ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC

3 2 Ứng dụng của kĩ thuật di truyền ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC NỘI DUNG 1 Giới thiệu 2 Nguyên lí kỹ thuật di truyền 3 Phân loại 4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền sản.Kỹ thuật di truyền có khả năng chữa lành các bệnh di truyền bằng cách hoán đổi gen bị lỗi với một gen còn hoạt động Những thực vật, động vật, hoặc vi sinh vật được thay đổi gen qua kỹ thuật di truyền được gọi là sinh vật biến đổi gen hoặc GMOs.

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI

TRUYỀN TRONG SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC

1 Giới thiệu

Khái niệm kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật

gen: là thao tác thay đổi gen bằng công nghệ sinh

học Nó bao gồm các phương pháp kỹ thuật dùng để thay đổi nhân tố di truyền của các tế bào, bao gồm sự dịch chuyển gen cùng loài và khác loài để tạo ra những sinh vật mới hoặc hoàn hảo hơn.

1 Giới thiệu

•Kỹ thuật di truyền có khả năng chữa lành các bệnh di truyền bằng cách hoán đổi gen bị lỗi với một gen còn hoạt động

•Những thực vật, động vật, hoặc vi sinh vật được thay đổi gen qua kỹ thuật di truyền được gọi là sinh vật

biến đổi gen hoặc GMOs.

2 Nguyên lý kỹ thuật di truyền

2.1 Các yếu tố cần thiết

2.1.1 Chuẩn bị gen mục tiêu

• Tách chiết DNA tổng số (DNA bộ gene)• Tách chiết DNA plasmid

• Tách chiết RNA

• Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm bằng điện di và quang phổ• Tổng hợp nhân tạo các oligonucleotide

2 Nguyên lý kỹ thuật di truyền

2.1.2 Các enzyme sử dụng trong kỹ thuật di truyền

2 Nguyên lý kỹ thuật di truyền

2.1.3 Vector tách dòng

2.1.5 Các hệ thống biểu hiện gen:

2 Nguyên lý kỹ thuật di truyền

2.1.4 Vector biểu hiện

2 Nguyên lý kỹ thuật di truyền

2.2 Các nguyên tắc

Nguyên tắc chọn vector tách dòng:

• DNA insert từ prokaryote: plasmid, phage, cosmid.

• DNA insert từ sinh vật bậc cao: NST nấm men nhân tạo, virus,…

Kỹ thuật biến nạp: bắn gen, vi tiêm, xung điện, sốc nhiệt, sử dụng

Kỹ thuật chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp:

• Chọn lọc bằng chỉ thị kháng sinh• Chọn lọc bằng chỉ thị màu

• Chọn lọc bằng phương pháp lai phân tử

3.1 Ý nghĩa của kĩ thuật di truyền

Y học

•Chẩn đoán bệnh, liệu pháp gen

•Phân tích miễn dịch và khối u, xác định vi khuẩn•Sản xuất protein

Công nghệ thực phẩm

•Lên men

•Phân tích di

truyền vi sinh vật • Xác định gen mã

•Tạo vi sinh vật chuyển gen

Nông nghiệp

•Xác định vị trí gen trong chọn tạo giống

•Cây chuyển gen

3.2 Ứng dụng của kĩ thuật di truyền

Ứng dụng kĩ thuật PCR

3.2 Ứng dụng của kĩ thuật di truyền

Công nghệ Protein tái tổ hợp

3.2 Ứng dụng của kĩ thuật di truyền

Liệu pháp gene

3.2 Ứng dụng của kĩ thuật di truyền

Ứng dụng công nghệ RNA

+ Antisense RNA

+ RNA can thiệp

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4.1 Sản xuất chế phẩm sinh học trong y học

4.1.1 Sản xuất insulin tái tổ hợp

• Năm 1922, Fred Banting và Charles Best tìm ra Insulin, ứng dụng thành công điều trị bệnh tiểu đường ở người.

• Bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA, chuyển gene mã hoá insulin vào tế bào vi khuẩn, khi được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, vi

khuẩn E.coli sẽ sinh tổng hợp tạo ra

loại peptide này.

