Nghiên cứu khả năng gắn kết của các hợp chất sinh học trong lá trầu không trên enzyme aspartyl proteinase có tác dụng kháng nấm candida albicans ở miệng

i BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GẮN KẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC TRONG LÁ TRẦU KHƠNG TRÊN ENZYME ASPARTYL PROTEINASE CĨ TÁC DỤNG KHÁNG NẤM CANDIDA ALBICANS Ở MIỆNG Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (Khoa, Trung tâm, …): Dược Chủ trì nhiệm vụ: TS Nguyễn Thụy Việt Phương Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GẮN KẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC TRONG LÁ TRẦU KHƠNG TRÊN ENZYME ASPARTYL PROTEINASE CĨ TÁC DỤNG KHÁNG NẤM CANDIDA ALBICANS Ở MIỆNG (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ) Cơ quan chủ quản (ký tên đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ (ký tên) Nguyễn Thụy Việt Phương Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) ii Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu đề tài TS DS Nguyễn Thụy Việt Phương Sinh viên Nguyễn Lê Trà Giang iii MỤC LỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH BẢNG v DÁNH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ vi ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm men Candida albicans 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Cấu tạo nấm men Candida albicans 2.1.3 Dấu hiệu triệu chứng 2.1.4 Chẩn đoán điều trị 2.2 Khám phá thuốc dựa tiếp cận in silico 2.2.1 Giới thiệu 5 2.2.2 Áp dụng khám phá thuốc dựa tiếp cận in silico virus Variola 2.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 3.1 Đối tượng nghiên cứu 10 3.2 Phần cứng phần mềm 10 3.2.1 Phần cứng máy tính 10 3.2.2 Phần mềm máy tính 10 Cơ sở liệu 11 3.3 3.3.1 Cơ sở liệu ligand 11 3.3.2 Cấu trúc mục tiêu tác động 11 3.4 Xây dựng mơ hình tương đồng 12 3.5 Quá trình docking (gắn kết phân tử) 13 3.5.1 Quá trình re-docking 13 3.5.2 Quá trình docking 15 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 4.1 Cấu trúc protein mục tiêu 18 4.1.1 Xây dựng mơ hình tương đồng cho cấu trúc VarTMK 18 iv 4.1.2 Chọn lọc cấu trúc protein mục tiêu 19 4.2 Cơ sở liệu ligand 19 4.3 Chất tiềm ức chế protein mục tiêu 19 4.3.1 Kết re-docking 19 4.3.2 Các chất có khả gắn kết tốt với virus Variola nhóm thuốc thử nghiệm kháng virus Variola 22 4.3.3 Các chất có khả gắn kết tốt với virus Variola nhóm thuốc kháng virus khác 26 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 41 45 v TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ DMET Absorption - Distribution – Metabolism Excretion – Toxicity QSAR Quantitative structure–activity relationship RMSD Root Mean Square Deviation (căn bậc hai bình phương độ lệch trung bình) Ala Alanin Arg Arginin Asn Asparagin Asp Acid Aspartic Ile Isoleucin Glu Acid Glutamic Gly Glycin Leu Leucin Lys Lysin Phe Phenylalanin Pro Prolin Ser Serin Thr Threonin Tyr Tyrosin Val Valin vi DANH SÁCH BẢNG STT Tên bảng Trang 2.2 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học trầu không 3.2 Thông số tọa độ phạm vi vùng gắn kết cho docking SAP2 21 4.1 Số lượng thông tin cấu trúc enzym SAPS từ ngân hàng 23 Protein Data Bank 4.2 Các acid amin quan trọng acid amin tạo nên vùng gắn 30 kết protein đích 4.3 Tương tác protein SAP2 ligand trước sau tiến 31 hành redocking 4.4 Năng lượng gắn kết nhóm chất từ tự nhiên có tiềm gắn kết tốt với protein đích 32 vii DANH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ STT Tên hình sơ đồ Trang 2.1 Cấu trúc tế bào nấm men 19 2.2 Hình thái trầu khơng 22 3.1 Sơ đồ qui trình tổng quát thực docking 25 4.1 Cấu trúc đồng kết tinh protein SAP2 28 4.2 Sự chồng lên ligand trước docking với ligand sau 31 docking 4.3 Tương tác ligand protein trước sau redocking với 34 SAP2 4.4 Các cấu trúc thuộc nhóm gắn với protein mục tiêu 35 4.5 Các cấu trúc thuộc nhóm gắn với protein mục tiêu 36 4.6 Tương tác 2-ethylacridin với protein mục tiêu 38 viii THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thông tin chung ‒ Tên đề tài: Nghiên cứu khả gắn kết hợp chất sinh học trầu khơng enzyme Aspartyl proteinase có tác dụng kháng nấm Candida Albicans miệng Mã số: ‒ Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thụy Việt Phương ‒ Điện thoại: 0919 52 07 08 Email: ntvphuong@ump.edu.vn ‒ Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Bộ môn Công Nghệ Thông Tin Dược – Khoa Dược – ĐH Y Dược Tp.HCM ‒ Thời gian thực hiện: 10/2018 đến 10/2019 Mục tiêu Tìm hợp chất sinh học có nguồn gốc từ Trầu khơng làm chất khởi nguồn có khả gắn kết tốt với thụ thể protein, dẫn đến ức chế nấm men thông qua khảo sát tương tác hợp chất tự nhiên protein mục tiêu - enzym aspartyl proteinase - cho tác động kháng nấm Nội dung ‒ Xác định cấu trúc protein mục tiêu thụ thể tác động cho trình nghiên cứu thuốc kháng nấm ‒ Sử dụng phương pháp gắn kết phân tử (molecular docking) để khảo sát tương tác chất có trầu khơng với mục tiêu tác động ‒ Nhận dạng chất gắn kết tốt enzyme Sap để chọn lọc chất kháng nấm tiềm Kết đạt (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ) - Các cấu trúc protein mục tiêu thụ thể quan trọng cho trình nghiên cứu thuốc kháng nấm - Các chất gắn kết enzyme Aspartyl proteinase Candida albicans - Các chất tiềm kháng Candida albicans - Những kết đạt từ đề tài ứng dụng cho trình sàng lọc thuốc kháng nấm Candida albicans từ hợp chất thiên nhiên ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm nấm niêm mạc miệng bệnh nhiễm trùng hội hay gặp, thường chủng loại nấm Candida gây ra, tiêu biểu Candida albicans (C albicans) [1] Nấm men tìm thấy khoang miệng khoảng 50% dân số giới thành phần bình thường hệ vi sinh vật có khoang miệng [1] Tuy nhiên, suy giảm miễn dịch mắc số bệnh mạn tính, tỷ lệ tử vong gây bệnh cao Trong năm gần đây, tình hình đề kháng với thuốc kháng sinh kháng nấm ngày gia tăng Việt Nam giới, có tình hình đề kháng với C albicans Vì vậy, việc tìm hoạt chất tiềm điều trị nấm khoang miệng C albicans vô cấp thiết Theo nghiên cứu công bố, men secreted aspartyl proteinases (SAPs) men Candida albicans tiết ra, đóng vai trị gián phân protein để cung cấp nitơ cho chuyển hóa tế bào nấm, góp phần vào việc kết dính tạo thuận lợi cho q trình thâm nhập nội mơ biểu mơ nấm Có tổng cộng 10 gen SAPs bao gồm nhóm men SAP1-SAP3, SAP4-SAP6, SAP7, SAP8, SAP9 SAP10 tương đồng trình tự hoạt tính pH Ức chế men aspartyl proteinase dẫn