Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri bị đột biến gen pura ở các điều kiện bảo quản khác nhau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ CHI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ðỘT BIẾN GEN PURA Ở CÁC ðIỀU KIỆN BẢO QUẢN KH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ CHI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI

KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ðỘT BIẾN GEN PURA

Ở CÁC ðIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa, năm 2014

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ CHI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI

KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ðỘT BIẾN GEN PURA

Ở CÁC ðIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU

Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản

Mã số: 60 62 03 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS VÕ VĂN NHA

2 TS LÊ MINH HOÀNG

Khánh Hòa, năm 2014

ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan các số liệu và kết quả ñã nêu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi cùng với sự cho phép sử dụng chung số liệu của nhóm tác giả thực hiện ñề tài thuộc chương trình Công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, những số liệu này là trung thực, chưa ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

iii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này ñã ñược thực hiện với sự giúp ñỡ của nhóm nghiên cứu ñề tài

Công nghệ sinh học cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri nhược ñộc dùng làm vắc xin phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) bằng kỹ thuật gây ñột biến gen” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, tôi xin chân thành cảm ơn ñến sự giúp ñỡ quí báu ñó

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến sự chỉ dẫn nhiệt tình, chu ñáo của giáo viên hướng dẫn TS Võ Văn Nha và TS Lê Minh Hoàng ñã giúp tôi trong suốt quá trình xây dựng ñề cương, triển khai thực hiện các nội dung và hoàn thiện bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi của các bạn ñồng nghiệp thuộc Phòng nghiên cứu Bệnh Thủy sản và dự báo, Trung tâm quốc gia quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III ñể tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn ñến Khoa Nuôi trồng Thuỷ sản, Khoa sau ðại học, Trường ðại học Nha Trang, cùng quý thầy cô ñã tận tình giảng dạy tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi xin cảm ơn ñến gia ñình ñã ñộng viên và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tác giả

iv

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa ……… i

LỜI CAM ðOAN ……… ii

LỜI CẢM ƠN ……… iii

MỤC LỤC ……… iv

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……… vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ……… viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ ……… ix

MỞ ðẦU ……… 1

Chương 1 – TỔNG QUAN ……… 3

1.1 Những nghiên cứu về chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen cho mục ñích tạo vaccine phòng bệnh do E ictaluri ở cá da trơn trên Thế giới và ở Việt Nam 3 1.1.1 Trên Thế giới ……… 3

1.1.2 Tại Việt Nam ……… 6

1.2 Những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra của vi khuẩn E ictaluri phân lập trên cá tra Việt Nam và cá nheo (catfish) Hoa Kỳ………… ……… 6

1.2.1 ðặc ñiểm hình thái, sinh lý và sinh vật hóa học vi khuẩn E ictaluri …… 6

1.2.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuôi của vi khuẩn E ictaluri ………

1.2.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E ictaluri ……….

8 11 1.3 Khả năng phát triển của chủng E ictaluri bị ñột biến gen và chủng E ictaluri chưa bị ñột biến gen (chủng “hoang dại”) trên một số môi trường nuôi cấy khác nhau ………

12 1.4 Một số phương pháp bảo quản chủng vi khuẩn E ictaluri hiện nay trên Thế giới và Việt Nam ……… ……… ……… 14

1.4.1 Phương pháp bảo quản thạch nghiêng.……… 14

1.4.2 Phương pháp bảo quản dưới lớp dầu khoáng ……… ……… 14

v

1.4.3 Phương pháp lạnh sâu ………

1.4.4 Phương pháp ñông khô ………

14 15 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 16

2.1 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu ……… 16

2.2 Vật liệu nghiên cứu ……… 16

2.3 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu ……… 18

2.2.1 Thời gian nghiên cứu ……… 18

2.2.2 ðịa ñiểm nghiên cứu ……… 18

2.4 Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài luận văn ……… 18

2.5 Phương pháp nghiên cứu ……… 19

2.5.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; ño kích thước của vi khuẩn; nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ……… 19

2.5.2 Phương pháp kiểm tra tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ……… 19

2.5.3 Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của chủng E ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau ……… 22

2.6 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu ……… 23

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……… 24

3.1 Xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA ………

3.1.1 Kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA trên môi trường BHI có kháng sinh kanamycine ……… …………

3.1.2 Kết quả tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA với một số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid

3.2 Kết quả khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản ………

3.2.1 Kết quả tìm hiểu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ………

24

24

25

26

26

3.2.2 Kết quả khảo sát kích thước của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị

vi

ñột biến gen purA theo thời gian và ñiều kiện bảo quản khác nhau ………

3.2.3 Kết quả nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau ………

32 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……… 43

KẾT LUẬN ……… 43

KIẾN NGHỊ ……… 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 45

PHỤ LỤC ………

vii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

API 20E: Hệ thống ñịnh danh vi khuẩn họ Enterobacteriaceae và vi khuẩn Gram âm

hình que

BHIA: Brain Heart Infusion Agar – Môi trường thạch BHI

BHIB: Brain Heart Infusion Broth – Môi trường lỏng BHI

CFU: Colony Forming Unit – ðơn vị khuẩn lạc

Cs: Cộng sự

DMM: Defined Minimal Medium – Môi trường nuôi cấy DMM

EIM: Edwardsiella Ictaluri Medium – Môi trường nuôi cấy EIM

ESC: Enteric Septicemia of Fish – Bệnh ESC

KIA: Klegler Iron Agar – Môi trường thạch KIA

LB: Luria Bertami – Môi trường LB

LDC: Lysine decarboxylase -

MAC: Mac Conkey Agar – Môi trường thạch Mac Conkey

NN&PTNT: Nông nghiệp và phát triển nông thôn

OD: Optical Density (mật ñộ quang)

ODC: Ornithine decarboxylase

O/F: Oxydation/Fermentation

ONPG: β- Galactosidase

TSA: Tryptone Soya Agar – Môi trường không chọn lọc TSA

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả vòng kháng kháng sinh của vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen

pur A và vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến với kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid ……….……… 25

Bảng 3.2 ðặc ñiểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng vi khuẩn E

ictaluri bị ñột biến gen purA và chủng chưa ñột biến gen purA……… 27

Bảng 3.3 ðặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen

pur A, E ictaluri chưa ñột biến gen purA ……… 29

Bảng 3.4 Kích thước chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA (E

ictaluri PAM) và E ictaluri chưa ñột biến gen purA (E ictaluri WT) 32

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát sự phát triển của chủng bị ñột biến gen purA ở các

ñiều kiện bảo quản khác nhau bằng thạch nghiêng ……… 41

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ Hình 1.1

Hình 2.1

Con ñường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA

Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài ………

4

18

Hình 2.2 Sơ ñồ xác ñịnh ñường cong sinh trưởng, phát triển của chủng E

ictaluri ñột biến gen purA trong môi trường BHIB có bổ sung kanamycine và không bổ sung kanamycine 20

Hình 2.3 Sơ ñồ thực hiện kháng sinh ñồ vi khuẩn 21 Hình 3.1 ðồ thị kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi

khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA trên môi trường nuôi cấy BHIB có

bổ sung kanamycine và không bổ sung kanamycine 24

Hình 3.2 Kháng sinh ñồ của vi khuẩn E ictaluri chưa ñột biến gen bị ñột biến

gen purA (A) và vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (B) 26

Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (A, B) 28 Hình 3.4 Vi khuẩn E ictaluri chưa ñột biến gen bị ñột biến gen purA (A) và vi

khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (B) 28

Hình 3.5 Sinh trưởng quần thể vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA trên môi

trường DMM có bổ sung adenine và không bổ sung adenine OD – mật

ñộ quang 31

Hình 3.6 Kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn E

ictaluri chưa bị ñột biến gen bị ñột biến gen purA và E ictaluri ñột biến gen purA trên môi trường nuôi cấy BHIB 34

Hình 3.7 Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến

gen và E ictaluri ñột biến gen purA bảo quản bằng thạch nghiêng ở

4oC theo thời gian 35

Hình 3.8 Kết quả khảo sát giá trị OD vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến gen và

E ictaluri ñột biến gen purA bảo quản bằng thạch nghiêng ở 4oC theo thời gian 35

Hình 3.9 Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến

gen và E ictaluri ñột biến gen purA bảo quản bằng thạch nghiêng có

phủ dầu khoáng ở 48C theo thời gian 37

Hình 3.10 Kết quả khảo sát giá trị OD vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến gen và