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4.1 Sản xuất chế phẩm sinh học trong y học

4.1.2 Sản xuất hormon sinh trưởng người hGH tái tổ hợp

• hGH là loại hormon được sản xuất ở các tế bào tuyến yên trong não → điều hòa quá trình sinh trưởng và phát triển xương, cơ bắp.

• Gen hGH có đoạn trình tự mã hóa chuỗi peptide tín hiệu không

tương thích promoter của E.coli, do đó biểu hiện của gen hGH trong tế bào E.coli rất yếu hoặc không hoạt động Để có thể tạo hGH tái tổ hợp trong tế bào E.coli cần thay đổi cấu trúc đoạn gen mã hóa

peptide tín hiệu trước khi tách dòng gen hGH.

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4.1 Sản xuất chế phẩm sinh học trong y học4.1.3 Sản xuất interferon tái tổ hợp

• Interferon là một nhóm các protein tự nhiên được sản xuất bởi các tế bào của hệ miễn dịch ở người và hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virus, vi khuẩn, kí sinh trùng và tế bào ung thư

• IFN được sản sinh ra bởi nhiều loại tế bào như: tế bào T, B, đại thực bào, nguyên bào xướng và các loại tế bào khác.

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

Quy trình sản xuất interferon tái tổ hợp:

• Bước 1: Tách DNA mang gen mã hóa IFN ở người• Bước 2: Tạo vector tái tổ hợp

• Bước 3: Tạo dòng E coli mang gen mã hóa IFN• Bước 4: Lên men tạo sinh khối

• Bước 5: Thu nhận IFN

• Bước 6: Tinh sạch và thu IFN thành phẩm

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

• Các sản phẩm thương mại được phát triển dựa trên quy trình này như: vaccine phòng bệnh trên gà, vector tái tổ hợp Gamma interferon gà, và các loại thuốc cho gia súc, gia cầm.

• Hoặc Feronsure (Interferon alfa-2a của người) điều trị:

- Bệnh viêm gan C

- Bệnh bạch cầu tế bào tóc

- Bệnh Sarcom Kaposi kết hợp với hội chứng suy giảm miễn dịch;

- Bệnh bạch cầu tủy mãn tính có nhiễm sắc thể Philadenphia dương tính- U lympho tế bào T có biểu hiện ngoài da.

- Bệnh viêm gan B

- U lympho không Hodgkin’s độ ác tính thấp.- Ung thư thận

- U hắc tố ác tính - Bệnh đa u tủy.

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4.1 Sản xuất chế phẩm sinh học trong y học4.1.4 Vaccin DNA tái tổ hợp

• Vaccine tái tổ hợp là loại nucleic acid vaccine, dựa trên nguyên lý một gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc hiệu được tiêm vào vật chủ (tế bào động vật hoặc vi sinh vật) để sản xuất các kháng nguyên này và khởi động một phản ứng miễn dịch.

• Các công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp để tạo ra vaccine tái tổ hợp: 1 Chọn nguyên liệu

2 Cắt bằng enzyme RE (Restriction Endonuclease) II3 Công đoạn nối với sự tham gia của DNA ligase

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4.2 Ứng dụng trong thực phẩm

Sản xuất các enzyme tái tổ hợp

• Enzyme tái tổ hợp là enzyme do vi sinh vật có DNA biến đổi sản xuất ra nhờ thêm vào hệ gen của vi sinh vật đó đoạn DNA mã hóa cho protein quan tâm

• DNA tái tổ hợp là một đoạn DNA nhân tạo được tạo thành từ việc kết hợp 2 trình tự DNA khác nhau trong 1 plasmid

• Plasmid là một phân tử DNA xoắn kép, khép vòng, không nằm trong nhân, thường có mặt ở vi khuẩn và một số vi sinh vật nhân thật.