đến ức chế phát triển Candida albicans góp phần vào điều trị bệnh nhiễm nấm nấm men gây miệng [2] Hiện nay, nước có số nghiên cứu thực trầu không Piper betle L hay Piper scriboa L (họ Hồ tiêu – Piperaceace) cho thấy tiềm kháng nấm chất có trầu khơng [3], đề tài hướng đến việc sàng lọc ảo (in silico) nhằm mục đích tiết kiệm thời gian chi phí mang lại hiệu cao thơng qua việc khảo sát khả gắn kết tương tác chất có hoạt tính sinh học Trầu không enzym aspartyl proteinase (do nấm men Candida albicans tiết ra) Các chất có tiềm gắn kết tốt lựa chọn từ thử nghiệm sử dụng để phát triển thành 20 7.6 kcal/mol), điểm số gắn kết tốt chất cấu trúc mang nhiều nhóm hydroxy (-OH), ceton (-CO) nên có khả tạo liên kết hydro với acid amin vùng gắn kết Đối với protein SAP3 (PDB ID: 2H6T) thu kết hợp chất tổng số 45 hợp chất có mức lượng gắn kết tốt thuộc nhóm Những chất có lượng gắn kết tốt cấu trúc không giống với ligand Pepstatin A đồng kết tinh (mạch thẳng), cấu trúc vịng nhóm xung quanh có nguyên tử có khả tạo liên kết hydro với acid amin khoang gắn Năng lượng gắn kết tốt thuộc hợp chất 2-Ethylacridin (-8.8 kcal/mol) có chứa N phân tử, nguyên tử tạo cầu nối hydro với nguyên tử oxy Gln11 Ser13 Tiếp đến 8C-hexosyl luteolin (7.8 kcal/mol), Luteolin 7-O-glucosid với mức lượng gắn kết (-7.6 kcal/mol) Phân tích tương tác Nhìn chung cấu trúc tiềm tạo liên kết hydro với acid amin vùng liên kết cấu trúc có nhiều ngun tử có khả tạo liên kết hydro Ngồi ra, đơi có xuất liên kết pi-alkyl liên kết pi-pi vòng thơm ligand vòng thơm acid amin 21 A B Hình 4.3 Các cấu trúc thuộc nhóm (có điểm gắn kết thấp) gắn kết với protein SAP2 (A) SAP (B): (Pdb id: SAP2 1EAG, SAP3 2H6T) 22 A B Hình 4.4 Các cấu trúc thuộc nhóm (có điểm gắn kết thấp) gắn kết với protein SAP2 (A) SAP (B): (Pdb id: SAP2 1EAG, SAP3 2H6T) 4.3 Nhận diện hợp chất tiềm Sau trình docking, 2-Ethylacridin xem chất gắn kết tiềm cho điểm số docking tốt protein: SAP2 (-8.1 kcal/mol) SAP3 (-8.8 kcal/mol) Về mặt cấu trúc, 2-Ethylacridin thuộc nhóm dị vịng ngưng tự kiểu dibenzo nên bền mặt hóa học Khi gắn kết với protein SAP2 ligand bao phủ trọn vẹn vùng gắn kết với SAP3 ligand gắn vào khoang gắn kết nhiên ligand chưa chiếm trọn thể tích khoang nên có tạo liên kết lỏng lẻo Ligand tạo liên kết hydro với Gly85 (SAP2), Gly121 Ser13 (SAP3) Hơn nữa, ligand gắn kết protein này, 23 Ethylacridin có xu hướng tạo nhiều liên kết gắn protein SAP3 SAP2 nên gắn với protein SAP-3 tốt protein SAP-2 Đối với SAP2, 2-Ethylacridin coi chất ức chế tiềm năng, theo kết thực nghiệm chất ức chế tiềm chất có khả tạo liên kết với acid amin quan trọng Asp32, Asp218, Gly220, Gly85, Gly34, Asp86, Asp120, Ile82, Tyr84, Ser88 Đối chiếu với kết docking, ligand 2Ethylacridin tạo liên kết pi-alkyl với Tyr84 liên kết hydro nguyên tử N 2-Ethlacridin O Gly85 Hình 4.7 Tương tác ligand 2-Ethylacridin với protein SAP2 24 Hình 4.8 Tương tác ligand 2-Ethylacridin với protein SAP Tuy nhiên, theo kết thực nghiệm, protein SAP3 chất ức chế chất có khả tác động acid amin quan trọng trình phân giải Asp32 Asp218 Như vậy, 2-Ethylacridin không tạo liên kết với acid amin mà 4-P-Coumaroylquinic acid chất gắn kết tiềm ligand tạo