Nghiên cứu khả năng phân giải độc tố vi khuẩn lam của vi khuẩn trong môi trường nước hồ phú dưỡng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỤ NHIÊN ■ Nghiên cứu khả phản giải độc tồ vi khuẩn lam vi khuẩn môi trường nước hồ phú dưỡng Mà SƠ:QT-07-53 CHỦ TRÌ ĐỂ TẢI: THS PHAM TH I MAI 63.7 «-M 007 M00001 I , HÀ NỘI - 2007 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI KHOA HỌC T ự• NHIÊN • HỌC * • Nghiên cứu khả phân giải độc tô vi khuẩn lam vi khuẩn môi trường nước hồ phú dưỡng Mà SỐ:QT-07' 51 CHỦ TR Ì ĐỂ TÀI: THS PHAM TH I MAI CÁC CÁN BỘ THAM GIA: THS NGUYÊN KIỂU BẢNG TÂM KTV ĐẶNG M INH HÀ HÀ NỘI - 2007 c Ạl H Ọ C Q U Ộ C GIA HA NỘI TPUNG TÁM THÔNG tin thư VIỆN d 0 b ũ C C Ít'C J BÁO CÁO TĨM TẮT Đ ề tài: Nghiên cứu khả phân giải độc tố vỉ khuẩn lam vỉ khuẩn môi trường nước hồ phú dưỡng Mã sỐ:QT-07-53 Chủ trì đề tài: ThS Pham Thi Mai Các cán tham gia: Ths Nguyễn kiều băng tâm KTV Đặng Minh hà Mục tiêu nghiên cứu: Trong năm gần Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kèm theo nhiễm môi trường ngày gia tăng Nhiều thủy vực thủ đô bị phú dưỡng Q trình diễn mơi trường nước dư thừa muối dinh dưỡng, dẫn tới phát triển mức loài tảo gây biến đổi cấu trúc thành phần loài hệ sinh thái hồ Sự gia tăng thành phần mật độ số loài tảo, đặc biệt loài tảo lam gây độc tạo nên lo ngại môi trường sống cho khu hệ động thực vật hồ Trong số loài tảo gây tượng nở hoa nước hổ có số lồi tảo lam gây độc Microcystis aemginosa Kutzing Thực tế cho thấy tượng nước nở hoa vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật người Mục tiêu đề tài thăm dò khả phân giải độc tố vi khuẩn lam hổ phú dưỡng chung vi khuẩn để góp phần bảo vệ mơi trường nước khu hệ thủy sinh vật Nội dung nghiên cứu: - Phân lập số chủng vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa nước hồ Hồn Kiếm lựa chọn mơi trường nuôi cấy phù hợp - Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải độc tố cao từ môi trường đât nước hồ - Thư nghiệm khả phân giải độc tố chủng vi khuẩn phân lập Các kết đạt được: Từ mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm, phân lập khiết chủng vi khuẩn lam thuộc chi Microcystis Môi trường thạch agarose B I2 thích hợp cho việc phân lâp Microcystis Microcystis phát triển tốt môi trường dịch thể J với mật độ đạt 26 X 106 tế bào/ml ngày thứ 12, sau đến mơi trường Bold 3N với mật độ đạt 24 X 106tế bào/ml cuối đến môi trường B I2 với mật độ 10,9 X 10è tế bào/ml Hàm lượng độc tố microcystin có chủng vi khuẩn lam thu hồ Hoàn Kiếm 10 |ug/800mg sinh khối khô Đã tuyển chọn từ mẫu đất nước hồ chủng vi khuẩn MM, NN1 NN2 có khả phân giải độc tố microcystin Trong chủng MM có khả phân giải mạnh Với nồng độ |ug/l, thời gian bán phân giải 0,052 ngày (tương đương 14 phút) Với nồng độ microcystin lớn gấp lần (10 p.g/1) thời gian bán phân giải 0,128 ngày (tương đương phút) Như chủng MM có khả phân giải độc tố microcystin mạnh Dựa vào đặc điểm ni cấy, sinh lý, sinh hóa đồng dựa vào khóa phân loại Bergey sơ phân loại chủng NN1, NN2 thuộc chi Bacillus chủng MM thuộc chi Sphingomonas Tinh hình kinh phí đề tài: Đã chi theo dự tốn tốn xong với phòng tài vụ trường KHOA