Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Ứng dụng Enzyme trong chiết xuất các hợp chất sinh học và đa dạng hóa các sản phẩm từ tỏi (Allium sativum)

TÓM TẮT Chúng tôi nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tỏi Allium sativum.. Ứng dụng các thông số tối ưu của enzyme Viscozyme vào qui trình c

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Huỳnh Ngọc Oanh đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình truyền đạt kiến thức, phương pháp nghiên cứu và động viên em trong suốt thời gian qua để em có thể hoàn thiện dần kiến thức đã học và hoàn thành luận văn

Cuối cùng em xin gởi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè luôn giúp đỡ động viên em trong suốt thời gian học tập

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2015

Nguyễn Thị Bích Nga

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả và số liệu nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, nếu có gì sai sót tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

TÓM TẮT

Chúng tôi nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất các hợp chất có hoạt tính

sinh học từ tỏi (Allium sativum) Kết quả cho thấy, khi sử dụng enzyme thương mại

Viscozyme với nồng độ 2% (v/w); pH bằng 5,5; nhiệt độ ủ 40oC; thời gian ủ 2 giờ thì tăng khả năng thu nhận hợp chất organosulfur (diallyl disulfide) từ tỏi lên gấp ba lần Ứng dụng các thông số tối ưu của enzyme Viscozyme vào qui trình chế biến các sản phẩm tỏi, làm tăng hiệu suất thu nhận dịch ép tỏi, tinh dầu tỏi lên từ 1,5 – 2 lần cũng như tăng hoạt tính kháng oxy hóa gấp 4 lần, hoạt tính kháng khuẩn tăng 1,5 lần và hàm lượng phenolic tổng tăng gấp 6 lần so với mẫu không xử lý bằng enzyme

ABSTRACT

We studied enzyme applications in extracting biological activity compounds from

garlic (Allium sativum) Results showed that, when using commercial enzyme

concentrations Viscozyme with 2% (v/w) ; pH 5.5 ; incubation temperature 40oC ; incubation time 2 hours, the acquisition increases organosulfur compounds (diallyl disulfide) from garlic to triple Application optimization parameters of enzyme Viscozyme in the process products processed garlic, increase acquisition performance garlic juice , garlic essential oil up from 1.5 to 2 times as well as increased activity against oxidative folding 4 times , the antimicrobial activity increased 1.5 times and total phenolic content increased 6 times compared with samples not treated with an enzyme

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây tỏi 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân loại 3

1.1.3.5 Hoạt tính kháng oxy hóa 10

1.1.3.6 Hoạt tính chống ung thư 11

1.2 Một số phương pháp chiết xuất thường dùng 14

1.2.1 Ngâm 14

1.2.2 Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt 14

1.2.3 Phương pháp chiết tách ngược dòng 15

1.2.4 Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn 16

1.2.5 Chiết dùng sóng siêu âm 16

1.3 Ứng dụng enzyme trong chiết xuất các hợp chất sinh học 17

1.3.1 Giới thiệu về enzyme thương mại Viscozyme L 19

1.3.1.1.Đặc tính của enzyme Viscozyme L 19

1.3.1.2 Cơ chế xúc tác cho phản ứng thủy phân 19

1.3.1.3 Hiệu quả của enzyme Viscozyme L 20

1.3.1.4 Ứng dụng của enzyme Viscozyme L 21

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất trên thế giới và trong nước 21

PHẦN 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 24

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 24

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 24

2.1.3 Nơi thực hiện nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.5.2 Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm kháng khuẩn 29

2.3 Nội dung nghiên cứu 31

2.3.1 Xác định phần trăm trọng lượng khô của tỏi 31

2.3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của tỏi Lý Sơn 31

2.3.3 Chiết xuất hợp chất từ tỏi: 34

2.3.4 Các bước khảo sát chiết xuất hợp chất từ tỏi có bổ sung enzyme 34

2.3.5 Xây dựng qui trình xử lý tỏi tươi bằng Viscozyme 36

2.3.5.1 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme thích hợp 37

2.3.5.2 Xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme 39

2.3.5.3 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme 40

2.3.5.4 Xác định thời gian phản ứng thích hợp của enzyme 41

2.3.6 Thử nghiệm chiết diallyl disulfide, chế biến các sản phẩm (tinh dầu, dịch ép và bột tỏi) từ tỏi tươi có bổ sung Viscozyme 42

2.3.6.1.Quy trình chiết diallyl disulfide từ tỏi sau khi xử lý bằng enzyme 42

2.3.6.2 Thu tinh dầu tỏi có sự hỗ trợ của enzyme Viscozyme 45

2.3.6.3 Thu nhận dịch ép tỏi có bổ sung enzyme 46

2.3.6.4 Sản phẩm bột tỏi có bổ sung enzyme 49

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 50

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Xác định hàm lượng nước trong tỏi Lý Sơn 51

3.2.Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của tỏi Lý Sơn 52

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme trong chiết xuất 55

3.3.1 Kết quả xác định nồng độ enzyme Viscozyme thích hợp 55

3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu quả xúc tác của enzyme 56

3.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme 57

3.3.4.Kết quả khảo sát thời gian phản ứng của enzyme đến hiệu quả chiết xuất 58

3.4 Đánh giá hiệu quả của phương pháp chiết xuất diallyl disulfide so với phương pháp chiết xuất truyền thống 60

3.4.1 Hiệu quả của enzyme trong chiết xuất diallyl disulfide 60

3.4.2 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do ABTS của dịch chiết tỏi 61

3.4.2.1 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do ABTS của dịch chiết tỏi với mẫu không xử lý bằng enzyme 61

3.4.2.2 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do ABTS của dịch chiết tỏi với mẫu có xử lý bằng enzyme 61

