng 2.7 Phương pháp xác định hoạt độ protease

Giữ ở 37 oC trong 30 phút sau đó đo OD660nm

- Tính ΔOD (ΔOD = ODOD = ODTest – ODBlank, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được

µM tyrosine

2.4.5.5 Tính kết quả

- Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tốithiểu trong điều kiện thí nghiệm (37oC, pH 6 …) thủy phân casein trong mộtphút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folincho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1 µM tyrosine trongđường chuẩn

Ho ´a t tính protease= X K V

t v

Trong đó:

V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống test hoặc ống blank (ml)

v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t: thời gian thủy phân (phút)

K: độ pha loãng enzyme

X: lượng µM tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

Hoạt tính enzym: (Unit/g, Unit/ ml)

2.4.6 Phương pháp tách chiết dịch enzyme thô từ môi trường lên men xốp

và định tính enzyme.

Nguyên tắc: dựa trên khả năng hòa tan trong nước của enzyme, dùngnước cất vô trùng hòa tan tạo dịch enzyme thôi Sau khi lên men trong môitrường lên men xốp sinh enzyme thô Tiến hành thu dịch enzyme thô để đánhgiá khả năng sinh tổng hợp enzyme protease

Quá trình thu nhận enzyme thô:

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình thu nhận enzyme thô

Chú thích: Dịch nổi là dịch enzyme thô được sử dụng để xác định hoạt tính

protease

2.4.7 Phương pháp tối ưu điều kiện lên men xốp

2.4.7.1 Tối ưu tỉ lệ nguyên liệu

Thí nghiệm nhằm mục đích xác định tỷ lệ nguyên liệu của khô đậutương và tinh bột để thu nhận được hoạt tính enzyme protease cao nhất vớicác điều kiện nuôi cấy như sau: khối lượng cơ chất lên men trong mỗi bìnhtam giác lên men là 15g, nhiệt độ 300C±20C lượng giống cho vào môi trườnglên men là 4%, độ ẩm cơ chất sau khi lên men là 50%, độ dày môi trường2,5cm Thời gian lên men xốp là 3 ngày

23

Bảng 2.8 Tỷ lệ nguyên liệu môi trường lên men rắn

Khô đậu tương (%) Tinh bột (%)

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu tỉ lệ nguyên liệu KĐT/TB

2.4.7.2 Tối ưu độ ẩm cơ chất khô đậu tương

Tiến hành tối ưu độ ẩm cơ chất KĐT trong môi trường lên men xốp.Khô đậu tương có độ ẩm cơ chất sau khi lên men từ 40-60% Lên men xốptrong 3 ngày ở 300C với các điều kiện lên men như ở mục 2.4.7.1 Tiến hànhxác định hoạt tính protease Tìm ra độ ẩm cơ chất thích hợp

Sơ đồ thí nghiệm:

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu độ ẩm cơ chất khô đậu tương

2.4.7.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy

Để nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào đến khả năng sinhtổng hợp enzyme protease của chủng VSV, tôi tiến hành cấy vào với lượnggiống cấy khác nhau lần lượt là 2%, 4%, 6%, 8%, 10% hỗn dịch bào tử /15g

cơ chất Điều kiện lên men giống như ở mục 2.4.7.1 Tiến hành thu dịchenzyme thô để xác định hoạt tính enzyme Tìm ra tỷ lệ giống thích hợp

Sơ đồ thí nghiệm

25Xác định độ ẩm cơ chất thích hợp

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu tỉ lệ giống cấy

2.2.7.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổnghợp enzyme protease của chủng VSV, tôi tiến hành lên men trong môi trườnglên men xốp ở các điều kiện nhiệt độ lần lượt là 250C, 300C, 350C Điều kiệnlên men giống như ở mục 2.4.7.1 Tiến hành thu dịch enzyme thô để xác địnhhoạt tính enzyme.Tìm ra nhiệt độ nuôi cây thích hợp

Sơ đồ thí nghiệm: