Số liệu thí nghiệm ñược xử lý bằng phép so sánh giá trị trung bình với phương sai khác nhau (t-test: two sample assuming unequal variances), phép phân tích ANOVA một nhân tố (ANOVA – single factor) và hai nhân tố không lặp lại (ANOVA – two factor without replication) trên phần mềm Excel của máy vi tính. Ngoài ra, phần mềm SPSS cũng ñược sử dụng ñể phân tích sâu Post hoc với kiểm ñịnh Tukey hay LSD ñể so sánh các giá trị trung bình của các nhóm dữ liệu nghiên cứụ
24
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bịñột biến gen purA
3.1.1 Kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển của chủng Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) trên môi trường BHIB có kháng sinh kanamycine
Kết quả xác khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA trên môi trường BHIB không bổ sung kanamycine và có bổ sung 50 µg kanamycine /ml môi trường, kết quả theo dõi sinh trưởng quần thể vi khuẩn Ẹ ictaluri
bị ñột biến gen purAtheo thời gian nuôi cấy ñược thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1 ðường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn Ẹ ictaluriñột biến gen purA (PAM) và Ẹ ictaluri chưa ñột biến (WT) trên môi trường nuôi cấy
25
Kết quả từ hình 3.1 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) trong môi trường BHIB có bổ sung 50 µg kanamycine /ml môi trường cho sinh trưởng tương tự như trong môi trường BHIB không bổ sung kanamycinẹ Phân tích Anova single factor so sánh sự khác biệt về sinh trưởng của chủng Ẹ ictaluri PAM trong ñiều kiện nuôi cấy trên môi trường BHIB có bổ sung kanamycine và môi trường BHIB không bổ sung kanamycine cho thấy không có sự khác biệt về sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn này (p>0,05) (phụ lục 1). Kết quả chứng tỏ chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA kháng với kháng sinh kanamycinẹ Sở dĩ vậy là do, trong quá trình ñột biến làm hỏng gen purA, mất khả
năng tổng hợp adenine, dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine nhược ñộc, ñoạn gen
purA bị gây ñột biến mất ñoạn và sử dụng một ñoạn gen kháng kháng sinh kanamycine chèn vào bộ gen của vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến. Do vậy chủng vi khuẩn ñột biến này có khả năng kháng ñược với kanamycinẹ
3.1.2 Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA vơi một số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid
Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA và vi khuẩn Ẹ ictaluri chưa bị ñột biến với một số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid ñược thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả vòng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bịñột biến gen purAvà vi khuẩn Ẹ ictaluri chưa bịñột biến với kháng sinh thuộc nhóm
aminoglycosid
ðường kính vòng kháng khuẩn (mm) Tên kháng sinh
Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA(PAM)
Ẹ ictaluri chưa bịñột biến (WT) ðường kính vòng kháng khuẩn chuẩn (mm) Gentamycine 14 12 ≥ 16 Streptomycine 0 19 ≥ 14 Kanamycine 0 22 ≥ 18 Neomycine 0 0 ≥ 15
Kết quả từ bảng 3.1 và hình 3.2 cho thấy chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA kháng với tất cả các loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid. ðiều này chứng tỏ chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA có sự hiện diện của gen
26
kháng kanamycine và có thể phát triển ñược trong môi trường có chứa kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid. Theo Aokị T (1988) [21], trong nuôi trồng thủy sản có sự
kháng thuốc hình thành gián tiếp thông qua thể R – plasmid, các R – Plasmid có thể
làm trung gian cho sự kháng một hay là nhiều loại thuốc kháng sinh.
Chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bịñột biến gen purA ñược tạo ra bằng cách làm hỏng gen purA, mất khả năng tổng hợp adeninẹ ðoạn gen purA, mã hóa cho enzyme tổng hợp adenine, bị gây ñột biến mất ñoạn và thay bằng gen kháng kháng sinh kanamycin. Chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri khi loại bỏ gen purA, gen mã hóa cho enzyme adenylosuccinate synthase là enzyme ñầu tiên xúc tác cho quá trình tổng hợp AMP- tham gia vào quá trình tổng hợp purin ribonucleotidẹ
Hình 3.2 Kháng sinh ñồ của vi khuẩn Ẹ ictaluri hoang dại chưa ñột biến gen
purA (A) và vi khuẩn Ẹ ictaluriñột biến gen purA (B)
3.2. Kết quả khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bịñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản
3.2.1. Kết quả tìm hiểu một sốñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bịñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) ictaluri bịñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM)
3.2.1.1. ðặc ñiểm hình thái
Trên môi trường nuôi cấy BHIA, vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) cũng như vi khuẩn Ẹ ictaluri hoang dại (Ẹ ictaluri WT) ñều phát triển chậm. Cụ thể, ở nhiệt ñộ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên
B A
27
mặt ñĩa thạch và hình dạng, kích thước vi khuẩn có các ñặc ñiểm ñược thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.3 và hình 3.4.