E ictaluri ñột biến gen purA bảo quản bằng thạch nghiêng có phủ dầu

x

khoáng ở 4oC theo thời gian 37

Hình 3.11 Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA

và E ictaluri chưa bị ñột biến gen theo thời gian bằng lạnh sâu -30oC 39

Hình 3.12 Kết quả khảo sát sát giá trị OD vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA

và E ictaluri chưa bị ñột biến gen theo thời gian bằng lạnh sâu -30oC 39

Hình 3.13 Kết quả khảo sát giá trị OD vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA bảo

quản ở các ñiều kiện khác nhau theo thời gian 40

Hình 3.14 Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA

bảo quản ở các ñiều kiện khác nhau theo thời gian 41

1

MỞ ðẦU

Trên thế giới, các nghiên cứu ñã phát hiện ra rằng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

là tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá nheo (catfish) ở Mỹ, cá trê trắng (Clarias

batrachus) ở Thái Lan và trên một số loài cá da trơn khác ở Indonesia, Trung Quốc

Ở Việt Nam, các nghiên cứu của Crumlish (ðại học Stirling-Anh); Công ty Bayer Việt Nam; Công ty Pharma Nauy và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II kết hợp với NAVETCO ñã cùng ñi ñến kết luận tại hội thảo ở Tp.Hồ Chí Minh tháng 9/2007:

“Mặc dù có thể phát hiện nhiều tác nhân vi khuẩn trên cá tra bệnh nhưng chỉ có duy

nhất vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra” Ngày 11/8/2009 hội thảo bàn về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra do Bộ

NN&PTNT tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh cũng ñã ñi ñến kết luận rằng: Vi khuẩn

E ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam

Bệnh nhiễm khuẩn gây ra bởi Edwardsiella ictaluri ñã làm tổn thất lớn cho nghề nuôi cá da trơn ở Mỹ hàng năm từ 20 – 30 triệu USD [47] Ở Việt Nam, Edwardsiella

ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở ñồng bằng sông Cửu Long với tỷ lệ chết từ 10 – 90%, gây thiệt hại ñáng kể cho người nuôi cá tra hàng năm [10]

Vi khuẩn E ictaluri trên cá tra ñã kháng với một số loại thuốc kháng sinh như

oxytetracylin, oxolinic acid, sulphonamid [3]; Bactrime, colistin, amoxicilin, tetracyclin, doxycyclin [8], [19] Hơn nữa, các sản phẩm thủy sản sau ñó thường không ñược ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt cá Do vậy, việc phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vaccine là vấn ñề ñược ñặt ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay

Nghiên cứu về E ictaluri cho thấy vi khuẩn này có ñặc tính sinh miễn dịch rất

mạnh, có sự tương quan giữa kháng thể sinh ra và khả năng bảo hộ chống lại sự cảm

nhiễm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [48], [49], [51] Do ñó, hiện nay các nghiên cứu ñang hướng ñến loại bỏ gen aroA hoặc purA hoặc cả 2 của chủng vi khuẩn E

ictaluri hay một số gen tiềm năng khác nhằm làm giảm ñộc lực của vi khuẩn E

ictaluri, dùng làm vaccine kích thích sinh miễn dịch dịch thể và kích thích hoạt hóa

sinh miễn dịch trung gian tế bào

Năm 2010, chương trình công nghệ sinh học cấp Nhà nước do Viện Nghiên cứu

Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì ñã nghiên cứu tạo ñược 3 dòng vi khuẩn E ictaluri

2 nhược ñộc làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng kỹ

thuật ñột biến gen Tuy nhiên, cho ñến nay việc lưu giữ, bảo quản chủng E ictaluri bị

ñột biến gen purA chưa có tài liệu nào ñề cập ñến, có chăng chỉ nhằm phục vụ trực tiếp cho những nghiên cứu về khả năng sử dụng chúng làm vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra

Trước thực tế trên, cùng với việc hoàn thành khóa học, ñược sự ñồng ý của Trường ðại học Nha Trang, Viện trưởng Viện Nuôi trồng Thủy sản, thầy giáo hướng

dẫn, tôi thực hiện ñề tài “Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau”

Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài luận văn:

+ Xác ñịnh ñược khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

bị ñột biến gen purA trong môi trường có chứa kháng sinh ñồng thời xác ñịnh ñược khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau Từ ñó có ñược ñiều kiện bảo quản phù hợp

Nội dung nghiên cứu của ñề tài luận văn:

+ Xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị

ñột biến gen purA

+ Khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài luận văn:

- Về khoa học: Kết quả của luận ñề tài luận văn ñã xác ñịnh ñược khả năng phát triển

của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA trong các ñiều kiện bảo

quản từ ñó làm tiền ñề cho những nghiên cứu tiếp theo về việc lưu giữ chủng vi khuẩn này

- Về thực tiễn: ðề tài luận văn góp phần nâng cao hiểu biết cho chính học viên về lĩnh vực vi sinh vật ñột biến gen ðồng thời cũng chỉ ra ñược ñiều kiện lưu giữ chủng vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA, làm cơ sở ban ñầu ñể lưu giữ

nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất vaccine nhược ñộc phòng bệnh gan thận mủ cá tra

3

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Những nghiên cứu về chủng E ictaluri bị ñột biến gen cho mục ñích tạo vaccine phòng bệnh do E ictaluri ở cá tra trên Thế giới và Việt Nam

1.1.1 Trên Thế giới

Năm 1996, Cooper và các cộng sự ñã tạo thành công chủng E ictaluri ñột biến gen ch bằng cách sử dụng mini-transposon lai giữa Tn10 và Tn903, chủng ñột biến

ñược tạo ra bị mất hoạt tính enzyme chondroitinase [23] Khi sử dụng chủng E

ictaluri ñột biến gen ch tiêm cho cá da trơn ở nồng ñộ 108 cfu/cá ñể kiểm tra ñộc lực, tác giả nhận thấy, sau 2 tuần theo dõi, cá không có dấu hiệu bệnh lý ñặc trưng của

bệnh nhiễm trùng do E ictaluri gây ra Sau ñó tác giả tiếp tục tiêm E ictaluri hoang

dại (gây bệnh) cho cá, cá cũng không có dấu hiệu bệnh nhiễm trùng ñặc trưng trong

khi cá ñối chứng chưa ñược tiêm chủng ñột biến gen ch từ trước bị chết toàn bộ [23]

Năm 1997, Lawrence và cộng sự lần ñầu tiên ñã tạo thành công chủng E

ictaluri ñột biến gen purA, mất khả năng tổng hợp adenine, dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine nhược ñộc [34] ðoạn gen purA, mã hóa cho enzyme tổng hợp adenine,

ñược cắt bỏ trình tự nucleotide ở giữa và thay vào ñó là gen kháng kháng sinh

kanamycin; gen purA ñột biến ñược dòng hóa vào plasmid pGP704, sau ñó , plasmid sản phẩm (pEI17) ñược biến nạp vào E coli SM10 λpir Chủng E ictaluri bị ñột biến gen purA (LSU-E2) ñược tạo ra khi cho E coli SM10 λpir mang pEI17 tiếp hợp với chủng E ictaluri hoang dại

ðoạn gen purA, mã hóa cho enzyme tổng hợp adenine, bị gây ñột biến mất ñoạn 598 bp và thay bằng gen kháng kanamycin Khi loại bỏ gen purA, gen mã hóa cho enzyme adenylosuccinate synthase là enzyme ñầu tiên xúc tác cho quá trình tổng hợp AMP- tham gia vào quá trình tổng hợp purin ribonucleotide (US Patent 6010705)

Do vậy, nếu ñột biến gen purA thì enzyme adenylosuccinate synthase không ñược tạo

thành và quá trình chuyển hóa inosine monophosphate (IMP) thành adenylosuccinate

sẽ không xảy ra, dẫn ñến ATP không ñược hình thành ñể cung cấp năng lượng cho quá trình chuyển hóa từ XMP thành GMP), tạo ra GTP tham gia quá trình tổng hợp DNA

và RNA (Hình 1.1) Từ ñó làm ảnh hưởng trược tiếp ñến khả năng sinh trưởng vi

khuẩn E ictaluri, gây ảnh hưởng gián tiếp ñến ñộc lực của chủng vi khuẩn này [1]

