Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh enzyme β galactosidase ưa lạnh, bước đầu nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ HUYÊN TUYỂN CHỌN, ĐỊNH TÊN VI KHUẨN SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE ƯA LẠNH, BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME TRONG SẢN XUẤT SỮA TƯƠI TIỆT TRÙNG KHƠNG LACTOSE Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Mã số: 54 01 01 Người hướng dẫn: TS Nguyễn Tiến Thành PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình khoa học tơi nhóm nghiên cứu, số liệu kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Huyên i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nỗ lực học hỏi thân, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Tiến Thành, PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh KS Nguyễn Thị Hồng tận tình bảo, hướng dẫn chuyên môn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, q Thầy/Cơ Bộ mơn Hóa sinh - Cơng nghệ sinh học thực phẩm, Phịng Thí nghiệm Trung tâm khoa học công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Thực phẩm Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu, thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thành viên tham gia nhóm nghiên cứu cộng tác, chia sẻ kiến thức, tìm kiếm phương pháp, tiến hành thí nghiệm tơi suốt thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi, động viên, khuyến khích giúp tơi hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Huyên ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt ký hiệu v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan sữa tươi 2.1.1 Sữa tươi 2.1.2 Tình hình sản xuất 2.1.3 Tình hình tiêu thụ 2.2 Một số ứng dụng enzyme công nghệ sản xuất sữa 2.2.1 Ứng dụng enzyme bảo quản sữa 2.2.2 Ứng dụng enzyme chế biến sữa 10 2.3 Tổng quan β-galactosidase 11 2.3.1 β-galactosidase 11 2.3.2 Nguồn thu nhận 12 2.3.3 Vai trò β-galactosidase 13 2.3.4 Tình hình nghiên cứu β-galactosidase 14 Phần Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 16 3.1 Vật liệu 16 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 3.1.2 Mơi trường ni cấy, thí nghiệm 17 3.1.3 Thiết bị dụng cụ 18 iii 3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 20 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Tuyển chọn vi khuẩn lactic, Bacillus sinh β-galactosidase 20 3.4.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng thời gıan nuôi cấy đến sự sinh trưởng khả sinh tổng hợp β-galactosidase 23 3.4.3 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao nhiệt độ thấp 23 3.4.4 Phương pháp tinh sơ β-galactosidase 24 3.4.5 Phương pháp xác định đặc tính enzyme sau tinh sơ 26 3.4.6 Định danh vi khuẩn có khả sinh β-galactosidase ưa lạnh 27 3.4.7 Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng khơng lactose sử dụng enzyme β-galactose ưa lạnh 28 Phần Kết thảo luận 29 4.1 Tuyển chọn vi khuẩn lactic, Bacillus sinh β-galactosidase 29 4.1.1 Kết xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase phương pháp Test X-Gal 29 4.1.2 Hoạt độ β-galactosidase vi khuẩn lactic Bacillus 30 4.