Phương pháp ñông khô là phương pháp phổ biến ñược sử dụng tại mọi bảo tang vi sinh vật trên thế giớị ðây là phương pháp làm thăng hoa phần nước có trong môi trường nhũ hóa vi sinh vật ở ñiều kiện áp suất thấp. Phương pháp này có ưu ñiểm là tỷ
lệ sống của vi sinh vật rất cao, các ñặc tính di truyền của vi sinh vật không bị biến ñổi và thời gian lưu giữ giống ñược kéo dài khá lâu, ít tốn công sức ñể cấy truyền nhiều lần. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là không phải phòng thí nghiệm vi sinh vật nào cũng làm ñược, phải ñầu tư các thiết bị có giá trị kinh tế caọ
16
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu
+ ðối tượng nghiên cứu: Chủng Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA từ
chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại có ñộc lực cao gây bệnh gan thận mủ cá tra ở ñồng bằng sông Cửu Long ñược cung cấp bởi nhóm nghiên cứu ñề tài cấp Nhà nước ở
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản IIỊ
+ Phạm vi nghiên cứu: Tìm hiểu ñặc ñiểm về hình dạng, kích thước, ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa và khả năng phát triển của chủng Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau trong ñiều kiện thí nghiệm.
2.2 Vật liệu nghiên cứu
+ Chủng Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) từ chủng
Ẹ ictaluri hoang dại có ñộc lực cao gây bệnh gan thận mủ cá tra Việt nam (Ẹ ictaluri
WT) ñược cung cấp bởi ñề tài cấp Nhà nước, mã số 163/Hð-BNN-KHCN. + Chủng Edwardsiella ictaluri hoang dại (Ẹ ictaluri WT).
+ Môi trường phân lập, nuôi cấy tăng sinh và kiểm tra sinh hóa chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri:
- Môi trường phân lập chủng Ẹ ictaluri: Sử dụng môi trường nuôi cấy không chọn lọc Brain Heart Infusion Agar (BHIA) và môi trường nuôi cấy chọn lọc Edwardsiella Ictaluri Medium (EIM) agar theo Shotts và Waltman (1990) [47]. Thành phần môi trường EIM cụ thể như sau:
Typtone: 10g
Yeast extract: 10g
Phenylalanine 1,25g
Ferric ammonium citrate 1,2g
Bromothymol blue 0,003g
Bile salts 1,0g
Agar 15g
17
- Môi trường nuôi cấy tăng sinh chủng Ẹ ictaluri: Sử dụng môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Luria Bertami (LB) theo Nguyễn Trọng Bình và cộng sự
(2011) [20], thành phần môi trường cụ thể như sau:
+ Thành phần môi trường BHI (Brain Heart Infusion) - Biorad (Mỹ)
Peptone: 10g
Veal Brain heart extract: 12,5g
Beef Brain heart extract: 5g
NaCl: 5g
Disodium phosphate: 2,5g (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Glucose: 2g
Nước cất cho ñủ: 1000ml
+ Thành phần môi trường LB (Luria Bertami)
Tryptone: 10g
Yeast extract: 5g
NaCl: 10g
Nước cất cho ñủ: 1000ml
- Kiểm tra khả năng tổng hợp adenine của chủng Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA: sử dụng môi trường DMM theo Lawrence và cộng sự (1997) [37]. Thành phần môi trường DMM cụ thể như sau: Na2HPO4.7H2O: 15g KH2PO4: 7,5g NH4Cl: 2,5g NaCl: 1,25g MgSO4.7H2O: 0,24g FeSO4.7H2O: 0,005g Glucose: 4g Pantothenic acid: 0,0005g Niacinamide: 0,001g
Peptone from casein: 0,3g
Nước cất cho ñủ: 1000ml
Kiểm tra các chỉ tiêu sinh vật hóa học: Sử dụng kít API 20E (Bio Merieux – Pháp); kết hợp một số phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống: Manitol, O/F, LDC, ODC.
18
+ Hóa chất, thuốc kháng sinh: Adenine, kanamycin, gentamycin, streptomycin, neomycin, mannitol 0,35%, Colistin sulphate, thuốc nhuộm Gram (cồn, acetone, Fucsine, Crystian violet), Chlorin, KMnO4, NaCl.
