ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc --- --- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên học viên: Huỳnh Viết Lộc MSH
Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu
Vật liệu
- 1 mẫu niêm mạc má từ người có gen EGFR không có đột biến dùng làm mẫu chứng âm
- 10 mẫu sinh thiết từ bệnh nhân ung thư phổi dùng làm kiểm chuẩn phòng thí nghiệm do EMQN (The European Molecular Genetics Quality Network) cung cấp
- 100 mẫu sinh thiết từ bệnh nhân được chuẩn đoán bị ung thư phổi không tế bào nhỏ
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ
- Máy Pyro Mark 24Q (Qiagen-Đức)
- Máy ủ nhiệt khô (Namkhoa-Việt Nam)
- Máy ly tâm (Beckman courter-Đức)
- Máy điện di (Biorad-Mỹ)
- Máy đọc gel (Biorad-Mỹ)
- Máy đo OD (eppendorf-Mỹ)
- Tủ đổ gel (Namkhoa-Việt Nam)
- Tủ cấy vi sinh (Shinsaeng-Hàn Quốc)
- FFPE extraction kit (Qiagen-Đức)
- EGFR Pyro kit (Q24) (Qiagen-Đức)
- PyroMark Gold 24Q Reagent (Qiagen-Đức)
- PyroMark Biding Buffer (Qiagen-Đức)
- PyroMark Ammealing Buffer (Qiagen-Đức)
- PyroMark Wash Buffer, PyroMark Denaturation Solution (Qiagen-Đức)
- Streptavidin Sepharose TM High Performance (GE Healthcare-Thụy Điển)
Phương pháp nghiên cứu
Từ cơ sở dữ liệu NCBI tìm kiếm trình tự của nhiễm sắc thể số 7 của người theo từ khóa “Homo sapiens nhiễm sắc thể 7”, từ đó chọn trình tự hoàn chỉnh của nhiễm sắc thể số 7 (có số accession: NC_000007 GPC_000000031) Trình tự này được đưa vào phần mềm Primer Premier 5 và sử dụng làm trình tự gốc để thiết kế mồi đặc hiệu khuếch đại các exon 18, 19, 20 và 21 trên gene EGFR Những mồi được chọn phải thỏa những yêu cầu sau:
- Phải chứa các vị trí codon đột biến đang khảo sát: 719 ở exon 18, deletions ở exon 19, 768 và 790 ở exon 20, 858 và 861 ở exon 21 trên gene EGFR
- Khuếch đại sản phẩm có kích thước không vượt quá 250 bp
- Không tạo cấu trúc thứ cấp “hairpin”, “primerdimer” hay “crossdimer” bền vững với chính nó hay các mồi khác
- Nhiệt độ mồi xuôi và mồi ngược không lệch nhau quá 4 0 C
Mồi đạt được các yêu cầu trên sẽ được kiểm tra tính đặc hiệu trên trang mạng NCBI với công cụ Primer BLAST Thông số dùng cho BLAST như sau:
Database “Genome (nhiễm sắc thể from all organisms)”, Organism “Homo sapiens”, Primer specificity stringency “primer must have at least 2 total mismathches to unintended targets, including at least 2 sai kháces within the last 5 bps at the 3’ end Ignore targets that have 6 or more sai kháces to the primer” Với thông số này mồi đưa vào kiểm tra sẽ được so sánh với toàn bộ di truyền của người và sẽ cho chúng ta biết có tất cả bao nhiêu sản phẩm được tạo ra (đặc hiệu và không đặc hiệu) Mồi được chọn phải:
- Tạo sản phẩm với gen EGFR tại các vị trí mong muốn ở exon 18, 19, 20 và exon 21, Không có vị trí sai khác tại các vị trí này tại vị trí bắt cặp của mồi