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng khả sinh tổng hợp β-galactosidase nội bào hai chủng SC3 SC4 31 4.3 Tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao nhiệt độ thấp 33 4.4 Tinh sơ β-galactosidase 34 4.5 Đặc tính β-galactosidase từ chủng SC3 sau tinh sơ 35 4.5.1 Độ bền β-galactosidase 4oC 35 4.5.2 Khả phân giải lactose sữa β-galactosidase 4ºC 36 4.6 Định danh chủng SC3 phương pháp xác định trình tự gen 16 rDNA 38 4.7 Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose 39 Phần Kết luận đề nghị 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 Tài liệu tham khảo 43 Phụ lục 48 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Chữ viết tắt Chữ tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Abs420nm Absorbance 420nm Độ hấp thụ bước sóng 420nm Abs595nm Absorbance 595nm Độ hấp thụ bước sóng 595nm BSA Bovine serum albumin cs Cộng EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid IPTG Isopropyl thiogalactopyranoside NA Nutrient Agar Môi trường thạch dinh dưỡng NB Nutrient broth Môi trường canh thang ONPG O - Nitrophenyl-β-Dgalactopyranoside Cơ chất oNPG để xác định hoạt độ β-galactosidase TCA Trichloroacetic acid X- gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalactopyranosit v/v Volume/volume β–D–1- Thể tích/Thể tích v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng sữa bị tươi tính 100g Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn sử dụng để nghiên cứu 16 Bảng 3.2 Môi trường đĩa thạch MRS pH:6-6,5 sử dụng lactose 17 Bảng 3.3 Môi trường đĩa thạch NA (Mirac Yilmaz et al., 2006) 17 Bảng 3.4 Danh sách thiết bị sử dụng để nghiên cứu 18 Bảng 3.5 Danh sách hóa chất 19 Bảng 3.6 Pha dãy đường chuẩn protein 24 Bảng 3.7 Số liệu dựng đường chuẩn lactose 26 Bảng 4.1 Khả sinh enzyme phương pháp test X-Gal 30 Bảng 4.2 Hoạt độ enzyme nội bào chủng SC3 SC4 30oC 4oC 34 Bảng 4.3 Bảng kết thu nhận β-galactosidase muối amonisunfate từ chủng SC3 35 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sản lượng sản xuất sữa giai đoạn 2010-2015 Hình 2.2 Sản lượng sữa tươi theo tháng năm 2015 tháng đầu năm 2016 Hình 2.3 Tăng trưởng doanh thu ngành sữa Việt Nam Hình 2.4 Sơ đồ thủy phân lactose β-galactosidase 12 Hình 3.1 Biểu đồ đường chuẩn oNP 22 Hình 3.2 Đường chuẩn protein 25 Hình 3.3 Biểu đồ đường chuẩn lactose 27 Hình 4.1 Màu khuẩn lạc thủy phân X-gal 29 Hình 4.2 Hoạt độ β-galactosidase vi khuẩn 31 Hình 4.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ β-galactosidase nội bào từ chủng vi khuẩn SC3 32 Hình 4.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ β-galactosidase nội bào từ chủng vi khuẩn SC4 33 Hình 4.5 Hoạt tính β – galactosidase 4ºC sau 24 ngày 36 Hình 4.6 Khả phân giải lactose β-galactosidase tinh sơ từ chủng SC3 37 Hình 4.7 Kết tách chiết DNA tổng số 38 Hình 4.8 Kết PCR với mồi 16 rDNA vi khuẩn SC3 38 Hình 4.9 Kết so sánh trı̀nh tự tương đồng của SC3 theo mồ i 16 rDNA bằ ng công cụ Blast 39 Hình 4.10 Lưu đồ sản xuất sản phẩm sữa tiệt trùng không lactose 40 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Huyên Tên luận văn: “Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh β-galactosidase ưa lạnh, bước đầu nghiên cứu ứng dụng enzyme sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose” Ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 54 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định 1-2 chủng vi khuẩn có khả sinh β-galactosidase phân giải lactose nhiệt độ thấp Phương pháp nghiên cứu Để thực đề tài sử dụng phương pháp sau: Phương pháp hoạt hóa nuôi cấy giống tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng cs (1978) Phương pháp xác định khả sinh β-galactosidase vi khuẩn theo Toru Nakayama Teruo Amachi (1996) Phương pháp xác định hoạt độ β-galactosidase theo Nguyễn