2.3 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu
2.3.1 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2013 ñến tháng 11/2014
2.3.2 ðịa ñiểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III
2.4 Sơ ñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài luận văn: ðược thể hiện qua sơ ñồ
hình 2.1
Hình 2.1Sơñồ khối nội dung nghiên cứu của ñề tài
Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng Edwardsiella ictaluriñột biến gen purA
ở các ñiều kiện bảo quản khác nhaụ Kết luận Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA Thạch nghiêng BHI theo thời gian bảo quản Trong ñiều kiện lạnh sâu (-30oC) Thạch nghiêng BHI có bổ sung dầu khoáng Khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển của vi khuẩn theo thời gian Khảo sát khả năng phát triển của chủng Ẹ ictaluriñột biến gen purA ở
các ñiều kiện bảo quản khác nhau Khảo sát khả năng phát triển trong
môi trường có kanamycine và tính kháng kháng sinh của chủng Ẹ
ictaluriñột biến gen purA
Khảo sát khả năng phát triển ở các ñiều kiện bảo quản Khả năng phát triển của vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purAtrong môi trường có kanamycnine
19
2.5 Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; ño kích thước của vi khuẩn; nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA
2.5.1.1 Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, ño kích thước vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA
+ Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn Ẹ ictaluri: Vi khuẩn ñược nuôi cấy trên môi trường BHIA ở nhiệt ñộ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc bằng mắt thường và ño kích thước khuẩn lạc bằng thước ño có ñộ chính xác ñến 1 mm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Hình dạng, kích thước vi khuẩn Ẹ ictaluri: ðược xác ñịnh bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow, Feltham, 1993) [20], soi và ño kích thước vi khuẩn trên kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) có gắn trắc vi thị kính, quan sát ở ñộ phóng ñại 1000 lần.
2.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa chủng Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA
+ Kiểm tra các ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa: Sử dụng kít API 20E (Bio Merieux - Pháp) kết hợp một số phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống (KIA-Kligler Iron Agar, Mannitol, di ñộng, oxidase, catalase, khả năng chịu mặn ở 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30 ‰). Tính di ñộng của vi khuẩn ñược quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính, trải ñều trên lam kính một ít vi khuẩn, ñậy bằng lamen và quan sát bằng kính hiển vi ở ñộ phóng ñại 100 lần.
+ Kiểm tra khả năng tổng hợp adenine của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri PAM bằng cách nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường DMM (Defined Minimal Medium) của Collins và Thune (1996) [22] không bổ sung adenine (Ẹ ictaluri PAM) và có bổ
sung 50 µg adenine/ml môi trường (Ẹ ictaluri PAM+Ad.0,05). Theo dõi và xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm tại các thời ñiểm 12, 24, 36 và 48 giờ nuôi cấy ở 28oC.
+ ðịnh danh vi khuẩn dựa vào hệ thống phân loại của Bergey’s (1994).
2.5.2 Phương pháp kiểm tra tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purẠ
20
2.5.2.1. Phương pháp khảo sát sự phát triển của vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA trong môi trường có kháng sinh kanamycine (Hình 2.2)
Hình 2.2 Sơñồ xác ñịnh ñường cong sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA trong môi trường BHIB có bổ sung kháng sinh kanamycine
+ Chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) giữñông ở - 800C ñược ñem nuôi cấy trên môi trường EIM, ủở 28oC trong 48 giờ.
+ Chọn khuẩn lạc ñơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên ñĩa EIM ñem cấy chuyển qua 5ml môi trường BHIB 50µg adenine/ml và 50 µg/ml colistin. Tiến hành nuôi cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ.
+ Chuyển dịch tăng sinh vào bình tam giác chứa môi trường BHIB có nồng ñộ
kháng sinh tương tự bước tăng sinh trong 5ml môi trường BHIB (50µg adenine/ml + 50 µg/ml colistin) và môi trường BHIB có bổ sung kháng sinh kanamycine (50µg adenine/ml + 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin ñối với chủng Ẹ ictaluri PAM). Tiếp tục nuôi cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ.