- Những mồi có tạo sản phẩm không đặc hiệu tại những vị trí khác trên bộ gen người, chỉ được chọn khi sản phẩm không đặc hiệu này phải có lớn hơn 4 vị trí sai khác tại điểm bắt cặp của mồi
Khi đã thiết kế được các cặp mồi dùng cho PCR khuếch đại các vị trí cần khảo sát, tiến hành thiết kế mồi dùng cho phản ứng giải trình tự Các mồi giải trình tự phải thỏa các điều kiện sau:
- Không bắt cặp không đặc hiệu tại các vị trí không mong muốn trên chuỗi DNA cần giải trình tự
- Chiều dài từ 15 nu đến 22 nu
- Nhiệt độ bắt cặp từ 42 0 C đến 57 0 C
- Mồi giải trình tự tốt nhất nên nằm ở vị trí cách vị trí đột biến cần khảo sát khoảng 1 đến 2 nu
- Mồi dùng cho PCR, khuếch đại trình tự là mạch bổ sung của trình tự với mồi giải trình tự phải gắn biotine ở đầu 5’
3.2.2 Kiểm tra mồi sau khi thiết kế ở điều kiên thực tế
3.2.2.1 PCR khuếch đại các exon 18, 19, 20 và exon 21 trên gen EGFR
Mồi sau khi được thiết kế, trình tự được gởi đến công ty Sigma (Singaore) để tổng hợp trình tự Các ống mồi được cung cấp ở dạng đông khô, trước khi sử dụng cần hoàn nguyên trong TE 1X, nồng độ cuối của mồi nước sau khi hoàn nguyên là 100 pmol/àl PCR mix khuếch đại cho mỗi exon được chuẩn bị riờng biệt, Thành phần PCR mix được chuẩn bị theo công thức sau:
Bảng 3.1: Thành phần nồng độ các chất cho phản ứng PCR
Thành phần Hàm lương/ nồng độ
Lượng cần dùng (àl)/ 1 phản ứng
Lượng cần dùng (àl)/ 10 phản ứng
Cho thờm 5 àl DNA cú nồng độ 10ng/ àl được ly trớch từ mẫu niờm mạc mỏ người không bị đột biến gen EGFR vào mỗi loại PCR mix để đạt thể tích cuối cùng là 25 àl Đặt cỏc tube PCR mix vào mỏy luõn nhiệt và thực hiện chu trỡnh luõn nhiệt như sau:
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 2% Kết quả đạt yêu cầu khi kết quả điện di tại mỗi exon cho 1 band DNA được khuếch đại dương, kích thước sản phẩm tại mỗi exon là: exon 18 (171 bp), exon 19 (163bp), exon 20 (291 bp) và exon 21 (97 bp)
Phản ứng pyrosequencing được thực hiện trên máy PyroMark Q24 (Qiagen)
Bước này nhằm kiểm tra mồi dùng cho giải trình tự, các mồi này chỉ được sử dụng cho bộ thuốc thử nếu kết quả giải trình tự tốt: không có đỉnh (peak) phụ hoặc đỉnh phụ không vượt quá 10% Để bắt đầu một thử nghiệm (assay) pyro mới cần cài đặt thử nghiệm mới và thực hiện thí nghiệm (experiment) tuần tư như sau a.Cài đặt thử nghiệm
Cài đặt thử nghiệm cho vị trí 719 ở exon 18 trên gene EGFR - Chọn “New AQ Assay”
- Nhập trình tự DGCTCCGGTGC vào ô “sequence to analyze”
- Nhập trình tự ATGTCACTCGTG vào ô “Dispensation Order”
- Click vào thanh “Analysis parameters”, chọn chỉ số 30 tại ô “Peak height threshold required height for passed quality”
- Lưu thử nghiệm dưới tên “EGFR codon 719”
Cài đặt thử nghiệm cho vị trí deletions ở exon 19 trên EGFR
