Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri bị đột biến gen pura ở các điều kiện bảo quản khác nhau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ CHI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ðỘT BIẾN GEN PURA Ở CÁC ðIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SĨ Khánh Hòa, năm 2014 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ CHI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI BỊ ðỘT BIẾN GEN PURA Ở CÁC ðIỀU KIỆN BẢO QUẢN KHÁC NHAU Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản Mã số: 60 62 03 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VÕ VĂN NHA TS LÊ MINH HOÀNG CHỦ TỊCH HỘI ðỒNG KHOA SAU ðẠI HỌC Khánh Hòa, năm 2014 ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu kết ñã nêu luận văn công trình nghiên cứu với cho phép sử dụng chung số liệu nhóm tác giả thực ñề tài thuộc chương trình Công nghệ sinh học cấp Nhà nước Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, số liệu trung thực, chưa ñược công bố công trình khác Tác giả iii LỜI CẢM ƠN Luận văn ñã ñược thực với giúp ñỡ nhóm nghiên cứu ñề tài Công nghệ sinh học cấp Nhà nước: “Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhược ñộc dùng làm vắc xin phòng bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) kỹ thuật gây ñột biến gen” Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III chủ trì, xin chân thành cảm ơn ñến giúp ñỡ quí báu ñó Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến dẫn nhiệt tình, chu ñáo giáo viên hướng dẫn TS Võ Văn Nha TS Lê Minh Hoàng ñã giúp suốt trình xây dựng ñề cương, triển khai thực nội dung hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp ñỡ tạo ñiều kiện thuận lợi bạn ñồng nghiệp thuộc Phòng nghiên cứu Bệnh Thủy sản dự báo, Trung tâm quốc gia quan trắc cảnh báo môi trường phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III ñể hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ñến Khoa Nuôi trồng Thuỷ sản, Khoa sau ðại học, Trường ðại học Nha Trang, quý thầy cô ñã tận tình giảng dạy suốt thời gian qua Cuối xin cảm ơn ñến gia ñình ñã ñộng viên giúp ñỡ hoàn thành luận văn Tác giả iv MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa ………………………………………………………………… i LỜI CAM ðOAN …………………………………………………………… ii LỜI CẢM ƠN …………………………………………………………… iii MỤC LỤC …………………………………………………………… iv DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT………………………………… vii DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………… viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ ……………………………………… ix MỞ ðẦU …………………………………………………………… Chương – TỔNG QUAN …………………………………………………… 1.1 Những nghiên cứu chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen cho mục ñích tạo vaccine phòng bệnh E ictaluri cá da trơn Thế giới Việt Nam 1.1.1 Trên Thế giới ………………………………………………………… 1.1.2 Tại Việt Nam …………………………………………………………… 1.2 Những nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học, khả gây bệnh cá tra vi khuẩn E ictaluri phân lập cá tra Việt Nam cá nheo (catfish) Hoa Kỳ………… ………………………………………… 1.2.1 ðặc ñiểm hình thái, sinh lý sinh vật hóa học vi khuẩn E ictaluri …… 6 1.2.2 Những nghiên cứu khả gây bệnh cá tra nuôi vi khuẩn E ictaluri …………………………………………………………… 1.2.3 Những nghiên cứu khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn E ictaluri …………………………………………………………………………… 11 1.3 Khả phát triển chủng E ictaluri bị ñột biến gen chủng E ictaluri chưa bị ñột biến gen (chủng “hoang dại”) số môi trường 12 nuôi cấy khác ……………………………………………… 1.4 Một số phương pháp bảo quản chủng vi khuẩn E ictaluri Thế giới Việt Nam …………… …………………… ……………… 14 1.4.1 Phương pháp bảo quản thạch nghiêng.………………………………… 14 1.4.2 Phương pháp bảo quản lớp dầu khoáng ………………… ……… 14 v 1.4.3 Phương pháp lạnh sâu …………………………………………………… 14 1.4.4 Phương pháp ñông khô …………………………………………………… 15 Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………… 16 2.1 ðối tượng phạm vi nghiên cứu ……………………………………… 16 2.2 Vật liệu nghiên cứu ……………………………………………………… 16 2.3 Thời gian ñịa ñiểm nghiên cứu ……………………………………… 18 2.2.1 Thời gian nghiên cứu …………………………………………………… 18 2.2.2 ðịa ñiểm nghiên cứu …………………………………………………… 18 2.4 Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu ñề tài luận văn ………………… 18 2.5 Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………… 19 2.5.