3.5 Khảo sát hiệu quả sử dụng enzyme khi thu tinh dầu tỏi 62

3.5.1 Hiệu quả sử dụng enzyme khi thu tinh dầu tỏi 62

3.5.2 Phân tích hợp chất sulfide của mẫu tinh dầu tỏi Lý Sơn bằng phương pháp Sắc ký khí khối phổ (GC/MS) 63

3.6 Khảo sát hiệu quả sử dụng enzyme thu dịch ép tỏi 65

3.6.1 Hiệu quả thu dịch ép tỏi 65

3.6.2 Khả năng kháng khuẩn của dịch ép tỏi 66

3.7 Khảo sát hiệu quả sử dụng enzyme khi thu sản phẩm bột tỏi 67

3.7.1 Đánh giá chất lượng bột tỏi thu được: 67

3.7.2 Xác định lượng phenolic tổng của bột tỏi 68

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

PHỤ LỤC 78

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo Allicin 6

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa hình thành Allicin 7

Hình 1 3 Công thức cấu tạo Diallyl disulfide 7

Hình 1.4 Công thức Ajoene 8

Hình 1.5 Tác động của enzyme lên cấu trúc thành tế bào tỏi 20

Hình 2.1 Quy trình thu dịch chiết 32

Hình 2.2 Qui trình dự kiến chiết diallyl disulfide từ tỏi tươi 35

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme thích hợp 38

Hình 2.4 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH 39

Hình 2.5 Thí nghiệm xác định nhiệt độ ủ thích hợp 40

Hình 2.6 Thí nghiệm xác định thời gian phản ứng thích hợp 41

Hình 2.7 Qui trình chiết diallyl disulfide từ tỏi tươi sau khi xử lý enzyme 43

Hình 2.8 Các bước tiến hành thu nhận tinh dầu 45

Hình 2.9 Qui trình thu dịch ép tỏi 47

Hình 2.10 Qui trình chế biến bột tỏi có bổ sung enzyme 49

Hình 3.1.Kết quả xác định nồng độ enzyme Viscozyme thích hợp 55

Hình 3.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của pH 56

Hình 3.3 Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ 57

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất thu diallyl disulfide 58

Hình 3.5 Quy trình xử lý tỏi tươi bằng enzyme 59

Hình 3.6 Kết quả GC/MS tinh dầu tỏi không có enzyme 64

Hình 3.7 Kết quả GC/MS tinh dầu tỏi có enzyme 64

Hình 3.8 Kết quả đường kính kháng khuẩn (mm) của hai mẫu dịch ép tỏi 66

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong củ tỏi 5

Bảng 2.1.Các phản ứng hóa học định tính những nhóm hợp chất 33

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của tỏi 51

Bảng 3.2.Kết quả định tính các hợp chất hữu cơ trong tỏi Lý Sơn 53

Bảng 3.3 Kết quả chiết xuất Diallyl disulfide từ tỏi tươi có xử lý bằng enzyme 60

Bảng 3.4.Kết quả khả năng bắt gốc tự do của dịch chiết tỏi không có enzyme 61

Bảng 3.5.Kết quả khả năng bắt gốc tự do của dịch chiết tỏi có enzyme 62

Bảng 3.6 Kết quả hiệu suất chiết mẫu tinh dầu có và không có enzyme 63

Bảng 3.7 Kết quả thu dịch ép tỏi mẫu có xử lý enzyme và không xử lý enzyme 65

Bảng 3.8 Kết quả hàm lượng chất khô hòa tan của bột tỏi 67

Bảng 3.9 Kết quả phenolic tổng của bột tỏi 68

MHA: Muler Hinton Agar

MRSA: Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

OD: Mật độ quang rpm: round per minute (vòng/phút) SAC: S-allylcysteine

SAMC: S-allylmercaptocysteine TCP: Total content phenolic (Lượng phenolic tổng) WHO: Tổ chức y tế thế giới

MỞ ĐẦU

Ai cũng biết rằng: ăn ở và mặc là nhu cầu không thể thiếu đối với con người Chính vì thế chế biến món ăn ngon hỗ trợ cho sức khỏe luôn được khuyến khích đề cao Gia vị là một phần không thể thiếu, về trực giác nó là chất điều vị giúp gia tăng hương vị, màu sắc và tăng sự hấp dẫn cho món ăn điều này một phần giúp cho sự tiêu hóa và hấp thụ thức ăn tốt hơn nhưng về sâu xa sử dụng gia vị là tận hưởng hoạt chất kháng sinh thực vật–phytolcid (fitolcid) có công dụng giúp cơ thể kháng khuẩn Có thể thấy công dụng của mỗi loại gia vị luôn tồn tại trong kho tàng tri thức

nhân gian và đã được khoa học chứng minh, trong số các gia vị đó có tỏi (Allium

sativum)

Tỏi (Allium sativum) được sử dụng trên toàn thế giới vì hương vị cay nồng của nó

như là một gia vị Con người đã sử dụng tỏi hơn 7000 năm Nguồn gốc của tỏi từ Trung Á, được trồng và sử dụng nhiều nơi khác như khu vực Địa Trung Hải, Châu Phi, Châu Âu Đặc biệt tỏi được sử dụng cho mục đích y học tại Ai Cập cổ [1] Ở Việt Nam tỏi được trồng từ rất lâu đời và được trồng khắp mọi miền nhưng tập trung nhiều ở huyện Kim Môn (Hải Dương), Gia Lâm (Hà Nội), Lý Sơn (Quảng Ngãi), Ninh Thuận

Có nhiều công nghệ được đề nghị để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tỏi như dùng dung môi hữu cơ, phương pháp khai thác CO2 siêu tới hạn, dùng sóng siêu âm Tuy nhiên việc sử dụng các dung môi hữu cơ có một số nhược điểm: mối nguy hiểm về sự an toàn (cháy, nổ), năng lượng đầu vào cao, chất lượng sản phẩm thấp, nguy hại môi trường, tồn dư dung môi hữu cơ trong sản phẩm [2] Cùng với nhược điểm đó thì việc chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật có thể bị hạn chế do cấu tạo của tế bào thực vật

Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp chiết xuất truyền thống, hạn chế do cấu tạo của tế bào thực vật (tỏi) Cũng như ứng dụng một phương pháp chiết xuất có thể tăng hiệu quả chiết xuất và tăng giá trị sinh học, chúng tôi chọn đề tài “

Ứng dụng enzyme trong chiết xuất các hợp chất sinh học và đa dạng hóa các sản phẩm từ tỏi “

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây tỏi 1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân loại

Cây tỏi có tên khoa học là Allium sativum L Các gọi thường gặp là Tỏi ta (Việt

Nam), Garlic (Anh, Mỹ), Ail (Pháp), Knoblauch (Đức) [3] Tỏi ta là tên gọi cây tỏi được sử dụng thống nhất trên toàn lãnh thổ Việt Nam Về phân loại thực vật tỏi thuộc:

Cây tỏi thuộc loài thảo nhỏ, thân thực hình trụ, phía dưới mang nhiều rễ phụ, phía trên mang nhiều lá Lá cứng, hình dải, thẳng dài 15 – 50 cm, rộng 1- 2,5 cm có rãnh khía, mép lá hơi ráp Ở mỗi nách lá phía gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển thành một tép tỏi, các tép này nằm chung trong một cái bao (do các bẹ lá trước đó tạo ra) thành một củ tỏi tức là thân hành (giò) của tỏi Hoa xếp thành tán ở ngọn

thân trên một cánh hoa dài 55cm hay hơn Bao hoa màu trắng hay hồng bao bởi một cái mo dễ rụng tận cùng thành mũi nhọn dài Củ tỏi có kích thước trung bình 2-4 cm, có màu trắng, mỗi củ có từ 12-20 tép tỏi [4].Tỏi thích hợp với nhiệt độ 60 độ đến 70 độ F, đất thông thoáng không ứ nước, có tính axit nhẹ

Tỏi được trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, ở Việt Nam tỏi được trồng chủ yếu ở Lý Sơn (Quảng Ngãi), Ninh Thuận, Kim Môn (Hải Dương), Gia Lâm (Hà Nội) Cây tỏi Lý Sơn: Được trồng chủ yếu tại huyện đảo Lý Sơn, vùng đất được hình thành do quá trình hoạt động của núi lửa và do sự bồi đắp của cát biển Củ tỏi Lý Sơn có kích thước nhỏ, tép tỏi vừa, màu trắng, mùi vị cay nồng, thơm, ăn xong có vị ngọt dịu nhẹ Năm 2009, tỏi Lý Sơn được Cục Sở Hữu Trí Tuệ Việt Nam công nhận thương hiệu Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao áp (HPLC) với detector PDA đã xác định được hàm lượng allicin của tỏi Lý Sơn là 0,767% cao hơn tỏi ta (0,712%) và tỏi Trung Quốc (0,670%) [5] Cao chiết toàn phần tỏi thu hái tại đảo Lý Sơn có tác dụng ức chế tăng cholesterol và triglycerid trong máu động vật thí nghiệm trên cả hai phương pháp tăng cholesterol nội sinh và ngoại sinh, tác dụng này mạnh hơn tỏi ta và tỏi Trung Quốc [6]