liên kết hydro với Asp218 acid amin quan trọng 25 Hình 4.8 Tương tác ligand 4-P-Coumaroylquinic acid với protein SAP Xét theo định luật 5-Lipinski 2-Ethylacridin Khối lượng 207 Số liên kết cho hydro Số liên kết nhận hydro LogP 2.58 4-P-Coumaroylquinic acid 338 1,41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Đề tài thực mục tiêu đề - Xác định protein đích tác động cho q trình khám phá thuốc kháng nấm men Candida dựa vai trị quan trọng protein q trình bệnh sinh vi nấm Các protein protein SAP2 (PDB id: 1EAG) protein SAP3 (PDB id: 2H6T) - Thu thập 45 hợp chất ligand chiết xuất từ trầu khơng Đã thực q trình docking protein mục tiêu chọn với 45 hợp chất ligand thu thập Sau sàng lọc hợp chất có lượng gắn kết tốt nhất, lượng gắn kết thấp khả gắn kết chất với protein mục tiêu cao 26 - Kết docking cho thấy 2-Ethylacridine 4-P-Coumaroylquinic acid cho lượng gắn kết thấp (-8.8 kcal/mol) Theo thực tế, 2-Ethylacridin 4-P-Coumaroylquinic acid chưa sử dụng nhiều Vì vậy, đề tài kiến nghị: - Thử thực nghiệm khả kháng nấm hợp chất - Sử dụng khung cấu trúc hai khung tiềm trình khám phá thuốc Ngồi ra, q trình redocking ligand đồng kết tinh protein SAP3 ligand bị phân mảnh, nên cần phân tích sâu ngun nhân sử dụng redocking phần mềm khác TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] Kerawala C , Newlands C (2010), "Oral and maxillofacial surgery", Oxford: Oxford University Press, pp 446 - 447 Staniszewska M., Bondaryk M., Siennicka K et al (2012), Role of aspartic proteinases in candida albicans virulence Part I Substrate specificity of aspartic proteinases and candida albicans, Vol 51 Nanayakkara B., L Abayasekara C., J Panagoda G et al (2011), AntiCandidal Activity of Piper betle, Vitex negundo and Jasminum grandiflorum Akpan A , Morgan R (2002), Oral candidiasis, Vol 78, Postgrad Med J, pp 455-459 Meng X Y., Zhang H X., Mezei M et al (2011), Molecular docking: a powerful approach for structure-based drug discovery, Vol 7, Current computer-aided drug design,, pp 146-167 Patra B., Das M , Kumar Dey S (2016), A review on Piper betle L, Vol 185 Shah S K., Garg G., Jhade D et al (2016), Piper betle: Phytochemical, pharmacological and nutritional value in health management, Vol 38 27 [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] Mani P., Menakha M., al aboody M et al (2016), Molecular Docking of Bioactive Compounds from Piper Plants Against Secreted Aspartyl Proteinase of Candida albicans Causing Oral Candidiasis, Vol Waghmode S., Pawar S., Kalyankar V et al (2017), Biochemical profiling of antifungal activity of betel leaf(Piper betle L.) extract and its significance in traditional medicine, Vol T J WALSH, M.-A VIVIANI, E ARATHOON et al (2000), "New targets and delivery systems for antifungal therapy", Medical Mycology, pp 335 - 347 Reddy Gundala S , Aneja R (2014), Piper Betel Leaf: A Reservoir of Potential Xenohormetic Nutraceuticals with Cancer-Fighting Properties, Vol Phạm Thế Chính, Dương Nghĩa Bang, Phan Thanh Phương cs (2009), "Thành phần hóa học tinh dầu trầu (Piper Betle L.) trồng Hải Dương", Tạp Chí Khoa học cơng nghệ 72, pp 48-52 Phạm Thế Chính, Phạm Thị Thắm, Nguyễn Hồng