Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc; ño kích thước của vi khuẩn; nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA

2.5.1.1 Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, ño kích thước vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA

+ Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn Ẹ ictaluri: Vi khuẩn ñược nuôi cấy trên môi trường BHIA ở nhiệt ñộ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc bằng mắt thường và ño kích thước khuẩn lạc bằng thước ño có ñộ chính xác ñến 1 mm.

+ Hình dạng, kích thước vi khuẩn Ẹ ictaluri: ðược xác ñịnh bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow, Feltham, 1993) [20], soi và ño kích thước vi khuẩn trên kính hiển vi (Olympus CX 31, Nhật) có gắn trắc vi thị kính, quan sát ở ñộ phóng ñại 1000 lần.

2.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa chủng Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA

+ Kiểm tra các ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa: Sử dụng kít API 20E (Bio Merieux - Pháp) kết hợp một số phản ứng sinh lý, sinh hóa truyền thống (KIA-Kligler Iron Agar, Mannitol, di ñộng, oxidase, catalase, khả năng chịu mặn ở 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30 ‰). Tính di ñộng của vi khuẩn ñược quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính, trải ñều trên lam kính một ít vi khuẩn, ñậy bằng lamen và quan sát bằng kính hiển vi ở ñộ phóng ñại 100 lần.

+ Kiểm tra khả năng tổng hợp adenine của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri PAM bằng cách nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường DMM (Defined Minimal Medium) của Collins và Thune (1996) [22] không bổ sung adenine (Ẹ ictaluri PAM) và có bổ

sung 50 µg adenine/ml môi trường (Ẹ ictaluri PAM+Ad.0,05). Theo dõi và xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm tại các thời ñiểm 12, 24, 36 và 48 giờ nuôi cấy ở 28oC.

+ ðịnh danh vi khuẩn dựa vào hệ thống phân loại của Bergey’s (1994).

2.5.2 Phương pháp kiểm tra tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purẠ

20

2.5.2.1. Phương pháp khảo sát sự phát triển của vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA trong môi trường có kháng sinh kanamycine (Hình 2.2)

Hình 2.2 Sơñồ xác ñịnh ñường cong sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA trong môi trường BHIB có bổ sung kháng sinh kanamycine

+ Chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) giữñông ở - 800C ñược ñem nuôi cấy trên môi trường EIM, ủở 28oC trong 48 giờ.

+ Chọn khuẩn lạc ñơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên ñĩa EIM ñem cấy chuyển qua 5ml môi trường BHIB 50µg adenine/ml và 50 µg/ml colistin. Tiến hành nuôi cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ.

+ Chuyển dịch tăng sinh vào bình tam giác chứa môi trường BHIB có nồng ñộ

kháng sinh tương tự bước tăng sinh trong 5ml môi trường BHIB (50µg adenine/ml + 50 µg/ml colistin) và môi trường BHIB có bổ sung kháng sinh kanamycine (50µg adenine/ml + 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin ñối với chủng Ẹ ictaluri PAM). Tiếp tục nuôi cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ.

+ Ghi nhận giá trị ño mật ñộ tế bào (OD) sau mỗi 2 giờ/lần bằng máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600 nm kết hợp với phương pháp ñếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch BHI theo Koch.

21

2.5.2.2 Phương pháp xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri

ñột biến gen purẠ

+ Dựa trên phương pháp Kirbry-Bauer, sử dụng môi trường BHI Broth (Merck, Darmstadt, Germany), chọn các loại kháng sinh thuôc nhóm aminoglycosid bao gồm: Streptomycin, kanamycin, gentamycin và neomycin ñể tiến hành lập kháng sinh ñồñối với chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) và Ẹ ictaluri

hoang dại (Ẹ ictaluri WT).

+ Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên ñĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) ñã tiệt trùng.

+ ðiều chỉnh mật ñộ vi khuẩn ñược xác ñịnh dựa vào phương pháp so màu trên máy quang phổ: dung dịch trộn ñều trên máy votec sau ñó ñem ño trên máy so màu quang phổở bước sóng 610nm, ñiều chỉnh ñộñục ở mức OD= 0,1± 0,02, khi ñó mật

ñộ vi khuẩn trong ống nghiệm vào khoảng 1 x 108 cfu/ml.