1.1.2 Thành phần hóa học và một số hợp chất chính

1.1.2.1 Thành phần hóa học

Về phương diện dinh dưỡng và trị liệu củ tỏi có tính sát trùng do có chứa các hợp chất sulfur, giúp tạo cảm giác thèm ăn do kích thích vị giác và trợ tiêu hóa[7] Thành phần hóa học trong củ tỏi thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong củ tỏi

Thành phần hóa học (100g)

Nước (%) Protein (g)

Lipid (g) Glucid (g) Magie (mg)

Canxi (mg) Phospho (mg)

Kẽm (mg) Kali (mg) Mangan (mg)

Natri (mg) Vitamin C (mg)

Selen (µg) Axit folic (Vitamin B9)(µg)

Vitamin B6(mg) Axit pantothenic (Vitamin B5) (mg)

Niacin (Vitamin B3) (mg) Riboflavin(Vitamin B2) (mg)

Thiamin (Vitamin B1) (mg) Betacaroten (µg)

65 6, 39

0, 5 1 25 181 153 1, 16

401 1, 67

17 31, 2 14, 2

3 1, 23 0, 59 0, 7 0, 11

0, 2 5

1.1.2.2 Một số hợp chất chính

a/ Allicin

Năm 1947, Stoll và Seebeck đã phân lập được một amino acid chứa lưu huỳnh từ tỏi và đặc tên là alliin [8] Bản thân alliin không có hoạt tính kháng khuẩn và tương đối bền Vì alliin có hai nguyên tử bất đối nên có thể có bốn đồng phân quang học,

nhưng trong tỏi chỉ thấy có một đồng phân (+) –S–allyl–L–cystein sulfoxide Alliin là hợp chất đầu tiên được tìm thấy trong thiên nhiên chứa một nguyên tử lưu huỳnh và một nguyên tử carbon bất đối Alliin có hàm lượng 5 đến 14 mg trong một gram tỏi tươi Do có nhóm amin, carboxyl, liên kết đôi, nên alliin có khả năng phản ứng hóa học rất cao Trong các điều kiện phản ứng khác nhau, alliin dễ dàng bị chuyển hóa để tạo ra các sản phẩm Một trong những phản ứng chuyển hóa cơ bản và quan trọng nhất là sự tạo thành allicin dưới tác dụng của enzyme allinase [8] Sự chuyển hóa này xảy ra cực kỳ nhanh ở nhiệt độ phòng chỉ trong vòng 10 giây Allinase có mặt trong tỏi với lượng lớn khác thường đối với một enzyme, gồm ít nhất 10% protein tổng số của tép tỏi Các tép tỏi chứa các lượng allinase và alliin xấp xỉ bằng nhau (10mg/g trọng lượng tươi) Điều này có thể giải thích rõ tại sao alliin lại chuyển hóa thành các thiosulfide quá nhanh khi tỏi được ép ra [9]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo Allicin

Ở điều kiện bình thường, trong các tế bào nguyên vẹn của tỏi, allinase và alliin bị tách biệt về mặt vật lý: các enzyme allinase tồn tại trong không bào trong khi alliin tồn tại ở tế bào chất Tuy nhiên khi tép tỏi bị nghiền nát hoặc bị tổn thương, thì hai phân tử này có mặt ở cùng một nơi xảy ra phản ứng Do đó cắt càng nhỏ hoặc càng đập nát, dịch tỏi có hoạt tính càng cao

Allicin là hợp chất có tính kháng sinh mạnh Allicin không phải là cấu tử hiện diện tự nhiên trong tỏi mà nó được hình thành S-Allylcystein sulfocide hay alliin Bản thân alliin không có tác dụng kháng khuẩn nhưng dưới tác dụng của enzyme allinase có sẵn trong tỏi sẽ tạo thành allicin – một ankyl thiosulfinate Allicin có vai trò kháng khuẩn và kháng nấm Quá trình chuyển hóa hình thành allicin được thể hiện trong sơ đồ sau

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa hình thành Allicin

Alliin là một chất kết tinh, không màu, tan được trong nước và hầu như không mùi ; ngược lại Allicin là chất lỏng không màu, có mùi tỏi mạnh có khối lượng riêng (d= 1,112 g/cm3) Khi cho kết hợp với kiềm thì allicin tạo thành allyl disulfide kết tủa.Allicin khi kết hợp với cystein hoạt tính sinh học của nó không tồn tại do tạo nên chất mới, chất này không mang đặc tính giống allicin

b/ Hợp chất Diallyl disulfide

Hình 1 3 Công thức cấu tạo Diallyl disulfide

Diallyl disulfide một hợp chất có tên gọi là organosulfur Organosulfur là một chất lỏng màu vàng, không hòa tan trong nước và có mùi tỏi mạnh, có nhiệt độ sôi 138

ứng Trong công nghiệp thực phẩm, Diallyl disulfide được sử dụng để giữ mùi vị cho thịt, rau và trái cây

Thành phần hóa học của tỏi đã công bố ở tài liệu [7] có chứa allicin, diallyl disulfide, diallyl trisulfide, ajoene…Và cũng chứng minh được allicin, diallyl disulfide, ajoene… là những hợp chất có khả năng kháng khuẩn cao, có tính chất quyết định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tỏi Mặt khác xét về mặt tính chất thì allicin là chất không màu, dễ bị oxy hóa làm cho hoạt tính kháng khuẩn giảm đi nhiều Còn diallyl disulfide là chất có màu vàng, bền hơn allicin Bằng phương pháp đo quang phổ có thể xác định được hàm lượng của diallyl disulfide ở bước sóng λmax= 240 nm [10]

Ajoene cũng được biết là hợp chất có phổ kháng khuẩn rộng (kháng khuẩn và kháng

nấm), là chất ngăn ngừa nhiễm nấm men (Candida albicans) hiệu quả Ajoene thậm

chí đã được chứng minh hiệu quả trong việc ức chế tăng trưởng tế bào khối ung thư [11]

1.1.3 Hoạt tính sinh học

Tỏi đã được xem như là một loại thảo dược từ xa xưa Tác dụng dược lý chính của tỏi là do các hợp chất organosulfur Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng tỏi có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống ký sinh trùng, kháng virus, chất kháng oxy hóa, cũng như chống huyết khối và chống ung thư Nó cũng có tác dụng giảm

cholesterol trong huyết tương, giảm huyết áp và giảm kết tập tiểu cầu[12]

1.1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Khả năng kháng khuẩn là một trong những đặc tính đầu tiên được nghiên cứu ở tỏi Tỏi đã được chứng minh là ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gram âm, gram dương và kháng acid cũng như các loại sản xuất độc tố Những vi khuẩn mà tỏi có

hiệu quả bao gồm các chủng Pseudomonas, Proteus, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Klebseilla, Salmonella, Micrococcus, Bacillus subtilis, Mycobacterium và Clostridium Một vài trong số các vi khuẩn đó kháng Penicillin,

Streptomycin, Doxycilline và Cephalexin Gần đây có báo cáo là chiết xuất từ tỏi có

tác dụng diệt vi khuẩn Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus,

Porphyromonas gingivalis và Prevotella intermedia (vi khuẩn gram dương) là

những vi khuẩn gây sâu răng và bệnh nha chu Chất có hoạt động kháng khuẩn của tỏi là chợp chất sulfur có nguồn gốc từ allicin như DAS, DADS và ajoene cũng như các thiosulfinate khác được phân lập từ tỏi ngâm dầu Các nghiên cứu dịch tễ học đã

chứng minh DAS và DADS từ tỏi có thể bảo vệ chống lại nhiễm trùng Helicobacter

pylori, vì vậy giảm nguy cơ tổn thương tăng sinh trong dạ dày[13].