TATCAA[GGAATTAAGAGAAGC]AACATCTCCGAAAGCCA- ACAAGGA vào ô “sequence to analyze”
- Nhập trình tự CTATCACTGTCAGCTCGATCGTCATCGTCACGC vào ô
- Click vào thanh “Analysis parameters”, chọn chỉ số 30 tại ô “Peak height threshold required height for passed quality”
Cài đặt thử nghiệm cho vị trí 768 ở exon 20 trên EGFR
- Nhập trình tự CAKCGTG vào ô “sequence to analyze”
- Nhập trình tự TCGAGTCG vào ô “Dispensation Order”
- Click vào thanh “Analysis parameters”, chọn chỉ số 30 tại ô “Peak height threshold required height for passed quality”
- Lưu thử nghiệm dưới tên “EGFR codon 768”
Cài đặt thử nghiệm cho vị trí 790 ở exon 20 trên EGFR
- Nhập trình tự ATCAYGCAG vào ô “sequence to analyze”
- Nhập trình tự CATCGACTGCA vào ô “Dispensation Order”
- Click vào thanh “Analysis parameters”, chọn chỉ số 30 tại ô “Peak height threshold required height for passed quality”
- Lưu thử nghiệm dưới tên “EGFR codon 790”
Cài đặt thử nghiệm cho vị trí 858 và 861 ở exon 21 trên EGFR
- Nhập trình tự CKGGCCAAACDGCTGGGT vào ô “sequence to analyze”
- Nhập trình tự ATCGTGCAAGCATGCTG vào ô “Dispensation Order”
- Click vào thanh “Analysis parameters”, chọn chỉ số 30 tại ô “Peak height threshold required height for passed quality”
- Lưu thử nghiệm dưới tên “EGFR codon 858-861” b.Thực hiện phản ứng pyrosequencing
- Chọn các thông số cho lần chạy:
Run name: Là tên của lần chạy và sẽ được lưu lại
Instrument method: Chọn “PyroMark Q24 method 007”
Plate ID: Phần này không nhất thiết phải nhập vào
Bar code: Được đặt theo ngày thực hiện phản ứng theo định dạng
- Cài đặt đĩa phản ứng (plate) bằng việc chèn loại thử nghiệm vừa được cài đặt ở trên vào dòng đầu tiên và tên mẫu vào dòng thứ 2 của mỗi giếng trên đĩa
- Vào “Tools” chọn “Pre run information”, phần mềm sẽ thông báo lượng hóa chất cần sử dụng cho thí nghiệm như: enzyme, substrate, nucleotides Bơm các loại hóa chất theo thể tích được yêu cầu vào cartridge
- Đặt cartridge vào máy PyroMark Q24
- Lưu thí nghiệm vào USB sau đó chuyển USB vào máy PyroMark Q24
Cố định mẫu sản phẩm PCR vào hạt bead
- Lắc đều hạt bead, chuẩn bị master mix cố định sản phẩm PCR theo bảng sau:
Bảng 3.2: Thành phần master mix cố định sản phẩm PCR
Thành phần Hàm lương/àl
Hạt bead (Streptavidin Sepharose High Performance) 2
- Trờn đĩa 24 giếng chứa mẫu cho vào mỗi giếng 70 àl master mix, thờm vào mỗi giếng 10 àl sản phẩm PCR cú gắn biotine, đậy nắp
- Đặt đĩa vào máy lắc, lắc ở 1400 vòng/phút trong 10 phút
Chuẩn bị mẫu cho phản ứng Pyrosequencing
- Trên đĩa 24 giếng chứa mồi, cho 5 loại mồi giải trình tự vào 5 giếng khác nhau (0,8 àl mồi + 24,2 àl dung dịch “annealing”)
- Đặt đĩa mẫu vào “work station”, mở nắp đậy, dùng bàn hút chân không (vacuum) hút hết mẫu
- Rửa bàn hút với ethanol 70% trong 5s, để khô bàn hút chân không trong 10s