Thu Hà cs (2006) Xác định ảnh hưởng thời gıan nuôi cấy đến sự sinh trưởng khả sinh tổng hợp β-galactosidase Nguyễn Thu Hà cs (2006) Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase có hoạt độ cao nhiệt độ thấp theo Nguyễn Thị Vân Linh cs (2013) Phương pháp tinh β-galactosidase theo Wendry Setiyadi Putranto (2007) Xác định độ bền nhiệt độ thấp β-galactosidase theo Nguyễn Thị Vân Linh cs (2013) Xác định khả phân giải lactose β-galactosidase sữa tươi nhiệt độ thấp hệ thống HPLC Định tên vi khuẩn có khả sinh β-galactosidase ưa lạnh phương pháp giải trı̀nh tự vùng gen mã hóa 16rDNA Kết kết luận − Từ 68 vi khuẩn sau kiểm tra phương pháp cấy đĩa thạch xác định 11 chủng có khả sinh β-galactosidase viii Sản phẩm PCR tinh xác định trình tự hãng First-base, Malaysia (hình 4.8 hình 4.9) Kết giải trình tự so sánh với liệu ngân hàng gene NCBI dùng cơng cụ blast (hình 4.10) Hình 4.9 Kết so sánh trın ̀ h tự tương đồng của SC3 theo mồ i 16 rDNA bằ ng công cụ Blast Kết luận: chủng SC3 Streptococcus thermophilus đặt tên Streptococcus thermophilus SC3 4.7 BƯỚC ĐẦU ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT SỮA TƯƠI TIỆT TRÙNG KHƠNG LACTOSE Từ kết nghiên cứu cho thấy: Vi khuẩn Streptococcus thermophilus SC3 có khả sinh β-galactosidase có hoạt độ cao bền nhiệt độ 4oC Β-galactosidase từ chủng SC3 sau tinh sơ có khả phân giải đường lactose sữa tươi nhiệt độ thấp Trên giới, Valio sản xuất sản phẩm sữa không lactose công nghệ màng lọc với việc kết hợp sử dụng bốn loại màng liên tiếp, loại số phục vụ mục đích khác Theo khả phân tách từ loại có kích thước lỗ nhỏ đến kích thước lỗ lớn bao gồm: màng thẩm thấu ngược (RO), màng lọc nano (NF), màng siêu lọc (UF) màng vi lọc (MF) Việc sử dụng kết hợp kỹ thuật màng giúp loại bỏ đường lactose 39 mà giữ nguyên thành phần khác sữa (Tossavainen et al., 2013) Tuy nhiên công nghệ địi hỏi chi phí đầu tư lớn cơng nghệ đại nhiều so với việc sử dụng enzyme để loại bỏ lactose khỏi sữa Từ kết đề xuất sử dụng β-galactosidase nội bào từ vi khuẩn Streptococcus thermophilus SC3 để ứng dụng quy trình sản xuất sữa tiệt trùng lactose khơng lactose với quy trình nội dung sau (hình 4.11): Sữa tươi NL β-galactosidase Bảo quản lạnh 4oC 27h Chuẩn hóa Bài khí Đồng hóa 70oC Tiệt trùng 140oC – giây Bao bì tiệt trùng Rót chai Sản phẩm Hình 4.10 Lưu đồ sản xuất sản phẩm sữa tiệt trùng không lactose Thuyết minh quy trình: - Thời điểm bổ sung enzyme: sau thu nhận sữa tươi từ nông trại nhà máy chờ đưa vào sản xuất sữa bảo quản lạnh 4-6oC Quá trình tận dụng thời gian để enzyme phân giải hết latose sữa - Do để phân giải hết lượng lactose sữa cần sử dụng enzyme có hoạt lực cao thông qua công đoạn cô đặc enzyme với lượng sinh khối sử 40 dụng lớn Việc sử dụng lượng dịch enzyme thấp/hoạt lực cao giúp giảm ảnh hưởng tới mùi vị sữa - Sữa chuẩn hóa sau đồng hóa 180/50bar, nhiệt độ 70 ±1oC trước tiệt trùng 140oC giây sau làm nguội nhanh xuống 25oC trước rót chai - Bao bì trước đưa vào rót hấp tiệt trùng 121oC 15 phút - Sữa thành phẩm sau rót chai bảo quản nhiệt độ thường sử dụng 41 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN − Từ 68 vi khuẩn sau kiểm tra phương pháp cấy đĩa thạch xác định 11 chủng có khả sinh β-galactosidase − Trong 11 chủng chọn, chủng SC3 SC4 cho hoạt độ cao 30oC sau 24h nuôi, 389,58 U/l 369,16 U/l Hoạt độ tương đối enzyme 4ºC so với 30oC chủng SC3 SC4 tương ứng 24,36% 11,10% − Enzyme nội bào chủng SC3 cho hoạt