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; ño kích thước vi khuẩn; nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA …………………………… 19 2.5.2 Phương pháp kiểm tra tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ……………………………… 19 2.5.3 Phương pháp khảo sát khả phát triển chủng E ictaluri bị ñột biến gen purA ñiều kiện bảo quản khác ……………………… 22 2.6 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu ………………………………… 23 Chương - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ……………………………………… 24 3.1 Xác ñịnh tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA ………………………………………………… 24 3.1.1 Kết khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA môi trường BHI có kháng sinh kanamycine ………………………… ………… 24 3.1.2 Kết tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA với số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid 25 3.2 Kết khảo sát khả phát triển chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA ñiều kiện bảo quản ………………………… 26 3.2.1 Kết tìm hiểu số ñặc ñiểm sinh học chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ……………………………… 3.2.2 Kết khảo sát kích thước chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị 26 vi ñột biến gen purA theo thời gian ñiều kiện bảo quản khác ……… 32 3.2.3 Kết nghiên cứu khả phát triển chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ñiều kiện bảo quản khác ……………… 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………………… 43 KẾT LUẬN …………………………………………………………………… 43 KIẾN NGHỊ …………………………………………………………………… 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………… 45 PHỤ LỤC …………………………………………………………… vii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT API 20E: Hệ thống ñịnh danh vi khuẩn họ Enterobacteriaceae vi khuẩn Gram âm hình que BHIA: Brain Heart Infusion Agar – Môi trường thạch BHI BHIB: Brain Heart Infusion Broth – Môi trường lỏng BHI CFU: Colony Forming Unit – ðơn vị khuẩn lạc Cs: Cộng DMM: Defined Minimal Medium – Môi trường nuôi cấy DMM EIM: Edwardsiella Ictaluri Medium – Môi trường nuôi cấy EIM ESC: Enteric Septicemia of Fish – Bệnh ESC KIA: Klegler Iron Agar – Môi trường thạch KIA LB: Luria Bertami – Môi trường LB LDC: Lysine decarboxylase MAC: Mac Conkey Agar – Môi trường thạch Mac Conkey NN&PTNT: Nông nghiệp phát triển nông thôn OD: Optical Density (mật ñộ quang) ODC: Ornithine decarboxylase O/F: Oxydation/Fermentation ONPG: β- Galactosidase TSA: Tryptone Soya Agar – Môi trường không chọn lọc TSA viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết vòng kháng kháng sinh vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến với kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid …………………….………………… 25 Bảng 3.2 ðặc ñiểm khuẩn lạc, hình dạng kích thước chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA chủng chưa ñột biến gen purA……… 27 Bảng 3.3 ðặc ñiểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA, E ictaluri chưa ñột biến gen purA …………………………… 29 Bảng 3.4 Kích thước chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) E ictaluri chưa ñột biến gen purA (E ictaluri WT) 32 Bảng 3.5 Kết khảo sát phát triển chủng bị ñột biến gen purA ñiều kiện bảo quản khác thạch nghiêng …………………… 41 ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ Hình 1.1 Con ñường tổng hợp adenylosuccinate synthetase từ gen purA Hình 2.1 Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu ñề tài …………………………… 18 Hình 2.2 Sơ ñồ xác ñịnh ñường cong sinh trưởng, phát triển chủng E ictaluri ñột biến gen purA môi trường BHIB có bổ sung kanamycine không bổ sung kanamycine 20 Hình 2.3 Sơ ñồ thực kháng sinh ñồ vi khuẩn Hình 3.1 ðồ thị kết khảo sát ñường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi 21 khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA môi trường nuôi cấy BHIB có bổ sung kanamycine không bổ sung kanamycine Hình 3.2 24 Kháng sinh ñồ vi khuẩn E ictaluri chưa ñột biến gen bị ñột biến gen purA (A) vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (B) 26 Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (A, B) 28 Hình 3.4 Vi khuẩn E ictaluri chưa ñột biến gen bị ñột biến gen purA (A) vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (B) Hình 3.5 28 Sinh trưởng quần thể vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA môi trường DMM có bổ sung adenine không bổ sung adenine OD – mật ñộ quang Hình 3.6 31 Kết khảo sát ñường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến gen bị ñột biến gen purA E ictaluri ñột biến gen purA môi trường nuôi cấy BHIB Hình 3.7 34 Kết khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến gen E ictaluri ñột biến gen purA