QUẢN LÝ (Ký ghi rõ họ tên) CHỦ TR Ì ĐỂ TÀI (Ký ghi rõ họ tên) C QUAN CHỦ T R Ì ĐỂ TÀI ABSTRACT OF PROJECT INTRODUCTION Hanoi city has been developing rapidly in recently Beyond of developing industrial that improved quality of life living, the pollution of this city is being serious as garbage, waste of animal and human, waste water espeđally, water sources are also polluted very seriously Hoan kiem lake, where is one of famous places in the city was also as stated above In where, water quality is changing from bad to worse That leads to disordered development of Cyanobacteria species inside micro -Algal flora The rapid development of toxic Cyanobacteria has been replacing endemic algal species Thus, the toxic in the lake has been increasing, that will threaten to the đestabilization of bio-ecology in there Among these blooming algal species, there is one toxic Cyanobacterìa species as Microcystis aeruginos (Kutzin), which can produce hepatotoxin composed cyclicchains peptide so-called “microcystin” It is accumulated within intemal algal cells or is released into water Microcystin enables to inhibit the PP1 and PP2A phosphatases enzymes as well as serine and threonine phosphatase enzymes There are some researches that have demonstrated blooming phenomena of Cyanobacteria in water, which caused harmful to aquatic organisms as well as animal and human To investigate to study of Cyanobacteria species, we focus on study on toxin ỉysis in blue-green algae by some straỉns bacteria isolated in euthophic lake water envỉroment THE AIM OF PROJECT Investigation into toxin lysis in blue-green algae by some bacteria, at eutrophic lake aiming at the protection of water enviroment and it’s aquatic system BRIEF RESULT - Isolation of some strains of blue-green algae in Hoankiem lake and selection of suitable culture medium - Isolation and screening of some strains o f bacteria possessing high toxin lysis activity from soil and water - Isolation, screening, study on characteristics of Microcystis isolated - Identiílcation of Microcystis isolated - Determination microcystin of same Microcystis strains by HPLC - Capacity of toxin degradation by fresh bacteria RESƯLTS - Pure isolation strain blue-green algae belonged to Microcystis from Hoan Kiem lake - J medium were the well growth Microcystis with density yielded x l0 6/ml at the 12 day - Microcystin toxin content in Microcystis in Hoan Kiem lake water, was 10 microgram/800dried biomass - Screening of bacteria strains prossessing microcystin toxin lysis Among which, MM strain was best with microgram density, and time for hole decomposition was 0.052 day (Equivalent our and 14 minute) Muc luc Muc luc Mở đầu Chương Tổng quan tài liệu 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 Hiện tượng phú dưỡng Vi khuẩn lam gây độc Các loại độc to vi khuẩn lam Anh hưởng độc tổ vi khuẩn lam tới người gia súc Các nhóm vi khuẩn có khả phân giảiđộc tố microcystin Cơ chế phân giải độc tố microcystins vi khuẩn Những nghiên cứu khả phân giải microcystins 3 11 14 Chương Đối tượng phương pháp Nghiên cứu 15 2.1 Đối tượng Nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 15 Chương kết thảo luận 18 3.1 Nuôi cấy phân lập chủng vi khuẩn lam Microcystis 3.2 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải microcystin 18 22 Kết luận kiến nghị 27 Kết luận Khuyến Nghị: Tài liệu tham khảo Phụ lục 27 27 28 30 Mở đầu Trong năm gần Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kèm theo nhiễm mơi trường ngày gia tăng Nhiều thủy vực thủ đô bị phú dưỡng Quá trình diễn môi trường nước dư thừa muối dinh dưỡng, dẫn tới phát triển mức loài tảo gây biến đổi cấu trúc thành phần loài hệ sinh thái hồ Sự gia tăng thành phần mật độ số loài tảo, đặc biệt loài tảo lam gây độc gây nên lo ngại môi trường sống cho khu hệ động thực vật hồ [1, 2, 5,7, 10, 12] Trong số loài tảo gây tượng nở hoa ,nước hồ có số lồi tảo lam có khả nãng_gây độc Microcystis aeruginosa Kutzing Loài M.aeruginosa chứa độc tố thuộc nhóm hepatotoxin(độc tố gan), cấu tạo từ peptiđ mạch vòng gọi microcystin [18, 19, 25, 28, 31] Thực tế cho thấy tượng nước nở hoa vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật người [20,21,22,25,26] Để góp phần bảo vệ mơi trường nước khu hệ thủy sinh vật lìồ phú dưỡng, tiến hành đề tài: “ Nghiền cứu khả phân giải độc tố vi khuẩn lam vi khuẩn môi trường nước hồ phủ dưỡng “ Chương Tổng quan tài liệu 1.1.Hiện tượng phú dưỡng Sự phú dưỡng nhận biết vào kỷ 20 vấn đề gây ô nhiêm nguôn nước hồ hồ chứa vùng Đông âu Bắc Mỹ Kể từ vấn đề ngày trở nên rộng khắp khắp giới Nó khơng làm giảm giá trị môi trường sống thuỷ vực mà ảnh hưởng trực tiếp tới việc sử dụng nguồn nước Những nghiên cứu gần cho thây vùng Châu - Thái Bình Dương có 54% hồ bị phú dưỡng Tỷ lộ theo thứ tự Châu âu, Châu Phi, Bắc Mỹ Nam Phi 53%, 28%, 48%, 41% [20] thủy vực có^điều kiện nhiệt độ, ánh sáng hàm lượng chất dinh dưỡng cao dẫn đến phát triển mức số loài tảo, tạo tượng nở hoa nước [22, 23, 38] Tại thuỷ vực phú dưỡng, vi khuẩn lam thưòng chiếm ưu lồi thực vật vào mùa hè Sinh khối vi khuẩn lam phát triển mạnh làm ảnh hưởng đến vấn đề thẩm mỹ giải trí{ tạo váng bề mặt mùi khó chịu), ảnh hưởng đến vị xử lý nước hồ chứa thành nước sinh hoạt Mặt khác, hoạt động sống vi tảo phân huỷ sinh khối chúng tiêu tốn oxy nước, đồng thời hình thành khí NH,, H2S gây hại đến thuỷ sinh vật [20] Trong tế bào nhiều loài vi khuẩn lam sống phù du nước có chứa khơng bào khí nội bào đặc biệt, cho phép điều chỉnh khả nãng chúng chúng tìm độ sâu cột nước thích hợp tối ưu cho sinh trưởng [20] Như vậy, đặc biệt thời tiết thay đổi từ bão tố sang biển lặng, nhiều tế bào tập đồn tảo lên gió đưa chúng vào vùng ven bờ, tập trung với mật độ cao tạo thành đám trông màu sơn xanh Hiện tượng thay đổi nhanh chóng vài giữ khơng đổi vài tuần, chí đến hàng tháng, đặc biệt thuỷ vực tĩnh kín gió Khi tế bào bị khơ chết đi, giải phóng nội chất vào nước [2 ] 1.2 vi khuẩn lam gây độc Vi khuẩn lam nhóm thể cổ xưa mang nhiều tên gọi khác như: thực vật phân cắt (Sclùzophyceơe), tảo nhầy (Myxophyceơe), tảo lam (Cyanophyta), vi khuẩn lam (iCvcinobacteriơ) Từ năm 1854, Kopp coi vi khuẩn tảo lam nhóm sinh vật chưa có cấu trúc nhân hồn hảo (Procaryota) vào đặc điểm hai khơng có nhân điển hình Vi khuẩn lam