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4.2 Ứng dụng trong thực phẩm

Quy trình sản xuất enzyme tái tổ hợp dựa theo công nghệ protein tái tổ hợp:

• Bước 1: Tuyển chọn vi sinh vật có enzyme mong muốn• Bước 2: Tách và tinh sạch DNA tổng số

• Bước 3: Nhân DNA tổng số bằng kỹ thuật PCR Nhân cDNA bằng RT-PCR.• Bước 4: Biến nạp DNA mã hóa protein E vào vector tách dòng phù hợp.

• Bước 5: Biến nạp vector tách dòng đã mang gen mã hóa E vào vector biểu hiện• Bước 6: Biến nạp vector biểu hiện vào tế bào vật chủ

(Bước 3, 4, 5, 6 được goi là tạo vi sinh vật tái tổ hợp)

• Bước 7: Tìm điều kiện nuôi thích hợp để sinh tổng hợp protein E• Bước 8: Tách, tinh sạch E

• Bước 9: Kiểm tra độ sạch bằng phương pháp điện li• Bước 10: Đánh giá chế phẩm E

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4.2 Ứng dụng trong thực phẩm

Với các định hướng nghiên cứu chính nhằm phục vụ mục đích phân lập, tách dòng và biểu hiện gen tạo protein tái tổ hợp Sàng lọc các gen mã hoá protein tái tổ hợp hữu ích đáp ứng nhu cầu thực tiễn Xây dựng quy trình chuẩn để sản xuất, bảo quản enzyme, protein và kit chẩn đoán:

• Nghiên cứu biểu hiện gen ở các dòng tế bào khác nhau

• Sàng lọc các gen mã hoá protein tái tổ hợp từ các nguồn vi sinh vật, thực vật, vi tảo, xây dựng thư viện gen cho biểu hiện protein

• Thiết kế, xây dựng hệ thống vector và dòng tế bào biểu hiện protein tái tổ hợp; Phát triển quy trình biểu hiện protein, enzyme tái tổ hợp

• Phát triển các kit chẩn đoán bệnh trên động thực vật trên cơ sở tạo protein tái tổ hợp của các kháng nguyên, kháng thể có nguồn gốc từ virus, vi khuẩn, nấm bệnh…

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4.2 Ứng dụng trong thực phẩm

Một số sản phẩm trên thị trường hiện nay:

• Các chế phẩm enzyme tái tổ hợp như: protease (NPRC10), chitinase (CHI42) và glucanase (GLU1-TA và GLU2-TA).

• Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis ở bò, tiêu chảy ở lợn.

• Hormone GnRH, FSH và LH tái tổ hợp → công nghệ sinh sản động vật.

• Các kit chẩn bệnh dựa trên cơ sở tạo protein tái tổ hợp của các kháng nguyên, kháng thể có nguồn gốc từ virus, vi khuẩn, nấm bệnh nhằm chẩn đoán nhanh các bệnh dịch như tả ở lợn,

Salmonella ở gà, bệnh virus ở tôm.

• Các enzyme tái tổ hợp sử dụng trong công nghiệp dược phẩm, công nghệ thực phẩm chế biến như cycloamyloses.

• Các bộ kít phát hiện vi khuẩn, độc tố gây bệnh bằng công nghệ protein tái tổ hợp.• Enzyme tái tổ hợp lipase, lactosidase và cellulase.

• Các chủng E coli mang các gene tổng hợp và chuyển hóa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính

sinh học, các sesquiterpene và dẫn xuất.

4 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong sản xuất hợp chất sinh học

4.3 Sản xuất hợp chất sinh học trong môi trường

Cải thiện khả năng sản xuất nhiên liệu sinh học từ vi tảo bằng kỹ thuật di truyền:

- Biến đổi lục lạp ở Chlamydomonas

rehardtii, trong 5-8h có thể thu mật

độ trên 107.