+Lấy 0,2 ml vi khuẩn từống nghiệm trải ñều trên ñĩa thạch, sau ñó gắn các ñĩa kháng sinh vào ñĩa thạch. (ñĩa kháng sinh là những mảnh giấy tròn có tẩm kháng sinh). Ủ trong tủấm ở nhiệt ñộ 30oC.

Hình 2.3: Sơñồ thực hiện kháng sinh ñồ các vi khuẩn

+ Sau 24 giờ, ño ñường kính vòng vô trùng (mm) bằng thước kẹp có ñộ chính xác 1mm: Dựa vào chuẩn ñường kính của vòng vô trùng theo tài liệu “The Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI (ormer NCCLS M31-A2)) của Anonymous

Vi khuẩn Edwardsiellạ ictaluri

Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý

ðiều chỉnh ñộñục vi khuẩn ( Nồng ñộ 108 cfu/mL) Cấy vi khuẩn lên ñĩa thạch BHI Broth

ðặt khoanh giấy kháng sinh

ðo vòng vô khuẩn

Xác ñịnh khả năng kháng của kháng sinh ñối với vi khuẩn Edwardsiellạ ictaluri

22

(2006b) nhằm xác tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen

purA (Ẹ ictaluri PAM) ñối với nhóm kháng sinh aminoglycosid.

2.5.3 Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của chủng Ẹ ictaluri bịñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau ñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản khác nhau

2.5.3.1. Phương pháp thiết lập ñường cong sinh trưởng phát triển vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA ởñiều kiện thí nghiệm

+ Phương pháp ñược tiến hành tương tự như mục 2.5.2.1 nhưng Chủng Ẹ ictaluri WT nuôi trong BHIB chứa 50 µg/ml colistin, chủng Ẹ ictaluri PAM nuôi trong BHIB 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin và 50 µg/ml kanamycin.

2.5.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ trên thạch nghiêng BHI ở 4oC

+ Vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) và Ẹ ictaluri chưa

ñột biến (Ẹ ictaluri WT) giữ ñông ở -80oC ñược ñem nuôi cấy phục hồi trên môi trường EIM, ủ ở 28oC sau 48 giờ. Sau ñó chọn một khuẩn lạc ñơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên môi trường EIM, tăng sinh trong môi trường BHIB chứa 50 µg/ml colistin (ñối với chủng Ẹ ictaluri WT) và môi trường BHIB chứa 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin (ñối với chủng Ẹ ictaluri PAM). Tiến hành nuôi cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ.

+ Lấy 10ml dịch vi khuẩn li tâm ở 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC thu phần huyền phù cặn (vi khuẩn) sao cho ñạt giá trị OD600nm khoảng 1,0 (tương ñương khoảng 109CFU/ml); kiểm tra mật ñộ vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo Koch ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn ban ñầu ñem bảo quản, ñồng thời nhuộm gram ñể xác ñịnh hình dạng và kích thước khi ñem bảo quản.

+ Chia dịch huyền phù (vi khuẩn) với thể tích 1ml vào ống thạch nghiêng BHI

ñã ñược chuẩn bị sẵn, sau ñó ñem bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC.

+ Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC, 3 ống thạch nghiêng ñem bảo quản

ñược lấy ra kiểm tra hình dạng, kích thước vi khuẩn và nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo phương pháp của Koch và ño mật ñộ quang (OD) trên máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn sau 30 ngày bảo quản. Thí nghiệm ñược tiến hành theo dõi trong 90 ngàỵ

2.5.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ trên thạch nghiêng BHI có phủ lớp dầu khoáng (paraffin) ở 4oC

23

+ Phương pháp ñược tiến hành tương tự như mục 2.5.3.2. nhưng dịch huyền phù vi khuẩn sau khi ñược ñưa vào các ống thạch nghiêng BHI ñã ñược chuẩn bị trước

ñược ñem phủ một lớp dầu khoáng dày 1 – 2 cm rồi mới ñem bảo quản ở nhiệt ñộ 40C. + Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như mục 2.5.3.2.