4

Hình 1.1 Con ñường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA

Chủng vi khuẩn khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA (LSU-E2) không gây

chết cho cá nheo Mỹ khi tiến hành gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp cho ăn hay ngâm nhưng gây chết khoảng 50% khi sử dụng phương pháp tiêm với liều khoảng

107 – 108 cfu/cá ðiều này có thể do các gen qui ñịnh ñộc tính của chủng LSU-E2 vẫn nguyên vẹn [34]

Thune và cộng sự (1997) [48] tạo thành công chủng E Ictaluri khuyết dưỡng adenine bằng phương pháp ñột biến gen purA dựa trên nguyên tắc của hiện tượng tái

tổ hợp tương ñồng của các trình tự AND Chủng E Ictaluri bị ñột biến gen purA

(LSU-E2) tạo ra ñược ñem thử nghiệm ñộc lực cho thấy, cá thí nghiệm tiêm chủng LSU-E2 ở nồng ñộ 105 và 106 cfu/cá cho tỉ lệ cá chết tích lũy là 0%, trong khi ñó với

nồng ñộ tiêm tương tự ñối với chủng E ictaluri hoang dại tỉ lệ tương ứng là 96,7% và

100% Với phương pháp tiêm, chủng ñột biến có liều gây chết LD50 là 5,1 x 107 cfu/cá

so với chủng hoang dại (<130 cfu/cá), nghĩa là LD50 của chủng hoang dại thấp hơn 5log10 so với chủng ñột biến Ngoài ra, khi thử nghiệm ñộc lực bằng phương pháp

5 ngâm (nồng ñộ 106, 107 cfu/ml) và cho ăn (nồng ñộ 107, 108 cfu/cá) với chủng LSU-

E2, tỷ lệ cá chết tích lũy là 0% sau thí ngiệm; trong khi ñó với chủng E ictaluri hoang

dại khi cá ñược ngâm (nồng ñộ 107 cfu/ml) hoặc cho ăn (nồng ñộ 109 cfu/cá) thì tỷ lệ

cá chết tương ứng là 63,3% và 54,8% Cá ñược ngâm với E ictaluri hoang dại sau khi

ngâm với chủng LSU-E2 có tỷ lệ chết tích lũy trung bình 11,1% trong khi ñó ở lô ñối chứng tỷ lệ này là 33,3%

Gen mục tiêu phổ biến nhất ñược quan tâm là aroA, mã hóa enzyme 5 – enolpyruvoylshikimate-3-phosphate synthase Các trình tự gen aroA của một số tác nhân gây bệnh gram (-) ñã ñược công bố, và ñột biến gen aroA ñã chứng minh là có

hiệu quả trong ứng dụng vaccine Nhóm tác giả Thune, ñại học bang Louisiana ñã tạo

thành công chủng E ictaluri ñột biến gen aroA bằng phương pháp tiếp hợp với chủng

E ictaluri hoang dại vào năm 1999 [49] Trong cùng nghiên cứu, chủng E ictaluri ñột

biến ñược thử nghiệm vaccine bằng các phương pháp ngâm ở các nồng ñộ 107 cfu/ml

và 108 cfu/ml Sau 4 tuần, cá ñược ngâm tăng cường với chủng ñột biến một lần nữa với cùng nồng ñộ lần ñầu (107 cfu/ml và 108 cfu/ml) Bốn tuần sau, cá tiếp tục ñược

ngâm với chủng E ictaluri hoang dại với nồng ñộ 107 cfu/ml Cá chết ñược ghi nhận trong mỗi 24 giờ sau khi ngâm cho ñến khi không còn cá chết trong 3 ngày Kết quả thu ñược như sau: Tỷ lệ sống của cá ñạt 54,1 – 63,8% khi ñược ngâm một lần và 77,3 – 94,4% khi ñược ngâm tăng cường với chủng ñột biến Nhóm nghiên cứu ñã ñưa ra kết luận lần ngâm thứ 2 giúp tăng ñáng kể khả năng bảo vệ của vaccine [49]

Nghiên cứu gần ñây của Javier Santander và cộng sự (2011) khi thực hiện loại bỏ

gen crp của chủng E ictaluri cho thấy, chủng bị loại bỏ gen crp giảm sự phát triển, mất khả năng sử dụng maltose, và thiếu khả năng tạo tiêm mao [32] Chủng E ictaluri

hoang dại gây chết 50% cá ở nồng ñộ tiêm 105 cfu/cá và 100% ở nồng ñộ 107, 108

cfu/cá; trong khi ñó chủng E ictaluri ñột biến gen crp không gây chết cá ở nồng ñộ

tiêm 107 cfu/cá và nhỏ hơn 20% ở 20% ở 108 cfu/cá Khả năng bảo hộ của E ictaluri

bị loại bỏ gen crp trong nghiên cứu này ñạt 100% sau 30 ngày thí nghiệm công cường

ñộc với chủng E ictaluri hoang dại cho cá ñã ñược kích thích miễn dịch với E ictaluri ñột biến gen crp [32]

Như vậy, trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về chủng E ictaluri bị

ñột biến gen cho mục ñích tạo vaccine sống nhược ñộc phòng bệnh do E ictaluri gây

ra trên cá da trơn Những sản phẩm vaccine tạo ra ở dạng này có khả năng kích thích

6 sinh kháng thể và kích hoạt miễn dịch trung gian tế bào, vi khuẩn bị làm yếu ñộc lực không có khả năng hoàn ñộc do không tái tạo lại ñoạn gen gây bệnh hay gen khuyết dưỡng ñã bị loại bỏ

1.1.2 Tại Việt Nam

Nhiều nghiên cứu trong nước tạo vi khuẩn E ictaluri bất hoạt bằng nhiều phương

pháp khác nhau ñể dung làm nguyên liệu sản xuất vaccine Nguyễn Hữu Thịnh và

cộng sự (2009) thử nghiệm vaccine bất hoạt vi khuẩn E ictaluri bằng phương pháp

ngâm kết hợp cho ăn 2 lần, kết quả cho tỷ lệ bảo hộ ñạt 52% [47]

Tuy nhiên, kể từ khi sử dụng vaccine phòng bệnh cho vật nuôi thủy sản năm

1987 [38], ñến nay vẫn có ít những sản phẩm vaccine sống ñược tạo ra ñáp ứng nhu cầu của thị trường Việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo các vi sinh vật ñột biến dung làm nguyên liệu sản xuất vaccine trong lĩnh vực thủy sản Việt Nam hiện nay chỉ

có ở giai ñoạn bắt ñầu Trong ñề án phát triển và ứng dụng công nghệ xinh học trong lĩnh vực thủy sản của chính phủ Việt Nam, năm 2010 ñã triển khai thực hiện ñề tài cấp

Nhà nước “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhược ñộc dung làm vaccine phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng kỹ thuật

gây ñột biến gen” do Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì Nhóm nghiên cứu phối hợp với Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh ñã tạo thành

công 03 chủng vi khuẩn: E ictaluri bị ñột biến gen purA, E ictaluri bị ñột biến gen

aro A và E ictaluri bị ñột biến gen ch [11] Các chủng vi khuẩn ñột biến này ñã ñược

xác ñịnh là ổn ñịnh về mặt kiểu gen và kiểu hình so với chủng vi khuẩn gốc ban ñầu [11], [12]

Như vậy, có thể thấy rằng việc nghiên cứu chủng E ictaluri bị ñột biến gen cho

mục ñịch tạo vaccine sống nhược ñộc phòng bệnh gan thận mủ cá tra ở Việt Nam chỉ mới ñược bắt ñầu từ năm 2010 khi chính phủ khởi ñộng chương trình ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản Cho ñến nay, chưa có công trình và sản phẩm

nào trong nước công bố về vaccine nhược ñộc phòng bệnh gan thận mủ cá tra do E

ictaluri gây ra

1.2 Những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học, khả năng gây bệnh trên cá tra của vi

khuẩn E ictaluri phân lập trên cá tra Việt Nam và cá nheo (catfish) Hoa Kỳ

1.2.1 ðặc ñiểm hình thái, sinh lý và sinh vật hóa học vi khuẩn E ictaluri

7

Trong hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp

Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria Giống Edwardsiella có các ñặc ñiểm

là: vi khuẩn dạng hình que thẳng, nhỏ, kích thước 1µm x 2-3 µm, gram âm, có khả năng di ñộng bằng vành lông rung (peritrichous flagella) ở nhiệt ñộ 25oC, không di ñộng ở 37oC, yếm khí tùy tiện Loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là một trong những

loài khó nuôi cấy trên môi trường nhân tạo nhất trong số các loài thuộc giống

Edwardsiella Chúng sinh trưởng yếm khí tùy tiện và phát triển chậm trên môi trường thạch BHI (Brain Heart Infusion), sau 48 giờ nuôi cấy ở 28oC, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc hình tròn, bóng có kích thước khoảng 2 mm, màu trắng, không có nhân, rìa có dạng

không ñồng nhất [3], [24], [42] Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn hình que,

gram âm, phần lớn ở dạng ñơn, ñôi và một số dạng chuỗi, kích thước khoảng 0,75 x 2,5 µm ở 26oC [28], chuỗi vi khuẩn kéo dài 5-7 µm khi ở 37oC [39] hoặc có thể biến thiên 1,2-15 µm [54] Vi khuẩn có khả năng chuyển ñộng bằng tiêm mao, di ñộng yếu