1.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm

Nghiên cứu in vitro và in vivo đã thể hiện một hiệu quả tuyệt vời của tỏi và các dẫn

xuất của nó kháng lại một phổ rộng nấm sợi và nấm men, bao gồm Candida,

Trichophyton, Torulopsis, Rhodotorula, Cryptococcus, Aspergillus và Trichosporon

cũng như một hoạt động hiệp đồng với amphotericin B (một trong các thuốc kháng nấm chính) trong ống nghiệm Hoạt động các hợp chất của tỏi tiêu diệt các tế bào nấm là làm giảm sự hấp thu oxy, ức chế tổng hợp protein, lipid, axit nucleic và ức

chế sự tổng hợp vách tế bào nấm Cũng giống như hoạt tính kháng khuẩn, các chất kháng nấm từ các chiết xuất của tỏi là các sản phẩm biến đổi của allicin như DATS, DADS, DAS và ajoene[13]

Rhinovirus, virus gây suy giảm miễn dịch ở người, virus gây viêm phổi, rotavirus đã

được nghiên cứu[13]

1.1.3.4 Hoạt tính chống ký sinh trùng

Chất chiết xuất từ tỏi có hiệu quả chống lại Opalina ranarum, Opalina dimidicita,

Balantidum entozoom, Entamoeba histolytica, Tripanosoma brucei Một nghiên cứu

lâm sàng đã chứng minh tỏi có tác dụng chống Giardia lamblia và Giardia

intestinalis Tại Trung Quốc, DATS, một chất do sự chuyển hóa của allicin, dễ tổng

hợp và ổn định hơn allicin, là một sản phẩm thương mại gọi là Dasuansu được sử

dụng để điều trị nhiễm Giardia, Entamoeba histolytica và Trichomonas

vaginalis[13].

1.1.3.5 Hoạt tính kháng oxy hóa

Trong số các sản phẩm có nguồn gốc từ tỏi, AGE là sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất Điều này là do quá trình chiết xuất làm tăng tính ổn định và số lượng các hợp chất sulfur hòa tan trong nước là SAC và SAMC, với các hoạt động kháng oxy hóa mạnh SAC và SAMC là những hợp chất organosulfur chính được tìm thấy trong AGE, ngoài ra còn có các hợp chất tan trong dầu như DAS, DATS, DADS cũng có tác dụng kháng oxy hóa Một chất gần đây đã được xác định hoạt tính kháng oxy hóa của AGE là N-fructosyl glutamate, N-fructosyl arginine có hoạt tính kháng oxy hóa được so sánh với acid ascorbic[13]

1.1.3.6 Hoạt tính chống ung thư

Bắt đầu vào những năm 1950 khi Weisberger và Pensky (1958) chứng minh in vitro và in vivo là thiosulfinate chiết xuất từ tỏi ức chế sự tăng trưởng tế bào khối u Tỏi được cho là có tính chất phòng ngừa ung thư và tác dụng đó được nghiên cứu đối với các loại ung thư khác nhau Tác dụng kháng u là do tỏi có khả năng chống gây đột biến Mặc dù cơ chế chưa rõ, nhưng qua nghiên cứu in vitro và in vivo đã chứng minh có sự giảm đáng kể kích thứơc khối u khi bổ sung tỏi tươi Nhiều nghiên cứu đã được công bố là tỏi làm giảm nguy cơ ung thư và ung thư trong các mô và cơ quan khác nhau như dạ dày, đại tràng, thực quản, tuyến tiền liệt, bàng quang, gan, phổi, da Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra các hợp chất lưu huỳnh tan trong dầu và trong nước chiết xuất từ tỏi như DAS, diallyl sulfoxide (DASO), DADS, DATS có tác dụng kháng ung thư Các hợp chất lưu huỳnh khác như ajoene, DADS và DATS có thể ức chế sự tăng sinh tế bào khi nuôi cấy in vitro[13]

1.1.3.7 Tác dụng hạ cholesterol

Nhiều nghiên cứu trên chuột, thỏ khi sử dụng tinh dầu tỏi và tỏi nguyên liệu giảm đáng kể hàm lượng cholesterol trong huyết thanh, LDL, VLDL và làm tăng đáng kể HDL Trong một nghiên cứu khác khi sử dụng AGE trên thỏ làm giảm sự tích tụ cholesterol vào thành mạch Bên cạnh đó có một số báo cáo lâm sàng đã công bố những ảnh hưởng làm giảm cholesterol của tỏi sống và các sản phẩm của nó như

dầu tỏi và AGE[13]

1.1.3.8 Tác dụng hạ huyết áp

Một vài hợp chất có nguồn gốc từ allicin trong tỏi như ajoene, DAS, DATS, SAC đã được chứng minh là có tác dụng đối với bệnh tim mạch Tác dụng hạ huyết áp của tỏi đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên chuột cao huyết áp sử dụng AGE, bột tỏi, dịch tỏi[13]

1.1.3.11 Điều hòa miễn dịch

Các nghiên cứu cho thấy rằng, tỏi có tác dụng ức chế miễn dịch bởi nhiều tác nhân khác nhau như hóa trị liệu, chiếu tia UV, tâm lý và thể chất căng thẳng Việc duy trì miễn dịch kích thích cơ thể bảo vệ chống lại bệnh ung thư, suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và cải thiện lão hóa liên quan đến suy giảm nhận thức[13]

1.1.4 Các hình thức sử dụng tỏi: a/ Rƣợu tỏi:

Người ta có thể dùng tỏi bằng nhiều cách khác nhau, nhưng đặc biệt ở Ai Cập thì hầu như nhà nào cũng dùng rượu tỏi Vào thập kỷ 70 của thế kỷ 20, Tổ chức Y Tế Thế giới (WHO) nhận thấy Ai Cập là một nước nghèo, khí hậu sa mạc khắc nghiệt, nhưng sức khỏe chung của người dân vào loại tốt, ít bệnh tật, tuổi thọ trung bình vào loại tương đối cao Thấy đây là một hiện tượng lạ, WHO đã cử nhiều chuyên gia y tế đến Ai Cập nghiên cứu Các nhà y học đã chia nhau về vùng nông thôn và thâm nhập vào các vùng có khí hậu khắc nghiệt để khảo sát, thu thập tài liệu có liên quan đến sức khỏe, bệnh tật Họ có nhận xét chung là nhà nào cũng có một hũ rượu ngâm tỏi để uống Từ nhiều thế kỷ nay người dân Ai Cập vẫn giữ được tập quán này Tiếp đó qua nhiều nghiên cứu phân tích, người ta nhận thấy rượu tỏi có thể chữa được bốn nhóm bệnh xương khớp (viêm đau khớp, vôi hóa các khớp, mỏi

xương khớp), hô hấp (viêm họng, viêm phế quản, hen phế quản), tim mạch (huyết áp cao, huyết áp thấp, xơ vữa động mạch), tiêu hóa (ợ chua, khó tiêu, viêm loét dạ dày-tá tràng), bệnh trĩ, bệnh tiểu đường Các nhà khoa học nhận xét đây là loại thuốc có hiệu quả chữa bệnh cao, không gây phản ứng phụ [14]

