2.5.3.1. Phương pháp thiết lập ñường cong sinh trưởng phát triển vi khuẩn Ẹ ictaluri bị ñột biến gen purA ởñiều kiện thí nghiệm
+ Phương pháp ñược tiến hành tương tự như mục 2.5.2.1 nhưng Chủng Ẹ ictaluri WT nuôi trong BHIB chứa 50 µg/ml colistin, chủng Ẹ ictaluri PAM nuôi trong BHIB 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin và 50 µg/ml kanamycin.
2.5.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ trên thạch nghiêng BHI ở 4oC
+ Vi khuẩn Ẹ ictaluri ñột biến gen purA (Ẹ ictaluri PAM) và Ẹ ictaluri chưa
ñột biến (Ẹ ictaluri WT) giữ ñông ở -80oC ñược ñem nuôi cấy phục hồi trên môi trường EIM, ủ ở 28oC sau 48 giờ. Sau ñó chọn một khuẩn lạc ñơn (có màu xanh lá, trong mờ) trên môi trường EIM, tăng sinh trong môi trường BHIB chứa 50 µg/ml colistin (ñối với chủng Ẹ ictaluri WT) và môi trường BHIB chứa 50µg adenine/ml, 50 µg/ml colistin + 50 µg/ml kanamycin (ñối với chủng Ẹ ictaluri PAM). Tiến hành nuôi cấy lắc ở 28oC, 250 vòng/phút trong 24 giờ.
+ Lấy 10ml dịch vi khuẩn li tâm ở 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC thu phần huyền phù cặn (vi khuẩn) sao cho ñạt giá trị OD600nm khoảng 1,0 (tương ñương khoảng 109CFU/ml); kiểm tra mật ñộ vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo Koch ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn ban ñầu ñem bảo quản, ñồng thời nhuộm gram ñể xác ñịnh hình dạng và kích thước khi ñem bảo quản.
+ Chia dịch huyền phù (vi khuẩn) với thể tích 1ml vào ống thạch nghiêng BHI
ñã ñược chuẩn bị sẵn, sau ñó ñem bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC.
+ Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC, 3 ống thạch nghiêng ñem bảo quản
ñược lấy ra kiểm tra hình dạng, kích thước vi khuẩn và nuôi cấy trên môi trường thạch BHI theo phương pháp của Koch và ño mật ñộ quang (OD) trên máy so màu quang phổ (Spectro 2000, Labomed, Inc.) ở bước sóng 600nm ñể xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn sau 30 ngày bảo quản. Thí nghiệm ñược tiến hành theo dõi trong 90 ngàỵ
2.5.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ trên thạch nghiêng BHI có phủ lớp dầu khoáng (paraffin) ở 4oC
23
+ Phương pháp ñược tiến hành tương tự như mục 2.5.3.2. nhưng dịch huyền phù vi khuẩn sau khi ñược ñưa vào các ống thạch nghiêng BHI ñã ñược chuẩn bị trước
ñược ñem phủ một lớp dầu khoáng dày 1 – 2 cm rồi mới ñem bảo quản ở nhiệt ñộ 40C. + Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như mục 2.5.3.2.
2.5.3.4. Phương pháp khảo sát khả năng phát triển của vi khuẩn ñược lưu giữ bằng phương pháp lạnh sâu (-30oC)
+ Các bước chuẩn bị vi khuẩn ñem bảo quản tương tự như mục 2.5.3.2. Tuy nhiên, vi khuẩn sau khi ly tâm ở tốc ñộ 3000 vòng/phút trong 10 phút ñược trộn với 10% glycerol ñã ñược thanh trùng (về thể tích) như là chất chống ñông.
+ Dùng pipet Pasteur hút khoảng 1ml dịch huyền phù ñưa vào trong ống lạnh sâu và ñóng nắp. Bao ống lạnh sâu bằng paraffin.
+ Toàn bộ các ống lạnh sâu ñem bảo quản ñược ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 30 phút ñể cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào vi khuẩn.
+ Các ống lạnh sâu ñem bảo quản ñược làm lạnh từ từ (thang 5oC/lần) ñến - 30oC và cuối cùng bảo quản ở - 30oC.
+ Sau mỗi 30 ngày bảo quản ở nhiệt ñộ -30oC, kiểm tra hình dạng, kích thước và mật ñộ vi khuẩn ñem bảo quản tương tự như phương pháp bảo quản bằng thạch nghiêng. Thí nghiệm ñược tiến hành theo dõi trong 30 ngàỵ
Lưu ý: khi ñem các ống lạnh sâu bảo quản ở nhiệt ñộ -30oC ñể kiểm tra hình dạng, kích thước và mật ñô vi khuẩn thì cần phải ñược hoạt hóa bằng cách làm rã ñông (ñưa ngay vào tủấm 37oC trong 40 giây).