ở 25-30oC nhưng không di ñộng ở nhiệt ñộ cao hơn [40]

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có khả năng phát triển tốt ở khoảng nhiệt ñộ tối

ưu 22 – 28oC [41] pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,0 – 7,5 và phát triển tốt nhất trong môi trường có nồng ñộ muối là 0,5%, nhưng không chịu ñược ñộ muối cao

hơn 1,5% [39], [40] E ictaluri thường ñược phân lập từ môi trường nuôi, từ nội quan hoặc mô não cá bị bệnh Trong môi trường nước, vi khuẩn E ictaluri có thể tồn tại khoảng 9 ngày [41], còn trong môi trường bùn, ñáy ao vi khuẩn E ictaluri có khả năng

tồn tại trong vòng 1 tháng [26] ñến 95 ngày khi ở nhiệt ñộ lạnh [30], [41]

Vi khuẩn E ictaluri có khả năng sử dụng D-glucose và một số ñường khác kết

quả sinh ra a xít và thường sinh hơi Oxidase âm tính, catalase dương tính, proskauer và simmon citrate âm tính, LDC dương tính, ODC dương tính, khử Nitrate thành Nitrite Vi khuẩn cho phản ứng destrose, dulcitol, fructose, galactose, maltose,

Voges-mannose và salicin dương tính Ngoài ra, E ictaluri cũng cho kết quả dương tính với

lysine, ornithine,glucose, mannitol và mellibiose [29], [33] Vi khuẩn này là nguyên nhân gây bệnh ở cá da trơn (catfish) và một số ñộng vật khác, hiếm khi là là tác nhân gây bệnh cơ hội cho người

8

1.2.2 Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh trên cá tra nuơi của vi khuẩn E ictaluri

Vi khuẩn E ictaluri lần đầu tiên được xác định là tác nhân gây bệnh gan thận mủ

trên cá tra ở đồng bằng sơng Cửu Long bởi Crumlish và cs (2002) [24] Các kết quả nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2004) [3], Trần Thị Minh Tâm (2003) [14], Nguyễn Hữu Thịnh và cộng sự (2007) [16], Lý Thị Thanh Loan (2007) [9] trên cá tra bị bệnh

gan thận mủ cho thấy một phức hợp gồm nhiều tác nhân gây bệnh gồm: Edwardsiella

ictaluri, E tarda, Aeromonas sp., Pseudomonas, Hafnia alvei, Plesiomonas

shigelloides, Vibrio, Klebsiella, Bacillus, Entercoccus, Enterobacter, Clostridinium

spp Tuy nhiên, cĩ hai nghiên cứu đáng chú ý nhất đĩ là: Kết luận của đề tài “Nghiên cứu bệnh đốm trắng trên cá tra nuơi cơng nghiệp” của Trần Thị Minh Tâm (2003) [14]

đã phỏng đốn tác nhân gây bệnh đốm trắng tức bệnh gan thận mủ trên cá tra là do vi

khuẩn Hafnia alvei và Plesiomonas shigelloides dựa trên tần suất bắt gặp cao nhất (73,1% cho Hafnia alvei và 31,9% cho Plesiomonas shigelloides), kết quả cảm nhiễm

để thử độc lực và phản ứng vi ngưng kết với kháng nguyên tồn phần Tuy nhiên, thơng tin gần đây lại cho thấy, sau khi kiểm chứng lại bằng kỹ thuật PCR thì vi khuẩn

Hafnia alvei chính là vi khuẩn E ictaluri [14] Nghiên cứu thứ 2 đĩ là sản phẩm hợp

tác của trường ðại Học Stirling (Anh) với Trường ðại học Cần Thơ kết luận: tác nhân

gây bệnh gan thận mủ trên cá tra là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [24] Sau đĩ,

Viện nghiên cứu nuơi trồng thủy sản II phối hợp với Cơng ty thuốc thú y trung ương II (NAVETCO) tiến hành điều tra thu mẫu cá tra bệnh tại các vùng địa lý khác nhau ở

các ổ dịch và xác định chính vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân gây bệnh gan

thận mủ nhờ vào kết quả phân lập định danh vi khuẩn, kiểm tra sinh hĩa và kiểm chứng bằng kỹ thuật PCR [14]

Cho đến nay, các nghiên cứu về tác nhân gây bệnh gan thân mủ trên cá tra nuơi ở đồng bằng sơng Cửu Long Việt Nam như: Crumlish (ðại học Stirling-Anh) [24]; nghiên cứu của nhĩm Cơng ty Bayer Việt Nam; nghiên cứu của nhĩm cơng ty Pharma

Na uy; nghiên cứu của Viện Nghiên cứu Nuơi trồng Thủy sản II kết hợp với NAVETCO; nghiên cứu của ðặng Thị Hồng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (ðại học Cần Thơ) năm 2009 [13]; nghiên cứu của ðồng Thanh Hà và ðỗ Thị Hịa (ðại học Nha Trang) năm 2009 [6] đã cùng đi đến kết luận mới nhất tại tại hội thảo bàn về tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra do Bộ NN&PTNT tổ chức tại Tp Hồ Chí

9

Minh vào ngày 11/8/2009: Vi khuẩn E ictaluri là một tác nhân thực sự gây bệnh gan

thận mủ trên cá tra nuôi tại Việt Nam [11] Thêm vào ñó, nhóm nghiên cứu của

Crumlish (ðại học Stirling-Anh) khẳng ñịnh rằng chủng vi khuẩn E.ictaluri ở Hoa Kỳ

và chủng vi khuẩn E ictaluri ở Việt Nam có một số sai khác ñáng kể [24].

Cá tra bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E ictaluri có thể có hoặc không xuất hiện

dấu hiệu bất thường ở bên ngoài ða số thể hiện dấu hiệu xuất huyết nhẹ ở các gốc vây, xung quanh miệng và vùng bụng, hoặc kèm theo dấu hiệu trắng mang (mang nhợt nhạt, tiết nhiều nhớt) Giải phẫu nội tạng cho thấy 100% cá bệnh ñều tồn tại của các ñốm trắng có ñường kính 0,5-3,0mm ở các tổ chức nội tạng như gan, thận, lá lách Các ñốm trắng thường xuất hiện trước tiên ở thận, làm thận sưng to gấp 2-3 lần bình thường và mềm nhũn, khi bệnh nặng mới có thể quan sát thấy ở tỳ tạng và gan, các ñốm trắng ở gan thường thưa và nhỏ hơn ở thận [6]

Bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây ra trên cá tra ở ñồng bằng sông Cửu Long xuất

hiện hàng năm và theo mùa vụ, thường vào tháng 8-11 trong ñó ñỉnh cao nhất vào

tháng 9 [10] Vi khuẩn E ictaluri gây bệnh cho cá tra ở mọi lứa tuổi, thường gặp nhất

và gây chết nhiều nhất ở cá tra dưới 3 tháng tuổi [10] Việc phòng và trị bệnh do vi

khuẩn E ictaluri cho cá tra hiện nay ở Việt Nam vẫn hoàn toàn dựa vào kháng sinh và

hóa chất Phần lớn khi có bệnh xảy ra trên cá tra, người nuôi sử dụng nhiều loại kháng sinh kết hợp nhằm ñiều trị có hiệu quả cho tất cả các bệnh nhiễm khuẩn nói chung Việc sử dụng thuốc như vậy dẫn ñến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày một gia tăng, ñồng thời gây ảnh hưởng lớn ñến chất lượng thực phẩm và gây ô nhiễm môi trường [10] Do vậy, phòng bệnh gan thận mủ cá tra bằng vaccine là vấn ñề ñược ñặt

ra cho công nghiệp nuôi cá tra hiện nay

Những nghiên cứu về cơ chế xâm nhập của vi khuẩn E ictaluri vào trong dạ dày của cá cho thấy: E ictaluri xâm nhập vào lớp biểu mô, sau ñó ñược thực bào bởi các