- Rửa bàn hút với denaturation trong 5s, để khô bàn hút chân không trong 10s
- Rửa bàn hút với wash buffer 1X trong 5s, để khô bàn hút trong 10s
- Tắt bàn hút, đặt vào đĩa chứa mồi, lắc nhẹ bàn hút
- Rửa bàn hút 3 lần với nước cất 2 lần
- Ủ đĩa chứa mồi ở 80 0 C trong 3 phút
- Đặt đĩa vào máy PyroMark 24Q, chạy experiment đã được cài đặt ở trên c Phân tích kết quả
Kết quả sẽ được phần mềm PyroMark 24Q phân tích khi chọn thanh
“Analyze all wells” Đây là kết quả từ mẫu DNA không đột biến EGFR, vì vậy các đột biến (ở tỷ lệ thấp) ghi nhận được đều không phải là kết quả đột biến thực Tỷ lệ phần trăm đột biến này được dùng xác định ngưỡng (LOD) phát hiện đột biến Khi phát hiện trên mẫu bệnh có tỷ lệ đột biến vượt quá chỉ số LOD thì mới ghi nhận đột biến tại vị trí này Mẫu DNA không có đột biến EGFR này được thực hiện pyrosequencing lặp lại 6 lần, các kết quả thu được sẽ là tham chiếu suy ra chỉ số
LOD cho mỗi vị trí cần xác định đột biến Mẫu DNA không mang đột biến EGFR được sử dụng làm chứng âm, Mẫu này được thực hiện xác định đột biến EGFR lại nếu thấy có gì bất thường trong kết quả trên mẫu thực tế Từ lúc này quy trình phát hiện đột biến gen EGFR dựa vào pyrosequencing được coi là một bộ thuốc thử với tên gọi “NamKhoa_EGFR Pyro Q24”
3.2.3 So sánh 2 bộ thuốc thử pyrosequencing phát hiện đột biến gen EGFR, NamKhoa_EGFR pyro Q24 và EGFR pyro kit (24)
EGFR pyro kit (24) là bộ thuốc thử xác định đột biến gen EGFR trên người, sử dụng kỹ thuật pyrosequencing do công ty Qiagen sản xuất Là bộ thuốc thử thương mại và đã được tổ chức FDA của Mỹ cấp chứng nhận IVD , độ nhạy của phương pháp này là 1-2% Chỉ 1-2% tế bào ung thư mang đột biến trong mẫu đi xét nghiệm thì có thể phát hiện được bằng bộ thuốc thử này
KẾT QUẢ
Kết quả thiết kế mồi
4.1.1 Kết quả thiết kế mồi sử dụng phần mềm primer premier 5.0
Với từ khóa “Homo sapiens nhiễm sắc thể 7” đã tìm được 18.529 kết quả có liên quan đến nhiễm sắc thể số 7 của người Từ đó chọn ra trình tự NC_000007 GPC_000001299 làm trình tự gốc thiết kế mồi cho các exon 18, 19, 20 và 21 trên gen EGFR Với sự trợ giúp của phần mềm Primer premier 5.0, tôi đã thiết kế được các cặp mồi có nhiệt độ bắt cặp khoảng 53 0 C có khả năng khuếch đại các vị trí codon đột biến 719, 768, 790, 858, 861 và đột biến mất đoạn ở exon 19 của gen
Bảng 4.1: Đặc điểm các mồi dùng cho nghiên cứu
Tên mồi Chiều dài (bp)
Số lượng nu loại C và G
Các mồi dùng cho PCR khuếch đại các đoạn DNA chứa các đột biến đều
PCR phải nhỏ hơn 500bp, chiều dài tốt nhất là khoảng < 200bp, Không tạo cấu trúc
“loop” 6bp liên tiếp trong sản phẩm PCR Đồng thời các cặp mồi này đều có nhiệt độ tương đồng nhau (khoảng 53 0 C), điều này giúp dễ dàng sử dụng 1 chương trình luân nhiệt dùng cho tất cả các phản ứng PCR tại tất cả các exon Vì vậy tôi tiến hành bước thứ 2, kiểm tra độ đặc hiệu của 4 cặp mồi này bằng công cụ BLAST_primer trên trang mạng NCBI