tính riêng cao 2,783 (U/mg) tinh sơ muối amonisunphat bão hòa 60% tương đương với hiệu suất thu hồi 86,63% Hoạt độ enzyme tinh bền sau 24 ngày bảo quản 4ºC 56,15% − Sau 27h 4oC với lượng enzyme sử dụng 2,110 U/1 g lactose (cơng thức 2) lượng lactose cịn lại 40,67b % − Kết định danh chủng SC3 Streptococcus thermophilus đặt tên Streptococcus thermophilus SC3 5.2 KIẾN NGHỊ − Tiếp tục xác định điều kiện nuôi cấy để tối ưu hoạt độ lượng β – galactosidase thu nhận từ chủng Streptococcus thermophilus SC3 − Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzyme tinh đến khả phân giải lactose sữa nguyên liệu nhiệt độ 4oC − Xây dựng quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose sử dụng β – galactosidase ưa lạnh 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Nhật Anh, Lư Ngọc Dung, Diệp Oanh Hảo Nguyễn Hoài Tâm (2013) Sữa tiệt trùng Ngày truy cập 16/07/2018 http://luanvan.net.vn/luan-van/do-ansua-tiet-trung-45537/ Nguyễn Văn Cách, Bùi Thị Hải Hòa Đặng Thị Thu (2008) Tách, tinh chế xác định đặc tính β-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội tr 287-289 Bộ Khoa học Công nghệ (2004) TCVN 7405:2004 Sữa tươi nguyên liệu Bộ Khoa học Công nghệ (2009) TCVN 7028 : 2009 Sữa tươi tiệt trùng Bộ Khoa học Công nghệ (2009) TCVN 8107:2009 (ISO 22662 : 2007) Sữa sản phẩm sữa - Xác định hàm lượng lactoza sắc ký lỏng hiệu cao Khuyết Danh (2016) Tổng quan ngành công nghiệp sữa Ngày truy cập 15/06/2018 http://investvietnam.gov.vn/vi/nghanh.nghd/15/sua-va-cac-san-pham-sua.html Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch Phạm Văn Ty (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tập Nguyễn Thu Hà, B Splechtna (2006) Nghiên cứu biểu enzyme lactase chủng Lactobacilus reuteri L103 L461 Trương Nam Hải (2004) Nghiên cứu, phân lập tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzyme beta-galactosidase có hiệu suất cao ứng dụng thực phẩm Báo cáo tổng kết Khoa học Kỹ thuật 10 Nguyễn Thị Vân Linh, Nguyễn Thị Thùy Dung Trần Bích Lam (2013) Thu nhận tinh β-galactosidase từ LactoBacillus acidophilus Tạp chí phát triển KH&CN 15 tr 65-72 11 Nguyễn Đức Lượng (2003) Khảo sát trình cảm ứng enzyme chitinase cellulase Trichoderma harzianum ảnh hưởng hai enzyme lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội tr 321-324 12 Trần Thị Na Nguyễn Hoàng Anh (2017) Tuyển chọn định danh vi khuẩn Bacillus có khả sinh β-galactosidase chịu nhiệt Tạp chí khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 15(8) tr 1070-1076 43 13 Đỗ Thị Thu Nga (2012) Khảo sát khả sinh tổng hợp protease số chủng Baccillus Luận văn thạc sĩ sinh học trường đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh tr 47 14 Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lê Thị Hồng Hảo Nguyễn Thành Trung (2010) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh Viện nghiên cứu an tồn vệ sinh thực phẩm quốc gia 15 Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh Trần Văn Giang (2008) Nhân dịng phân tích trình tự gene mã hố β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1 Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội tr 908 16 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy Nguyễn Xuân Sâm (2007) Công nghệ enzyme NXB Khoa học Kỹ thuật 17 Đỗ Thị Bích Thủy (2012) Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận chế phẩm protease ngoại bào Bacillus amyloliquefacien N1 Tạp chí khoa học, Đại học Huế 71 (2) 18 VIRAC , JSC (2016) Báo cáo chuyên sâu ngành sữa Q3/2016 19 Bộ Y tế (2007) Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam Nhà xuất y học, Hà Nội 20 Nguyễn Thị Hải Yến (2003) Khảo sát đặc tính khả thu nhận enzym βgalactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16 Luận văn thạc sỹ sinh học, ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐHQGHN, Hà Nội Tiếng Anh: Bafort F , O Parisi, J-P Perraudin and MH Jijakli (2014) Mode of Action of Lactoperoxidase as Related to Its Antimicrobial Activity Benjamin M., P Daniel, F Heiko, F Michael, R.V Stephan and F Mark (2013) Lactose malabsorption and intolerance: pathogenesis, diagnosis and treatment, United European Gastroenterol J 1(3) pp.151–159 Bradford M.M (1976) A rapid and sensitive method for quantitation of protein utilization, The principle of protein-dye binding, Anal Biochem, (72) pp 248-254 Chen W., H Chen, Y Xia, J Yang, J Zhao, F Tian, HP Zhang and H Zhang (2009) Immobilization of recombinant thermostable beta-galactosidase from Bacillus stearothermophilus for lactose hydrolysis in milk J Dairy Sci, 92(2) pp 491-8 44 Davail S., G Feller, E Narinx and C Gerday (1994) Cold adaptation of protein J Biol Chem, 269 De Man J.D., M Rogosa and M.E Sharpe (1960) A Medium for the Cultivation of Lactobacilli, J Appl Bact, 23 pp 130–135 Duman Y.A and E Kaya (2013) Purification, recovery, and characterization of chick pea (Cicer arietinum) β-galactosidase in single step by three phase partitioning as a rapid and easy technique 91 (2) pp 155-60 Driks A (1999) Bacillus subtilis spore coat, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63 Furlan S.A., A.L.S Schneider, R Merkle, MFC Jonas and R Jonas (2000) Formulation of a lactose-free, low-cost culture medium for the production of β- D galactosidase by Kluyveromyces marxianus.Biotechnol Lett 22 pp 589-593 10 Hansson T and P Adlercreutz (2001) Enhanced transglucosylation/ hydrolysis ratio of mutants of Pyrococcus furiosus b-glucosidase: effects of donor concentration, water content and temperature on activity and selectivity in hexanol, Biotechnology and Bioengineering 75 pp 656–665 11 Harju M., H Kallioinen and O Tossavainen (2012) Lactose hydrolysis and other conversions in dairy products: technological aspects, Int Dairy J, 22 pp 104-109 12 Laemmli UK (1970) Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 pp 680-685 13 Li JM., CY Chiou, TR Lee, YS Chen and GC Shaw (2005) Identification of a lactose-responsive element upstream of the promoter of Bacillus megaterium betagalactosidase-encoding gene mbgA, Curr Microbiol 14 Liburdi K, I Benucci and M Esti (2014) Lysozyme in Wine: An Overview of Current and Future Applications, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 15 Miller J.C and J N Miller (1988) Statistics for Analytical Chemistry, Ellis Horwood Limited 16 Milica C., S Maja, G Sanja, S Marija, M Mladen, D Aleksandra and B Dejan (2015) Optimization of β-galactosidase production from lactic acid bacteria Scientific paper, 69 (3) pp 305–312 45 17 Mirac Y (2006) Antimicrobial activities of some Bacillus spp Microbiological Research 161 pp 127-131 18 Nguyen H A., T H Nguyen, V Kren, V G H Eijsink, D Haltrich and C K Peterbauer (2012) Heterologous Expression and Characterization of an N-Acetylβ-D-hexosaminidase from Lactococcus lactis ssp lactis IL1403 J Agric Food Chem, 60 (12) pp 3275-81 19 Omar M A., H.A