ñại thực bào ngoại vi nằm dưới lớp biểu mô [21], [37], [50] Tuy nhiên, lại không phát

hiện thấy các tổn thương ở vùng tế bào biểu mô nên người ta cho rằng E ictaluri

xuyên qua lớp tế bào biểu mô nền nhờ vào các hệ thống vận chuyển bình thường của

tế bào Lập luận này cũng ñược củng cố bởi quan sát của Thune (1993) rằng thời gian

cho sự xâm nhập nhanh chóng của E ictaluri qua lớp tế bào biểu mô nền không ñủ ñể

tổng hợp các protein chức năng cho quá trình xâm nhập này [50] Nhìn chung, vi

10

khuẩn E ictaluri có thể xâm nhập vào cá tra theo 2 con ñường chủ yếu là từ môi

trường nước qua da hoặc mang cá và qua miệng theo ñường thức ăn gây bệnh gan thận

mủ Vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ quan khứu giác, sau ñó lên não gây viêm não

Ngoài ra, vi khuẩn E ictaluri còn có thể xâm nhiễm từ ñường tiêu hóa qua niêm mạc

ruột vào máu và gây hiện tượng nhiễm trùng máu Nghiên cứu của Baldwin và Newton (1993) [19] cho thấy vi khuẩn có thể vượt qua lớp màng nhầy ruột sau khi gây nhiễm

15 phút, xuất hiện trong không bào của phagocyte sau 24 giờ và trong các không bào

ñã thoái hóa sau 72 giờ Trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh, vi khuẩn gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận Các cơ quan nội tạng bị hoại tử hoặc xuất hiện ñốm trắng, trong ruột chứa ñầy dịch máu

Các nhân tố gây ñộc liên quan ñến quá trình phát sinh bệnh do vi khuẩn E

ictaluri bao gồm: Các polysaccharide của vỏ capsule, các hemolysin, lypopolysaccharide và một số enzyme chondroitin sulfate [23] Tương tự với các

chủng vi khuẩn gây bệnh khác, E ictaluri có thể tạo ra lớp polysaccharide dày giống

như chất nhày bao phủ các protein kháng nguyên giúp vi khuẩn tránh khỏi sự ñáp ứng

miễn dịch của tế bào vật chủ [35] Màng tế bào E ictaluri có liên ñới với các

hemolysin, nhưng hemolysin không phải là nhân tố gây ñộc quan trọng ở cá tra [53] Theo Lawwrence và cộng sự (2003), lypopolysaccharide (LPS) ñược xem như là nhân

tố gây ñộc chính của E ictaluri [35] Các chủng vi khuẩn E ictaluri có LPS có khả

năng kháng ñối với sự phân hủy tế bào vi khuẩn bởi hệ thống bổ thể hoặc quá trình thực bào tốt hơn các chủng thiếu LPS [35] Cooper và cộng sự (1996) cho rằng hoạt

tính chondroitinase cũng góp phần vào ñộc tính của E ictaluri [23] Hoạt tính

chondroitinase phân giải mô sụn tạo nên những lỗ thủng trên ñầu cá (thườn goi là triệu trứng “hole in the head”) [23]

E ictaluri tồn tại trong các lớp chất ñáy ao hồ tới 95 ngày ở nhiệt ñộ lạnh [33], [41] Vì vậy, dưới những ñiều kiện tối ưu, nó có thể cảm nhiễm vào cá ở mọi lứa tuổi [26] Sự lây nhiễm theo trục ngang của bệnh có thể diễn ra thông qua sự phát tán vi khuẩn vào môi trường nước nuôi bởi các cá thể cá bị nhiễm bệnh hoặc do sự ăn thịt lẫn nhau giữa cá khỏe với cá bị bệnh [30] Ngoài ra, chim và các trang thiết bị từ các ao/bể

cá bị bệnh cũng góp phần vào sự lan truyền bệnh giữa các ao/hồ hoặc giữa các trại cá [30]

11

1.2.3 Những nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E ictaluri

đã có một số nghiên cứu về khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E

ictaluri ở các ựối tượng thủy sản khác nhau Hawke (1979) [29] là người ựầu tiên kiểm

tra tắnh nhạy cảm của vi khuẩn E ictaluri ựối với kháng sinh Sau ựó, Waltman và Shotts (1986) [52] ựã thử nghiệm tắnh nhạy cảm của 118 chủng vi khuẩn E ictaluri

ựược phân lập trên cá nheo tại Hoa Kỳ với 37 loại kháng sinh khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy hơn 90% các chủng vi khuẩn ựề kháng ựược với colistin và

sulfonamid Reger và cộng sự (1993) [43], cũng ựã xác ựịnh chủng E ictaluri phân lập

trên cá nheo còn nhạy với enrofloxacin, gentamycin và doxycucline Stock và

Wiedemann (2001) [45] xác ựịnh vi khuẩn thuộc giống Edwardsiella, kể cả vi khuẩn

E ictaluri nhạy với các kháng sinh thuộc nhóm quinolones Tuy nhiên, Akinbowale và

cộng sự (2007) ựã thông báo vi khuẩn E ictaluri ựã bắt ựầu kháng với nhóm kháng

sinh này Theo báo cáo của Cục kiểm ựịnh thuốc ở Châu Âu, quinolon là nhóm thuốc kháng sinh rất quan trọng chuyên dùng trị các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho người

và ựộng vật Do ựó, việc dùng thuốc kháng sinh này trong thủy sản cần hết sức thận trọng và cần ựược kiểm soát chắt chẽ bởi các cơ quan có thẩm quyền

Hiện tượng kháng thuốc càng trở nên nghiêm trọng hơn, khi trong môi trường nuôi thủy sản có sự kháng thuốc hình thành gián tiếp thông qua thể R Ờ plasmid R Ờ plasmid có 2 nhóm, nhóm mang gen kháng sulphonamid và tetracycline và nhóm mang gen kháng chloramphenicol, sulphonamid và streptomycine Các R Ờ plasmid

có thể làm trung gian cho sự kháng một hay nhiều loại thuốc kháng sinh thông qua các gen mã hóa theo cơ chế bất hoạt hóa một hay nhiều loại thuốc kháng sinh [18] Mcphearson và cộng sự (1991) [36] ựã phát hiện trên một số vi khuẩn gây bệnh cá chứa plasmid kháng thuốc kháng sinh chloramphenicon, trimethoprim, sulphonamid

và tetracylin

Ở Việt Nam, chủng vi khẩn E ictaluri phân lập từ cá tra bị nhiễm bệnh gan thận

mủ ở ựồng bằng song Cửu Long Việt Nam ựược xác ựịnh là kháng lại với một số loại thuốc kháng sinh thông thường và rất có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh xuất huyết nội tạng (ESC) trên cá nheo Mỹ như: Oxytetracylin, oxonilic acid, sulphonamid [3], [10], [24]; bactrime, colostin, amoxicillin, tetracylin, doxycyclin [8]

12

Từ Thanh Dung và cộng sự (2008, 2010) khảo sát tính kháng kháng sinh của

chủng E ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ở ñồng bằng song Cửu Long cho

thấy vi khuẩn ñã có hiện tượng kháng thuốc ñáp ứng với kháng sinh streptomycin (83% trong số 64 chủng ñã kháng thuốc), trimethoprim (71% trong tổng số 64 chủng

ñã kháng thuốc), tetracycline (64% trong tổng số 50 chủng ñã kháng thuốc), doxycylin

(56% trong tổng số 50 chủng) và có trên 705 trong tổng số 50 chủng E ictaluri kháng

với thuốc kháng sinh nhóm phenicol (chloramphenicol và florfenicol) [4], [25] ðồng thời kết quả cũng ñã xác ñịnh nồng ñộ ức chế tối thiểu (MIC) khá cao (MIC90 128µg/ml) cũng ñã thể hiện tính kháng cao của vi khuẩn ñối với nhóm kháng sinh phenicol Vi khuẩn này ñã bắt ñầu có hiện tượng kháng với nhóm quinolone như: flumequin và enrofloxacin ở mức giá trị MIC50 là 4 µg/ml và MIC90 là 64 µg/ml; streptomycin với giá trị MIC90 ≥ µg/ml, chloramphenicol, enrofloxacine MIC90 (128 µg/ml) và oxytetracyline với giá trị MIC90 (64 µg/ml) [4], [25]