Bảng 3.2 ðặc ñiểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA
TT ðặc ñiểm Chủng Ẹ ictaluri WT Chủng Ẹ ictaluri PAM
1 Thời gian mọc khuẩn lạc (giờ) 24 24
2 Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường BHIA sau 48 giờ
Dạng tròn, trơn, hơi lồi Dạng tròn, trơn, hơi lồi 3 Màu sắc khuẩn lạc trên môi
trường thạch BHI sau 48 giờ
Màu trắng hơi mờ Màu trắng hơi mờ
4 Kích thước khuẩn lạc trên thạch BHI sau 48 giờ (mm)
2,46±0,21 1,35±0,14
5 Hình dạng vi khuẩn Que ngắn, ñơn hoặc chuỗi ngắn
Que ngắn, ñơn hoặc chuỗi ngắn
6 Khả năng sinh bào tử Không Không
7 Kích thước vi khuẩn (µm) 2,5-3,3 x 0,75-1,00 1,5-2,5 x 0,25-0,75 8 Bắt màu thuốc nhuộm Gram Hồng (Gram âm) Hồng (Gram âm)
Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy ở nhiệt ñộ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường BHIA, khuẩn lạc vi khuẩn chủng Ẹ ictaluri PAM hình thành có kích thước
ñường kính khoảng 1,35±0,14mm nhỏ hơn so với chủng Ẹ ictaluri WT (ñường kính khuẩn lạc khoảng 2,46±0,21mm), kích thước vi khuẩn chủng Ẹ ictaluri PAM cũng nhỏ hơn so với vi khuẩn chủng Ẹ ictaluri WT và sự sai khác này có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (phụ lục 2).
Cũng từ kết quả bảng 3.2, hình 3.3 và hình 3.4 cho thấy màu sắc, hình dạng, thời gian mọc khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn ở cả hai chủng Ẹ ictaluri WT và Ẹ ictaluri PAM ñều tương tự nhaụ Cụ thể, khuẩn lạc có màu trắng hơi mờ ñục, dạng tròn trơn, hơi lồi, rìa có dạng không ñồng nhất (hình 3.1A, B). Khi nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi ở ñộ phóng ñại 1000 lần, vi khuẩn chủng Ẹ ictaluri PAM và Ẹ ictaluri WT bắt màu hồng (vi khuẩn Gram âm) và có hình que ngắn, ñơn hoặc chuỗi ngắn và không sinh bào tử (hình 3.3 A, B).
28
Hình 3.3 Khuẩn lạc vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA (A, B) trên môi trường BHIA
Hình 3.4 Vi khuẩn Ẹ ictaluri hoang dại chưa ñột biến gen purA (A) và vi khuẩn Ẹ ictaluriñột biến gen purA (B)
Kết quả nghiên cứu vềñặc ñiểm hình thái 108 chủng Ẹ ictaluri thu ñược từ 181 cá tra bị bệnh gan thận mủ của Từ Thanh Dung và cộng sự (2004) [3]; Võ Văn Nha và cộng sự (2012) [12] cho thấy, khuẩn lạc tạo thành có màu trắng ñục, rìa có dạng không
ñồng nhất, vi khuẩn bắt màu hồng thuốc nhuộm hematoxylin (Gram âm), hình que và có kích thước biến ñổi cũng tương tự như những mô tả về hình thái chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri hoang dại (Ẹ ictaluri WT) và chủng Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) mà chúng tôi nghiên cứụ ðiều này chứng tỏ vi khuẩn Ẹ ictaluri PAM (bịñột biến gen purA) có kiểu hình khá ổn ñịnh, không thay ñổi sau khi bịñột biến và có khả năng nuôi cấy và lưu giữ. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Võ Văn Nha (2013) [11].