Mohammad and M.A Ibrahim (2016) Characterization of βgalactosidase in the Crude Plant Extract of Artemisia judaica L in Presence and Absence of Some Heavy Metals American Journal of Life Sciences, Volume 4, Issue pp 99-105 20 Park HY., HJ Kim, JK Lee, D Kim and DK Oh (2008) Galactooligosaccharide production by a thermostable beta-galactosidase from Sulfolobus solfataricus World J Microb Biot.; 24:1553–1558 doi: 10.1007/s11274-007-9642-x 21 Parmjit S P., K Shwta and P Reeba (2010) Protential Applications of Ininiobilized βgalactosidase in Food Prossesing Industries SAGE-Hindawi Access to Research, Enzyme Research, Article ID473/37, 16 page 22 Petzelbauer I., B Splechtna and B Nidetzky (2000) Galactosyl transfer catalyzed by thermostable b-glycosidases from Sulfolobus solfataricus and Pyrococcus furiosus: kinetic studies of the reactions of galactosylated enzyme intermediates with a range of nucleophiles Journal of Biochemistry 130 pp 341–349 23 Raveendran S., B Parameswaran, S.B Ummalyma, A Abraham, A.K Mathew, A Madhavan, S Rebello and A Pandey (2018) Applications of Microbial Enzymes in Food Industry, Food Technology Biotechnology, 56(1).pp 16–30 24 Rosenberg M (2006) Zuzana mlichová, Current trends of β-galactosidase application in food technology, Journal of Food and Nutrition Research, Vol 45, No pp 47-54 25 Selvarajan E and V Mohanasrinivasan (2015) Kinetic studies on exploring lactose hydrolysis potential of β galactosidase extracted from LactoBacillus plantarum HF571129, Food Sci Technol, 52(10) pp 6206–6217 26 Sonia A de Bales and J.C Francisco (1979) Production of Lactase by Candida pseudotropicalis Grown in Whey Appl Environ Microbiol, 37(6) pp 1201–1205 46 27 Toru N and A Toru (1996) Beta–galactosidaza enzymology Encyclopaedia of Food science food technology and nutrion, pp 1291 – 130 28 Tossavainen, Olli (Espoo, FI), Sahlstein, Janne (Espoo, FI) (2013) Lactose-Free Milk Product And Processes For Producing The Same, United States Patent and Trademark Office, Patent Number 8449938 29 Wendry S P and P Aktivitas (2007) LactoBacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi (Proteolytic Activity of LactoBacillus acidophilus in Fermentation of Dairy Cow Milk) Jurnal ilmu Ternak, Juni 2007, Vol.7 (No.1) pp.69-72 47 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Bảng Hoạt độ enzyem vi khuẩn thu 24h 30oC Mẫu Hoạt độ enzyme nội bào (U/L) Hoạt độ enzyme ngoại bào (U/L) KL3 11.94 ± 0,45 18,37 ± 0,70 BA15.6 7.53 ± 0,41 16,79 ± 0,63 NT4.1 27.90 ± 0,89 71,13 ± 1,80 PB3.4 45.65 ± 1,28 74,35 ± 1,86 BA23.5 38.83 ± 1,11 17,52 ± 0,59 SC3 390,32 ± 5,26 50,25 ± 1,36 SC4 361,30 ± 4,56 210,01 ± 4,60 SC5 46,10 ± 1,13 2,63 ± 0,25 SDA3 4,16 ± 0,30 2,66 ± 0,28 SPD2.3 3,08 ± 0,21 3,72 ± 0,30 SPD3.3 4,75 ± 0,35 8,69 ± 0,38 48 Bảng Hoạt độ emzyme nội bào (U/L) chủng SC3, SC4 30h Thời gian (giờ) SC3 SC4 56,60h ± 0,37 89,02h ± 1,56 130,55g ± 3,06 109,98g ± 2,96 12 206,99f ± 4,42 156,55f ± 3,78 15 264,58e ± 4,05 213,41e ± 4,23 18 321,44d ± 5,12 270,85d ± 4,97 21 370,43c ± 4,12 332,34c ± 5,26 24 389,58a ± 5,24 369,16a ± 6,28 27 382,62ab ± 0,20 355,02b ± 4,60 30 373,19bc ± 3,23 320,34c ± 2,87 * Trong cột, giá trị mang chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê (α= 0,05) Bảng Hoạt độ chủng SC3, SC4 30oC và4oC (U/L) Nhiệt độ (oC) SC3 SC4 30 391,36 ± 7,27 369,40 ± 7,34 95,34 ± 2,21 41,02 ± 1,18 49 Bảng Hoạt độ enzyme từ chủng SC3 sau