Cách bào chế rượu tỏi: tỏi khô (đã bóc bỏ vỏ) 40 gram đem thái nhỏ, cho vào chai

ngâm với 100 ml rượu trắng 40 - 45 độ, thỉnh thoảng lại lắc chai rượu, dần dần rượu chuyển từ màu trắng sang màu vàng, đến ngày thứ 10 thì chuyển sang màu vàng nghệ và uống được Mỗi ngày uống 2 lần, sáng uống 40 giọt (tương đương một thìa cà phê) trước khi ăn ; tối uống 40 giọt trước khi ngủ [14]

Tỏi ngâm dấm trong môi trường acid (acid acetic), tác dụng của tỏi tăng gấp 4 lần nên dùng tỏi ngâm dấm là rất tốt

Cách chế biến: Lấy 50 gram tỏi tươi bóc vỏ rồi ngâm với 100 ml dấm, sau khoảng

10 ngày là dùng được, nếu để 30 ngày thì càng tốt

c/ Dầu tỏi

Thành phần có tác dụng chính trong tỏi là allicin, chất này bị phá hủy rất nhanh bởi nhiệt độ và sự oxy hóa, vì vậy nên dùng tỏi dưới dạng ngâm rượu uống, tuy nhiên nhược điểm lớn nhất là có mùi rất khó chịu và không tiện dụng Dầu tỏi là thành phần chứa nhiều allicin nhất trong tỏi Viên nang dầu tỏi GARLIC OIL là sản phẩm được các nhà khoa học Việt Nam chiết xuất từ giống tỏi tía bằng phương pháp

chưng cất lôi cuốn hơi nước, được bào chế dưới dạng viên nang mềm, khắc phục được mùi vị khó chịu của tỏi tươi và thuận tiện khi sử dụng

d/ Viên tỏi

Một dạng sản phẩm khác của tỏi là viên tỏi, viên tỏi có thành phần chính là bột tỏi và một số thành phần phụ khác như bột talc, magie carbonat, magie stearat…vỏ nang bằng gelatin Được đóng gói và sử dụng như thực phẩm chức năng

1.2 Một số phương pháp chiết xuất thường dùng

1.2.1 Ngâm

Là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa Nguyên liệu đã xử lý sơ bộ cho vào bình chiết sau đó đổ dung môi ngập nguyên liệu, ngâm trong một thời gian nhất định (tùy nguyên liệu), lấy dịch chiết rồi rửa bã bằng dung môi thích hợp Để tăng cường hiệu quả chiết rút có thể tiến hành khuấy trộn hoặc tuần hoàn cưỡng bức dung môi

Có nhiều cách ngâm: Ngâm tĩnh, ngâm động, ngâm nóng, ngâm lạnh, dung môi được bổ sung khi ngâm một hoặc nhiều lần

Phương pháp này có ưu điểm: Thiết bị đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng cũng có nhiều nhược điểm như năng suất thấp, phải thao tác thủ công Nếu chỉ chiết xuất một lần thì hiệu suất thu hồi thấp, còn nếu chiết nhiều lần thì tốn dung môi và thời gian

1.2.2 Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt

Ngâm nguyên liệu vào dung môi trong bình ngấm kiệt sau một thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới bình ngấm kiệt, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phái trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp vật liệu chiết nằm dưới Lớp dung môi trong bình chiết thường phải ngập lớp vật liệu khoảng 3–4 cm

Chiết xuất ngấm kiệt thường chia thành các phương pháp sau:

- Ngấm kiệt đơn giản: Là phương pháp ngấm kiệt luôn sử dụng dung môi mới để chiết đến kiệt chất cần thiết trong nguyên liệu

- Ngấm kiệt phân đoạn: Là phương pháp ngấm kiệt có sử dụng dung dịch chiết loãng để chiết mẻ mới hoặc chiết các mẻ chiết có mức độ chiết khác nhau Ưu điểm của phương pháp này là nguyên liệu được chiết kiệt hơn, đỡ tốn dung môi hơn phương pháp ngâm

Nhược điểm là năng suất thấp, phải thao tác thủ công, thao tác phức tạp hơn phương pháp ngâm Đối với ngấm kiệt đơn giản lại tốn nhiều dung môi

1.2.3 Phương pháp chiết tách ngược dòng

Là phương pháp sử dụng một số chuỗi thiết bị chiết tách, đường đi của dung môi và nguyên liệu ngược chiều nhau trong thiết bị Dịch chiết di chuyển trong thiết bị nhờ những cơ cấu chuyên dùng khác nhau Nguyên liệu trước khi lấy ra khỏi thiết bị được tiếp xúc với nguyên liệu mới nên dịch chiết thu được đậm đặc hơn, bã trước khi tháo khỏi thiết bị được tiếp xúc với dung môi mới nên bã được tách kiệt hơn

1.2.4 Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn

Phương pháp chiết tách bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn (SFE) là phương pháp tận dụng chất lưu ở trạng thái siêu tới hạn làm dung môi để chiết, tách thành phần khác nhau trong nguyên liệu từ chất rắn hoặc chất lỏng rối tiến hành phân tách

Chất lỏng siêu tới hạn hình thành khi nhiệt độ và áp suất vượt quá điểm tới hạn Ở trạng thái này, Tỷ trọng của pha lỏng và pha khí bằng nhau, ranh giới phân biệt giữa hai pha không tồn tại

Chất chiết dùng trong phương pháp này là khí carbonic (CO2), nhờ vào các đặc điểm không độc, không ăn mòn, điều kiện tới hạn thích hợp của CO2 nên nó trở thành chất lưu siêu tới hạn được dùng phổ biến nhất trong phương pháp chiết tách này

CO2 khi ở điểm tới hạn có nhiệt độ cao và áp suất cao sẽ xảy ra hai khuynh hướng: Nhiệt độ cao sẽ bay hơi, áp suất cao thì hóa lỏng Thế nên, ở khoảng nhiệt độ và áp suất nào đó, hai pha khí và lỏng cùng tồn tại, đó là trạng thái siêu tới hạn Khi mang tính chất của chất khí (dễ khuếch tán vào chất rắn) và chất lỏng (hòa tan chất khác) Người ta thường cho CO2 hóa lỏng ở áp suất cao để tạo điều kiện trích ly các chất có trong nguyên liệu rồi sau đó giảm áp suất để CO2 hóa khí, tiến hành thu hồi CO2nhằm tái sử dụng

Ưu điểm:

- Khả năng chiết xuất cao - Có khả năng tái sử dụng nên chi phí rẻ hơn - An toàn, độ tinh khiết cao

1.2.5 Chiết dùng sóng siêu âm

Là phương pháp ngâm chiết dùng sóng siêu âm có tác dụng tăng tần số và vận tốc chuyển động phân tử của vật chất, tăng khả năng thẩm thấu, tăng tốc độ và số lần thoát ra, rút ngắn thời gian chiết

Tác dụng của sóng siêu âm:

- Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành hạt nhỏ

- Phá vỡ một phần tế bào - Tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp - Có tác dụng làm tăng nhiệt tại chỗ Phương pháp chiết dùng siêu âm tuy có khả năng tăng cường quá trình chiết xuất nhưng phương pháp này chỉ mới được nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa có ứng dụng thực tế vì giá thành cao

1.3 Ứng dụng enzyme trong chiết xuất các hợp chất sinh học

Enzyme hỗ trợ trong chiết xuất là một kỹ thuật được ứng dụng trong thời gian gần đây để chiết xuất hợp chất sinh học từ nguyên liệu thực vật

Enzyme là protein được sản xuất bởi sinh vật sống, khả năng xúc tác chuyên biệt cao Enzyme tham gia xúc tác các phản ứng sinh hóa thiết yếu của vi sinh vật Enzyme cần thiết cho tất cả các quá trình trao đổi chất Mặc dù cũng giống như các protein khác, enzyme được tạo thành từ các amino acid, chúng khác nhau về chức năng nhưng có khả năng khác biệt là tham gia xúc tác các phản ứng sinh hóa mà không cần thay đổi cấu trúc Enzyme không chỉ là chất xúc tác hiệu quả mà còn là một chất thân thiện với môi trường [15]

Trong mỗi trường hợp ứng dụng enzyme, người ta phải tối ưu hóa điều kiện phản ứng về nồng độ enzyme, thời gian ủ, nhiệt độ ủ và pH Để sử dụng enzyme có hiệu quả trong thực phẩm cần phải biết rõ về bản chất của enzyme, nguồn gốc của enzyme, tâm hoạt động, phương thức xúc tác, điều kiện hoạt động tối ưu là rất cần thiết[15] Những enzyme như cellulase, hemicellulase, pectinase và sự kết hợp của các enzyme này đã được sử dụng tiền xử lý nguyên liệu thực vật Những enzyme này tác động trên thành phần vách tế bào, thủy phân chúng và tăng tính thấm của

vách tế bào, do đó năng xuất chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học cao hơn[16]

Phương pháp chiết xuất có sự hỗ trợ của enzyme đạt năng suất cao đối với các hợp chất: polysaccharide, các loại dầu, bột màu tự nhiên, hương vị và dược liệu[17-19] Việc áp dụng thành công các enzyme để chiết xuất các hợp chất như chiết xuất carotenoid từ hoa cúc vạn thọ và da cà chua[20], nanillin từ quả vani xanh [21].dầu từ hạt nho [19] và polyphenol [22] Các enzyme đã được sử dụng để làm tăng hoạt chất flavonoid từ nguyên liệu thực vật, trong khi giảm thiểu việc sử dụng các dung môi và nhiệt [23] Ví dụ: Sử dụng enzyme cellulase và pectinase chiết xuất lycopene từ cà chua trong điều kiện tối ưu làm tăng hàm lượng lycopene lên 206 % so với chiết xuất không sử dụng enzyme [24] tương tự như vậy sử dụng sử dụng pancreatin xử lý da cà chua làm tăng hiệu suất chiết xuất lên 2,5 lần Xử lý nguyên liệu với enzyme trước khi chiết xuất với dung môi làm tăng hiệu quả thu hồi lycopene [25] Các enzyme được sử dụng làm tăng hiệu suất chiết xuất flavonoid trong vỏ cam, quýt

Trong thực phẩm, enzyme pectinase được sử dụng để làm trong và tăng hiệu suất chiết xuất các loại nước ép trái cây [26], chiết xuất pectin [27], chiết xuất dầu [28] hương liệu và sắc tố từ nguyên liệu thực vật [19, 29] Các enzyme thường được sử dụng để chiết xuất dầu là cellulase, amylase và pectinase Enzyme kết hợp trong quá trình chiết xuất dầu thu hồi một hàm lượng cao chất chống oxy hóa trong dầu ô liu [30] Enzyme (pectinase và glucanase) được sử dụng cải thiện sản lượng dầu lên 15%, chất lượng dầu chiết xuất bằng enzyme tương đối tốt so với dầu chiết bằng hexane [30] Sự gia tăng của các hợp chất phenolic (25,90 – 39,72 %) và đường (12-14 g/l) đã được nhận thấy sau chiết xuất có hổ trợ của enzyme từ vỏ cam quýt và nho [31]

1.3.1 Giới thiệu về enzyme thương mại Viscozyme L

1.3.1.1.Đặc tính của enzyme Viscozyme L

- Viscozyme L là hỗn hợp các enzyme chứa một loạt các carbohydrase bao gồm cellulase, beta-glucanase, hemicellulase và xylanase Chế phẩm enzyme thu được từ

chủng đã được lựa chọn Aspergillus acuteatus

- Hoạt tính: 100 FBG/g - Điều kiện tối ưu cho Viscozyme L là pH: 3,3-5,5; nhiệt độ: 25-55oC - Khả năng hoạt động của Viscozyme L ở nhiệt độ thấp sẽ dẫn tới việc giảm năng lượng tiêu thụ trong việc chiết xuất

- Sản phẩm tuân thủ những điều kiện của FAO/WHO/JECFA và FCC đối với các chế phẩm tinh khiết được sử dụng trong thực phẩm

- Hãng sản xuất: Novozyme, Đan Mạch

1.3.1.2 Cơ chế xúc tác cho phản ứng thủy phân

- Enzyme Viscozyme L xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose và hemicellulose thành các sản phẩm hòa tan như oligosaccharide, glucose

- Enzyme Viscozyme L với hoạt tính hemicellulase: hemicellulase sẽ phá vỡ các sợi hemicellulose lớn tạo ra các mảnh vỡ cellulose có kích thước nhỏ hơn

- Enzyme Viscozyme L với hoạt tính cellulase: Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4-glucoside trong cellulose,

lignin và α-D-glucan một cách ngẫu nhiên Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ, cellobiose (disaccharide) và glucose

Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose β-glucosidase (hay còn gọi là cellobiase): tham gia phân giải cellobiose và ellotetrose thành glucose

Hình 1.5 Tác động của enzyme lên cấu trúc thành tế bào tỏi

1.3.1.3 Hiệu quả của enzyme Viscozyme L

Khả năng Viscozyme L giải phóng các vật liệu liên kết trong thành tế bào tỏi và bẽ gãy các polysaccharide không phải là tinh bột, thường được sử dụng để cải thiện sự có mặt tinh bột trong lên men và thông thường làm giảm độ nhớt của dịch và vì thế cải thiện hiệu suất thu hồi Việc chiết các thành phần từ tế bào thực vật và trong quy trình sản xuất các loại rau quả có thể được cải thiện bằng cách xử lý trước với Viscozyme L trước khi thực hiện quy trình sản xuất truyền thống Khả năng Viscozyme L thực hiện ở nhiệt độ thấp sẽ giảm năng lượng cần thiết cho chiết xuất Thêm vào đó hoạt tính amylase và lipase thấp trong Viscozyme L, thành phần của các vật liệu sẽ không bị ảnh hưởng trong quá trình chiết