- Cải thiện kiểu sản xuất, điều khiển quá trình chuyển hóa carbon, nâng cao năng suất

4.4 Đối với cây trồng

4.4.1 Lúa gạo

- Nghiên cứu về Arabidopsis IRT1 (AtIRT1) ở giống Medicago Sativa,

Nodulin 12B trong các dòng gạo NFP có hàm lượng sắt cao phát triển nicotianmine tổng hợp (AtNAS1) cho ra dòng lúa chuyển gen biểu hiện AtIRT1 tăng đáng kể lượng sắt và kết hợp với NAS và Ferritin đã làm tăng lượng sắt lên 9,6 µg/g DW trong hạt bóng, cao gấp 2,2 lần so với dòng NFP - Các hạt của dòng AtIRT1 cũng tích lũy nhiều đồng và kẽm hơn nhưng không có mangan

Kết quả: sự biểu hiện phối hợp của AtIRT1 , AtNAS1 và PvFERRITIN làm tăng sắt trong cả hạt gạo đã đánh bóng và chưa đánh bóng

Do đó, AtIRT1 là chất vận chuyển có giá trị cho các chương trình lọc sinh học sắt khi được sử dụng kết hợp với các gen khác mã hóa chất vận chuyển sắt hoặc protein dự trữ.

4.4 Đối với cây trồng

4.4.1 Lúa gạo

Tăng cường dự trữ sắt trong gạo

Hàm lượng sắt trong hạt, lá và rễ của các dòng biểu hiện AtIRT1.

Nồng độ đồng, kẽm và mangan trong các hạt của AtIRT1 thể hiện các dòng chuyển gen.

4.4 Đối với cây trồng

• Trong hầu hết các nhóm cây lương thực, khoảng 80% tổng lượng axit phytic được tích lũy trong aleurone Axit phytic tích tụ dưới dạng muối hỗn hợp được gọi là phytate.

• Phytate có 6 ion mang điện tích âm, làm cho nó trở thành chất chelat hóa trị mạnh đối với các cation hóa trị hai như Fe2+, Zn2+, Ca2+ và Mg2+ làm giảm hoạt tính của các khoáng chất này.

4.4.1 Lúa gạo

Sử dụng công nghệ RNAi đối với hàm lượng Phytate trong gạo

Con đường chuyển hóa axit phytic trong gạo

4.4 Đối với cây trồng

4.4.1 Lúa gạo

Sử dụng công nghệ RNAi đối với hàm lượng Phytate trong gạo

• Giảm 3,85 lần hàm lượng enzyme IPK1 đối với các hạt chuyển gen → giảm phytate và tăng phosphate vô cơ.

• Tích lũy sắt gấp 1,8 lần trong nội nhũ mà không cản trở sự tăng trưởng và phát triển của cây lúa chuyển gen.

• Nồng độ acid phytic giảm 46,2% bởi sự can thiệp RNAi gây bất hoạt gen của chất

tương đồng ITPK ở gạo Khitish Indica và

sự tích lũy sắt trong hạt giống tăng 1,3 lần, kẽm gấp 1,6 lần và gấp 3,2 lần sinh khả dụng của Pi.

Hình thái hạt được tìm thấy giữa gạo đối chứng (không biến đổi gen) và gạo được bổ sung dinh dưỡng sinh học (gạo nhiều sắt) khi sử dụng kĩ thuật can thiệp RNA.

4.4 Đối với cây trồng

4.4.1 Lúa gạo

Con đường sinh tổng hợp của Gạo vàng

Ba loại gạo vàng được nghiên cứu

Các giống Indica như IR64 và BR29 đã được biến đổi gen để tăng cường carotenoid trong hạt Tổng số carotenoid đã tăng lên 9,34 µg/g trong các giống Indica và β-caroten đã được biến đổi (provitamin A) ở hạt IR64 là 2,32 µg/g và BR29 là 3,92 µg/g.

4.4 Đối với cây trồng

4.4.1 Lúa gạo

4.4 Đối với cây trồng

4.4.1 Lúa gạo

Kĩ thuật CRISPR-Cas9 ở gạo

Super Basmati kháng bệnh bạc lá do vi khuẩn

Giản đồ của promoter cho thấy vị trí EBE trên promoter mà ba gRNA được thiết kế.