phân bố khắp nơi trái đất, đa số sống nước ngọt, sô thuỷ vực nước mặn giàu chất hữu nước lợ [8 ] v ề mặt phân loại, vi khuẩn lam chia thành (Cliroococcales, Chamaesiphonaỉes, Nostocơles, Srigonematơles)[8] Các chi vi khuẩn lam có khả gây độc là: Coelosphaerium, Gomphosphaevia, Microcystis, Synechococcus, Synechocystis, Lyngbya, Osciìỉatoria, Schizothrix, Anabaena, Anabcienopsis, Cindropermum, Scytonema[6,8 ] , chi thường gập nước hổ nở hoa Microcystis Có 46 loài chứng minh gây độc cho động vật có xương sống Các lồi vi khuẩn lam gây độc phân bô' nước chủ yếu Microcystis aeruginosa, Cyỉindrospermopsis raciborskii, Planktothrix (hay gọi Oscillatovia) rubescens, Plankthrix agavdhn, Osciììatoria ỉimosa, Anabaena fìos-aquae, Lyngbya wlei [19, 20] Bảng 1.1 Những lồi vi khuẩn lam gây độc phân b ố chúng ỉ 20] Tham khảo từ Nơi phát tác giả Loại độc tố sinh Loài Anabaena spp (jĩosaquae, lemmermannii, circinalis) Microcystins Fỉnland Sivonen et a i, 1990b; 1992a Attabaena circinalis Microcystins France Vezie et a ỉ 1998 Anabaena flo$-aquae Microcystins Norway Sivonen et al., 1992a Microcystis aeruginosa Microcystins Worldwide Several; see Rinehart et al., 1994 for a summary M virìdỉs Microcystins Japan Kusumi et al., Watanabe et al., 1986 M botrys Microcystins Denmark Henrikseii et al., 1996b Planktothrìx agardhii Microcystins China Ueno et al., 1996a p agardhii Microcystins Norway Krishnamurthy et al., 1989; Meriluoto et al., 1989 Oscillatoria limosa Microcystins Switzerland Mez et aỉ.f 1996 Nostoc sp Microcystins England Beattie et ah, 1998 Anabaenopsis millerii Microcystins Greece Lanaras and Cook, 1994 Haphalosiphon hibernicus (soil isolate) Microcystins USA Prinsep et a i, 1992 Australia Baker and Humpage, 1994; Jones et al., 1994 Nodularia spumigena Nodularins 1987; Áphaniiom enon ovalisporum Cylindrosperm opsin Israel Banker et aỉ., 1997 Cylindrospermopsis raciborskii Cylindrospermopsin Australia Hawkins et al., 1985; 1997 Umeiakia natans Cylindrospermopsin Japan Harada et a l, 1994 Anabaena flos-aquae Anatoxin-a Canada Carmichael et aL, Devlin et aỉ., 1977 Anabaena blooms Anatoxin-a Germany Bumke-Vogt, 1998 Anabaena sp Anatoxin-a Japan Park et a i, 1993a Á pham tom enon sp Anatoxin-a Pinland Sivonen et a l, 1989a Aphanizom enon bloorns Anatoxin-a Germany Bumke-Vogt, 1998 Cyỉindrospermum sp Anatoxin-a Finland Sivonen et ai., 1989a Microcystis sp Anatoxin-a Japan Park et a l, 1993a Pỉanktothrix sp Anatoxin-a Finland Sivonen etal., 1989a Homơanatoxin-a Norway Skulberg et al., 1992 Pỉanktothrix / 'ormosa 1975; Phụ lục Các môi trường nuôi cấy tảo dùng nghiên cứu 2.1 Môi trường Bold3N Vi lượng PIV B3N ml/1 Dung dịch gốc g/400ml H20 30 NaNO, 0 10 CaCl2 2H20 FeClv6H20 97 10 M gS0 7H20 3.0 MnCl2 4H20 41 10 k 2h p o 3.0 ZnCl2 10 k h 2p o 7.0 CoC12.6H20 10 NaCl Na2M o0 2H20 Vitamin B,2 Na2EDTA 750 PIV metal 40 Nước chiết đất 60.0 X Hoá chất 10‘fi - Khối lượng (mg/1) 2.2 Mơi trường B12 (pH=9,0) Hố chất Khối lượng NaNO, 100 k 2h p o 10 MgS04.7H20 75 CaCl2 2H20 40 Na2CO, 20 Ferric citiate Disodium EDTA 2H20 28 2.3 Môi trường BG11 Vi lượng A, BG11 Hoá chất Khối lượng (g/1) K H