Ngoài ra, hiện tượng ña kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn E ictaluri cũng ñang

là mối lo không chỉ của người nuôi mà còn là mối lo ñối với các nhà quản lý sức khỏe cộng ñồng bởi nó không chỉ làm giảm hiệu quả ñiều trị mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ ñối với sức khỏe con người, nhất là các kháng sinh ñã bị cấm Nghiên cứu của nhóm

tác giả ðại học Cần Thơ năm 2010 cho thấy có ñến 86% chủng vi khuẩn E ictaluri thể

hiện tính ña kháng Trong ñó vi khuẩn kháng ñồng thời với 8 loại kháng sinh chiếm tỉ

lệ 20,9%, với 9 loại kháng sinh chiếm tỉ lệ 11,6%; có 73% trong tổng số 64 chủng E

ictaluri khảo sát ña kháng sinh với ít nhất 3 loại kháng sinh

Tóm lại, những nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học của chủng E ictaluri cho thấy

vi khuẩn E ictaluri gây nhiễm trùng máu trên cá nheo ở Hoa Kỳ, cá trê trắng ở Thái

Lan và gây hoại tử nội quan của một số loài cá da trơn (cá tra, cá basa) nuôi ở Indonesia, Trung Quốc và Việt Nam ðồng thời vi khuẩn này ñã kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh thường ñược sử dụng trong nuôi trồng thủy sản Do vậy, việc nghiên

cứu ñặc ñiểm sinh học và ñiều kiện bảo quản chủng E ictaluri ñã bị làm yếu ñộc lực

bằng công nghệ ñột biến gen nhằm ổn ñịnh nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm vaccine phòng bệnh cho cá là hết sức cần thiết và thiết thực

1.3 Khả năng phát triển của chủng E ictaluri bị ñột biến gen và chủng E ictaluri

chưa ñột biến gen (chủng “hoang dại”) trên một số môi trường nuôi cấy khác nhau

13 Shots và Waltman (1990) [44] ñã nghiên cứu và thử nghiệm các môi trường nuôi

cấy vi khuẩn E ictaluri bao gồm: Môi trường MAC, TSA và EIM (Edwardsiella

ictaluri medium) Kết quả cho thấy, EIM ñược xem là môi trường chọn lọc của vi

khuẩn E ictaluri so với môi trường MAC và TSA EIM có khả năng ức chế hầu hết sự phát triển của: Vi khuẩn gram âm ngoại trừ Proteus sp., Serratia marcescens,

Aeromonas hydrophila và Yersinia ruckeri; Vi khuẩn gram dương trừ cầu khuẩn

ñường ruột, ức chế ñược các chủng Pseudomonas spp mà không ảnh hưởng ñến sự

phát triển của E ictaluri Vi khuẩn E ictaluri phát triển trên EIM có thể dễ dàng phân

biệt với các vi khuẩn khác dựa trên hình thái khuẩn lạc trên EIM, sau 48 giờ nuôi cấy,

khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri có ñường kính 0,5 – 1,0 mm, màu xanh mờ [44]

Năm 1996, Collins và Thune ñã xác ñịnh thành phần môi trường tối thiểu ñể vi

khuẩn E ictaluri có thể phát triển ñược (môi trường DMM) [22] Năm 1998, Hawke

ñã sử dụng môi trường BHIA và TSA ở nhiệt ñộ 25 – 300C ñể nuôi cấy chủng vi

khuẩn E ictaluri Tuy nhiên, sự phát triển của chủng vi khuẩn E ictaluri rất chậm và

không thể xác ñịnh ñược sau 24 giờ Sau 48 giờ nuôi cấy, các khuẩn lạc ñiển hình với

số lượng lớn hình thành [30]

Lawrence và cộng sự (1997), Nguyễn Quốc Bình và cộng sự (2010) [1] cho rằng,

khi ñột biến gen khuyết dưỡng (gen purA, gen aroA), chủng vi khuẩn bị ñột biến cần

ñược bổ sung chất dinh dưỡng phù hợp thì mới có thể sống ñược [37] ðối với chủng

vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA, chất dinh dưỡng cần bổ sung là adenine ðối với chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen aroA, chất dinh dưỡng cần bổ sung là

chorismate Hàm lượng adenine cung cấp tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

25 µg/ml adenine ñối với môi trường DMM [37], 50 µg/ml adenine ñối với môi trường BHIB, [11] Ngoài ra, Nguyễn Trọng Bình và cộng sự (2011) , Trần Thị Bích Thủy (2012) sử dụng các môi trường BHIB, LB và EIM ñể nuôi cấy tăng sinh chủng vi

khuẩn E ictaluri sau khi ñột biến gen purA, aroA và ch, sau 48 giờ nuôi cấy ở 280C

cho thấy vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến có khả năng phát triển trên các môi trường

14

1.4 Một số phương pháp bảo quản chủng vi khuẩn E ictaluri hiện nay trên Thế

giới và Việt Nam

Hiện nay có rất nhiều phương pháp bảo quản vi khuẩn khác nhau, tuy nhiên với

vi khuẩn E ictaluri thì có một số phương pháp sau thường ñược nhiều người sử dụng 1.4.1 Phương pháp bảo quản thạch nghiêng

ðây là phương pháp khả phổ biến, rất ñơn giản và tiện lợi, tuy nhiên thời gian lưu giữ lại khá ngắn, sau ñó phải cấy truyền lại trên môi trường thạch mới Do phải cấy truyền nhiều lần nên tốn khá nhiều công sức và chủng cũng dễ bị mất ñi các ñặc tính di truyền ban ñầu

1.4.2 Phương pháp bảo quản dưới lớp dầu khoáng

Phương pháp này ñã ñược Lumiere và Chevotier ñề nghị ñầu tiên năm 1914, tương tự như phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng nhưng ñể ngăn cản vi khuẩn phát triển, phủ một lớp dầu khoáng lên trên mặt môi trường thạch nghiêng, làm vi khuẩn không thể tiếp xúc trực tiếp với không khí nên không thể phát triển Phương pháp này ñơn giản, nhưng thời gian bảo quản có thể kéo dài ñến 12 tháng, ñỡ tốn công cấy truyền và ít có nguy cơ giống bị thoái hóa hoặc nhiễm tạp Phương pháp này ñược

khuyến cáo là không thích hợp với một số vi sinh vật như: Aerobacter, Alcaligens,

Erwinia, Cytophaga, Leuconostoc, Pseudomonas, Streptococcus và Vibrio [5]

1.4.3 Phương pháp lạnh sâu

ðây là phương pháp dựa trên cơ sở phát triển của vi khuẩn bị ức chế ở nhiệt ñộ lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn ñến việc làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất ñiện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào ðể khắc phục nhược ñiểm này, người ta ñã bổ sung các chất làm hạn chế tốc ñộ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này ñược thể hiện ở các thang nhiệt ñộ khác nhau như -200C, -300C, -400C, -700C, -

1400C và -1900C Nói chung, ở mức nhiệt ñộ cao hơn -300C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng ñộ muối cao sinh ra từ các chất ñiện giải Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và vi rút ðặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong môi trường nitơ lỏng là phương pháp tốt hơn cả Tuy nhiên phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược ñiểm như ñầu tư kinh phí cho thiết bị và ñiện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy,

15

nổ, … ðặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng ñến Nói chung, phương pháp lạnh sâu thường ñược dùng với các chủng vi sinh vật có những ñặc tính quí mà không thích hợp với việc ñông khô

1.4.4 Phương pháp ñông khô

Phương pháp ñông khô là phương pháp phổ biến ñược sử dụng tại mọi bảo tang

vi sinh vật trên thế giới ðây là phương pháp làm thăng hoa phần nước có trong môi trường nhũ hóa vi sinh vật ở ñiều kiện áp suất thấp Phương pháp này có ưu ñiểm là tỷ

lệ sống của vi sinh vật rất cao, các ñặc tính di truyền của vi sinh vật không bị biến ñổi

và thời gian lưu giữ giống ñược kéo dài khá lâu, ít tốn công sức ñể cấy truyền nhiều lần Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là không phải phòng thí nghiệm vi sinh vật nào cũng làm ñược, phải ñầu tư các thiết bị có giá trị kinh tế cao