3.2.1.2. ðặc ñiểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA Các ñặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen
purA (Ẹ ictaluri PAM), Ẹ ictaluri hoang dại (Ẹ ictaluri WT) ñược kiểm tra bằng kít
A 10µm B
10µm
A
29
API 20E kết hợp với phương pháp truyền thống. Kết quả thu ñược ñược thể hiện ở
bảng 3.3
Bảng 3.3ðặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Ẹ ictaluri bịñột biến gen
purA (Ẹ ictaluri PAM), Ẹ ictaluri hoang dại (Ẹ ictaluri WT)
ðặc ñiểm Chất nền Ẹ ictaluri PAM Ẹ ictaluri WT Ẹ ictaluri theo Bergey’s
Hình dạng Que Que Que
Gram - - - Di ñộng + + + Oxidase Oxidase - - - Catalase Catalase + + + O/F +/+ +/+ +/+ ONPG Orthonitrophenyl - - - ADH Arginin - - - LDC Lysin + + + ODC Ornithin - - V
CIT Sodium citrate - - -
H2S Sodium thisulfat - - - URE Urê - - - TDA Tryptophan - - - IND Indol - - - VP Sodium piruvac - - - GEL Gelatin - - - GLU Glucose + + + Gas Hơi - - V Khử Nitrate Nitrate + + + MAN Manitol - - - INO Inositol - - - SOR Sorbitol - - - RHA Rhamnose - - - SAC Sacrose - - - MEL Melibiose - - - AMY Amygdalin - - - ARA Arabinose - - - Lactose Lactose - - - ðộ muối (‰) 0;5;10;15;20;25 NaCl + + 30 NaCl - -
30
Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy các ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) như: Gram âm, di ñộng, cho phản ứng oxydase âm tính, catalase dương, lysin dương, âm tính với các loại ñường ngoại trừ
Glucose (dương tính),….ñều tương ñồng với chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri hoang dại (Ẹ ictaluri WT) và của khóa phân loại Bergey’s (1994) [31].
Theo mô tả trong hệ thống phân loại của Bergey giống Edwardsiella có các ñặc ñiểm là: Vi khuẩn dạng hình que thẳng, nhỏ, kích thước 1µm x 2-3 µm, gram âm, có khả
năng di ñộng bằng vành lông rung (peritrichous flagella) (Ẹ ictaluri di ñộng ở 25oC, không di ñộng ở 37oC), yếm khí tùy tiện, có oxydation/fermentation (O/F) ñều dương tính. Có khả năng sử dụng D-glucose, kết quả sinh ra acid và thường sinh hơị Oxidase âm tính, catalase dương tính, voges-proskauer (VP) và simmon citrate âm tính, lysine decarboxylase (LDC) dương tính, ornithine decarboxylase (ODC) dương tính, khử
Nitratẹ Tất cả các loài thuộc giống này ñều có khả năng lên men ñường maltose và D- mannosẹ
Như vậy, với những ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa ñã thu ñược từ kết quả nghiên cứu trên có thể khẳng ñịnh rằng chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) cũng cho các ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa không khác gì so với chủng Ẹ ictaluri hoang dại (Ẹ ictaluri WT) ban ñầu chưa ñột biến.
3.1.2.3 Khả năng tổng hợp adenin của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA
Khi kiểm tra khả năng tổng hợp adenine của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri PAM bằng cách nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường DMM của Collins và Thune (1996) không bổ sung adenine (Ẹ ictaluri PAM) và có bổ sung 50µg adenine/1ml môi trường (Ẹ ictaluri PAM+Ad.0,05), kết quả theo dõi sinh trưởng quần thể vi khuẩn Ẹ ictaluri PAMtheo thời gian nuôi cấy ñược thể hiện ở hình 3.5
Kết quả từ hình 3.5 cho thấy, theo thời gian nuôi cấy, lô thí nghiệm Ẹ ictaluri
PAM không bổ sung adenine cho sự sinh trưởng quần thể vi khuẩn Ẹ ictaluri PAM kém so với lô thí nghiệm có bổ sung 50µg adenine/ml môi trường DMM và sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (phụ lục 3).
31
Hình 3.5 Sinh trưởng quần thể vi khuẩn Ẹ ictaluriñột biến gen purA (Ẹ ictaluri
PAM) trên môi trường DMM có bổ sung adenine (Ẹ ictaluri PAM+Ad.0,05) và không bổ sung adenine (Ẹ ictaluri PAM). OD- Mật ñộ quang.