1.3.1.4 Ứng dụng của enzyme Viscozyme L

Trong sản xuất bia: Viscozyme L được dùng trong giai đoạn lên men để tăng độ lên men 2-5% và giảm hàm lượng dextrin cuối cùng

Chế biến rau củ: Viscozyme L được sử dụng cho chế biến rau quả để tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết xuất các thành phần có giá trị của rau quả Những lợi ích của việc sử dụng enzyme Viscozyme L trong chế biến rau quả: cải thiện việc tách chiết các thành phần có giá trị và có lợi cho sức khỏe, cải thiện hiệu quả của qui trình, tiết kiệm chi phí, giảm bã

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất trên thế giới và trong nước

Diana NEAGU đã ứng dụng enzyme hỗ trợ trong chiết xuất carotenoid và phenolic từ mô cà chua Carotenoid được xác định và định lượng bằng HPLC-DAD, trong khi dẫn xuất phenolic được định lượng bằng quang phổ UV-VIS Các hoạt động chống oxy hóa được đo bằng DPPH Việc chiết xuất carotenoid có sự hỗ trợ của enzyme cellulase tăng hiệu suất 1,6 lần trong khi đối với β-carotene là 2,4 lần so với mẫu không có sử dụng enzyme Năng suất cao hơn của các dẫn xuất phenolic bằng việc chiết xuất có sự hỗ trợ của 10% enzyme pectinase thô là 174,6 mg GAE/ 100g trọng lượng khô Các hoạt động chống oxy hóa, dựa trên DPPH bắt gốc tự do cao hơn đáng kể so với mẫu chứng [32]

H.B Sowbhagya và cộng sự ứng dụng enzyme đối với tỏi trước khi chưng cất lôi cuốn hơi nước dẫn đến việc gia tăng gấp hai lần sản lượng dầu Sản lượng dầu khi sử dụng enzyme cellulase, pectinase, protease và Viscozyme tiền xử lý là trong khoảng 0,39-0,51 % so với 0,28 % trong mẫu đối chứng Nghiên cứu chứng minh enzyme tạo thuận lợi cho việc khai thác dầu tỏi, dẫn đến sự gia tăng sản lượng dầu[33]

Robert A Moreau và cộng sự nghiên cứu ứng dụng enzyme cellulase trong trích xuất dầu ngô từ mầm ngô với dung môi là nước, sản lượng dầu thu được là 80% so với sản lượng dầu không sử dụng enzyme là 27-37% [34]

Kwaku Tano-Debrah và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng enzyme protease, cellulase và amylase hỗ trợ trong chiết dầu dừa, năng suất tăng khoảng 50% so với mẫu chứng [35]

AK Landbo và cộng sự đã ứng dụng enzyme trong chiết xuất hợp chất polyphenol

từ bã nước ép nho đen (Ribes nigrum) làm tăng sản lượng phenol từ 1,6-5 lần [36]

H Farah Salina và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chiết xuất dầu hành với dung môi là nước đã chứng minh rằng việc thu hồi sản lượng dầu và hàm lượng phenolic tăng đáng kể [37]

Mai Huỳnh Cang và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng enzyme cellulase, pectinase,

protease và α-amylase trong chiết xuất dầu giàu carotenoid từ quả Gấc (Momordica

cochinchinensis Spreng.) có một tác động đáng kể vào việc thu hồi sản lượng dầu Hiệu

suất thu hồi dầu là 79,5% và tổng số carotenoid là 5,3mg/g trọng lượng khô [38]

Một số nghiên cứu sử dụng enzyme Viscozyme để xử lý nguyên liệu trước khi chiết xuất

Trong nghiên cứu của Robert N và các đồng sự (2008), chiết xuất dầu từ nhân hạt

xoài dại gabonensis không sử dụng dung môi hữu cơ, nhưng sử dụng enzyme để

chiết dầu Kết quả cho thấy rằng, quá trình chiết xuất mà không có enzyme cho phép thu được 27,4% dầu từ nhân hạt Khi sử dụng từng enzyme Alcalase, Pectinex và Viscozyme một cách riêng biệt, hiệu suất chiết dầu tương ứng là 35,0; 42,2 và 68% Nhóm tác giả đã thực hiện điều kiện tối ưu hóa điều kiện chiết xuất dầu từ nhân hạt với enzyme Viscozyme, xác định được điều kiện tối ưu như sau: tỷ lệ nhân hạt: nước 11:1, nồng độ enzyme 1,4-2,0%, thời gian ủ 14-18 giờ Kết quả sau khi xử lý bột nhân hạt bằng Viscozyme 2% trong 18 giờ, đã thu được hiệu suất chiết dầu 83% Trong cùng điều kiện, bằng cách thêm Alcalase 1% trong 2 giờ, hiệu suất 90% [39] Các kết quả nghiên cứu gần đây đã chứng minh việc xử lý bột ớt bằng enxyme Viscozyme L ở nhiệt độ 50oC, lắc trong thời gian 7 giờ, tốc độ 120 vòng /phút, tỷ lệ bột ớt: nước là 1:50 dẫn đến sự gia tăng hiệu suất đáng kể (11% caratenoid và 7% capsaicinoid) [40]

Trong nghiên cứu Danso-Boateng E (2011) đánh giá tác dụng của việc kết hợp sử dụng enzyme Viscozyme L và đồng thời xử lý nhiệt trước khi chiết đối với hoa hướng dương Kết quả nghiên cứu cho thấy xử lý nhân hạt hướng dương bằng Viscozyme ở nhiệt độ thường thì cho hiệu suất thu hồi dầu là 53,33%, nhưng khi xử lý bằng Viscozyme kết hợp với nổ nhiệt thì hiệu suất được cải thiện lên đến 55,38%[41]

E Barzana và cộng sự nghiên cứu ứng dụng enzyme Viscozyme thương mại trong

chiết xuất carotenoid từ hoa vạn thọ (Marigold Flower) làm tăng năng suất hơn

45%[42] Zheng H và các cộng sự (2009) đã nghiên cứu về sử dụng enzyme Viscozyme nhằm tăng hiệu suất chiết xuất polyphenol từ quả táo Nhóm tác giả đã xử lý quả táo bằng 0,02% Viscozyme; pH bằng 3,7; nhiệt độ ủ 50oC; thời gian 12 giờ Kết quả, hiệu suất chiết polyphenol (7,08%) cao hơn nhiều so với mẫu chiết không được xử lý bằng Viscozyme (3,2%)[43]

Những kết quả trên cho thấy Viscozyme tỏ ra có hiệu quả trong việc xử lý nhiều loại nguyên liệu khác nhau trước khi chiết dầu Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng Viscozyme trong xử lý tỏi trước khi chiết xuất thì chưa thấy, nên chúng tôi sẽ sử dụng enzyme Viscozyme trong nghiên cứu của mình

PHẦN 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Tỏi Lý Sơn được trồng tại vùng đảo Lý Sơn, tỉnh Quãng Ngãi Đặt mua tại công ty “Vua tỏi Lý Sơn”