2.5.3.4. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ bằng phương pháp lạnh sâu (-30oC)

+ Các bước chuẩn bị vi khuẩn ñem bảo quản tương tự như mục 2.5.3.2. Tuy nhiên, vi khuẩn sau khi ly tâm ở tốc ñộ 3000 vòng/phút trong 10 phút ñược trộn với 10% glycerol ñã ñược thanh trùng (về thể tích) như là chất chống ñông.

+ Dùng pipet Pasteur hút khoảng 1ml dịch huyền phù ñưa vào trong ống lạnh sâu và ñóng nắp. Bao ống lạnh sâu bằng paraffin.

+ Toàn bộ các ống lạnh sâu ñem bảo quản ñược ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 30 phút ñể cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào vi khuẩn.

+ Các ống lạnh sâu ñem bảo quản ñược làm lạnh từ từ (thang 5oC/lần) ñến - 30oC và cuối cùng bảo quản ở - 30oC.

+ Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt ñộ -30oC, kiểm tra hình dạng, kích thước và mật ñộ vi khuẩn ñem bảo quản tương tự như phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng. Thí nghiệm ñược tiến hành theo dõi trong 30 ngàỵ

Lưu ý: khi ñem các ống lạnh sâu bảo quản ở nhiệt ñộ -30oC ñể kiểm tra hình dạng, kích thước và mật ñô vi khuẩn thì cần phải ñược hoạt hóa bằng cách làm rã ñông (ñưa ngay vào tủấm 37oC trong 40 giây).

2.6. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu

Số liệu thí nghiệm ñược xử lý bằng phép so sánh giá trị trung bình với phương sai khác nhau (t-test: two sample assuming unequal variances), phép phân tích ANOVA một nhân tố (ANOVA – single factor) và hai nhân tố không lặp lại (ANOVA – two factor without replication) trên phần mềm Excel của máy vi tính. Ngoài ra, phần mềm SPSS cũng ñược sử dụng ñể phân tích sâu Post hoc với kiểm ñịnh Tukey hay LSD ñể so sánh các giá trị trung bình của các nhóm dữ liệu nghiên cứụ

24

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bịñột biến gen purA

3.1.1 Kết quả khảo sát ñường cong sinh trưởng phát triển của chủng Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) trên môi trường BHIB có kháng sinh kanamycine

Kết quả xác khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA trên môi trường BHIB không bổ sung kanamycine và có bổ sung 50 µg kanamycine /ml môi trường, kết quả theo dõi sinh trưởng quần thể vi khuẩn Ẹ ictaluri

bị ñột biến gen purAtheo thời gian nuôi cấy ñược thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1 ðường cong sinh trưởng (theo giá trị OD) vi khuẩn Ẹ ictaluriñột biến gen purA (PAM) và Ẹ ictaluri chưa ñột biến (WT) trên môi trường nuôi cấy

25

Kết quả từ hình 3.1 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) trong môi trường BHIB có bổ sung 50 µg kanamycine /ml môi trường cho sinh trưởng tương tự như trong môi trường BHIB không bổ sung kanamycinẹ Phân tích Anova single factor so sánh sự khác biệt về sinh trưởng của chủng Ẹ ictaluri PAM trong ñiều kiện nuôi cấy trên môi trường BHIB có bổ sung kanamycine và môi trường BHIB không bổ sung kanamycine cho thấy không có sự khác biệt về sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn này (p>0,05) (phụ lục 1). Kết quả chứng tỏ chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA kháng với kháng sinh kanamycinẹ Sở dĩ vậy là do, trong quá trình ñột biến làm hỏng gen purA, mất khả

năng tổng hợp adenine, dùng làm nguyên liệu sản xuất vaccine nhược ñộc, ñoạn gen

purA bị gây ñột biến mất ñoạn và sử dụng một ñoạn gen kháng kháng sinh kanamycine chèn vào bộ gen của vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến. Do vậy chủng vi khuẩn ñột biến này có khả năng kháng ñược với kanamycinẹ