P04.3 H20 0,04 N aN 1,5 M gS0 7H20 0,075 Khối lượng mg/1 ! Hoá chất Axit xitric H,Bo, ,8 MnCl2 1,81 ZnS0 ,2 2 CuS0 0,079 MoO, 0,015 0.006 CaCl2 2H20 0.036 EDTA 0 Na CƠ ,0 Ferric amonium citrate 0,006 2.4 Môi trường J Được tạo phôi trộn loại dung dịch gốc c , D G9 Metals Dung dịch gốc c, D G9 metal chuẩn bị riêng rẽ lOOOml nước cất lần với thành phần bảng bảo quản tủ lạnh 4' C D ung dịch gốc C: điểu chỉnh pH=9.0 Hoá chất Khối lượng (g/1) NaNO, 67.0 Na 2H P 0.67 k 2h p o 3.8 Tricine buffer 25.0 Dung dịch gốc D: không điều chỉnh pH Hoá chất M gS0 7H20 Khối lượng (g/1) 0 g/1 MgCl2 6H20 5.0 g/1 FeCl,.6H20 CaCl2 2H20 4.2 g/I Na2EDTA 4.4 g/1 g/1 Sau làm lạnh, phôi trộn dung dịch theo tỷ lệ 1:1 để tạo thành môi trường j 29 Dung dịch gốc G9 metal Hoá chất Khối lượng (g/1) H 3BO3 3.25 M nS0 H20 1.5 ZnS0 7H20 0.3 (NH4 )6Mo70 24 4H20 0.08 CuS0 5H20 0.05 Co(N0 )2 6H20 0.15 KI 0 Phụ lục I Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường NA (g/1) Môi trường NB (g/1) Mơi trường M7: Ị Hố chất ị Pepton Cao thịt Khối lượng (g) Khối lượng (g) Hoá chất Khối lượng (g) ,0 Trypton ,0 Peptone Cao thịt 5,0 Yeast extract NaCl ,0 Agar 15.0 Thạch 15.0 Glucose lít Nước cất 1 ,0 NaCl 1,5 Thạch 15,0 Ị Nước cất Ị Hố chất lít Nước cất Khử trùng r’C 15 phút, pH =7,0 Khử trùng 121°c 15 phút, pH =7,0 lít Khử trùng 121"C 15 phút pH =7,0 30 II Một sơ hình ảnh xác định đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hố khuẩn ảnh Khả phân giải tinh bột ảnh 10 Khả di động TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN KHOA MÔI TRƯỜNG - oOo Đặng Thị Kim Anh BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT s ố CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC T ố CỦA KHUÂN LAM Mỉcrocystỉs Ở H ổ HỒN KIÊM, HÀ NỘI KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP HỆ ĐẠI HỌC CHÍNH QUY Ngành: Khoa học Mơi trường Cán hướng dản: Thạc sĩ Phạm Thị Mai Tiến sĩ Nguyễn Thị Hồi Hà Hà Nội - 2007 Tìm hieu khả phân giải độc tố vi khuẩn lam Microcystis hồ Hoàn kiếm vi khuẩn Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, khoa Môi trường, ĐHKHTN-334 Nguyễn Trãi Nguyễn Thị Hồi Hà, viện Cơng nghệ Sinh học, ĐHQGHN-144'Xuân thủy, cầu giấy Tóm tắt Trong năm gần Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kèm theo nhiêm mơi trường ngày gia tăng Nhiều thủy vực thủ đô có hồ Hồn kiem bị phú dưỡng Q trình diễn mơi trường nước dư thừa muối dinh dưỡng, dân tới phát triên cỊuá mức loài tảo, đặc biệt loài vi khuẩn latn(VKL) gây độc ảnh hường xâu tới khu hệ động thực vật hồ Trong hồ Hồn kiếm, nhóm VKL Microcysíis chiếm ti lệ lớn Đây nhóm VKL sản sinh độc tố microcystin, Thực tê cho tượng VKL nở hoa gây hại tới sinh vật người Trong nghiên cứu này, chúng tơi thăm đò khả phân giải độc tố nhỏm VKL Microcystis phân lập từ hơ Hồn kiêm băng chủng vi khuẩn phân lập từ nước hồ Hoàn Kiếm từ đất Đặt vấn đề Hiện tượng nở hoa cùa vi tảo tượng tự nhiên liên quan đến nhiều yếu tổ tự nhiên xã hội Những năm gân đâỵ, với đà phát triển kinh tế dân số đáng kể Hà Nội, Hô Gươm -một địa danh nôi tiêng thủ đô tinh trạng bị ô nhiễm Hoạt động từ dịch vụ, du lịch quanh hồ làm cho hàm lượng chất ô nhiễm đặc biệt