bảo quản thạch nghiêng 4oC theo thời gian Hình 3.8 35 Kết khảo sát giá trị OD vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến gen E ictaluri ñột biến gen purA bảo quản thạch nghiêng 4oC theo thời gian Hình 3.9 35 Kết khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến gen E ictaluri ñột biến gen purA bảo quản thạch nghiêng có phủ dầu khoáng 48C theo thời gian 37 Hình 3.10 Kết khảo sát giá trị OD vi khuẩn E ictaluri chưa bị ñột biến gen E ictaluri ñột biến gen purA bảo quản thạch nghiêng có phủ dầu 49 37 Miyazaki T., Plumb J A (1985), “Histopathology of Edwardsiella ictaluri in chanel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque)”, J Fish Dis, (8), pp 389392 38 Newman S G (1993), “Bacterial vaccines for fish”, Annual Review of Fish Diseases, 3, pp 145-185 39 Plumb J A., and Vinitnantharat S (1989), “Biochemical, biophysical, and serological homogeneity of Edwardsiella ictaluri”, Journal of Aquatic Animal Health, 1, pp 51-56 40 Plumb J A (1993), “Edwardsiella septicaemias”, Bacterial Dieases of Fish, Blackwell Scientific Publications, Oxford, pp 61-79 41 Plumb J A., and Quinlan E E (1986), “Survival of Edwardsiella ictaluri in pond water and bottom mud”, The Progressive Fish – Culturis, (48), pp.212-214 42 Plumb J A (1991), “Edwardsiella septicaemias ” Fish Disease and Disorders, Volume : Viral, Bacterial and Fungal infections 43 Reger P J., Mock D F., and Miller M A., (1993), “Comparison of antimicrobial susceptibility beta-lactamase production, plasmid analysis and serum bactericidal activity in Edwardsiella tarda, E ictaluri and E hoshinae”, J Med.Microbitol, (39), pp.273-281 44 Shotts, E B., and W D Waltman (1990), “A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri”, Journal of Wildlife Diseases, 26(2), pp 214-218 45 Stock I and Wiedemann B., (2001), “Natural antimicrobial susceptibility of Edwardsiella tarda E ictaluri and E hoshinae”, Antimicrob Agents Chemother, (45), pp 2245–2255 46 Thang N M (2007), Report on Fish Vaccine production, RIA2 and NAVETCO: workshop on development vaccine used in Aquaculture, Ha Noi 6/20007 47 Thinh N H, Kuo T Y., Hung L T., Loc T H., Chen S C., Evensen O., Schuurman H J (2009), “Combined immersion and oral vaccination of Vietnamese catfish (Pangasianodon hypophthalmus) confers protection against mortality caused by Edwardsiella ictaluri”, Fish & Shellfish Immunology, 27(6), pp 773-776 48 Thune R.L., Hawke J.P., Fernandez D.H., Lawrence M.L., and Moore M.M (1997), “Immunization with bacterial antigens: edwardsiellosis”, In: Fish 50 Vaccinology, Gudding R., Lillehaug A., Midtlyng P.J and Brown P.J., eds Dev Biol Stand., Karger, Basel, Switzerland, 90, pp 125-134 49 Thune R L., D H Fernandez, and J R Battista (1999), “An aroA mutant of Edwardsiella ictaluri is safe and efficacious as a live, attenuated vaccine”, Journal of Aquatic Animal Health, 11(4), pp 358-372 50 Thune R L (1993), “Bacterial diseases of catfish”, In M K Stoskopf (ed.), Fish Medicine W B Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania, pp 511520 51 Vinitnantharat S., and Plumb J A (1993), “Protection of channel catfish Ictalurus punctatus following natural exposure to Edwardsiella ictaluri and effects of feeding antigen on antibody titer”, Dis Aquat Org., 15, pp 31-34 52 Waltman W D., Shotts E B and Hsu T C (1986), “Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri”, Applied and Environmental Microbiology, 51, pp 101-104 53 Williams M L., Lawrence M L (2005), “Identification and characteristics of a two-component hemolysine from Edwardsiella ictaluri ”, Veterinary microbiology, 108, pp.281-289 54 Yuasa, K., E B Kholidin, N Panigoro and K Hatai (2003), “First isolation of Edwardsiella ictaluri from cultured striped catfish (Pangasius hypophthalmus) in Indonesia”, Fish Pathology, 38(4), pp 181-183 x PHỤ LỤC 1: So sánh sinh trưởng quần thể vi khuẩn PAM nồng ñộ kanamycine 50 µg/ml ANOVA single factor Anova: Single Factor SUMMAR Y Groups Count 13 Ko có Kanamycin e Ko có kanamycine ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Varianc Sum Average e 60,6666 156 12 13 7,281 13 6,884 SS 1137,258 733,173 1870,431 0,56007 0,22135 0,52953 0,20972 df MS F P-value 568,6292 27,92063 4,7727E-08 F crit 3,259446 36 20,36592 38 PHỤ LỤC 2: Xử lý thống kê t-Test So sánh kích thước khuẩn lạc PAM WT (p[...]... 