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

Enzyme Viscozyme L của Novozyme thông qua Công ty Brenntag Việt Nam, được

sản xuất từ chủng Aspergillus aculeatus, với hoạt tính 100 FBG/g

Acid gallic (Ấn Độ, độ tinh khiết 98%); thuốc thử Folin-Ciocalteu Methanol; cồn tuyệt đối 96o,Na2SO4, NaOH; HCl; Na2CO3

Thiết bị

-Máy đo quang phổ UV-VIS, máy cô quay chân không, máy ly tâm, tủ sấy SANYO, cân điện tử, máy đo pH, máy đo độ ẩm AND MX95, tủ cấy vô trùng, thiết bị chưng cất tinh dầu …

2.1.3 Nơi thực hiện nghiên cứu

Phòng thí nghiệm trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vật lý Xác định độ ẩm

Nguyên tắc: độ ẩm có trong nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi [44]

Cách tiến hành: Cân 5g tỏi đã bóc vỏ cho vào máy đo độ ẩm, thực hiện sấy ở 105oC Lặp lại 3 lần và tính độ ẩm trung bình của tỏi

2.2.2 Phương pháp hóa học

Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của tỏi [45] Thành phần hóa học của một dược liệu là rất phức tạp và thường không thể biết được một cách tường tận Vì vậy, thông thường việc nghiên cứu thành phần hóa học của dược liệu thường bắt đầu bằng việc xác định các nhóm hợp chất thường gặp trong thực vật bằng phản ứng hóa học Trong phân tích thành phần hóa học thực vật, người ta thường sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng cho một nhóm hợp chất để xác định sự có mặt của hợp chất này trong nguyên liệu thực vật Việc phân tích này được tiến hành theo hai bước:

Bước 1: Phân tích sơ bộ Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành một vài phân đoạn đơn giản bằng cách sử dụng các qui trình chiết đơn giản, trong những điều kiện nhất định (dung môi, pH môi trường…) Định tính nhanh các hợp chất trong phân đoạn bằng thuốc thử chung

Bước 2: Định tính xác định Dùng các qui trình chiết đặc hiệu hơn, nhiều phản ứng đặc hiệu hơn để xác định sự có mặt của nhóm hợp chất

Quy trình dùng để xác định nhanh một số nhóm hợp chất thường gặp trong nguyên liệu thực vật bằng các phản ứng hóa học dựa trên nguyên tắc: Phân tách hỗn hợp các chất trong nguyên liệu thành phân đoạn theo độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình, phân cực mạnh Dùng phản ứng hóa học đặc trưng (thường là phản ứng kết tủa, phản ứng màu) để phát hiện nhóm hợp chất có trong dịch chiết Yêu cầu chung của các phản ứng hay thuốc thử sử dụng trong định tính một nhóm hợp chất là chúng phải đặc hiệu, nhạy và dễ phát hiện

Chiết xuất: Cân 10 gram bột tỏi và chiết lần lượt qua các dung môi diethyl ether, ethanol, nước cất, lượng dịch chiết của mỗi loại cô còn khoảng 50 ml để định tính

2.2.3 Phương pháp hóa lý

2.2.3.1 Đo quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS

Theo tài liệu tham khảo [10], để xác định hàm lượng diallyl disulfide trong dịch chiết tỏi với ethanol, chúng tôi sẽ tiến hành đo quang mẫu dịch chiết ở bước sóng λ

max =240 nm

Cơ sở lý thuyết của phương pháp

Cơ sở lý thuyết của phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS dựa trên định luật Lambert- Beer Khi năng lượng (tia) bức xạ đơn sắc đi qua dung dịch chứa chất hấp thụ thì cường độ của tia ló bức xạ có xu hướng giảm mạnh nếu có càng nhiều phân tử hấp thụ được năng lượng bức xạ Sự giảm cường độ phụ thuộc vào nồng độ chất hấp thụ và độ dài đoạn đường mà bức xạ đơn sắc đi qua

Cách tiến hành: Dịch chiết tỏi sau khi thu được, sử dụng cuvette thạch anh để đo ống trắng (ethanol+enzyme), ống mẫu dịch chiết tỏi ở bước sóng λ max =240 nm Thực hiện trên ba mẫu khác nhau và tính giá trị trung bình

2.2.3.2 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS)

Nguyên tắc:

GC/MS: là một trong những phương pháp pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Bản chất của phương pháp GC/MS, là sự kết hợp của Sắc ký khí và Khối phổ, ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram

Nhờ có khí trong bơm khí, mẫu từ buồng bơm hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký được diễn ra tại đây Sau khi rời khỏi cột tách tại

các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả

Cách tiến hành:

Mẫu được chuẩn bị bằng cách: hòa tan 20 uL mẫu trong 2 mL dung môi, sau khi làm khan bằng Na2SO4 thì lấy 20 uL dung dịch vừa pha hòa tan vào 2 mL dung môi, dung dịch cuối này được đem đi phân tích GC/MS

Nhiệt độ nguồn ion: 200oC Nhiệt độ phun: 250oC Chế độ phun: Split Nhiệt độ giao diện: 280oC Chế độ điều khiển dòng chảy: vận tốc tuyến tính Áp suất: 101.5 kPa

Tổng lưu lượng: 40 mL/min Lưu lượng cột: 1.76 mL/min Vận tốc tuyến tính: 48 cm/sec Dòng chảy purge: 3 mL/min Chia tỷ lệ: 20

Cột: ZB-5 (30m x 0.25 mm x 0.25 um) Khí ra hiện tại: 60 μA

Phạm vi quét: m/z = 16 - 480 Thời gian: 0.2s

Tốc độ quét: 2500 Chế độ ion hóa: EI, điện áp ion hóa 70 V Chương trình nhiệt độ: Giữ ở 45o

C trong 2 phút, gia nhiệt 5oC/phút lên 60oC, giữ ở 60oC trong 4 phút, gia nhiệt 5oC/phút lên 250oC, giữ ở 250oC trong 5 phút, gia nhiệt 10oC/phút lên 280oC và giữ ở 280oC trong 5 phút

2.2.4 Phương pháp hóa sinh

2.2.4.1 Xác định hàm lượng phenolic tổng

Nguyên tắc:

Lượng phenolic tổng trong bột tỏi được xác định bằng phương pháp dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu[46] Thuốc thử này chứa chất oxy hóa là axit phospho-vonframic, trong quá trình khử, các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxy hóa, chất oxy hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden Các thuốc thử Folin-Ciocalteu phản ứng với nhiều hợp chất polyphenol

Cách tiến hành:

100µl chiết xuất đã pha trong methanol, 100µl thuốc thử Faolin-Ciocalteu thêm vào, lắc đều Thêm 200µl Na2CO3 20%, quay ly tâm 1400 vòng /phút trong 3 phút, để ủ tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng 20 phút, đo OD ớ bước sóng 765 nm Vẽ đường chuẩn bằng acid garlic Hàm lượng phenolic tổng bằng GEA (mg/kg nguyên liệu bột tỏi)

2.2.4.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do ABTS

Nguyên tắc:

ABTS thường được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và nghiên cứu lĩnh vực nông nghiệp để đánh giá khả năng kháng oxy hóa thực phẩm [47]