+ Ghi nhận giá trị ño mật ñộ tế bào (OD) sau mỗi 2 giờ/lần bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600 nm kết hợp với phương pháp ñếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch BHI theo Koch.
21
2.5.2.2 Phương pháp xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri
ñột biến gen purẠ
+ Dựa trên phương pháp Kirbry-Bauer, sử dụng môi trường BHI Broth (Merck, Darmstadt, Germany), chọn các loại kháng sinh thuôc nhóm aminoglycosid bao gồm: Streptomycin, kanamycin, gentamycin và neomycin ñể tiến hành lập kháng sinh ñồñối với chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) và Ẹ ictaluri
hoang dại (Ẹ ictaluri WT).
+ Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên ñĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) ñã tiệt trùng.
+ ðiều chỉnh mật ñộ vi khuẩn ñược xác ñịnh dựa vào phương pháp so màu trên máy quang phổ: dung dịch trộn ñều trên máy votec sau ñó ñem ño trên máy so màu quang phổở bước sóng 610nm, ñiều chỉnh ñộñục ở mức OD= 0,1± 0,02, khi ñó mật
ñộ vi khuẩn trong ống nghiệm vào khoảng 1 x 108 cfu/ml.
+Lấy 0,2 ml vi khuẩn từống nghiệm trải ñều trên ñĩa thạch, sau ñó gắn các ñĩa kháng sinh vào ñĩa thạch. (ñĩa kháng sinh là những mảnh giấy tròn có tẩm kháng sinh). Ủ trong tủấm ở nhiệt ñộ 30oC.
Hình 2.3: Sơñồ thực hiện kháng sinh ñồ các vi khuẩn
+ Sau 24 giờ, ño ñường kính vòng vô trùng (mm) bằng thước kẹp có ñộ chính xác 1mm: Dựa vào chuẩn ñường kính của vòng vô trùng theo tài liệu “The Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI (ormer NCCLS M31-A2)) của Anonymous
Vi khuẩn Edwardsiellạ ictaluri
Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý
ðiều chỉnh ñộñục vi khuẩn ( Nồng ñộ 108 cfu/mL) Cấy vi khuẩn lên ñĩa thạch BHI Broth
ðặt khoanh giấy kháng sinh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ðo vòng vô khuẩn
Xác ñịnh khả năng kháng của kháng sinh ñối với vi khuẩn Edwardsiellạ ictaluri
22
(2006b) nhằm xác tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen
purA (Ẹ ictaluri PAM) ñối với nhóm kháng sinh aminoglycosid.
2.5.3 Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của chủng Ẹ ictaluri bịñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau
2.5.3.1. Phương pháp thiết lập ñường cong sinh trưởng phát triển vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA ởñiều kiện thí nghiệm
+ Phương pháp ñược tiến hành tương tự như mục 2.5.2.1 nhưng Chủng Ẹ ictaluri WT nuôi trong BHIB chứa 50 µg/ml colistin, chủng Ẹ ictaluri PAM nuôi trong BHIB 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin và 50 µg/ml kanamycin.
2.5.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ trên thạch nghiêng BHI ở 4oC
+ Vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) và Ẹ ictaluri chưa
ñột biến (Ẹ ictaluri WT) giữ ñông ở -80oC ñược ñem nuôi cấy phục hồi trên môi trường EIM, ủ ở 28oC sau 48 giờ. Sau ñó chọn một khuẩn lạc ñơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên môi trường EIM, tăng sinh trong môi trường BHIB chứa 50 µg/ml colistin (ñối với chủng Ẹ ictaluri WT) và môi trường BHIB chứa 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin (ñối với chủng Ẹ ictaluri PAM). Tiến hành nuôi cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ.
+ Lấy 10ml dịch vi khuẩn li tâm ở 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC thu phần huyền phù cặn (vi khuẩn) sao cho ñạt giá trị OD600nm khoảng 1,0 (tương ñương khoảng 109CFU/ml); kiểm tra mật ñộ vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo Koch ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn ban ñầu ñem bảo quản, ñồng thời nhuộm gram ñể xác ñịnh hình dạng và kích thước khi ñem bảo quản.