hợp chât hữu nước hô tăng cao, dân tới bùng phát nhiều loài vi tảo VKL(Cyanobacteria) Sự phát triển mạnh mẽ cùa chi vi khuẩn lam nước hình thành vùng vảng xanh lớn che kín góc hồ gây nhiều lo ngại mơi trường sống cùa khu hệ thủy sinh vật hồ cảnh quan đô thị, Trong sổ chi vi khuẩn lam đó, nhóm Microcystis thường xuất với tần suất lớn (chiếm xấp xi 90%) xác định chùng có khả sinh độc tố microcystin gây độc cao Hiện nay, giới có nhiều phương pháp tiêu diệt loài tào độc phương pháp hoá học, phương pháp vật lý Tuy nhiên biện pháp an toàn thân thiện với môi trường cạnh tranh sinh học ức chế sinh học tự nhiên cần phải nghiên cứu áp dụng rộng rãi.Trong nghiên cứu chúng tơi, nhân tố ức chế phát triển VKL chủng vi khuẩn phân lập từ đất nước có khả hạn chế phát triển Microcystis cỏ khả phân giải độc tố microcystin VKL gây độc tiết Đối tu'Ọ’ng phương pháp nghiên cứu - Vi khuẩn lam Microcystis phân lập từ hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội - Các loài vi khuẩn đất nước có khả ửc chế phát triển cùa Microcystis phân giải độc tố microcystin - Địa điểm thu mẫu: Hồ Hoàn Kiếm Thời điểm thu mẫu: 10/2/2007 10/4/2007 - Thu mẫu VKL lưới chuyên dụng vớt phù du thực vật với kích thước mắt lưới cỡ No 75 - Phương pháp phân lập nuôi cấy vi khuẩn lam Microcystis: ^.ư ^ m®1 Bold 3N, BI2, J, BG11 Quy trình phân lập tiến hành theo phương pháp cùa Shirai có cải tiến - Phương pháp xác định mật độ tế bào: So lượng te bào vi khuan lam thể tích nước xác đinh bàng cách đếm số tế bào buồng đếm Thoma - Phương phap tach chiet đọc to microcystin từ tế bào Microcysíis Microcystin tách chiết theo phương pháp đơng tan (freeze - thawing), xây dựng đương chuân hàm lượng microcystin theo mật độ quang: - Phương pháp nuôi cấy chủng vi khuẩn đất nước Các chủng vi khuẩn nước phân lập từ mẫu nước hồ, chùng vi khuẩn đất phân lập từ hỗn hợp Microcystis va đất vườn - Phương pháp ức che sinh trưởng Microcyslis chủng vi khuẩn Khả ức chế sinh trưởng vi khuẩn lam bàng chủng vi khuẩn xác định theo phưomg pháp Reim, sử dụng kỹ thuật giếng - khuếch tán (well-diffusion) - Phương pháp xác định khả nãng phân giài microcystin khơng hồ tan Hiệu phân giải rnicrocystin xác định nhờ phương pháp bán thời gian mô tả cùa Keneíick cộng (1993): c t = Co.e(‘kt) đó: C| - hàm lượng microcystin thời điểm đo (|ig); Co" hàm lượng microcystin trước phân huỳ; k - số phân hủy bậc (tính ngày); t - thời gian bán phân huỷ (ngày) - Phương pháp phân loại sơ chủng vi khuẩn Sự phân loại sơ chùng vi khuẩn dựa theo khoá phân loại cùa Bergey (Krieng Holt, 1984) Các đặc điểm sinh hoá chủng kiểm tra hệ thống nhận diện API (bio Merieux) Hỉnh thái tể bào nghiên cứu kính hiển vi quang học kính hiển vi đối pha kết thảo luận 3.1 Nuôi cấy phân lập chủng vi khuẩn lam Microcysíis Tào sau thu từ hồ nuôi cấy làm giàu môi trường dịch thể Bold 3N, lọ nhỏ cỏ thể tích ml, để nhiệt độ phòng chiểu sáng với cường độ ánh sáng 0 2500 Lux Sau tiến hành nuôi cấy môi trường thạch môi trường dịch thể * Phàn lập VKL môi trường thạch Sử dụng loại môi trường: thạch agarose 0,4%, Bold 3N, B I2, BG11 Ở thí nghiệm với loại môi trường lại tiến hành thừ nghiệm thạch