ðể giải thích hiện tượng sinh trưởng quần thể vi khuẩn Ẹ ictaluri PAM kém khi không bổ sung adenine, Lawrence và cộng sự (1997) [36]; Thune (1999) [52] cho rằng, gen purA mã hóa cho enzyme adenylosuccinate synthase là enzyme ñầu tiên xúc tác cho quá trình tổng hợp AMP-tham gia vào quá trình tổng hợp purine ribonucleotidẹ Do vậy, nếu vi khuẩn bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) thì enzyme adenylosuccinate synthase không ñược tạo thành và quá trình chuyển hóa inosine monophosphate (IMP) thành adenylosuccinate sẽ không xảy ra, dẫn ñến ATP không ñược hình thành ñể cung cấp năng lượng cho quá trình chuyển hóa từ XMP thành GMP, tạo ra GTP tham gia quá trình tổng hợp DNA và RNẠ Từ ñó làm ảnh hưởng trực tiếp ñến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Ẹ ictaluri PAM. Vì vậy, khi vi khuẩn bị ñột biến gen purA, thì chủng vi khuẩn bịñột biến phải cần ñược bổ sung chất dinh dưỡng phù hợp, mà cụ thể là adenine mới có thể phát triển bình thường như
32 chủng ban ñầu chưa bị ñột biến
Tóm lại, chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) cũng cho các ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa không khác gì so với chủng Ẹ ictaluri hoang dại (Ẹ ictaluri WT) ngoại trừ khả năng tổng hợp adeninẹ
3.2.2. Kết quả khảo sát kích thước của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) theo thời gian và ñiều kiện bảo quản khác nhau
Vi khuẩn Ẹ ictaluri PAM sau mỗi 30 ngày bảo quản ở các ñiều kiện khác nhau: Thạch BHI nghiêng ở nhiệt ñộ 4oC và thạch BHI nghiêng có phủ dầu khoáng ở nhiệt
ñộ 4oC, bảo quản lạnh sâu -30oC ñược kiểm tra kích thước trên kính hiển vị Kết quả
khảo sát kích thước của chủng Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA theo thời gian và ñiều kiện bảo quản khác nhau ñược thể hiện ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Kích thước chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bịñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) theo thời gian và ñiều kiện bảo quản khác nhau
Kích thước (chiều dài) vi khuẩn Ẹ ictaluri PAM
Kích thước khuẩn lạc vi khuẩn
Ẹ ictaluri PAM sau 24 giờ (mm) ðiều kiện bảo quản Thời Gian bảo quản (ngày) Thạch nghiêng ở 4oC Thạch nghiêng + dầu khoáng4oC Lạnh sâu (-30oC) Thạch nghiêng 4oC Thạch nghiêng + dầu khoáng 4oC Lạnh sâu (-30oC) 0 2,42±0,14 2,42±0,14 2,42±0,14 1,67±0,15 1,67±0,15 1,67±0,15 30 2,17±0,38 2,08±0,52 2,25±0,25 1,50±0,01 1,57±0,21 1,50±0,50 60 1,92±0,29 2,00±0,25 1,67±0,29 1,63±0,12 1,50±0,30 1,57±0,40 90 1,42±0,29 1,58±0,14 1,60±0,17 1,30±0,10 Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy:
+ Chiều dài vi khuẩn Ẹ ictaluri bịñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tuy nhiên, theo thời gian bảo quản: 0; 30; 60 và 90 ngày lại cho sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (phụ lục 4) ở ñiều kiện bảo quản bằng thạch BHI nghiêng và bảo quản bằng thạch BHI nghiêng có bổ sung dầu khoáng (ngoại trừ giai ñoạn 30 ñến 60 ngày) (bảng
33
3.4); còn ở ñiều kiện bảo quản lạnh sâu -30oC trong 30 ngày bảo quản, không cho sự
khác biệt về kích thước vi khuẩn so với ban ñầu, nhưng lại khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (phụ lục 4) sau 60 ngày bảo quản (Bảng 3.4).
+ Kích thước khuẩn lạc vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri
PAM) sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo thời gian và ñiều kiện bảo quản khác nhau không cho sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (phụ lục 5).
Sở dĩ trong cùng một thời gian bảo quản, ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau kích thước của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) không cho sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p>0,05) có thể là do ở ñiều kiện bảo quản bằng thạch BHI nghiêng và thạch BHI nghiêng phủ dầu khoáng ở nhiệt ñộ 4oC là tương tự nhau, việc phủ một lớp dầu khoáng dày 1 – 2 cm chỉ giúp vi khuẩn không thể
tiếp xúc trực tiếp ñược với không khí nên không thể phát triển ñược. Còn bảo quản ở