+ Chia dịch huyền phù (vi khuẩn) với thể tích 1ml vào ống thạch nghiêng BHI
ñã ñược chuẩn bị sẵn, sau ñó ñem bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC.
+ Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC, 3 ống thạch nghiêng ñem bảo quản
ñược lấy ra kiểm tra hình dạng, kích thước vi khuẩn và nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo phương pháp của Koch và ño mật ñộ quang (OD) trên máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn sau 30 ngày bảo quản. Thí nghiệm ñược tiến hành theo dõi trong 90 ngàỵ
2.5.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ trên thạch nghiêng BHI có phủ lớp dầu khoáng (paraffin) ở 4oC
23
+ Phương pháp ñược tiến hành tương tự như mục 2.5.3.2. nhưng dịch huyền phù vi khuẩn sau khi ñược ñưa vào các ống thạch nghiêng BHI ñã ñược chuẩn bị trước
ñược ñem phủ một lớp dầu khoáng dày 1 – 2 cm rồi mới ñem bảo quản ở nhiệt ñộ 40C. + Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như mục 2.5.3.2.
2.5.3.4. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ bằng phương pháp lạnh sâu (-30oC)
+ Các bước chuẩn bị vi khuẩn ñem bảo quản tương tự như mục 2.5.3.2. Tuy nhiên, vi khuẩn sau khi ly tâm ở tốc ñộ 3000 vòng/phút trong 10 phút ñược trộn với 10% glycerol ñã ñược thanh trùng (về thể tích) như là chất chống ñông.
+ Dùng pipet Pasteur hút khoảng 1ml dịch huyền phù ñưa vào trong ống lạnh sâu và ñóng nắp. Bao ống lạnh sâu bằng paraffin.
+ Toàn bộ các ống lạnh sâu ñem bảo quản ñược ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 30 phút ñể cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào vi khuẩn.
+ Các ống lạnh sâu ñem bảo quản ñược làm lạnh từ từ (thang 5oC/lần) ñến - 30oC và cuối cùng bảo quản ở - 30oC.
+ Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt ñộ -30oC, kiểm tra hình dạng, kích thước và mật ñộ vi khuẩn ñem bảo quản tương tự như phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng. Thí nghiệm ñược tiến hành theo dõi trong 30 ngàỵ
Lưu ý: khi ñem các ống lạnh sâu bảo quản ở nhiệt ñộ -30oC ñể kiểm tra hình dạng, kích thước và mật ñô vi khuẩn thì cần phải ñược hoạt hóa bằng cách làm rã ñông (ñưa ngay vào tủấm 37oC trong 40 giây).
2.6. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm ñược xử lý bằng phép so sánh giá trị trung bình với phương sai khác nhau (t-test: two sample assuming unequal variances), phép phân tích ANOVA một nhân tố (ANOVA – single factor) và hai nhân tố không lặp lại (ANOVA – two factor without replication) trên phần mềm Excel của máy vi tính. Ngoài ra, phần mềm SPSS cũng ñược sử dụng ñể phân tích sâu Post hoc với kiểm ñịnh Tukey hay LSD ñể so sánh các giá trị trung bình của các nhóm dữ liệu nghiên cứụ
24 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bịñột biến gen purA
3.1.1 Kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển của chủng Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) trên môi trường BHIB có kháng sinh kanamycine
Kết quả xác khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA trên môi trường BHIB không bổ sung kanamycine và có bổ sung 50 µg kanamycine /ml môi trường, kết quả theo dõi sinh trưởng quần thể vi khuẩn Ẹ ictaluri
bị ñột biến gen purAtheo thời gian nuôi cấy ñược thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1 ðường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn Ẹ ictaluriñột biến gen purA (PAM) và Ẹ ictaluri chưa ñột biến (WT) trên môi trường nuôi cấy
25
Kết quả từ hình 3.1 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) trong môi trường BHIB có bổ sung 50 µg kanamycine /ml môi trường cho sinh trưởng tương tự như trong môi trường BHIB không bổ sung kanamycinẹ Phân tích Anova single factor so sánh sự khác biệt về sinh trưởng của chủng Ẹ ictaluri PAM trong ñiều kiện nuôi cấy trên môi trường BHIB có