4.1.2 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu mồi trên trang mạng NCBI
Các cặp mồi được kiểm tra độ đặc hiệu với toàn bộ gen người bằng công cụ BLAST trên trang mạng NCBI:
Cặp mồi 18F và 18BR cho đoạn sản phẩm đặc hiệu trên bộ gen người là 171bp và 1 sản phẩm không đặc hiệu 1704bp với nhiễm sắc thể số 17 Tuy nhiên sản phẩm không đặc hiệu này có 4 vị trí sai khác với mồi 18F, điều này chứng tỏ sản phẩm không đặc hiệu chỉ tạo thành khi nhiệt độ bắt cặp rất thấp so với nhiệt độ Tm là 53 0 C Vì vậy Cặp mồi 18F và 18BR được chọn
Cặp mồi 19F và 19BR tạo sản phẩm đặc hiệu 163bp với bộ gen người và 1 sản phẩm không đặc hiệu 3701bp với nhiễm sắc thể số 6 trên bộ gen Sản phẩm này có 3 vị trí sai khác với mồi 19BR, vì vậy sản phẩm không đặc hiệu này chỉ hình thành khi nhiệt độ bắt cặp rất thấp so với nhiệt độ Tm = 53 0 C đồng thời thời gian kéo dài ở mỗi chu kỳ phải khoảng 4 phút Do vậy về mặt thực tế sản phẩm này không thể hình thành vì: nhiệt độ bắt cặp được sử dụng là 53 0 C và thời gian kéo dài ở mỗi chu kỳ là 20 giây Do đó cặp mồi 19F và 19BR được chọn
Cặp mồi 20F và 20BR tạo sản phẩm đặc hiệu 291bp với bộ gen người đồng thời không tạo sản phẩm phụ nào Do đó 20F và 20BR được chọn
Cặp mồi 21F và 21BR tạo sản phẩm đặc hiệu 97bp với bộ gen vào đồng thời cũng tạo 2 sản phẩm phụ: 1680bp với nhiễm sắc thể số 7 (sản phẩm có 2 sai khác với primer 21F) và 1590bp với nhiễm sắc thể số 6 (sản phẩm có chứa 4 sai khác với primer 21BR) Vì vậy để tạo điều kiện tối ưu cho việc tạo sản phẩm đặc hiệu thì chu trình nhiệt phải có nhiệt độ bắt cặp là 53 0 C và thời gian kéo dài ở 72 0 C chỉ vừa đủ là 20 giây Cặp mồi 21F và 21BR được chọn
4.1.3 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu mồi trên điều kiện thực tế
4 Cặp mồi được kiểm tra độ đặc hiệu khuếch đại các exon 18, 19, 20 và 21 trên gen EGFR của người không có đột biến Phản ứng được lặp lại sáu lần đều cho kết quả khuếch đại đặc hiệu, chỉ có 1 vạch DNA trên gel agarose 2% Kích thước của các vạch cũng trùng khớp với kích thước thiết kế ban đầu
Hình 4.1: Kết quả diện di sản phẩm PCR trên gel agarose Sản phẩm PCR khuếch đại exon18: 171bp, exon 19: 163bp, exon 20: 291bp, exon 21: 97bp
Kết quả kiểm tra cho thấy các sản phẩm khuếch đại từ các Cặp mồi vừa thiết kế cho kết quả các vạch DNA sáng, rõ và đặc hiệu chỉ khuếch đại đoạn DNA đích
Sản phẩm PCR từ các Cặp mồi này đáp ứng yêu cầu làm nguyên liệu cho giải trình tự bằng pyrosequencing
4.1.4 Kết quả xác định chỉ số LOD cho các vị trí đột biến 719, 768, 790, 858, 861 và deletions