3.1.2 Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị ñột biến gen purA vơi một số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid

Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA và vi khuẩn Ẹ ictaluri chưa bị ñột biến với một số loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid ñược thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1. Kết quả vòng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bịñột biến gen purAvà vi khuẩn Ẹ ictaluri chưa bịñột biến với kháng sinh thuộc nhóm

aminoglycosid

ðường kính vòng kháng khuẩn (mm) Tên kháng sinh

Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA(PAM)

Ẹ ictaluri chưa bịñột biến (WT) ðường kính vòng kháng khuẩn chuẩn (mm) Gentamycine 14 12 ≥ 16 Streptomycine 0 19 ≥ 14 Kanamycine 0 22 ≥ 18 Neomycine 0 0 ≥ 15

Kết quả từ bảng 3.1 và hình 3.2 cho thấy chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA kháng với tất cả các loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid. ðiều này chứng tỏ chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA có sự hiện diện của gen

26

kháng kanamycine và có thể phát triển ñược trong môi trường có chứa kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid. Theo Aokị T (1988) [21], trong nuôi trồng thủy sản có sự

kháng thuốc hình thành gián tiếp thông qua thể R – plasmid, các R – Plasmid có thể

làm trung gian cho sự kháng một hay là nhiều loại thuốc kháng sinh.

Chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bịñột biến gen purA ñược tạo ra bằng cách làm hỏng gen purA, mất khả năng tổng hợp adeninẹ ðoạn gen purA, mã hóa cho enzyme tổng hợp adenine, bị gây ñột biến mất ñoạn và thay bằng gen kháng kháng sinh kanamycin. Chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri khi loại bỏ gen purA, gen mã hóa cho enzyme adenylosuccinate synthase là enzyme ñầu tiên xúc tác cho quá trình tổng hợp AMP- tham gia vào quá trình tổng hợp purin ribonucleotidẹ

Hình 3.2 Kháng sinh ñồ của vi khuẩn Ẹ ictaluri hoang dại chưa ñột biến gen

purA (A) và vi khuẩn Ẹ ictaluriñột biến gen purA (B)

3.2. Kết quả khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bịñột biến gen purA ở các ñiều kiện bảo quản

3.2.1. Kết quả tìm hiểu một sốñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bịñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) ictaluri bịñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM)

3.2.1.1. ðặc ñiểm hình thái

Trên môi trường nuôi cấy BHIA, vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) cũng như vi khuẩn Ẹ ictaluri hoang dại (Ẹ ictaluri WT) ñều phát triển chậm. Cụ thể, ở nhiệt ñộ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên

B A

27

mặt ñĩa thạch và hình dạng, kích thước vi khuẩn có các ñặc ñiểm ñược thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.3 và hình 3.4.

Bảng 3.2 ðặc ñiểm khuẩn lạc, hình dạng và kích thước chủng vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA

TT ðặc ñiểm Chủng Ẹ ictaluri WT Chủng Ẹ ictaluri PAM

1 Thời gian mọc khuẩn lạc (giờ) 24 24

2 Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường BHIA sau 48 giờ

Dạng tròn, trơn, hơi lồi Dạng tròn, trơn, hơi lồi 3 Màu sắc khuẩn lạc trên môi

trường thạch BHI sau 48 giờ

Màu trắng hơi mờ Màu trắng hơi mờ

4 Kích thước khuẩn lạc trên thạch BHI sau 48 giờ (mm)

2,46±0,21 1,35±0,14

5 Hình dạng vi khuẩn Que ngắn, ñơn hoặc chuỗi ngắn

Que ngắn, ñơn hoặc chuỗi ngắn

6 Khả năng sinh bào tử Không Không

7 Kích thước vi khuẩn (µm) 2,5-3,3 x 0,75-1,00 1,5-2,5 x 0,25-0,75 8 Bắt màu thuốc nhuộm Gram Hồng (Gram âm) Hồng (Gram âm)

Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy ở nhiệt ñộ 28oC, sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường BHIA, khuẩn lạc vi khuẩn chủng Ẹ ictaluri PAM hình thành có kích thước