16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu

+ ðối tượng nghiên cứu: Chủng Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA từ chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại có ñộc lực cao gây bệnh gan thận mủ cá tra ở

ñồng bằng sông Cửu Long ñược cung cấp bởi nhóm nghiên cứu ñề tài cấp Nhà nước ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III

+ Phạm vi nghiên cứu: Tìm hiểu ñặc ñiểm về hình dạng, kích thước, ñặc ñiểm

sinh lý, sinh hóa và khả năng phát triển của chủng Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau trong ñiều kiện thí nghiệm

2.2 Vật liệu nghiên cứu

+ Chủng Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) từ chủng

E ictaluri hoang dại có ñộc lực cao gây bệnh gan thận mủ cá tra Việt nam (E ictaluri

WT) ñược cung cấp bởi ñề tài cấp Nhà nước, mã số 163/Hð-BNN-KHCN

+ Chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại (E ictaluri WT)

+ Môi trường phân lập, nuôi cấy tăng sinh và kiểm tra sinh hóa chủng vi khuẩn E

ictaluri:

- Môi trường phân lập chủng E ictaluri: Sử dụng môi trường nuôi cấy không

chọn lọc Brain Heart Infusion Agar (BHIA) và môi trường nuôi cấy chọn lọc Edwardsiella Ictaluri Medium (EIM) agar theo Shotts và Waltman (1990) [47] Thành phần môi trường EIM cụ thể như sau:

17

- Môi trường nuôi cấy tăng sinh chủng E ictaluri: Sử dụng môi trường Brain

Heart Infusion Broth (BHIB), Luria Bertami (LB) theo Nguyễn Trọng Bình và cộng sự (2011) [20], thành phần môi trường cụ thể như sau:

+ Thành phần môi trường BHI (Brain Heart Infusion) - Biorad (Mỹ)

- Kiểm tra khả năng tổng hợp adenine của chủng E ictaluri bị ñột biến gen purA:

sử dụng môi trường DMM theo Lawrence và cộng sự (1997) [37] Thành phần môi trường DMM cụ thể như sau:

18 + Hóa chất, thuốc kháng sinh: Adenine, kanamycin, gentamycin, streptomycin, neomycin, mannitol 0,35%, Colistin sulphate, thuốc nhuộm Gram (cồn, acetone, Fucsine, Crystian violet), Chlorin, KMnO4, NaCl

2.3 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

2.3.1 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2013 ñến tháng 11/2014

2.3.2 ðịa ñiểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III

2.4 Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài luận văn: ðược thể hiện qua sơ ñồ

hình 2.1

Hình 2.1 Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài

Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng Edwardsiella ictaluri ñột biến gen purA

ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau

Kết luận

Tính kháng kháng sinh của

Trong ñiều kiện lạnh sâu (-30oC)

Thạch nghiêng BHI có

bổ sung dầu khoáng

Khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển của

vi khuẩn theo thời gian

Khảo sát khả năng phát triển của

chủng E ictaluri ñột biến gen purA ở

các ñiều kiện bảo quản khác nhau

Khảo sát khả năng phát triển trong

môi trường có kanamycine và tính

kháng kháng sinh của chủng E

ictaluri ñột biến gen purA

Khảo sát khả năng phát triển ở các

ñiều kiện bảo quản

19

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; ño kích thước của vi khuẩn; nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA

2.5.1.1 Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, ño kích thước vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA

+ Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri: Vi khuẩn ñược nuôi cấy trên môi

trường BHIA ở nhiệt ñộ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc bằng mắt thường và ño kích thước khuẩn lạc bằng thước ño có ñộ chính xác ñến 1

mm

+ Hình dạng, kích thước vi khuẩn E ictaluri: ðược xác ñịnh bằng phương pháp

nhuộm Gram (Barrow, Feltham, 1993) [20], soi và ño kích thước vi khuẩn trên kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) có gắn trắc vi thị kính, quan sát ở ñộ phóng ñại 1000 lần

2.5.1.2 Phương pháp nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa chủng E ictaluri bị ñột biến gen purA

+ Kiểm tra các ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa: Sử dụng kít API 20E (Bio Merieux - Pháp) kết hợp một số phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống (KIA-Kligler Iron Agar, Mannitol, di ñộng, oxidase, catalase, khả năng chịu mặn ở 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30 ‰) Tính di ñộng của vi khuẩn ñược quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính, trải ñều trên lam kính một ít vi khuẩn, ñậy bằng lamen và quan sát bằng kính hiển vi ở

ñộ phóng ñại 100 lần

+ Kiểm tra khả năng tổng hợp adenine của chủng vi khuẩn E ictaluri PAM bằng

cách nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường DMM (Defined Minimal Medium)

của Collins và Thune (1996) [22] không bổ sung adenine (E ictaluri PAM) và có bổ sung 50 µg adenine/ml môi trường (E ictaluri PAM+Ad.0,05) Theo dõi và xác ñịnh

mật ñộ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm tại các thời ñiểm 12, 24, 36 và 48 giờ nuôi cấy ở 28oC

+ ðịnh danh vi khuẩn dựa vào hệ thống phân loại của Bergey’s (1994)

2.5.2 Phương pháp kiểm tra tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA

20

2.5.2.1 Phương pháp khảo sát sự phát triển của vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA trong môi trường có kháng sinh kanamycine (Hình 2.2)

Hình 2.2 Sơ ñồ xác ñịnh ñường cong sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn E

ictaluri ñột biến gen purA trong môi trường BHIB có bổ sung kháng sinh kanamycine

+ Chủng vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) giữ ñông ở -

800C ñược ñem nuôi cấy trên môi trường EIM, ủ ở 28oC trong 48 giờ

+ Chọn khuẩn lạc ñơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên ñĩa EIM ñem cấy chuyển qua 5ml môi trường BHIB 50µg adenine/ml và 50 µg/ml colistin Tiến hành nuôi cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ

+ Chuyển dịch tăng sinh vào bình tam giác chứa môi trường BHIB có nồng ñộ kháng sinh tương tự bước tăng sinh trong 5ml môi trường BHIB (50µg adenine/ml +

50 µg/ml colistin) và môi trường BHIB có bổ sung kháng sinh kanamycine (50µg

adenine/ml + 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin ñối với chủng E ictaluri PAM)

Tiếp tục nuôi cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ

+ Ghi nhận giá trị ño mật ñộ tế bào (OD) sau mỗi 2 giờ/lần bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600 nm kết hợp với phương pháp ñếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch BHI theo Koch

với chủng vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) và E ictaluri hoang dại (E ictaluri WT)

+ Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên ñĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) ñã tiệt trùng

+ ðiều chỉnh mật ñộ vi khuẩn ñược xác ñịnh dựa vào phương pháp so màu trên máy quang phổ: dung dịch trộn ñều trên máy votec sau ñó ñem ño trên máy so màu quang phổ ở bước sóng 610nm, ñiều chỉnh ñộ ñục ở mức OD= 0,1± 0,02, khi ñó mật

ñộ vi khuẩn trong ống nghiệm vào khoảng 1 x 108 cfu/ml

+Lấy 0,2 ml vi khuẩn từ ống nghiệm trải ñều trên ñĩa thạch, sau ñó gắn các ñĩa kháng sinh vào ñĩa thạch (ñĩa kháng sinh là những mảnh giấy tròn có tẩm kháng sinh) Ủ trong tủ ấm ở nhiệt ñộ 30oC

Hình 2.3: Sơ ñồ thực hiện kháng sinh ñồ các vi khuẩn

+ Sau 24 giờ, ño ñường kính vòng vô trùng (mm) bằng thước kẹp có ñộ chính xác 1mm: Dựa vào chuẩn ñường kính của vòng vô trùng theo tài liệu “The Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI (ormer NCCLS M31-A2)) của Anonymous

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý ðiều chỉnh ñộ ñục vi khuẩn ( Nồng ñộ 108 cfu/mL)

Cấy vi khuẩn lên ñĩa thạch BHI Broth ðặt khoanh giấy kháng sinh

ðo vòng vô khuẩn Xác ñịnh khả năng kháng của kháng sinh ñối với vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri

22

(2006b) nhằm xác tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen

pur A (E ictaluri PAM) ñối với nhóm kháng sinh aminoglycosid

2.5.3 Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của chủng E ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau

2.5.3.1 Phương pháp thiết lập ñường cong sinh trưởng phát triển vi khuẩn E ictaluri

bị ñột biến gen purA ở ñiều kiện thí nghiệm

+ Phương pháp ñược tiến hành tương tự như mục 2.5.2.1 nhưng Chủng E

ictaluri WT nuôi trong BHIB chứa 50 µg/ml colistin, chủng E ictaluri PAM nuôi

trong BHIB 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin và 50 µg/ml kanamycin

2.5.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ trên thạch nghiêng BHI ở 4 o C

+ Vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) và E ictaluri chưa

ñột biến (E ictaluri WT) giữ ñông ở -80oC ñược ñem nuôi cấy phục hồi trên môi trường EIM, ủ ở 28oC sau 48 giờ Sau ñó chọn một khuẩn lạc ñơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên môi trường EIM, tăng sinh trong môi trường BHIB chứa 50 µg/ml

colistin (ñối với chủng E ictaluri WT) và môi trường BHIB chứa 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin (ñối với chủng E ictaluri PAM) Tiến hành nuôi

cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ

+ Lấy 10ml dịch vi khuẩn li tâm ở 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC thu phần huyền phù cặn (vi khuẩn) sao cho ñạt giá trị OD600nm khoảng 1,0 (tương ñương khoảng 109CFU/ml); kiểm tra mật ñộ vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo Koch ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn ban ñầu ñem bảo quản, ñồng thời nhuộm gram ñể xác ñịnh hình dạng và kích thước khi ñem bảo quản

+ Chia dịch huyền phù (vi khuẩn) với thể tích 1ml vào ống thạch nghiêng BHI

ñã ñược chuẩn bị sẵn, sau ñó ñem bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC

+ Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC, 3 ống thạch nghiêng ñem bảo quản ñược lấy ra kiểm tra hình dạng, kích thước vi khuẩn và nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo phương pháp của Koch và ño mật ñộ quang (OD) trên máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn sau 30 ngày bảo quản Thí nghiệm ñược tiến hành theo dõi trong 90 ngày

2.5.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ trên thạch nghiêng BHI có phủ lớp dầu khoáng (paraffin) ở 4 o C

23 + Phương pháp ñược tiến hành tương tự như mục 2.5.3.2 nhưng dịch huyền phù vi khuẩn sau khi ñược ñưa vào các ống thạch nghiêng BHI ñã ñược chuẩn bị trước ñược ñem phủ một lớp dầu khoáng dày 1 – 2 cm rồi mới ñem bảo quản ở nhiệt ñộ 40C

+ Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như mục 2.5.3.2

2.5.3.4 Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ bằng phương pháp lạnh sâu (-30 o C)

+ Các bước chuẩn bị vi khuẩn ñem bảo quản tương tự như mục 2.5.3.2 Tuy nhiên, vi khuẩn sau khi ly tâm ở tốc ñộ 3000 vòng/phút trong 10 phút ñược trộn với 10% glycerol ñã ñược thanh trùng (về thể tích) như là chất chống ñông

+ Dùng pipet Pasteur hút khoảng 1ml dịch huyền phù ñưa vào trong ống lạnh sâu và ñóng nắp Bao ống lạnh sâu bằng paraffin

+ Toàn bộ các ống lạnh sâu ñem bảo quản ñược ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 30 phút ñể cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào vi khuẩn

+ Các ống lạnh sâu ñem bảo quản ñược làm lạnh từ từ (thang 5oC/lần) ñến

-30oC và cuối cùng bảo quản ở - 30oC

+ Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt ñộ -30oC, kiểm tra hình dạng, kích thước

và mật ñộ vi khuẩn ñem bảo quản tương tự như phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng Thí nghiệm ñược tiến hành theo dõi trong 30 ngày

Lưu ý: khi ñem các ống lạnh sâu bảo quản ở nhiệt ñộ -30oC ñể kiểm tra hình dạng, kích thước và mật ñô vi khuẩn thì cần phải ñược hoạt hóa bằng cách làm rã ñông (ñưa ngay vào tủ ấm 37oC trong 40 giây)

2.6 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu

Số liệu thí nghiệm ñược xử lý bằng phép so sánh giá trị trung bình với phương sai khác nhau (t-test: two sample assuming unequal variances), phép phân tích ANOVA một nhân tố (ANOVA – single factor) và hai nhân tố không lặp lại (ANOVA – two factor without replication) trên phần mềm Excel của máy vi tính Ngoài ra, phần mềm SPSS cũng ñược sử dụng ñể phân tích sâu Post hoc với kiểm ñịnh Tukey hay LSD ñể so sánh các giá trị trung bình của các nhóm dữ liệu nghiên cứu

24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri bị ñột biến gen purA

3.1.1 Kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển của chủng E ictaluri bị ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) trên môi trường BHIB có kháng sinh kanamycine

Kết quả xác khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA trên môi trường BHIB không bổ sung kanamycine và có bổ sung 50 µg kanamycine /ml môi trường, kết quả theo dõi sinh trưởng quần thể vi khuẩn E ictaluri

bị ñột biến gen purA theo thời gian nuôi cấy ñược thể hiện ở hình 3.1

Hình 3.1 ðường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen

purA (PAM) và E ictaluri chưa ñột biến (WT) trên môi trường nuôi cấy

BHIB có kanamycin

25

Kết quả từ hình 3.1 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy chủng vi khuẩn E ictaluri bị

ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) trong môi trường BHIB có bổ sung 50 µg kanamycine /ml môi trường cho sinh trưởng tương tự như trong môi trường BHIB không bổ sung kanamycine Phân tích Anova single factor so sánh sự khác biệt về sinh

trưởng của chủng E ictaluri PAM trong ñiều kiện nuôi cấy trên môi trường BHIB có

bổ sung kanamycine và môi trường BHIB không bổ sung kanamycine cho thấy không

có sự khác biệt về sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn này (p>0,05) (phụ lục 1) Kết

quả chứng tỏ chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA kháng với kháng sinh kanamycine Sở dĩ vậy là do, trong quá trình ñột biến làm hỏng gen purA, mất khả

năng tổng hợp adenine, dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine nhược ñộc, ñoạn gen

purA bị gây ñột biến mất ñoạn và sử dụng một ñoạn gen kháng kháng sinh

kanamycine chèn vào bộ gen của vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến Do vậy chủng vi

khuẩn ñột biến này có khả năng kháng ñược với kanamycine

3.1.2 Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA vơi một số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid

Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA và vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến với một số loại kháng sinh

thuộc nhóm aminoglycosid ñược thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả vòng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến

gen purA và vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến với kháng sinh thuộc nhóm

aminoglycosid ðường kính vòng kháng khuẩn (mm) Tên kháng sinh

26 kháng kanamycine và có thể phát triển ñược trong môi trường có chứa kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid Theo Aoki T (1988) [21], trong nuôi trồng thủy sản có sự kháng thuốc hình thành gián tiếp thông qua thể R – plasmid, các R – Plasmid có thể làm trung gian cho sự kháng một hay là nhiều loại thuốc kháng sinh

Chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA ñược tạo ra bằng cách làm hỏng gen purA, mất khả năng tổng hợp adenine ðoạn gen purA, mã hóa cho enzyme tổng

hợp adenine, bị gây ñột biến mất ñoạn và thay bằng gen kháng kháng sinh kanamycin

Chủng vi khuẩn E ictaluri khi loại bỏ gen purA, gen mã hóa cho enzyme

adenylosuccinate synthase là enzyme ñầu tiên xúc tác cho quá trình tổng hợp AMP- tham gia vào quá trình tổng hợp purin ribonucleotide

Hình 3.2 Kháng sinh ñồ của vi khuẩn E ictaluri hoang dại chưa ñột biến gen

purA (A) và vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (B)

3.2 Kết quả khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản

3.2.1 Kết quả tìm hiểu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA (E ictaluri PAM)

3.2.1.1 ðặc ñiểm hình thái

Trên môi trường nuôi cấy BHIA, vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA (E

ictaluri PAM) cũng như vi khuẩn E ictaluri hoang dại (E ictaluri WT) ñều phát triển

chậm Cụ thể, ở nhiệt ñộ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên

B

A