ủ 4oC 24 ngày Thời gian Thời gian (giờ) Hoạt độ (U/L) (h) 388,43a ± 3,87 26 h 355,57b ± 2,58 50 h 345,63bc ± 2,70 68 h 337,76c ± 3,15 116 h 320,96d ± 6,05 152 h 310,22d ± 3,65 10 200 h 297,60e ± 3,97 12 248 h 277,17f ± 4,27 14 296 h 269,43f ± 5,49 16 320 h 254,86g ± 4,95 18 368 h 245,69gh ± 4,01 20 416 h 237,15hi ± 4,55 22 464 h 225,79ij ± 2,36 24 512 h 218,10j ± 3,77 (ngày) * Trong cột, giá trị mang chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê (α= 0,05) 50 Bảng Lượng lactose cịn lại cơng thức qua 27 (%) Thời gian (giờ) CT1 CT2 CT3 100 100 100 77,36a ± 1,37 74,74b ± 1,59 73,89b ± 1,52 75,64a ± 1,24 71,92b ± 1,63 69,89c ± 1,54 64,76a ± 1,45 63,92a ± 1,49 61,59b ± 1,62 12 61,54a ± 1,46 60,41ab ± 1,43 59,14b ± 1,64 15 58,11a ± 1,67 56,11b ± 1,73 55,99b ± 1,60 18 55,37a ± 1,57 50,65b ± 1,57 49,76b ± 1,49 21 52,86a ± 1,78 48,00b ± 1,40 46,92b ± 1,74 24 48,06a ± 1,68 42,77b ± 1,60 40,69c ± 1,50 27 45,27a ± 1,34 40,67b ± 1,43 39,89b ± 1,73 * Trong hàng, giá trị mang chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê (α = 0,05) 51 PHỤ LỤC Sắc ký đồ CT3 12h Sắc ký đồ CT1 12h 52 PHỤ LỤC Kết giải trình tự gen 16S rDNA chủng SC3 - Kết giải trình tự: CTATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGTTGC GAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAA ACGATAGCTAATACCGCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGC AATTGCTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGG CTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGG GGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAA GCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTA GCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTC CCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTC TGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAG TGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGG AGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAA AGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA GTGCTAGGTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGAAGCTAACGCATTAAGCAC TCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCC GCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAG GTCTTGACATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGA CAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGC AACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGA CTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTA TGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTTGCGAGTCGGTGA CGGCGAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCT ACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTC CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCG GTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAG 53 ... sữa Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu: Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh β- galactosidase ưa lạnh, bước đầu nghiên cứu ứng dụng enzyme sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose 1.2 MỤC ĐÍCH – U... đồ sản xuất sản phẩm sữa tiệt trùng không lactose 40 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Huyên Tên luận văn: ? ?Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh β- galactosidase ưa lạnh, bước đầu. .. Định tên vi khuẩn có khả sinh β- galactosidase ưa lạnh - Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng khơng lactose sử dụng β- galactosidase ưa lạnh 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Tuyển