Phong cs (2009), "Nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học trầu (Piper Betle L.)", Tạp chí Khoa học cơng nghệ 96, pp 69-73 Nguyễn Thu Gương, Nguyễn Vũ Giang Bắc, Lê Thị Lệ Uyên cs (2014), "Phân lập xác định cấu trúc hóa học hoạt chất kháng nấm có cao chiết từ trầu không ", Y Học TP Hồ Chí Minh 18 (2) Hà Tuấn Minh , Lê Hữu Doanh (2016), "Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chống nấm số chủng Candida gây bệnh miệng", Tạp chí nghiên cứu y học 101, pp 40-46 Ferreres F., Oliveira A., Gil-Izquierdo A et al (2014), Piper betle leaves: Profiling phenolic compounds by HPLC/DAD-ESI/MS n and anticholinesterase activity, Vol 25 Lim C M., Ee G C L., Rahmani M et al (2009), "Alkaloids from Piper nigrum and Piper betle", Pertanika Journal of Science & Technology 17 (1), pp 149-154 28 PHỤ LỤC STT Tên CÔNG THỨC CẤU TRÚC HO HO C16H18O9 OH O OH HO O Safrole C10H10O2 Estragol C10H12O O O O HO Eugenol C10H12O2 Isoeugenol O C10H12O2 OH HO Terpinen-4-ol C10H18O C10H18O Cineole 2-amino-6-(3flourophenyl)pyrimidin4(3H)-one OH O 5-Caffeoylquinic acid O C10H8FN3O 29 O O HO Allylpyrocatechol monoac etate C11H12O3 2,3-dihydro-N-hydroxy4-methoxy-3,3-dimethylIndole-2-one, C11H13NO3 11 Eugenyl acetate C12H14O3 12 2-methyl-Undecanal C12H24O 10 OH O OH C15H10O7 HO O OH 13 14 Quercetin 2-ethylacridine OH C15H13N N 1,2,3,5,6,7,8,8aoctahydro-1,8a-dimethyl7-(1-methylethenyl)-, (1R,7R,8as)- Naphthalene, C15H24 Β-Caryophyllene C15H24 15 16 30 4,5,9,10-tetrahydropyrene 17 C16H14 O HO HO O 4-P-Coumaroylquinic acid 18 C16H18O8 OH OH O HO O OH HO 5-P-Coumaroylquinic acid O C16H18O8 O 19 20 HO OH Palmitic acid C16H32O2 O OH O Cis,cis-9,12Octadecadienoic Acid C18H32O2 21 OH 22 6-Octadecenoic acid C18H34O2 23 Oleic acid C18H34O2 O HO C20H40O 24 Phytol OH OH 31 OH O C21H19O11- HO HO O O O OH HO 25 8C-hexosyl luteolin – OH OH OH O HO Apigenin-7-O-glucoside O C21H20O10 HO O O HO 26 OH OH OH O OH HO O Luteolin 7-O-glucoside HO O HO 27 28 C21H20O11 Isopropyl isothiocyanate C4H7NS Pent-1-en-3-ol 29 30 C5H10O 1,2,3-Propanetriol, monoacetate C5H10O4 O OH OH 32 31 Hydroquinone C6H6O2 C6H8O4 32 3,5-Dihydroxy-6-methyl2,3-dihydro-4H-pyran-4one 3-[(E)-2Nitrovinyl]pyridine 33 C7H6N2O2 6-Methyl-3-heptanone 34 C8H16O C8H8O 35 Coumaran 33 36 2,5-dimethyl-Benzoic acid C9H10O2 3,5-Dimethylbenzoic acid 37 38 C9H10O2 2,3-dimethyl-Benzoic acid C9H10O2 C9H10O2 39 2-Methoxy-4-vinylphenol 40 4-chromanol C9H10O2 Triacetin C9H14O6 41 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 34 42 Trans-Cinnamic acid C9H8O2 P-coumaric acid C9H8O3 43 44 Chavibetol Delta-Cadinene 45 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh ... KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung ‒ Tên đề tài: Nghiên cứu khả gắn kết hợp chất sinh học trầu khơng enzyme Aspartyl proteinase có tác dụng kháng nấm Candida. .. trình nghiên cứu thuốc kháng nấm - Các chất gắn kết enzyme Aspartyl proteinase Candida albicans - Các chất tiềm kháng Candida albicans - Những kết đạt từ đề tài ứng dụng cho trình sàng lọc thuốc kháng. .. HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GẮN KẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT SINH