Khóa luận tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh Enzyme protease cao trong thủy phân đậu tương

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khoá luận trung thực chưa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khoá luận cảm ơn thơng tin trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2017 Người cam đoan Lê Thị Hợi i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Vũ Văn Hạnh – Trưởng phòng – Phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người Thầy định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, tạo điều kiện vật tư, hóa chất, thiết bị cho nghiên cứu chỉnh sửa luận văn để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến ThS Nguyễn Thị Thu Hằng thuộc môn Vi sinh - Hóa sinh tận tình hướng dẫn tơi q trình học tập, làm khóa luận thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Việt Nam nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức q báu giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn CN Nguyễn Danh Hưng trực tiếp hỡ trợ thí nghiệm, tập thể cán anh chị Phịng Các chất chức sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ tơi tận tình suốt q trình làm khóa luận Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, tập thể lớp K58B – Công nghệ sinh học tất bạn bè giúp đỡ động viên suốt trình thực hiên đề tài Trong trình thực hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp thời gian kiến thức hạn chế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót mong nhận đóng góp ý kiến, bảo tận tình q thầy, để đề tài khóa luận hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2016 Sinh viên Lê Thị Hợi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1 Tìm hiểu chung khô đậu tương 1.2 Một số chủng vi sinh vật sử dụng lên men đậu tương .3 1.2.1 Nấm 1.2.2 Vi khuẩn .4 1.3.2 Phân loại 1.3.3 Cơ chế thủy phân của protease 1.3.4 Ứng dụng của protease 1.4 Phương pháp lên men chìm lên men bề mặt 10 1.4.1 Lên men chìm 10 1.4.2 Lên men bề mặt 11 1.5 Tình hình nghiên cứu enzyme protease thủy phân đậu tương 11 1.5.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 12 1.5.2 Tình hình nghiên cứu giới 12 CHƯƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Vật liệu, hóa chất, mơi trường nuôi cấy .14 2.3.1 Vật liệu .14 iii 2.3.2 Hóa chất 14 2.3.3 Môi trường nuôi cấy 15 2.3.4 Trang thiết bị 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Phương pháp phân lập và giữ chủng 17 2.4.2 Phương pháp vi sinh 17 2.4.2.1 Hoạt hóa chủng 17 2.4.2.2 Phương pháp lên men chìm 17 2.4.3 Phương pháp quan sát hình thái .17 2.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính protease đo đường kính vịng phân giải casein 18 2.4.5 Phương pháp hóa sinh .18 2.4.5.1 Nguyên lý của phương pháp 19 2.4.5.2 Hóa chất .19 2.4.5.3 Chuẩn bị đường chuẩn 19 2.4.5.4 Phương pháp tiến hành 20 2.4.5.5 Tính kết 21 2.4.6 Phương pháp tách chiết dịch enzyme thô từ môi trường lên men xốp và định tính enzyme 22 2.4.7 Phương pháp tối ưu điều kiện lên men xốp .22 2.4.7.1 Tối ưu tỉ lệ nguyên liệu 22 2.4.7.2 Tối ưu độ ẩm chất khô đậu tương 23 2.4.7.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy 24 2.2.7.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 25 2.4.7.5 Tối ưu thời gian lên men .26 2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu .27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 iv 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi vi khuẩn có khả sinh protease từ chế phẩm 28 3.2 Tuyển chọn sơ chủng có hoạt tính protease 32 3.3 Tối ưu điều kiện sinh enzyme protease 36 3.3.1 Tối ưu tỉ lệ nguyên liệu 36 3.3.2 Tối ưu độ ẩm 38 3.3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy 39 3.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 41 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 42 3.4 Một số đặc điểm sinh học khả kháng sinh nấm sợi N11 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 46 4.1 Kết luận 46 4.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 56 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng khô đậu tương .3 Bảng 2.1 Công thức môi trường LB 15 Bảng 2.2 Công thức môi trường PDA 15 Bảng 2.3 Cơng thức mơi trường định tính enzyme protease 15 Bảng 2.4 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.5 Xây dựng đường chuẩn tyrosine .19 Bảng 2.6 Phương pháp xác định hoạt độ protease 21 Bảng 2.7 Tỷ lệ nguyên liệu môi trường lên men rắn 23 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật phân lập 28 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính protease chủng nấm sợi phân lập .33 Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính protease chủng vi khuẩn phân lập 33 Bảng 3.4 Kết khảo sát hoạt tính chủng chọn 35 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tỉ lệ khô đậu tương tinh bột đến khả tổng hợp protease chủng N11 37 Bảng 3.6 Ảnh hưởng độ ẩm đến khả tổng hợp protease chủng nấm sợi N11 38 Bảng 3.7 Ảnh hưởng tỉ lệ giống cấy đến khả tổng hợp protease chủng nấm sợi N11 40 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả tổng hợp protease chủng nấm sợi N11 41 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả tổng hợp protease chủng nấm sợi N11 42 vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VSV Vi sinh vật CT1 Cơng thức thí nghiệm CT2 Cơng thức thí nghiệm CT3 Cơng thức thí nghiệm CT4 Cơng thức thí nghiệm CT5 Cơng thức thí nghiệm CT6 Cơng thức thí nghiệm VK Vi kh̉n NS Nấm sợi KĐT Khô đậu tương QO Quốc oai TB Tinh bột viii ĐẶT VẤN ĐỀ Khô đậu tương loại ngun liệu sẵn rẻ, cơng dụng lại hữu ích cách trái ngược so với giá thành Trước người ta hay sử dụng acid hoặc H2SO4 để thủy phân protein khô đậu tương Nhưng kết cho thấy cách không tạo nhiều sản phẩm mong muốn không đáp ứng tiêu ch̉n an tồn thực phẩm Vì thủy phân protein khô đậu tương enzyme protease nghiên cứu, sử dụng nhiều hiệu tương đối cao Mặt khác, protease enzyme xúc tác thủy phân mối liên kết peptide phân tử protein, ứng dụng cách rộng rãi nhiều lĩnh vực khác công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, cơng nghiệp sản xuất xà phịng chiếm khoảng 60% thị trường enzyme Hiện giới, đa số chế phẩm enzyme thu nhận từ vi sinh vật vi sinh vật nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất enzyme quy mơ lớn dùng cơng nghệ, đời sống có nhiều ưu điểm vượt trội chu kỳ phát triển 280 ngắn, môi trường nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Vì vậy, hai phần ba protease ứng dụng công nghiệp sản xuất từ vi sinh vật Hiện nay, giới, chế phẩm protease thương mại hóa đưa vào ứng dụng cách rộng rãi Tuy vậy, thời gian gần đây, giới, nhiều nhà khoa học tiếp tục tiến hành nghiên cứu thu nhận, tinh chế, xác định tính chất chế phẩm sản xuất từ enzyme protease Ở Việt Nam có số nghiên cứu protease vi sinh vật, nhiên dừng lại quy mơ phịng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng enzyme cịn hạn chế Nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật, mong muốn tạo chế phẩm sản xuất từ enzyme protease có hoạt tính cao thủy phân đậu tương chất tự nhiên sẵn có, tơi tiến hành đề tài khóa luận: “Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi vi khuẩn có khả sinh enzyme protease cao thủy phân đậu tương”