2.1 Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng Edwardsiella ictaluri ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau Khảo sát khả năng phát triển trong môi trường có kanamycine và tính kháng kháng sinh của chủng E ictaluri ñột biến gen purA Khả năng phát triển của vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA trong môi trường có kanamycnine Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA Khảo... ñột biến gen purA trong môi trường có chứa kháng sinh ñồng thời xác ñịnh ñược khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau Từ ñó có ñược ñiều kiện bảo quản phù hợp Nội dung nghiên cứu của ñề tài luận văn: + Xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA + Khảo sát khả năng phát triển của. .. purA Khảo sát khả năng phát triển của chủng E ictaluri ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau Khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển của vi khuẩn theo thời gian Khảo sát khả năng phát triển ở các ñiều kiện bảo quản Thạch nghiêng BHI theo thời gian bảo quản Thạch nghiêng BHI có bổ sung dầu khoáng Kết luận Hình 2.1 Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài Trong ñiều kiện lạnh sâu (-30oC)... với vi c hoàn thành khóa học, ñược sự ñồng ý của Trường ðại học Nha Trang, Vi n trưởng Vi n Nuôi trồng Thủy sản, thầy giáo hướng dẫn, tôi thực hiện ñề tài Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài luận văn: + Xác ñịnh ñược khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị. .. M31-A2)) của Anonymous 22 (2006b) nhằm xác tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) ñối với nhóm kháng sinh aminoglycosid 2.5.3 Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của chủng E ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau 2.5.3.1 Phương pháp thiết lập ñường cong sinh trưởng phát triển vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA ở ñiều kiện. .. triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài luận văn: - Về khoa học: Kết quả của luận ñề tài luận văn ñã xác ñịnh ñược khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA trong các ñiều kiện bảo quản từ ñó làm tiền ñề cho những nghiên cứu tiếp theo về vi c lưu giữ chủng vi khuẩn này... ñột biến gen purA bảo quản ở các ñiều kiện khác nhau theo thời gian 40 Hình 3.14 Kết quả khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA bảo quản ở các ñiều kiện khác nhau theo thời gian 41 1 MỞ ðẦU Trên thế giới, các nghiên cứu ñã phát hiện ra rằng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân gây bệnh quan trọng trên cá nheo (catfish) ở Mỹ, cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái... sử dụng các môi trường BHIB, LB và EIM ñể nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn E ictaluri sau khi ñột biến gen purA, aroA và ch, sau 48 giờ nuôi cấy ở 280C cho thấy vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến có khả năng phát triển trên các môi trường này [2], [17] Tóm lại, những nghiên cứu về môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn E ictaluri hoang dại (chưa ñột biến) và chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen cho... Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau trong ñiều kiện thí nghiệm 2.2 Vật liệu nghiên cứu + Chủng Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) từ chủng E ictaluri hoang dại có ñộc lực cao gây bệnh gan thận mủ cá tra Vi t nam (E ictaluri WT) ñược cung cấp bởi ñề tài cấp Nhà nước, mã số 163/Hð-BNN-KHCN + Chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại (E ictaluri. .. 2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; ño kích thước của vi khuẩn; nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA 2.5.1.1 Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, ño kích thước vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA + Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri: Vi khuẩn ñược nuôi cấy trên môi trường BHIA ở nhiệt ñộ 28oC, ... Kết khảo sát khả phát triển chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA (E ictaluri PAM) ñiều kiện bảo quản khác a Ở ñiều kiện bảo quản thạch nghiêng 4oC Kết theo dõi khả phát triển chủng E ictaluri. .. ñồ vi khuẩn E ictaluri hoang dại chưa ñột biến gen purA (A) vi khuẩn E ictaluri ñột biến gen purA (B) 3.2 Kết khảo sát khả phát triển chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA. .. bào vi khuẩn) Do vậy, vi khuẩn E ictaluri PAM ñược bảo quản ổn ñịnh 3.2.3 Kết nghiên cứu khả phát triển chủng vi khuẩn E ictaluri bị ñột biến gen purA ñiều kiện bảo quản khác 3.2.3.1 Kết khảo