Phương pháp thực hiện:

- Thiết kế và xây dựng gRNAs

- Quá trình biến đổi xác định gạo chuyển gen

- Thử nghiệm Endonuclease T7

- Sàng lọc chống lại sự đề kháng của vi khuẩn

- Tách chiết RNA, tổng hợp cDNA và RT-qPCR

- Đánh giá kiểu hình

4.4 Đối với cây trồng

4.4.1 Lúa gạo

Kĩ thuật CRISPR-Cas9 ở gạo Super Basmati để kháng bệnh bạc lá do vi khuẩn

Giải trình tự Sanger của các cây đã được chỉnh sửa AvrXa7 và PthXo3 EBE.

4.4 Đối với cây trồng

4.4.2 Vaccine từ thực vật

Phương pháp phân phối gen

trực tiếpPhương pháp phân phối gen

gián tiếpVirus thực vật được biến đổi gen

Các nghiên cứu và sử dụng lâm sàng đối với các vaccine từ thực vật.

4.4 Đối với cây trồng

4.4.3 Thực vật phát sáng

• Kỹ thuật làm cho thực vật phát ra ánh sáng và chiếu sáng bền vững dựa trên cơ chế tạo và lưu trữ nguồn năng lượng độc lập và khả năng tự sửa chữa trong thực vật

• Nghiên cứu được thực hiện dựa trên kỹ thuật di truyền bằng cách sử dụng luciferase đom đóm gen 2 hoặc operon lux của vi khuẩn tạo protein phát sáng vào gen của cây cần thực hiện

Kết quả khả năng phát xạ ánh sáng

của 4 loài rau bina (spinacia

oleracea), rau arugula (eruca sativa),

cải xoong (nasturtium officinale), và cải xoăn (brassica oleracea).

4.4 Đối với cây trồng

Phương pháp nghiên cứu:

• Hạt giống của ba dòng cà chua Micro-Tom, CSl09-03 và Sheng Nv-Guo

• Tiến hành định lượng flavonoid

• Định lượng PCR thời gian thực (qRT-PCR)

• Định lượng khả năng chống oxy hóaKiểu hình cà chua đối chứng

và cà chua biểu hiện SlMYB1.

4.4.1 Tăng hàm lượng Flavonol cà chua

• Cà chua bi ( Lycopersicon esculentum M.)

được coi là một loại trái cây lành mạnh trên toàn thế giới do chứa nhiều chất dinh dưỡng • Flavonol, một trong những chất dinh dưỡng

chính trong cà chua bi, có đặc tính chống oxy hóa và điều chỉnh tế bào

5 Tính đạo đức

♦ An toàn sức khỏe: GMO không lành mạnh

Các nghiên cứu trên người cho thấy thực phẩm biến đổi gen (GM) có thể để lại vật chất bên trong cơ thể, nguy cơ gây ra các vấn đề lâu dài

Nhiều vấn đề sức khỏe sau khi GMOs được giới thiệu vào năm 1996 Tỷ lệ người Mỹ mắc các bệnh mãn tính tăng từ 7 - 13% trong 9 năm; dị ứng thực phẩm và các chứng rối loạn như tự kỷ, rối loạn sinh sản, các vấn đề tiêu hóa và những bệnh khác cũng gia tăng

♦ Vấn đề lo ngại đối với môi trường

Cây trồng biến đổi gen và các chất diệt cỏ liên quan có thể gây hại cho các loài chim, côn trùng, động vật lưỡng cư, hệ sinh thái biển và sinh vật đất → làm giảm sự đa dạng sinh học, gây ô nhiễm nguồn nước và sinh thái không bền vững.

♦ Tạo mầm bệnh tính kháng mạnh

GMO làm tăng việc sử dụng thuốc diệt cỏ: từ năm 1996 - 2008, nông dân Hoa Kỳ đã phun thêm 383 triệu pound thuốc diệt cỏ lên GMOs Lạm dụng Roundup quá mức dẫn đến "siêu tảo", kháng thuốc diệt cỏ Điều này đang khiến nông dân phải sử dụng nhiều loại thuốc diệt cỏ độc hại hơn Dẫn đến gây hại cho môi trường, thực phẩm biến đổi gen còn chứa dư lượng thuốc diệt cỏ độc hại cao hơn

5 Tính đạo đức

6 Kết luận