agarose thạch tinh khiết Kết cho thấy đĩa Petri chứa mơi trường có bổ sung agarose, khuẩn lạc VKL phát triển nhanh so với môi trường thạch tinh khiết Đặc biệt đĩa chứa môi trường thạch agarose B12 tảo mọc rat nhanh, sau 10 ngày thấy xuất nhiều cụm khuẩn lạc mọc riêng rẽ Như sử dụng môi trường B12 để phân lập VKL Microcystis khác B , , „ m _„ sau ngày lấy mẫu kiem tra so lượng tê bào hết 15 ngày kết thúc thời kỳ nuôi cấy Kết cho thấy Microcystis sinh trưởng tốt môi trường, mật độ tế bào đạt từ 6,7-18,6 X 106/ ml sau ngày nuôi cấy Đặc biệt môi trường J mật độ tế bào đạt 28,0 X 106 tế bào/ml sau ngày thứ I5.Trên môi trường Bold 3N mơi trường ni cấy thích hợp cho VKL, mật độ tế bào đạt 24 X 106 tê bào/ml, môi trường B12 mật độ 17,9 X 106 tế bào/ml Trong môi trường BG11 vi khuẩn lam Microcystis phát triển nhung không hiệu bàng loại môi trường Như có thê sử dụng loại moi trường cho việc nuôi cấy thu sinh khối Mỉcrocystis 3.2 Phân lập tuyển chọn’ chùng vi khuẩn có khả ức chế sinh trướng Microcystis phân giải microcystin 3.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Từ mẫu đất nước,chúng phân lập tuyển chọn 12 chủng vi khuẩn Sau chúng tơi tiến hành thử nghiệm khả ức chế sinh trưởng Microcystis theo phương pháp Riem sử dụng kỹ thuật giếng khuếch tán Kết thu sau Bảng 3.1 Khả ức chế sinh trưởng Microcystis chủng vi khuẩn Chùng vi khuẩn Bán kính vòng phân giải (D-d, mm) MM 2,5 NN1 ,6 NN2 ,8 Pseudomonas aeruginose (mẫu chuẩn, VTCC) 2,4 r u m u a ỉ lg iiia t aiIIẲỉ u u U Ẳ ỉg UUUI/ Aa^/ U ỊIU I u a iig oụ ru n g /vung, t ịu u im giếng Kết bảng 3.1 cho thấy với chùng vi khuân NN1 vòng phân ức chê đạt l, mm Đặc biệt, chùng vi khuẩn MM có khả ức chế sinh trưởng Mìcrocysỉis tốt, vòng írc chế đạt 2,5mm cao so với chủng NN1 Còn chủng vi khuẩn NN2 vòng ức chê đạt 0,8mm Như vậy, từ 12 chủng vi khuẩn phân lập, lựa chọn chùng vi khuẩn cỏ khả ức chế sinh trưởng VKL Microcystis, chủng NN1 NN2 vi khuẩn đẩt, phân lập từ đất vườn chủng vi khuân MM phân lập từ nước hơ Hồn Kiếm Ba chùng vi khuẩn MM, NNI NN2 tiếp tục sừ dụng để thử nghiệm khả phân hủy microcystin không hòa tan 3.2 Xác định khả phân giải microcystin khơng hòa tan Tiến hành chiết microcystin thơ từ chùng VKL phân lập từ hồ Hoàn Kiếm Các chúng vi khuẩn MM, N N NN2 nuôi cấy môi trường dịch thể với mật độ I0 lế bào/ml Tiến hành thử nghiệm khả phân giải độc tố microcystin cách bổ sung dịch chứa chủng vi khuẩn vào dung dịch chứa độc tố với nồng độ |4.g/l, Jig/1, 10 fig/l Cứ sau đo mật độ quang, từ xác định hàm lượng độc tố lại Kết quả-được trình bày bảng 3.2 hình 3.1 Bảng 3.2, H ằng số tốc độ phân giải (K) thời gian bán phân huỷ microcysiin với nồng độ khác Nồng độ microcystin ban đầu ụ B/L ug/1 10 Llg/1 K(l/ngày) K(l/ngày) to.5 (ngày) to.5 (ngày) K(l/ngày) to.5 (ngày) 0,076 0,074 0,140 0,045 0,102 0,043 0,094 0,153 0,092 0,052 0,156 0,056 0,128 0,063 0,052 0,040 0,096 0,030 Chủng vi khuan NN1 NN2 MM J 4,000 '1 3,000 £ g O) ĩ ■“ ,0 0 1,000 Nông độ microcystin Hình 3.1 Biểu đồ thời gian bán phán huỷ microcystin nồng độ khác chửng MM, NN1 VỜN N2 Dựa vào kết bảng 3.2 hình 3.1 ta nhận thấy chủng MM có hoạt tính phân giải mạnh