Mỗi vị trí đột biến được thực hiện pyrosequencing 6 lần với mẫu DNA từ người không có đột biến gen EGFR Đột biến được xác định khi có tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận tại vị trí đột biến, tổng của đỉnh tại vị trí đột biến (Pđb) và đỉnh tại vị trí không đột biến (P wt ) là 100% Khi tại vị trí đột biến có xuất hiện tín hiệu
97 bp huỳnh quang, phần mềm sẽ đo chiều cao của đỉnh này cộng với chiều cao của đỉnh tại vị trí không đột biến để được chiều cao của đỉnh có tỷ lệ không đột biến 100%
Tỷ lệ đột biến được tính theo công thức:
Bảng 4.2: Kết quả đột biến ghi nhận trên mẫu DNA không đột biến EGFR Loại đột biến Lần thực hiện % đột biến được ghi nhận
Kể từ lúc này chúng ta đã có quy trình hướng dẫn thực hiện một cách hoàn sử dụng các thử nghiệm có tên: EGFR codon 719, EGFR exon 19 del, EGFR codon 790, EGFR codon 858-861 làm thông số cài đặt thí nghiệm cho máy PyroMark 24Q hoạt động Các thử nghiệm của bộ thuốc thử này có chỉ số LOD các vị trí đột biến như sau:
- Đột biến G719S trên exon 18 là 2,9 %
- Đột biến deletions trên exon 19 là 3.6%
- Đột biến S768I trên exon 20 là 7.6 %
- Đột biến T790M trên exon 20 là 11.0 %
- Đột biến L858R trên exon 21 là 2.6 %
- Đột biến L861Q trên exon 21 là 5,6 %
Bộ thuốc thử “NamKhoa_EGFR pyro Q24” gồm các thành phần sau:
- PyroMark Gold 24Q Reagent (Qiagen-Đức)
- PyroMark Biding Buffer (Qiagen-Đức)
- PyroMark Ammealing Buffer (Qiagen-Đức)
- PyroMark Wash Buffer (Qiagen-Đức)
- PyroMark Denaturation Solution (Qiagen-Đức)
- Streptavidin Sepharose TM High Performance (GE Healthcare-Thụy Điển)
- EGFR_Exon 18 PCR mix, EGFR_Exon 19 PCR mix, EGFR_Exon 20 PCR mix, EGFR_Exon 21 PCR mix (Nam Khoa-Việt Nam)
- 719_seq primer, 768_seq primer, 790_seq primer, 858&861_seq primer, deletions_seq primer (Nam Khoa-Việt Nam)
- Master mix 2X (Nam Khoa-Việt Nam)
- Trình tự cài đặt các assay có tên EGFR codon 719, EGFR exon 19 del,
EGFR codon 768, EGFR codon 790 và EGFR codon 858-861
Hình 4.2: Hình kết quả thô tại các vị trí đột biến trên gen EGFR: (a) vị trí 719 trên exon 18, (b) vị trí deletions trên exon 19, (c) vị trí 768 trên exon 20, (d) vị trí 790 trên exon 20, (e) vị trí 858 và 861 trên exon 21.
Kết quả xác định đột biến EGFR của bộ thuốc thử NamKhoa_EGFR pyro Q24 và EGFR pyro kit (24)
10 mẫu FFPE được cung cấp bởi EMQN nhằm kiểm tra khả năng thực hiện xét nghiệm xác định đột biến gen EGFR chính xác của phòng thí nghiệm đăng ký kiểm tra Kiểu đột biến trên các mẫu này đã được EMQN xác định, tuy nhiên kết quả này được giữ bí mật Để xác đinh đột biên gen EGFR của các mẫu này chúng tôi dùng cùng lúc 2 bộ thuốc thử NamKhoa_EGFR pyro Q24 và EGFR pyro kit (24) Kết quả có được như sau.
Bảng 4.3 Bảng so sánh kết quả đột biến EGFR trên 10 mẫu kiểm tra phòng xét nghiệm của 2 bộ thuốc thử NamKhoa_EGFR pyro Q24 và EGFR pyro kit (24)
Case Số ID NamKhoa_EGFR pyro Q24
1 106161774 Không đột biến Không đột biến 65 tuổi
Số mẫu Tỷ lệ % Số mẫu Tỷ lệ % Số mẫu Tỷ lệ %