với thời gian bán phân huý nhỏ Chủng NN1 NN2 có hoạt tính phân giải microcystin khơng chủng MM Chùng MM phân lập từ mẫu nước hồ, môi trường thạch dịch thể tịết sắc tố xanh Khi cho dịch vi khuân vào dịch chiêt microcystin làm biên đôi màu dịch chứa độc tố Chủng MM phân huỷ microeystin nồng độ M-g/1 với thời gian bán phân huỷ 0,052 ngày (tương đương 14 phút) Với nồng độ microcystin lớn gấp lân (10 jag/l) thời gian bán phân huỷ 0,128 ngày (tương đương phút) Như chùng MM có khả phân giải độc tố microcystin mạnh nhât Chủng NN1, NN2 phân lập từ đất vườn, môi trường thạch chùng NN1 khuẩn lạc có màu da cam, NN2 có màu trắng đục Cả hai chủng phân giải microcystin nhanh, đặc biệt nồng độ thấp ng/1 thi thời gian bán phân hủy chùng tương đối ngắn, đôi vớ i chung NN1 0,074 ngày (Ị 47 phút) chùng NN2 ỉà 0,092 ngày (2 12 phút) Với nồng độ microcystin cao gấp lần (10fig/l) chủng NN1 có thời gian bán phân hủy 0,140 ngày (3 21 phút), chủng NN2 có thời gian bán phân hủy 0,153 ngày (3 40 phút) L2.3 Sơ phân loại chủng vi khuẩn MM, NN1 NN2 Dựa vào kết đặc điểm nuôi cấy, hỉnh thái, đặc tính sinh lý, sinh hố đồng dựa rào khoáphân loại Bergey (Krieng Holt, 1984) sơ kết luận chủng vi khuẩn tược phân lập từ đất NN1, NN2 thuộc chi Bacillus chùng MM phân lập từ nước hồ thuộc chi bhỉngomonas Điều hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu David G Boume cs (1996) re đường enzyme cùa vi khuẩn Sphingomonas việc phân giải độc tố MLR cùa VKL Ighiên cứu A.Munkong cs (2006) khả ly giải tế bào Microcystis phân giải độc ố mỉcrocystin băng chùng vi khuẩn đất, tiêu biểu Baciilus brevis l.Ket luận Từ kết thu rút số kết luận sau: Môi trường thạch agarose B12 thích hợp cho việc phân lập Microcystis Nhưng ihúng lại phát triển tốt môi trường dịch thể J với mật độ đạt 26 X 106 tế bào/ml ngày 12, sau đến mơi trường Bold 3N với mật độ đạt 24 X 106 tế bào/ml cuối đển môi rường B 12 với mật độ 10,9 X 106 tế bào/ml Đã tuyển chọn từ mẫu đất nước hồ chùng vi khuẩn MM, N N NN2 có ihả ức chế sinh trưởng Microcystis phân giải độc tẻ microcystin Trong chủng klMcó khả ức chế sinh trưởng Mỉcrocystis mạnh (đường kính vòng phân hủy !,5mm )và phân giải microcystin mạnh Với nồng độ jag/!, thời gian bán phân huỷ 0,052 Igày (tương đương 14 phút) Với nồng độ microcystin lớn gấp lần (10 p.g/1) thời gian bán ihân huỷ 0,128 ngày (tương đương phút) Dựa vào đặc điểm nuôi cấy, sinh lý, sinh hóa đồng dựả vào khóa phân loại iergey sơ phân loại chủng NN1, NN2 thuộc chi Baciỉỉus chủng MM thuộc ihi Sphiĩỉgomonas íhuyến nghị; Cần tiep tục giám sát nở hoa cùa chùng vi khuẩn lam gây độc hồ Hồn Kiếm- Hà fơi mối liên quan chủng với điều kiện môi trường i Cac nghiên cứu khả phân giải độc tố microcystin cần làm sâu nhăm tìm ác biên phan lam giảm thiểu, ngăn ngừa tác hại vi khuẩn lam gây độc, ý dên ác biện pháp sinh học vừa cho chi phí rẻ mà lại thân thiện với mơi trường "ơng trình hoan thành hỗ trợ kinh phí đề tài QT 07-53 'ài liệu tham khảo fì3 no ninh Kim Đăng Hoàng Phước Hiền (2006), Điều tra phát tảo độc thuỳ vực •, * , _ , rAt rhnt Iươne nsuôn nước, Báo cáo Tông kêt nhiệm vụ khoa học V; S $ ệz ZLT- TV»ìệ U i í n lam Micmcyslis